采用表面增强拉曼光谱的分枝杆菌无标签检测的制作方法

采用表面增强拉曼光谱的分枝杆菌无标签检测
1.相关申请的交叉引用
2.本技术请求申请日2019年4月9日提交的申请号为10201903159v的新加坡专利申请的优先权，其内容通过引用全部并入本文。
技术领域
3.本发明涉及一种鉴定分枝杆菌的方法，以及一种检测分枝杆菌疾病的方法，上述方法均采用表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman spectrosc opy，sers)。


背景技术：

4.分枝菌酸(myclolic acid)为在其脂肪酸链上具有大约60～90个碳原子的高分子量脂肪酸，其中，所述脂肪酸链包括α-支链烷基链以及β-羟基链。分枝菌酸可以从多种细菌的细胞壁中找到，例如结核分枝杆菌(mycobacteri a tuberculosis)以及非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，ntm)。
5.分枝菌酸可以由三种形式组成。三种形式可以包括具有环丙烷的α分枝菌酸(alpha-mycolic acid，ama)、具有环氧官能团的酮基分枝菌酸(keto-mycolic acid，kma)以及具有酯官能团的甲氧基分枝菌酸(methoxy-myco lic acid，mma)。这些分枝菌酸起到保护细菌免受脱水和化学损伤、帮助细菌在恶劣条件下生存的作用。例如，所述分枝菌酸可以存在于分枝杆菌细胞壁中，其中，分枝菌酸可以与阿拉伯半乳聚糖的聚合物(分枝杆菌细胞壁的结构性成分)共价结合或是紧密连接，以维持细胞壁的刚性。分枝菌酸还起到屏障作用，保护分枝杆菌免受吞噬作用产生的溶菌酶以及氧自由基影响，并且该屏障甚至有助于分枝杆菌在低ph(酸性环境)下生存。由于分枝杆菌可能包含分枝菌酸，已开发检测分枝菌酸的方法以用于确定分枝杆菌存在或不存在。
6.检测分枝菌酸的方法可以包括高效液相色谱法(hplc)、薄层色谱法、涂片镜检法(smear microscopy)以及质谱法。在hplc中，可以通过观察hplc柱中的hplc谱图以及分析样品保留时间检测样品中的分枝菌酸。然而，所采用的方法受到一种或多种限制。
7.例如，诸如涂片镜检法以及质谱法的方法可能涉及大型器械，该器械无法缩减为更小的即时仪器。即时仪器的示例可以为便携分枝菌酸检测试剂盒。上述方法可能在检测多种分枝菌酸甚至单种分枝菌酸时过于耗时。上述方法还可能要求所存在的分枝菌酸有足够的分枝菌酸的浓度，以从样品中检测到，这可能转而要求培养疑似包含分枝杆菌的样品。此外，这些方法可能要求使用一种或多种特定的试剂，使得该些方法经济上不受欢迎。
8.此外，若脂质或其他生物材料未从疑似包含分枝菌酸的样品中分离，这些方法可能受到检测干扰。为了从细菌样品中提取分枝菌酸，这些方法可能要求对细菌样品进行额外的球磨步骤。球磨步骤旨在打破细胞壁，以从中释放分枝菌酸。同时，脂质或其他蛋白可以被释放。此类脂质或其他蛋白可能干扰这些方法中分枝菌酸的检测。因此，上述方法要求额外的提取和/或分离步骤。
9.因此，需要提供解决一个或多个上述限制的方案。该方案应当至少提供一种鉴定
细菌例如分枝杆菌的方法，而不仅仅是鉴定单种分枝菌酸的存在或不存在。
10.发明概述
11.第一方面，提供了一种采用表面增强拉曼光谱(sers)鉴定分枝杆菌的方法，所述方法包括：
12.配置待测的包括分枝杆菌的样品在sers活性基底上；
13.检测表面增强拉曼信号，其对应来自设于sers活性基底的样品的α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸以及酮基分枝菌酸；
14.以及确定表面增强拉曼信号的一个或多个强度比率，以鉴定分枝杆菌。
15.一种采用表面增强拉曼光谱(sers)检测分枝杆菌疾病的方法，所述方法包括：
16.根据第一方面的各个实施方案所描述的方法鉴定分枝杆菌；
17.以及基于鉴定的分枝杆菌确定分枝杆菌疾病。
附图说明
18.附图非比例绘制，通常重点是本发明原理的阐述上。下述说明中，本公开的部分中的各个实施方案的描述参考下述附图，其中：
19.图1a为涂覆硅纳米柱的银的场发射扫描电子显微镜(fesem)图像，比例尺表示1μm。
20.图1b为60nm金胶体的fesem图像，比例尺表示1μm。
21.图2a显示了α分枝菌酸(ama)的表面增强拉曼光谱(sers)的光谱，α分枝菌酸通过合成获得，并且光谱为100个ama sers光谱的平均值。
22.图2b显示甲氧基分枝菌酸(mma)的sers光谱，甲氧基分枝菌酸通过合成获得，并且光谱为100个mma sers光谱的平均值。
23.图2c显示酮基分枝菌酸(kma)的sers光谱，酮基分枝菌酸通过合成获得，并且光谱为100个kma sers光谱的平均值。
24.图3a显示了取自存在于脱脂分枝杆菌(dl-mtb)样品中的分枝菌酸的sers光谱，并且光谱为10个sers光谱的平均值。
25.图3b显示了取自存在于未脱脂分枝杆菌(ndl-mtb)样品中的分枝菌酸的sers光谱，并且光谱为10个sers光谱范围的平均值。
26.图4比较了取自dl-mtb样品的sers光谱(上图)与通过合成获得的ama的sers光谱(下图)，所述ama的sers光谱为100个sers光谱的平均值，所述dl-mtb的sers光谱为10个sers光谱的平均值；采用b和d标记两支产生dl-mtb的平均光谱的光谱数据。
27.图5比较了取自dl-mtb样品的sers光谱(上图)与通过合成获得的kma的sers光谱(下图)。所述kma的sers光谱为100个sers光谱的平均值，所述dl-mtb的sers光谱为10个sers光谱范围的平均值。采用b和d标记两支产生dl-mtb的平均光谱的光谱数据。
28.图6显示了取自dl-mtb样品的sers光谱中的对应ama(上图)以及kma(下图)的sers峰的鉴定以及匹配，两个sers光谱均为10个sers光谱的平均值，采用b和d标记两支产生dl-mtb的平均光谱的光谱数据。
29.详细说明
30.以下详细描述参考附图，附图通过图示的方式示出了可以实践本发明的具体细节
和实施方案。
31.在一个实施方案的上下文中描述的特征可相应地适用于其他实施方案中的相同或类似特征。即使未在其他实施方案中明确描述，在一个实施方案的上下文中描述的特征也可以相应地适用于其他实施方案。此外，如针对实施方案的上下文中所描述的特征的添加和/或组合和/或选择可以相应地适用于其他实施方案中的相同或相似的特征。
32.第一方面的各个实施方案涉及一种采用表面增强拉曼光谱(sers)从样品中鉴定分枝杆菌的方法。
33.分枝杆菌可能包括分枝菌酸。可能在分枝杆菌中找到的分枝菌酸的例子包括α分枝菌酸、酮基分枝菌酸以及甲氧基分枝菌酸。在第一方面的所述方法中，包括这三种分枝菌酸形式的分枝菌酸可能通过其sers信号被鉴定出，因为这些分枝菌酸各自在sers光谱中产生特定特征(specific signature)。
34.在第一方面的所述方法中，存在于样品中的一种分枝菌酸的量可以与存在于其中的另一种分枝菌酸比较，以获得比率。本发明的方法通过比较一种分枝菌酸与另一种的sers信号强度比较建立该比率，并且可测定的一个或多个该比率取决于其中所存在的分枝菌酸的类型数量确定。一种分枝菌酸的sers信号强度取决于其在样品中的量，即，分枝菌酸的量越高产生的ser s信号强度越高，而量越低导致sers信号强度越低。例如，采用第一方面所述的方法处理的样品可能产生α分枝菌酸、酮基分枝菌酸以及甲氧酸分枝菌酸的sers信号强度。可以确定α分枝菌酸与酮基分枝菌酸之间、α分枝菌酸与酮基分枝菌酸之间、和/或酮基分枝菌酸与甲氧基分枝菌酸之间一个或多个sers信号强度的比率。第一方面所述的方法中，测定此类比率有助于鉴定样本中可能存在的分枝杆菌，因为不同的分枝杆菌可能含有不同量的不同分枝菌酸。如果比率表明甲氧基分枝菌酸含量较高，则可鉴定出致病性结核分枝杆菌。通过第一方面的方法，还开发了采用表面增强拉曼光谱(ser s)检测分枝杆菌疾病的方法，本文公开的多个实施方案均有涉及。换言之，检测到的分枝杆菌疾病基于通过第一方面的方法鉴定的分枝杆菌。
35.第一方面的方法包括将疑似含有分枝杆菌的样品配置在sers活性基底上疑似的步骤。本文中的术语“sers活性基底”指能够增强拉曼散射的材料。样品可与sers活性基底接触或配置于其附近，以产生一个或多个对应于分枝杆菌中可能存在的一种或多种分枝菌酸的sers信号。换句话说，本方法不需要使用标签(例如结合实体)将分枝菌酸附着到sers活性基底上以产生sers信号。相反，在一些分枝杆菌检测方法中，疑似样品与特异性靶向分枝菌酸的结合实体(蛋白质、配体、抗体等)混合。然后，与结合实体结合的分枝菌酸能够附着到基底上以产生指示分枝菌酸存在的信号。在其他方法中，基底用结合实体固定，以捕获特定的分枝菌酸用以检测。此外，一些方法使用一个结合实体，当它连接到一个分枝菌酸时会发出一个信号，以指示分枝菌酸的存在。本方法在不使用此类标签的情况下检测和鉴定各种分枝菌酸，因此在本文中可称为“无标签”方法。
36.第一方面的方法使用sers，这有利于鉴定分枝杆菌。sers允许单分子检测，即，由于其高灵敏度和再现性，可鉴定分枝菌酸存在和/或不存在。由于第一方面的方法具有高灵敏度，其可检测浓度在nm到μm量级范围内的分枝菌酸。由于第一方面的方法能够在如此低的浓度下检测分枝菌酸，因此可以避免为了检测培养样品以增加分枝菌酸的量。第一方面的方法最小化了制备样品所需的步骤，既不需要试剂，也不需要耗时使用与检测技术(如
hplc、色谱、质谱等)相关的复杂器械。通过第一方面的方法可以更快地检测和鉴定分枝杆菌，减少用户暴露于有害分枝杆菌的时间。
37.通过使用sers，第一方面的方法是非侵入性的，即可以在体外和/或离体进行，并且不需要破坏样品。sers将第一方面的方法呈现为高空间分辨率技术，并允许样品以固体、液体或气体的形式进行分析。sers信号强度及其比率也可以简单、快速地量化，以鉴定不同的分枝杆菌(例如，一天内)。第一方面的方法还可与其它现有检测技术结合使用以确定分枝杆菌的存在或不存在。
38.第一方面的方法和基于第一方面的方法检测分枝杆菌疾病的方法的各种实施方案的细节，以及各种实施方案相关的优点如下所述。
39.第一方面的方法提供了使用表面增强拉曼光谱(sers)鉴定分枝杆菌的方法。该方法可包括将疑似疑包含分枝杆菌的样品配置于sers活性基底上，检测对应于来自配置于sers活性基底上的样品的α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸的表面增强拉曼信号，以及测定一个或多个表面增强拉曼信号的强度比率以鉴定分枝杆菌。
40.在样品为液体或转化为液体的实施例中，样品可配置于sers活性基底上或与sers活性基底混合。换句话说，将样品配置于sers活性基底上可包括以液体形式提供样品。以液体形式提供样品可包括在溶剂中混合样品。因此，将样品配置于sers活性基底上可包括在将样品配置于sers活性基底上之前在溶剂中混合样品。
41.溶剂可包含氯仿和甲醇。氯仿和甲醇的这种组合可以使不同的脂质溶解在其中，这使得从分枝杆菌膜上提取脂质更容易。在使用氯仿和甲醇的实施方案中，氯仿和甲醇的体积比可为1:1至9:1、2:1至9:1、3:1至9:1、4:1至9:1、5:1至9:1、6:1至9:1、7:1至9:1、8:1至9:1。这些比例表明在不存在过量氯仿和甲醇的情况下不同脂质的溶解，从而实现了脂质的有效提取。
42.第一方面的方法在多用途上是有利的，因为可能需要也可能不需要从分枝杆菌中提取分枝菌酸以产生对应于分枝菌酸的一个或多个sers信号，因为分枝菌酸不需要与sers活性基底物理接触以产生sers信号。这是因为sers活性基底附近的分枝菌酸足以使分枝菌酸和sers活性基底之间发生产生sers信号的相互作用。例如，分枝杆菌膜的表面可能与sers活性基底非常接近(例如，10nm或更小)，而这可能足以产生等离子体增强以发出拉曼信号。由此，疑似包含分枝杆菌的样品可能不需要进行提取过程以从疑似包含在样品中的分枝杆菌中提取α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸。这减少了快速鉴定分枝菌酸和分枝杆菌所需的步骤和试剂数量。然而，优选地，第一方面的方法可进一步包括在将样品配置于sers活性基底上之前从疑似包含在样品中的分枝杆菌中提取α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸。提取α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸可包括分解疑似包含在样品中的分枝杆菌的细胞壁，因为分枝菌酸是分枝杆菌细胞壁中的结构性成分。
43.为了分解细胞壁，提取α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸可包括使样品进行皂化、机械研磨、脱脂或其组合。可以使用其他合适的方法从细胞壁释放分枝菌酸。
44.在各种实施方案中，提取α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸可包括对疑似包含在样品中的分枝杆菌进行脱脂。以脱脂为例，提取的分枝菌酸可从细胞壁崩解释放的其他脂质中分离出来，因此可产生更清晰的ser s信号。如果碰巧存在其它脂质，则其它脂质可产生干扰分枝菌酸的sers信号的sers信号。因此，第一方面的方法可进一步包括在
将样品配置于sers活性基底上之前从样品中去除脂质。尽管如此，由于第一方面的方法具有高灵敏度和准确性，即使存在其他脂质，也可以检测和鉴定分枝菌酸的sers信号。
45.在各种实施方案中，脱脂可包括使疑似包含在样品中的分枝杆菌失活，并将样品分离为水相和有机相。有机相用以溶解分枝杆菌释放的其他脂质，可以去除有机相以分离水相中的分枝菌酸。
46.分枝杆菌的失活可包括在20℃至40℃、20℃至30℃或30℃至40℃的温度范围内孵育样品。可对样品进行至少24小时的培养。或者，可通过将分枝杆菌曝露于γ射线来进行分枝杆菌的失活。例如，疑似包含分枝杆菌的样品可通过曝露于使用
137
cs源的2.4mrads的电离γ辐射而失活。失活可通过阿尔玛蓝(alamar blue)分析技术确认。
47.为了减少磷脂和水解脂肪酸的离子抑制(即，由于分枝杆菌膜中存在的其他磷脂和脂肪酸的干扰，导致分枝菌酸提取不完全)，可进行第二次脱脂，其可进一步包括将水相与一种或多种有机溶剂混合以形成混合物，将混合物分离成进一步水相、进一步有机相和中间相，其中中间相可包括脱脂的疑似包含在样品中的分枝杆菌。在各种实施方案中，一种或多种有机溶剂可包含氯仿。
48.在获得中间相后，第一方面的方法可进一步包括干燥中间相，以获得疑似包含在样品中的脱脂分枝杆菌。
49.第一方面的方法可进一步包括将脱脂的疑似包含在样品中的分枝杆菌与乙醇和碱的混合物接触，加热所得混合物，并向加热的混合物中添加提取溶剂和酸。这可能有助于破坏分枝杆菌膜，以选择性地提取分枝菌酸。
50.在各种实施方案中，提取溶剂可包含氯仿。在各种实施方案中，酸可包含盐酸。在各种实施方案中，碱可包含氢氧化钾。在各种实施方案中，醇可包含甲醇。可以使用不会改变或破坏分枝菌酸的其他合适的提取溶剂、酸、碱和醇。
51.第一方面的方法使用sers活性基底生成对应于分枝菌酸的sers信号。sers活性基底可涂覆或完全由sers活性材料形成，例如但不限于贵金属，例如银、钯、金、铂、铱、铑、钌或其合金。其他sers活性材料可包括铜、铝或其合金，其中该合金可包括贵金属。sers活性基底可包括或由金、银或其合金组成。sers活性基底可包含金、银、其合金或其混合物的纳米粒子。或者，sers活性基底可包括涂覆在衬底上的一层金、银或其合金。在某些情况下，sers活性基底可由非sers活性材料形成，例如塑料、陶瓷、复合材料、玻璃或有机聚合物，并涂覆有上述sers活性材料以呈现等离子体特性。
52.sers活性基底可以是包含至少一种sers活性纳米结构的衬底，该纳米结构配置在衬底的表面上。包含配置在衬底表面上的至少一个sers活性纳米结构的衬底可以是绝缘衬底、半导体衬底或纸质衬底中的一种，包含至少一种纳米结构的衬底可以涂覆一层sers活性材料。sers活性材料可包含一层金、银或其合金。本文中的术语“纳米结构”指至少一个维度在纳米范围内的材料。所述纳米结构的至少一个维度可以是1000nm或更小，或者从100nm到1000nm的范围。纳米结构的实例可包括但不限于纳米岛、纳米柱、纳米片、纳米粒子及其组合。例如，衬底可包括具有配置于其上的纳米结构阵列的硅基底。纳米结构可包括硅纳米柱。作为另一实例，包含配置在衬底表面上的至少一种sers活性纳米结构的衬底可以是绝缘衬底，例如玻璃衬底或二氧化硅涂覆的硅衬底。配置在绝缘衬底表面上的至少一种ser s活性纳米结构可以是涂覆一层sers活性材料的多个纳米柱的形式。所述多个纳米柱的高度
范围可为250nm至300nm、260nm至300nm、270nm至300nm、280nm至300nm、290nm至300nm等。每个纳米柱之间的距离可为100nm或更小、90nm或更小、80nm或更小、70nm或更小、60nm或更小、50nm或更小、40nm或更小、30nm或更小、20nm或更小，10nm或更小等。
53.在各种实施方案中，检测表面增强拉曼信号可包括将配置在sers活性基底上的样品曝露于电磁辐射中，并生成一个或多个来自样品的表面增强拉曼信号。电磁辐射的波长范围可为100nm至1000nm、200nm至1000nm、300nm至1000nm、400nm至1000nm、500nm至1000nm、600nm至1000nm、700nm至1000nm、800nm至1000nm或900nm至1000nm。这些范围的波长，包括更长的波长，可从样本中产生更强的信号。在一些实施方案中，电磁辐射具有785nm的波长。
54.根据第一方面的方法，产生的一个或多个表面增强拉曼信号可能在600cm-1
到1800cm-1
的范围内。该范围内的sers信号可对应于上述三种分枝菌酸中的一种或多种。
55.在各种实施方案中，检测表面增强拉曼信号可包括将从样品中产生的一个或多个表面增强拉曼信号与从人工合成α分枝菌酸、人工合成甲氧基分枝菌酸以及人工合成的酮基分枝菌酸生成的表面增强拉曼信号进行比较。检测表面增强拉曼信号可包括测定对应于α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸的表面增强拉曼信号的存在和/或强度。通过将从本方法获得的sers信号与人工合成的分枝菌酸的sers信号进行比较，可以鉴定样品中存在的分枝菌酸。
56.在鉴定分枝菌酸存在和/或不存在后，可测定表面增强拉曼信号的一个或多个强度比率。这可包括将对应于α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸的表面增强拉曼信号的强度与在样品中检测到的α分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸各自的浓度相关联，并比较浓度以获得用于鉴定分枝杆菌的一个或多个比率。如上所述，不同的分枝杆菌含有不同量的各分枝菌酸。通过比较sers信号强度的比率以建立样本中分枝菌酸的组成，从而可以鉴定分枝杆菌。
57.可通过第一方面的方法鉴定的分枝杆菌的非限制性示例包括非结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合群的种。非结核分枝杆菌可包括鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)复合群、堪萨斯分枝杆菌(mycobacterium kansasi)或脓肿分枝杆菌(mycobacterium abscessus)。结核分枝杆菌复合群的种可包括结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、非洲型分枝杆菌(mycobacteri um africanum)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)或田鼠分枝杆菌(myc obacterium microti)。
58.疑似包含分枝杆菌的样品可能含有(i)分枝杆菌，和/或(ii)α分枝杆菌酸、甲氧基分枝杆菌酸和酮基分枝杆菌酸中的任何一种，浓度范围为1nm至1μm。第一方面的方法具有高灵敏度，使得在这种浓度下检测和鉴定分枝杆菌。
59.第一方面的方法是非侵入性的，因为它可以通过使用sers在体外(in vitro)或离体(ex vivo)进行，以鉴定样本中的分枝杆菌。通过鉴定样本中的分枝杆菌，第一方面的方法可用于检测分枝杆菌疾病。分枝杆菌疾病可包括肺部疾病、淋巴疾病或皮肤疾病。分枝杆菌病也可包括结核病。
60.如上所述，本公开涉及一种使用表面增强拉曼光谱(sers)检测分枝杆菌疾病的方法。该方法可以基于第一方面的各种实施方案。为第一方面的方法描述的实施方案和优点可以类似地适用于本文描述的检测分枝杆菌疾病的本方法，反之亦然。由于各种实施方案
和优点已在上文和本文所示的示例中描述，因此为了简洁起见，不再重复描述这些实施方案和优点。
61.本方法采用表面增强拉曼光谱(sers)检测分枝杆菌疾病，可包括根据第一方面的方法描述的各种实施方案鉴定分枝杆菌，并基于所鉴定的分枝杆菌确定分枝杆菌疾病。
62.分枝杆菌疾病可包括肺部疾病、淋巴疾病或皮肤疾病。分枝杆菌疾病也可包括结核病。
63.本方法检测分枝杆菌疾病是非侵入性的，因为它可以通过使用sers并基于第一方面的方法在体外(in vitro)或离体(ex vivo)进行。
64.词语“基本上(substantially)”并不排除“完全”，例如，“基本上没有”y的组成可能完全没有y。如有必要，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。
65.在各种实施方案的上下文中，关于特征或元件的冠词“a”、“an”和“the”包括对一个或多个特征或元件的引用。
66.在各种实施方案的上下文中，应用于数值的术语“大约”或“约”包括精确值和合理偏差。
67.如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关的列出项目的任一和所有组合。
68.除非另有规定，术语“包含”和“包括”及其语法变体旨在表示“开放性”或“包含性”语言，以使它们不仅包括引用的元件，还包含其他未引用的元件。
实施例
69.本公开涉及一种基于表面增强拉曼光谱(sers)的方法，用于鉴定分枝杆菌，例如结核(tuberculosis，tb)细菌。本方法能够通过量化对应于样本中存在或不存在的分枝菌酸的sers信号来鉴定分枝杆菌。换言之，分枝菌酸可作为鉴定分枝杆菌的生物标志物。
70.本方法通过使用sers检测样品中的分枝菌酸而不使用任何标签，从而提高了灵敏度。也就是说，疑似含有分枝杆菌的样品(从中得到分枝菌酸)不需要与任何特异性靶向分枝菌酸的结合实体混合，以与sers活性基底结合来产生sers信号。因此，本方法在此被称为“无标签(label-free)”方法。
71.本方法结合使用sers活性基底。sers活性基底在此可称为“sers散射平台”。当分枝菌酸接触sers活性基底或接近sers活性基底时，产生se rs信号。sers信号可以从sers活性基底以一个或多个光谱的形式检测到。sers活性基底可以是包含镀银硅纳米柱(agsnp)或金纳米粒子的基底。
72.在本方法中，可对从样品中分枝菌酸获得的sers信号进行统计分析。例如，可以从样品中鉴定每种分枝菌酸的sers信号。可比较每种分枝菌酸的sers信号的强度以获得sers信号强度的一个或多个比率，其可提供关于样品中存在和不存在的各种分枝菌酸的量及其相对比率的信息。这种稳健而有效的分析方案可准确定量从样品中提取的分枝菌酸，然后可用于鉴定样品中的分枝杆菌。
73.此外，本方法可用于鉴定γ辐照细菌中存在和不存在的分枝菌酸，且无需首先从细菌细胞壁中提取分枝菌酸。γ射线使样品更安全，因为它使样品中疑似含有的分枝杆菌失活。
74.有利的是，如以下实施例所示，本方法可用于鉴定分枝杆菌，即使样本中的分枝菌
酸浓度为nm至μm量级。
75.通过非限制性示例，详细讨论了目前鉴定分枝杆菌和检测分枝杆菌疾病的方法，如下所述。
76.实施例1a：硅纳米柱sers活性基底的制备
77.为了制备硅纳米柱(snp)sers活性衬底，使用牛津仪器公司(oxfor d instruments)的电感耦合等离子体反应离子刻蚀(icp-rie)系统进行硅刻蚀。未掺杂或p型硅片可用于snp制备。
78.作为第一步，根据要求，使用o2气体在10-15
mtorr室压力下对硅片进行5分钟到10分钟的氧等离子体处理。进行该步骤是为了在硅表面上增加二氧化硅层。
79.在第二步中，以1.1到1.21的比率使用sf6:o2气体的组合，蚀刻速率为2.5到2.8nm/s。获得了高度为250～300nm的随机排列的硅纳米柱，纳米柱间距小于100nm。在此步骤之后，可通过溅射或电子束蒸发系统(涉及物理气相沉积技术)沉积纯银或金和银的组合。图1a示出了镀银硅纳米柱，其仅作为sers活性基底的一个示例。
80.实施例1b：分枝菌酸的sers光谱
81.首次获得了各种分枝菌酸的sers光谱。分枝菌酸，包括α分枝菌酸(ama)、酮基分枝菌酸(kma)和甲氧基分枝菌酸(mma)，购自美国avan ti polar lipides。购买的分枝菌酸是合成的(即人工生产的)分枝菌酸。这三种分枝菌酸是重点关注的，因为它们可能构成分枝杆菌中更突出的分枝菌酸。
82.为了再现性和准确性，对三种分枝菌酸中的每一种进行多次sers扫描，以分别获得三个合成sers光谱，其中每个合成sers光谱是多次扫描获得的sers光谱的平均值。因此，所得光谱在此可称为“平均光谱”或“平均sers光谱”。图2a至2c分别描绘了α分枝菌酸、酮基分枝菌酸和甲氧基分枝菌酸的平均sers光谱。为了产生形成sers光谱的sers信号，所使用的sers活性基底可以是镀银硅纳米柱(图1a)或金纳米粒子(图1b)。
83.在本方法中，分枝菌酸的sers信号强度取决于其在样品中的量。例如，在图2a中，α分枝菌酸可具有接近1000cm-1
的特征峰，且该峰的强度可取决于存在的α分枝菌酸的浓度，即，较高的量的α分枝菌酸产生较高的se rs信号强度的特征峰，而较低的量可导致较低的sers信号强度。在本方法中，可比较每种分枝菌酸的sers信号强度以获得其相对比率，并且通过其sers信号强度测定分枝菌酸的相对比率，可鉴定样本中存在或不存在的分枝杆菌。换言之，通过sers信号强度，可按照本方法中所述测定的分枝菌酸相对于另一分枝菌酸的量，从样品中鉴定分枝杆菌。例如，所有三种分枝菌酸可能同时存在于结核分枝杆菌(mycobacteria tuberculosis)和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，ntm)谱系中，但比例不同。并且在许多情况下，致病性结核分枝杆菌可能含有较高量的甲氧基分枝菌酸。然后，可以比较三种分枝菌酸之间的sers信号强度以鉴定分枝杆菌。有利的是，本方法能够鉴定分枝杆菌，尽管不同的分枝杆菌具有所有三种分枝菌酸，但存在量不同。
84.实施例2：样品的脱脂和非脱脂
85.分枝菌酸是导致结核病的结核分枝杆菌(mycobacteria tuberculosis)谱系中的主要脂质之一。本方法的通用性在于，分枝菌酸的特征可通过从分枝杆菌中提取或不提取分枝菌酸来表征。换句话说，本方法可能涉及从分枝杆菌中提取分枝菌酸的提取步骤。作为非限制性示例，可在将样吕与sers活性基底接触前，将疑似含有分枝杆菌的样品投入球磨
机并在其中粉碎，以获得sers光谱，由此可确定是否存在分枝菌酸。在这种情况下，因为未分离分枝菌酸，其他脂质的sers信号可能会出现在sers光谱中。这种含有其他脂质的样品在本文中称为“非脱脂”样品。如果分枝菌酸已与其他脂质，则该样品称为“脱脂”样品。
86.在各种实施例中，鉴定致病性结核菌株中存在的分枝菌酸的组成，并将其与非非致病性结核菌株中发现的分枝菌酸进行比较。提取分枝菌酸。提取是基于matralix提取方案进行的，下文通过对疑似含有分枝杆菌的样品进行脱脂提取的非限制性示例对该方案进行讨论。
87.将100mg细菌在pyrex玻璃培养管中用1ml氯仿-甲醇(体积比为2:1)处理，并在40℃下搅拌过夜，以灭活病原体并提取游离脂质。还包括两个仅含有1ml氯仿-甲醇(体积比为2:1)的空白管作为对照。过夜培养后，将混合物转移至螺旋盖管中，并用500μl h2o冲洗一次。通过充分旋转混合物1分钟并在室温下以14000rpm离心10分钟来进行脱脂。去除下层的有机相(含游离脂质)。为了减少磷脂和水解脂肪酸的离子抑制，使用额外的500μl氯仿通过重复上述步骤进行第二次脱脂。第二次脱脂可以去除松散结合在分枝杆菌膜上的游离脂质。小心地去除上层水相和下层有机相。将中间层转移到新管中并干燥以获得脱脂细菌。
88.脱脂细菌的脂质松散地结合在去除其的分枝杆菌膜上，然后对其进行分枝菌酸提取。分枝菌酸的提取涉及从细胞膜分离分枝菌酸，其中可使用碱和醇。简言之，向100mg脱脂细菌细胞中添加2ml 20％甲醇koh。样品在80℃下培养30分钟，然后在121℃下高压灭菌30分钟。添加氯仿(2ml)，然后添加1.5ml 50％盐酸。样品在室温下以2000rpm离心10分钟。收集氯仿层并在室温下风干过夜，以获得分枝菌酸。按照这些步骤，可以使用分枝菌酸来鉴定本方法中所述的细菌。
89.在一个示例中，比较了从全天然细菌中提取的分枝菌酸(未脱脂)和从细菌外膜脱脂后获得的另一批分枝菌酸。
90.图3a和3b分别显示了脱脂和非脱脂样品的sers光谱。从图3a和3b中可知，本方法显然是多用途的，因为可以在两个样品中都观察到对应于α分枝菌酸(ama)、酮基分枝菌酸(kma)和甲氧基分枝菌酸(mma)的sers峰。这意味着，即使存在其他脂质成分，也可以通过本方法鉴定不同的分枝菌酸。
91.实施例3：使用去脂细菌的sers信号强度比率分析
92.在随后的研究中，使用不同细菌菌株的脱脂分枝菌酸来说明本方法的有效性。具体而言，通过sers信号强度量化α分枝菌酸(ama)、酮基分枝菌酸(kma)和甲氧基分枝菌酸(mma)的相对浓度。例如，在图4中，示出了可在dl-mtb光谱中观察到的特异性和代表性ama峰。在图5中，示出了可在dl-mtb光谱中观察到的特异性和代表性kma峰。在图6中，示出了可在dl-mtb光谱中观察到的特异性和代表性ama和kma峰。具体而言，在图6中，显示了在dl-mtb光谱中可以看到的准确的ama和kma峰。可使用化学计量学和/或高级机器学习进行量化。例如，在三种分枝菌酸中，α分枝菌酸和甲氧基分枝菌酸的sers特征可能彼此更相似。因此，化学计量学方法可用于鉴定三种分枝菌酸的相对比例。
93.实施例4：商业和潜在应用
94.总之，本方法是一种无标签sers方法，可用于结核病诊断。本方法能够鉴定三种不同的分枝菌酸，即α分枝菌酸、酮基分枝菌酸、甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸，并评估疑似含有分枝杆菌的样品中存在的每种分枝菌酸的比例。三种分枝菌酸相对存在的比例可通过
分枝菌酸的sers信号强度确定，有助于区分致病性和非致病性分枝杆菌菌株。
95.本方法也适用于在不需要提取分枝菌酸的情况下鉴定γ辐照细菌。γ射线有助于灭活细菌，提高本方法的生物安全性，并使即时快速诊断分枝杆菌疾病成为可能。
96.虽然本发明已参照具体实施例进行了具体展示和描述，但本领域技术人员应理解，在不脱离所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的形式和细节进行各种更改。因此，本发明的范围由所附权利要求书表示，因此，在权利要求书的等效含义和范围内的所有变更均在本发明的范围内。