用于治疗癌症的组合物和方法与流程

用于治疗癌症的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求美国临时专利申请号62/839,376的优先权，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。


背景技术：

3.过继性细胞疗法(act)是一种将细胞从供体中取出、在体外培养和/或操作并且然后施用于患者以治疗疾病的治疗方法。在act中已使用多种细胞类型来试图治疗若干种类别的疾病。对于癌症的治疗，act通常涉及淋巴细胞(诸如嵌合抗原受体(car)t细胞)的转移。此类car t细胞的使用涉及识别car t细胞可以结合的肿瘤细胞上的抗原，但肿瘤异质性可使抗原识别具有挑战性。因此，仍然需要用于使用过继性细胞疗法治疗癌症的改进的方法。


技术实现要素：

4.本发明提供了可用于治疗癌症和/或可用于启动或调节免疫反应的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供细胞治疗剂(例如，免疫细胞)，其包含组成型表达构建体，所述组成型表达构建体包含与目标基因可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，本发明提供细胞治疗剂(例如，免疫细胞)，其包含(i)抗原结合受体，其中抗原结合受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域；和(ii)诱导型表达构建体，其包含与目标基因可操作地连接的启动子。除其他外，本发明涵盖以下认识：本文所述的细胞治疗剂和一种或多种额外疗法(例如，一种或多种额外细胞治疗剂(例如，自体car-t细胞、同种异体car-t细胞、car-nk细胞、tcr-t细胞、til细胞、同种异体nk细胞、自体nk细胞、γδt细胞、ipsc衍生细胞、骨髓细胞或其他合适的细胞治疗细胞类型)、抗体-药物缀合物、抗体和/或本文所述的多肽)的组合可以引起有益免疫反应(例如细胞反应(例如，t细胞活化))的改善的诱导。
5.在一些实施方案中，本公开提供治疗患有肿瘤的受试者的方法，其包括向受试者施用本文所述的细胞治疗剂和/或本文所述的蛋白质治疗剂。在一些实施方案中，方法还包括施用一种或多种额外疗法(例如，第二细胞治疗剂(例如，自体car-t细胞、同种异体car-t细胞、car-nk细胞、tcr-t细胞、til细胞、同种异体nk细胞、自体nk细胞、γδt细胞、ipsc衍生细胞、骨髓细胞或其他合适的细胞治疗细胞类型)、抗体-药物缀合物、抗体和/或本文所述的多肽)。
6.本发明的其他特征、目的和优点在以下具体实施方式中为清楚的。然而，应当理解，尽管具体实施方式指出了本发明的实施方案，但是仅以举例说明而非限制的方式给出。在本发明范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言根据具体实施方式将为清楚的。
附图说明
7.附图仅用于说明目的，而非限制。
8.图1是描绘示例性细胞治疗剂的示意图。
9.图2是描绘示例性“自扩增”细胞治疗剂的示意图，所述细胞治疗剂表达抗原结合受体，所述抗原结合受体不包含导致杀伤诱导的信号传导结构域，并且确实包含足以诱导基因转录的信号传导结构域；并且所述细胞治疗剂还编码诱导型scfv-cd19融合蛋白和靶向cd19的诱导型car(左)或组成型表达的car(右)。
10.图3描绘了来自多突变体库的cd19变体的序列。指出了许多变体在各个位置处的氨基酸。下表提供了从设计到分选群的频率的相对变化。
11.图4a是cd19的细胞外结构域的带状图，突出显示了产生结合配体的多样性潜在区域。橙色：ig结构域1环；蓝色：ig结构域2环；红色：ig结构域2折叠。图4b描绘了示例性变体设计的表格。
12.图5a描绘了示例性cd19变体。指出了许多克隆在各个位置处的氨基酸。下表提供了从设计到分选群的频率的相对变化。
13.图5b描绘了示例性cd19变体。指出了许多克隆在各个位置处的氨基酸。下表提供了从设计到分选群的频率的相对变化。
14.图5c描绘了其他示例性cd19变体。指出了许多克隆在各个位置处的氨基酸。
15.图5d描绘了示例性cd19变体。指出了许多克隆在各个位置处的氨基酸。
16.图6描绘了示例性cd19变体。指出了许多克隆在各个位置处的氨基酸。
17.图7描绘了双互补位融合蛋白的结合。
18.图8a和8b描绘了cd19-scfv蛋白的细胞毒性。
19.图9描绘了纯化的双互补位融合蛋白的细胞毒性。
20.图10描绘了纯化的双互补位融合蛋白的细胞毒性。
21.图11描绘了纯化的双互补位融合蛋白的细胞毒性。
22.图12描绘了组成型表达的双互补位融合蛋白的细胞毒性。
23.图13描绘了组成型表达的双互补位融合蛋白的细胞毒性。
24.图14描绘了纯化的双互补位融合蛋白的结合。
25.图15描绘了纯化的双互补位融合蛋白的细胞毒性。
26.图16a-16c证明了具有和不具有his标签的双互补位融合蛋白的等效性。
27.图17证明了具有和不具有his标签的组成型表达的双互补位融合蛋白的细胞毒性等效性。
28.图18证明了具有和不具有his标签的组成型表达的双互补位融合蛋白的体内细胞毒性等效性。
29.图19证明了双互补位融合蛋白结合clec12a的多个不同等位基因的能力。
30.图20描绘了双抗原融合蛋白的结合。
31.图21a和21b描绘了双抗原融合蛋白的细胞毒性。
32.定义
33.为了使本发明更容易理解，下文首先定义了某些术语。以下术语和其他术语的额外定义在整个说明书中阐述。
34.施用：如本文所用，术语“施用”是指向受试者或系统施用组合物。向动物受试者(例如，人)施用可以通过任何适当的路径进行。例如，在一些实施方案中，可以经支气管(包括通过支气管滴注)、颊、肠、皮间、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、脑室内、特定器官内(例如，肝内)、粘膜、鼻、口、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、透皮、阴道和玻璃体施用。在一些实施方案中，可以经瘤内或瘤周施用。在一些实施方案中，施用可涉及间歇给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少选定的时间段。
35.过继性细胞疗法：如本文所用，“过继性细胞疗法”或“act”涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移至癌症患者中。在一些实施方案中，act是一种治疗方法，其涉及使用具有抗肿瘤活性的淋巴细胞、将这些细胞体外扩增至大量并将它们输注到荷癌宿主中。
36.剂：如本文所用，术语“剂”可以指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属或其组合。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，剂可以是或包含细胞或生物体、或者其级分、提取物或组分。在一些实施方案中，剂是或包含天然产物，因为剂存在于和/或得自自然界中。在一些实施方案中，剂是或包含一个或多个人造实体，因为剂是通过人手动操作来设计、工程化和/或产生的，和/或不存在于自然界中的。在一些实施方案中，剂可以以分离的或纯的形式使用；在一些实施方案中，剂可以以粗制的形式使用。在一些实施方案中，潜在的剂作为集合或库提供，例如可以被筛选以鉴定或表征它们中的活性剂。可根据本发明使用的剂的一些具体实施方案包括小分子、抗体、抗体片段、适体、核酸(例如，sirna、shrna、dna/rna杂合体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施方案中，剂是或包含聚合物。在一些实施方案中，剂不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物。在一些实施方案中，剂含有至少一个聚合部分。在一些实施方案中，剂缺少或基本上不含任何聚合部分。
37.改善：如本文所用，“改善”是指对一种状态的预防、减轻和/或缓解，或对受试者状态的改善。改善包括但不要求完全恢复或完全预防疾病、病症或病状。
38.氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可被并入到多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构h2n
–
c(h)(r)
–
cooh。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成的氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常存在于天然存在的肽中的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是得自天然来源的。如本文所用，“合成的氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，其包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代物。氨基酸(包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或使用其他化学基团的取代来修饰，其可改变肽的循环半衰期而不对它们的活性产生不利影响。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可包含一种或多种翻译后修饰，诸如与一种或多种化学实体(例如，甲基、乙酸基、乙酰基、磷酸基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文中可以清楚它是指游离氨基酸还是肽的残基。
39.抗体：如本文所用，术语“抗体”是指包含足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的
经典免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，自然界产生的完整抗体是大约150kd的四聚体剂，其由两个相同的重链多肽(每个约50kd)和两个相同的轻链多肽(每个约25kd)组成，所述重链多肽和轻链多肽彼此缔合成通常称为“y形”结构的结构。每条重链由至少四个结构域(每个结构域长约110个氨基酸)组成，所述结构域为氨基末端可变(vh)结构域(位于y结构的尖端)，然后三个恒定结构域：ch1、ch2和羧基末端的ch3(位于y的茎的基部)。称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将ch2和ch3结构域连接至抗体的其余部分。此铰链区中的两个二硫键将完整抗体中的两个重链多肽彼此连接起来。每条轻链由两个结构域组成，所述结构域为一个氨基末端可变(vl)结构域，然后一个羧基末端恒定(cl)结构域，两个结构域通过另一个“开关”彼此分隔。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成，其中所述重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接起来，使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也被糖基化，通常在ch2结构域上。天然抗体中的每个结构域都具有特征为“免疫球蛋白折叠”的结构，所述“免疫球蛋白折叠”由两个β折叠(例如，3-、4-或5-链折叠)彼此填充在压缩的反平行β桶中而形成。每个可变结构域都含有称为“互补决定区”的三个超变环(cdr1、cdr2和cdr3)和四个稍微不变的“框架”区(fr1、fr2、fr3和fr4)。当天然抗体折叠时，fr区形成了为结构域提供结构框架的β折叠，并且来自重链和轻链的cdr环区域在三维空间中聚集在一起，使得它们形成位于y结构的顶端的单个超变抗原结合位点。天然存在的抗体的fc区域与补体系统的元件结合，并且也与效应细胞上的受体结合，所述效应细胞包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域已知的，fc区域对fc受体的亲和力和/或其他结合属性可以通过糖基化或其他修饰来调节。在一些实施方案中，根据本公开产生和/或利用的抗体包含糖基化的fc结构域，其包括具有此类修饰或工程化的糖基化的fc结构域。出于本公开的目的，在某些实施方案中，包含如天然抗体中存在的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物均可称为和/或用作“抗体”，无论此类多肽是天然产生的(例如，由生物体对抗原作出反应而产生)还是通过重组工程化、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，抗体是多克隆的；在一些实施方案中，抗体是单克隆的。在一些实施方案中，抗体具有小鼠、兔、灵长类动物或人抗体所特有的恒定区序列。在一些实施方案中，如本领域已知的，抗体序列元件全部是人的或人源化的、灵长类化的、嵌合的等。此外，如本文所用，术语“抗体”在适当的实施方案(除非另有说明或从上下文可以清楚地看出)中可指在替代方案说明中利用抗体结构和功能特征的任何本领域已知或开发的构建体或形式。例如，在一些实施方案中，根据本公开利用的抗体的形式选自但不限于：完整的igg、ige和igm、双特异性抗体或多特异性抗体(例如，等)、双互补位抗体或多互补位抗体、单链fv、多肽fc融合物、fab、骆驼抗体(camelid antibody)、掩蔽抗体(masked antibody)(例如，)、小型模块化免疫药物(“smipstm”)、单链或串联双抗体vhh、微型抗体、锚蛋白重复蛋白或dart、tcr样抗体、dart、tcr样抗体、微蛋白、微蛋白、和在一些实施方案中，抗体可能缺少在天然产生时具有的共价修饰(例如，
聚糖的附接)。在一些实施方案中，抗体可含有共价修饰(例如，聚糖、有效载荷(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)或其他侧基(例如，聚乙二醇等)的附接)。
40.抗体依赖性细胞毒性：如本文所用，术语“抗体依赖性细胞毒性”或“adcc”是指被抗体结合的靶细胞被免疫效应细胞杀伤的现象。不希望受任何特定理论的束缚，adcc通常被理解为涉及能够识别并随后杀伤抗体包被的靶细胞(例如，在表面上表达与抗体结合的特异性抗原的细胞)的荷fc受体(fcr)效应细胞。介导adcc的效应细胞可包括免疫细胞，其包括但不限于自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞中的一种或多种。
41.抗体片段：如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如像抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；三抗体；四抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，抗体片段包括分离的片段、“fv”片段(由重链和轻链的可变区组成)、轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scfv蛋白”)、由抗体重链的可变区组成的重组单结构域抗体(例如，vhh)和由模拟超变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，重链可变区(vh)的超变区、轻链可变区(vl)的超变区、vh内的一个或多个cdr结构域和/或vl内的一个或多个cdr结构域)。在许多实施方案中，抗体片段含有足够的亲本抗体序列，所述抗体片段是结合与亲本抗体结合的抗原相同的抗原的片段；在一些实施方案中，片段以与亲本抗体相当的亲和力结合抗原和/或与亲本抗体竞争结合抗原。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、scfv片段、fv片段、dsfv双抗体、dab片段、fd'片段、fd片段、重链可变区和分离的互补决定区(cdr)。抗体的抗原结合片段可以通过任何方式产生。例如，抗体的抗原结合片段可以通过使完整抗体片段化来以酶促或化学方式产生和/或可以由编码部分抗体序列的基因以重组方式产生。或者或另外，抗体的抗原结合片段可以完全地或部分地以合成方式产生。抗体的抗原结合片段可任选地包含单链抗体片段。或者或另外，抗体的抗原结合片段可包含例如通过二硫键联连接在一起的多条链。抗体的抗原结合片段可任选地包含多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸并且更通常包含至少约200个氨基酸。
42.抗原：如本文所用，术语“抗原”是指引发免疫反应的剂；和/或与t细胞受体(例如，当由mhc分子呈递时)或与抗体或抗体片段结合的剂。在一些实施方案中，抗原引发体液反应(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；在一些实施方案中，抗原引发细胞反应(例如，涉及t细胞，其受体与抗原特异性相互作用)。在一些实施方案中，抗原结合抗体并且可以诱导或不诱导生物体中的特定生理反应。一般而言，抗原可以是或包括任何化学实体，例如像小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施方案中除了生物聚合物(例如，除了核酸或氨基酸聚合物))等。在一些实施方案中，抗原是或包含多肽。在一些实施方案中，抗原是或包含聚糖。本领域普通技术人员将理解，一般而言，抗原可以以分离的或纯的形式提供，或者可以以粗制的形式提供(例如，与其他材料一起，例如在含抗原来源的提取物诸如细胞提取物或其他相对粗制的制剂中)，或者或可存在于细胞上或细胞内。在一些实施方案中，抗原是重组抗原。
43.抗原呈递细胞：如本文所用，短语“抗原呈递细胞”或“apc”具有本领域理解的含义，是指加工抗原并将抗原呈递至t细胞的细胞。示例性apc包括树突细胞、巨噬细胞、b细
胞、某些活化的上皮细胞和能够进行tcr刺激和适当t细胞共刺激的其他细胞类型。
44.大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”当应用于一个或多个目标值时，是指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外可从上下文中明显看出，否则术语“大约”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围(除非此类数值将超过可能值的100％)。
45.结合：应当理解，如本文所用，术语“结合”通常是指两个或更多个实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及通过与一个或多个中间实体的物理接触进行物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合可通常在多种环境中的任一种环境中被评估，所述环境包括单独或在更复杂系统的环境中研究相互作用的实体或部分(例如，当与载体实体以共价方式或以其他方式缔合和/或在生物系统或细胞中时)。
46.癌症：术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中可互换使用，是指细胞表现出相对反常的、不受控制的和/或自主的生长，使得其表现出特征为显著失控的细胞增殖的异常生长表型。一般而言，本技术中用于检测或治疗的目标细胞包括癌前(例如，良性)细胞、恶性细胞、转移前细胞、转移性细胞和非转移性细胞。本公开的教义可以与任何和所有癌症相关。略举数例非限制性的实例，在一些实施方案中，本公开的教义被应用于一种或多种癌症，例如像造血癌症(包括白血病(t细胞、b细胞和骨髓的)、淋巴瘤(霍奇金(hodgkins)淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤、骨髓增生性病症)、肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、实体组织癌、鳞状细胞癌(口腔、咽喉、喉和肺)、肝癌、泌尿生殖癌症(诸如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌以及肾细胞癌)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、头颈癌、乳腺癌、胃肠道癌症和神经系统癌症、良性病变(诸如乳头状瘤)等。
47.嵌合抗原受体：如本文所用，“嵌合抗原受体”或“car”或“cars”是指工程化的受体，其将抗原特异性移植到细胞(例如，t细胞，诸如幼稚t细胞、中枢记忆性t细胞、效应记忆性t细胞或其组合)上。car也称为人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体。在一些实施方案中，car包含抗原特异性靶向区、细胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，car包含多于一个抗原特异性靶向区、细胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。例如，car可能具有双特异性抗原靶向区，从而识别两个不同的抗原。
48.组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，两种或更多种剂可以同时施用；在一些实施方案中，此类剂可以依次施用；在一些实施方案中，此类剂以重叠的给药方案施用。
49.结构域：术语“结构域”在本文中用于指实体的区段或部分。在一些实施方案中，“结构域”与实体的特定结构特征和/或功能特征相关联，使得当结构域与亲本实体的其余部分物理分离时，结构域基本上或完全保留特定结构特征和/或功能特征。或者或另外，结构域可以是或包括实体的一部分，当与(亲本)实体分离并与不同的(接受者)实体连接时，所述结构域基本上保留和/或赋予接受者实体其在亲本实体中表征的一个或多个结构特征
和/或功能特征。在一些实施方案中，结构域是分子的区段或部分(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸或多肽)。在一些实施方案中，结构域是多肽的区段；在一些此类实施方案中，结构域的特征在于特定的结构元件(例如，特定的氨基酸序列或序列基序、α螺旋特征、β折叠特征、卷曲螺旋特征、随机螺旋特征等)和/或在于特定的功能特征(例如，结合活性、酶活性、折叠活性、信号传导活性等)。
50.剂型：如本文所用，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的治疗剂的物理离散单位。每个单位含有预定量的活性物质，据计算可产生所需治疗效果。然而，应理解组合物的总剂量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。
51.给药方案：如本文所用，术语“给药方案”是指单独施用于受试者、通常以时间段分开的一组单位剂量(通常多于一个)。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可以涉及一次或多次给药。在一些实施方案中，给药方案包括多次给药，每次给药彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施方案中，给药方案包括多次给药以及至少两个不同时间段间隔开的单次给药。在一些实施方案中，给药方案内的所有给药具有相同的单位剂量量。在一些实施方案中，给药方案内的不同给药具有不同的量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一次给药，随后是与第一剂量量b不同的第二剂量量的一次或多次额外给药。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一次给药，随后是与第一剂量量相同的第二剂量量的一次或多次额外给药。在一些实施方案中，当跨相关人群施用时，给药方案与期望的或有益的结果相关(即，是治疗性给药方案)。
52.效应子功能：如本文所用，“效应子功能”是指由抗体fc区域与fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)和补体介导的细胞毒性(cmc)。在一些实施方案中，效应子功能是在抗原结合后起作用的功能或独立于抗原结合而起作用的功能或两者功能。
53.效应细胞：如本文所用，“效应细胞”是指表达一种或多种fc受体并介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。在一些实施方案中，效应细胞可包括但可不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(langerhans'cell)、自然杀伤(nk)细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞中的一种或多种并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
54.表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一种或多种：(1)从dna序列产生rna模板(例如，通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)将rna翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
55.细胞外结构域：如本文所用，“细胞外结构域”(或“ecd”)是指延伸超出跨膜结构域进入细胞外空间的多肽的一部分。
56.融合蛋白：如本文所用，术语“融合蛋白”通常是指包含至少两个区段的多肽，每个区段都显示出与肽部分的高度氨基酸同一性，所述肽部分(1)天然存在，且/或(2)代表多肽的功能性结构域。通常，如果所述两个区段是如下的部分，则含有至少两个此类区段的多肽被认为是融合蛋白：(1)未天然包含在同一肽中，且/或(2)先前未与单个多肽中的另一个区段连接，且/或(3)通过人手动操作而相互连接的部分。
57.基因：如本文所用，术语“基因”具有本领域所理解的含义。本领域普通技术人员将
理解，术语“基因”可包含基因调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。还应理解，基因的定义包括对不编码蛋白质而是编码功能性rna分子(诸如trna、rnai诱导剂等)的核酸的提及。为了清楚起见，注意到，如本技术中所用的，术语“基因”通常是指编码蛋白质的核酸的一部分；所述术语可以任选地涵盖调控序列，如本领域普通技术人员根据上下文将是清楚的。此定义并不意欲排除术语“基因”对非蛋白质编码表达单元的应用，而是要澄清，在大多数情况下，如本文件中使用的所述术语是指蛋白质编码核酸。
58.基因产物或表达产物：如本文所用，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因转录的rna(加工前和/或加工后)或由从基因转录的rna编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
59.免疫反应：如本文所用，术语“免疫反应”是指在动物中引发的反应。免疫反应可以指细胞免疫、体液免疫或者可能涉及两者。免疫反应也可仅限于免疫系统的一部分。例如，在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导增加的ifnγ反应。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导粘膜iga反应(例如，如在鼻腔和/或直肠冲洗液中测量的)。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导全身性igg反应(例如，如在血清中测量的)。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导病毒中和抗体或中和抗体反应。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导t细胞的细胞溶解(ctl)反应。
60.提高、增加或减少：如本文所用，术语“提高”、“增加”或“减少”或语法等义词表示相对于基线测量值(诸如在本文所述的治疗开始之前在同一个体中的测量值，或在没有本文所述的治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量值)的值。
61.个体、受试者或患者：如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”是指人或非人哺乳动物受试者。被治疗的个体(也称为“患者”或“受试者”)是罹患疾病(例如，癌症)的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人)。在一些实施方案中，所述受试者是人。
62.接头：如本文所用，术语“接头”是指例如在融合蛋白中不同于出现在天然蛋白中特定位置的氨基酸序列的具有适当长度的氨基酸序列且通常被设计为柔性的且/或在两个蛋白质部分之间插入结构(诸如α螺旋)。一般而言，接头使得融合蛋白的两个或更多个结构域保留每个结构域的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多生物活性。接头也可称为间隔物。
63.掩蔽部分：如本文所用，“掩蔽部分”是指当与本文所述的抗原结合蛋白连接时能够掩蔽此类抗原结合部分与其靶抗原的结合的分子部分。包含此种掩蔽部分的抗原结合蛋白在本文中称为“掩蔽的”抗原结合蛋白。
64.核酸：如本文所用，“核酸”在其最广泛的意义上是指并入或可并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键联并入或可并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包括rna；在一些实施方案中，“核酸”是或包括dna。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基，包含所述残基，或由所述残基组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核酸类似物，包含所述类似物，或由所述类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个“肽核酸”，包含所述肽核酸，或由所
述肽核酸组成，所述肽核酸是本领域已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，所述核酸被认为在本发明的范围内。或者或另外，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-n-亚磷酰胺键联，而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包含所述天然核苷，或由所述天然核苷组成。在一些实施方案中，核酸是一种或多种核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基及其组合)，包含所述类似物，或由所述类似物组成。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个与天然核酸中的糖相比修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物诸如rna或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸可以通过以下的一种或多种方法来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合进行酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中复制以及化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是单链的；在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或是编码多肽的序列的补体。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。
65.可操作地连接的：如本文所用，“可操作地连接的”是指并置，其中所述组分所处于的关系允许其以预期的方式起作用。与一种或多种编码序列“可操作地连接的”的控制序列是以一种方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现一种或多种编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与目标基因相邻的表达控制序列和反式或在远处起作用以控制目标基因的表达控制序列两者。如本文所用，术语“表达控制序列”是指影响与多核苷酸序列连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包含适当的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；高效的rna加工信号，诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即kozak共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，提高蛋白质分泌的序列。此种控制序列的性质因宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列通常包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，此类控制序列通常包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包含自身的存在对于表达和加工必不可少的组分，并且还可以包含自身的存在是有利的额外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
66.互补位：如本文所用，术语“互补位”是指结合抗原表位的抗原结合多肽(例如，抗体)的一部分。如本文所用，术语“双互补位”(在本文所述的抗体、构建体或融合蛋白的情况下)是指包含两个互补位的抗体或构建体，每个互补位结合单一抗原上的不同表位。如本文所用，术语“多互补位”(在本文所述的抗体或构建体的情况下)是指包含两个或更多个互补位的抗体或构建体，每个互补位结合单一抗原上的不同表位。在一些实施方案中，本文所述
的多互补位抗体或融合蛋白的两个或更多个互补位结合单一抗原上的非重叠表位。在一些实施方案中，本文所述的多互补位抗体或融合蛋白的两个或更多个互补位结合单一抗原上的两个表位，所述两个表位可共享1、2或3个氨基酸。
67.患者：如本文所用，术语“患者”是指例如出于实验、诊断、预防、美容和/或治疗的目的而施用或可施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，患者罹患或易患一种或多种病症或病状。在一些实施方案中，患者表现出病症或病状的一种或多种症状。在一些实施方案中，患者已被诊断为患有一种或多种病症或病状。在一些实施方案中，所述病症或病状是或包括癌症，或一种或多种肿瘤的存在。在一些实施方案中，所述患者正在接受或已经接受某些疗法以诊断和/或治疗疾病、病症或病状。
68.肽：如本文所用，术语“肽”是指通常相对较短的多肽，例如长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸。
69.药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症并且与合理的效益/风险比率相称的物质。
70.多肽：如本文所用，“多肽”一般来说是至少两个通过肽键彼此附接的氨基酸的串。在一些实施方案中，多肽可以包含至少3-5个氨基酸，每个氨基酸通过至少一个肽键附接至其他氨基酸。本领域普通技术人员将理解，多肽有时包含“非天然”氨基酸或仍能够任选地整合到多肽链中的其他实体。
71.启动子：如本文所用，“启动子”是被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的dna序列。“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。“诱导型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞中存在启动子特异性诱导物时才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
72.蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，至少两个通过肽键彼此连接的氨基酸的串)。蛋白质可以包含除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)且/或可以其他方式加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其一部分。普通技术人员将理解，蛋白质有时可包含多于一条多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合。多肽可含有l-氨基酸、d-氨基酸或两者并且可含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。
73.参考：如本文所用，“参考”描述了标准或对照，比较是相对于所述标准或对照进行的。例如，在一些实施方案中，将目标的剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照的剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，在进行目标测试或测定的情况下基本上地同时对参考或对照进行测试和/或测定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。如本领域技术人员将理解的，通常对参考或对照进行测定或表征的条件或情况相当于评估者。本领域技术人员将理解何时存在足够
的相似性来证明对特定可能的参考或对照的依赖和/或比较。
74.实体瘤：如本文所用，术语“实体瘤”是指通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等。
75.癌症分期：如本文所用，术语“癌症分期”是指对癌症进展水平的定性或定量评估。用于确定癌症分期的标准包括但不限于肿瘤的大小和转移的程度(例如，局部的或远处的)。
76.受试者：“受试者”意指哺乳动物(例如，人，在一些实施方案中包括产前人的形式)。在一些实施方案中，受试者罹患相关疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状或特征。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或病状的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是具有疾病、病症或病状的易感性所特有的一个或多个特征或者患有疾病、病症或病状的风险的人。在一些实施方案中，受试者为患者。在一些实施方案中，受试者是被施用和/或已被施用诊断和/或治疗的个体。
77.罹患：“罹患”疾病、病症或病状(例如，癌症)的个体已被诊断出和/或表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状。
78.症状得到减轻：根据本发明，当特定疾病、病症或病状的一种或多种症状的幅度(例如，强度、严重性等)或频率减小时，“症状得到减轻”。为了清楚起见，特定症状发作的延迟被认为是该症状的频率减小的一种形式。这并不意味着本发明仅限于消除症状的情况。本发明特别考虑了使得一种或多种症状得到减轻(并且受试者的病状因此得到“改善”)，尽管并未完全消除的治疗。
79.t细胞受体：如本文所用，“t细胞受体”或“tcr”是指存在于t细胞表面上的抗原识别分子。在正常t细胞发育期间，四种tcr基因α、β、γ和δ中的每一种都能够重新排列，从而产生高度多样化的tcr蛋白。
80.治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”通常是指当施用至生物体时引起所需药理学效应的任何剂。在一些实施方案中，如果剂在整个适当的群体中表现出统计学显著的效应，则所述剂被认为是治疗剂。在一些实施方案中，适当的群体可以是模式生物体群体。在一些实施方案中，适当的群体可以根据各种标准定义，诸如某个年龄组、性别、遗传背景、先前存在的临床条件等。在一些实施方案中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的物质。在一些实施方案中，“治疗剂”是在可上市用于施用于人之前已经或需要由政府机构批准的剂。在一些实施方案中，“治疗剂”是需要医学处方才能施用于人的剂。
81.治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当根据治疗给药方案施用于罹患或易患疾病、病症和/或病状的群体时，足以治疗所述疾病、病症和/或病状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是减小疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的发生率和/或严重性、稳定其一种或多种特征和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上并不需要在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是当施用于需要此类治疗的患者时，在极大量受试者中提供特定所需药理学反应的量。例如，在一些实施方案中，“治疗有效量”是指当在使用发明的疗法的情况下施用于有需要的个体时，将阻
断、稳定、减弱或逆转在所述个体中发生的癌症支持过程，或者将增强或增加所述个体中的癌症抑制过程的量。在癌症治疗的情况下，“治疗有效量”是当施用于被诊断患有癌症的个体时，将预防、稳定、抑制或减少个体中癌症的进一步发展的量。本文所述组合物的特别优选的“治疗有效量”逆转(在治疗性治疗中)恶性肿瘤诸如胰腺癌的发展或者帮助实现或延长恶性肿瘤的缓解。施用于个体以治疗该个体中的癌症的治疗有效量可以与被施用来促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。与大多数癌症疗法一样，本文所述的治疗方法不应被解释为、局限于或以其他方式限于癌症的“治愈”；相反，治疗方法涉及使用所述组合物“治疗”癌症，即对患有癌症的个体的健康产生期望的或有益的改变。此类益处已被肿瘤学领域的熟练医疗保健提供者所认可，并且包括但不限于患者病状的稳定、肿瘤大小的减小(肿瘤消退)、生命功能的改善(例如，癌组织或器官的功能的改善)、进一步转移的减少或抑制、机会性感染的减少、生存能力的增加、疼痛的减少、运动功能的改善、认知功能的改善、能量感的改善(活力、不适减少)、幸福感的改善、正常食欲的恢复、健康体重增加的恢复及其组合。此外，还可以通过从肿瘤部位诸如胰腺癌(例如，在治疗过程中)采集癌细胞样品并测试癌细胞的代谢和信号标记物水平以监测癌细胞的状态以在分子水平上证实癌细胞退化到恶性程度较低的表型来评估个体中特定肿瘤的消退(例如，作为本文所述治疗的结果)。例如，通过采用本发明的方法诱导的肿瘤消退将通过发现一种或多种促血管生成标记物的减少、抗血管生成标记物的增加、在诊断患有癌症的个体中表现出异常活动的代谢途径、细胞间信号传导途径或细胞内信号传导途径的正常化(即，朝向存在于未罹患癌症的正常个体中的状态的改变)来表明。本领域普通技术人员将理解，在一些实施方案中，治疗有效量可以以单一剂量配制和/或施用。在一些实施方案中，治疗有效量可以以多个剂量配制和/或施用，例如，作为给药方案的一部分。在细胞治疗剂的情况下，治疗有效剂量可取决于多种变量，包括用于产生细胞治疗剂的患者细胞的状态、随后施用于患者的细胞剂量、在注射后和随着时间推移在患者体内的那些注射细胞的扩增和持久性、肿瘤抗原负荷、预处理淋巴细胞清除的程度以及其他已知和未知的因素。
82.转化：如本文所用，“转化”是指将外源dna或rna引入到宿主细胞中的任何过程。可以使用本领域内熟知的各种方法在自然或人工条件下进行转化。转化可依赖于将外源核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。在一些实施方案中，特定转化方法是基于被转化的宿主细胞来选择的，并且可包括但不限于病毒感染“转导”和转染技术，例如电穿孔和脂质转染。在一些实施方案中，“转化的”细胞被稳定转化，使得插入的dna能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。在一些实施方案中，转化的细胞在有限时间段内瞬时表达引入的核酸。在一些实施方案中，“转化的”细胞被转化，使得插入的dna或rna是转座子或转座元件。
83.治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状(例如，癌症)的一种或多种症状、特征和/或诱因、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的物质的任何施用。此类治疗可以针对不表现出相关疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或针对仅表现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者。或者或另外，此类治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定迹象的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已被诊断为罹患相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，
治疗可以针对已知具有在统计学上与相关疾病、病症和/或病状的发展的风险增加相关的一种或多种易感因素的受试者。
84.肿瘤浸润淋巴细胞：如本文所用，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”(til或tils)是指患有癌症(例如，黑色素瘤)的受试者的白细胞，其已离开血流并已迁移到肿瘤中。在一些实施方案中，肿瘤浸润淋巴细胞具有肿瘤特异性。
85.载体：如本文所用，“载体”是指能够转运另一个与其缔合的核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞诸如真核和/或原核细胞中进行染色体外复制和/或表达与其连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。
具体实施方式
86.本公开至少部分基于此发现：双互补位融合蛋白(例如，包含抗cll-1scfv、抗cll-1vhh和cd19变体的双互补位融合蛋白)不仅与cll-1结合，而且导致car-cd19介导的细胞毒性水平惊人地高于使用包含抗cll-1scfv/cd19变体的相应融合蛋白或包含抗cll-1vhh/cd19变体的相应融合蛋白产生的细胞毒性水平。除其他外，本公开提供了可用于治疗癌症的方法和组合物。具体地，本公开提供了细胞治疗剂，例如基因修饰成具有整合基因的免疫细胞，所述整合基因例如编码本文所述的一种或多种双互补位融合蛋白的核苷酸序列(例如，包含此类核苷酸序列的组成型表达构建体和/或诱导型表达构建体)。在一些实施方案中，如本文所述，编码本文所述的双互补位融合蛋白的核苷酸序列的表达可通过适当选择、构建和/或设计与此类核苷酸序列可操作地连接的表达的启动子序列来设计成组成型的或诱导型的。在组成型表达构建体的情况下，构建体中的基因被组成型地表达。在诱导型表达构建体的情况下，细胞治疗剂可被基因修饰成具有编码抗原结合受体的核酸并具有诱导型表达构建体。在结合靶抗原后，细胞治疗剂的抗原结合受体诱导在诱导型表达构建体中包含的基因的表达，例如，如图1所示。在某些实施方案中，此类基因的表达促进和/或改善对癌症的治疗，例如通过一种或多种细胞疗法。本公开还具体地公开了蛋白质治疗剂，其包含由此类基因编码的双互补位融合蛋白(例如，此类基因产物的可溶形式，例如用于施用的包含此类蛋白质的药物组合物)和编码此类双互补位融合蛋白的核酸，诸如用于基因治疗。
87.组成型表达构建体
88.在一些实施方案中，本公开包括组成型表达构建体。在一些实施方案中，组成型表达构建体包含核酸序列，其包含至少与编码本文所述的双互补位融合蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动子。组成型表达构建体可包含调控序列，诸如转录以及翻译起始和终止密码子。在一些实施方案中，此类调控序列对在适当时引入非诱导型表达构建体的细胞类型具有特异性。组成型表达构建体可以包含与编码双互补位融合蛋白的核苷酸序列可操作地连接的天然或非天然启动子。优选地，所述启动子在免疫细胞中是有功能的。
89.示例性启动子包括例如cmv、e1f、vav、tcrvβ、mcsv和pgk启动子。核苷酸序列与启动子的可操作连接是在技术人员的技能范围内。在一些实施方案中，组成型表达构建体是或包括本文所述的重组表达载体。
90.诱导型表达构建体和诱导型表达
91.对于诱导型表达，本公开的细胞治疗剂可以包括(i)一种或多种类型的抗原结合
受体，其包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内(或细胞质)结构域，以及(ii)诱导型表达构建体。
92.抗原结合受体
93.抗原结合受体的细胞外结构域包含靶特异性抗原结合结构域。抗原结合受体的细胞内结构域(或细胞质结构域)包含信号传导结构域。信号传导结构域包含氨基酸序列，其在靶抗原与抗原结合结构域结合后启动和/或介导细胞内信号传导途径，这可以活化除其他之外的本文所述的诱导型表达构建体，从而使得诱导型基因被表达。在一些实施方案中，信号传导结构域还包含活化一种或多种免疫细胞效应子功能(例如，天然免疫细胞效应子功能)的一种或多种额外信号传导区(例如，共刺激信号传导区)。在一些实施方案中，信号传导结构域活化t细胞活化、增殖、存活或其他t细胞功能，但不诱导细胞毒活性。在一些实施方案中，抗原结合受体包含整个嵌合抗原受体(car)或其一部分。此类car是本领域已知的(参见例如gill等人,immunol.rev.263:68-89(2015)；stauss等人,curr.opin.pharmacol.24:113-118(2015))。
94.抗原结合结构域
95.抗原结合结构域可以是或包含与靶抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)特异性结合的任一多肽。例如，在一些实施方案中，抗原结合结构域包含本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、scfv片段、fv片段、dsfv双抗体、dab片段、fd'片段、fd片段、分离的互补决定区(cdr)、骆驼抗体、掩蔽抗体(例如，)、单链或串联双抗体vhh、单结构域抗体(例如，)、锚蛋白重复蛋白或蛋白或或)。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合结构域是ph敏感性结构域(参见例如schroter等人,mabs 7:138-51(2015))。在一些实施方案中，多肽(例如，本文所述的cd19或cd19变体)可以被工程化以作为抗原结合结构域起作用。
96.抗原结合结构域可以基于例如存在于靶细胞表面上或附近的靶抗原的类型和数量来选择。例如，可以选择抗原结合结构域来识别在与特定疾病状态相关的靶细胞上充当细胞表面标记物的抗原。在一些实施方案中，选择抗原结合结构域以特异性结合肿瘤细胞上的抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，并且在一些实施方案中，其引发免疫反应，例如t细胞介导的抗肿瘤免疫反应。抗原结合结构域的选择可取决于例如待治疗的癌症的具体类型。
97.跨膜结构域
98.一般而言，如本文所用，“跨膜结构域”是指具有存在于膜中的属性的结构域(例如，跨越一部分或整个细胞膜)。应当理解，不需要跨膜结构域中的每个氨基酸都存在于膜中。例如，在一些实施方案中，跨膜结构域的特征在于蛋白质的指定片段或一部分基本上位于膜中。如本领域熟知的，可以使用多种算法分析氨基酸或核酸序列以预测蛋白质亚细胞定位(例如，跨膜定位)。除其他外，示例性此类程序包括psort(psort.org)、prosite(prosite.expasy.org)。
99.本文所述的抗原结合受体中包含的跨膜结构域的类型不限于任何特定类型。在一
些实施方案中，选择与抗原结合结构域和/或细胞内结构域天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域包含一个或多个氨基酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)，例如以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
100.跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。示例性跨膜区可源自t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd27、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、tnfsfr25或cd154(例如，可包含其至少一个跨膜区)。或者，跨膜结构域可以是合成的(并且可以例如主要包含疏水性残基诸如亮氨酸和缬氨酸)。在一些实施方案中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体包含在合成跨膜结构域的每个末端处。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞质结构域直接连接。在一些实施方案中，较短的寡核苷酸或多肽接头(例如，长度在2与10个氨基酸之间)可以在跨膜结构域与细胞内结构域之间形成键联。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
101.细胞质结构域
102.细胞内结构域(或细胞质结构域)包含信号传导结构域，其在靶抗原与抗原结合结构域结合后启动和/或介导细胞内信号传导途径，这诱导了本文所述的诱导型表达构建体的表达。
103.在抗原与免疫细胞结合后可以转导信号的细胞内信号传导结构域是已知的，其中任何一个都可以在本文中使用。例如，已知t细胞受体(tcr)的细胞质序列在tcr与抗原结合后启动信号转导(参见例如brownlie等人,nature rev.immunol.13:257-269(2013))。在一些实施方案中，信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。含有细胞质信号传导序列的itam的实例包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些(参见例如love等人,cold spring harb.perspect.biol.2:a002485(2010)；smith-garvin等人,annu.rev.immunol.27:591-619(2009))。
104.在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域不包含转导信号从而导致t细胞(例如，cd8

t细胞)杀伤的序列。例如，已知tcr细胞质序列活化许多信号传导途径，其中一些导致杀伤(参见例如smith-garvin等人,annu.rev.immunol.27:591-619(2009))。在一些实施方案中，细胞内结构域包含导致信号转导的信号传导结构域，所述信号转导介导诱导型表达构建体的表达，但不诱导杀伤(例如，如图2中所示例的)。例如，细胞质结构域可包含pdgf受体的细胞质部分，并且在抗原被抗原结合结构域结合后，细胞质结构域可产生诱导诱导型表达构建体的启动子的细胞内信号。本领域技术人员可以基于本领域的知识选择将包含在诱导型表达构建体中的细胞内结构域和同源启动子。
105.已知通过单独的tcr产生的信号不足以完全活化t细胞并且还需要第二或共刺激信号。因此，在一些实施方案中，信号传导结构域还包含活化一种或多种免疫细胞效应子功能(例如，本文所述的天然免疫细胞效应子功能)的一个或多个额外信号传导区(例如，共刺激信号传导区)。在一些实施方案中，可以使用此类共刺激信号传导区的一部分，只要所述部分转导效应子功能信号。在一些实施方案中，本文所述的细胞质结构域包含t细胞共受体(或其片段)的一个或多个细胞质序列。此类t细胞共受体的非限制性实例包括cd27、cd28、
4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、myd88、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体。
106.在一些实施方案中，两个或更多个信号传导结构域以随机或指定次序彼此连接。任选地，较短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个氨基酸之间)可以形成键联。在一些实施方案中，此类接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
107.诱导型表达构建体
108.在一些实施方案中，如本文所用的“诱导型表达构建体”可以是或包含核酸序列，其至少包含与编码本文所述的双互补位融合蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动子。诱导型表达构建体可包含调控序列，诸如转录以及翻译起始和终止密码子。在一些实施方案中，此类调控序列对在适当时引入诱导型表达构建体的细胞类型具有特异性。在一些实施方案中，此类调控序列对由本文所述的信号传导结构域诱导的信号传导途径具有特异性。
109.诱导型表达构建体可以包含与编码双互补位融合蛋白的核酸可操作地连接的天然或非天然启动子。优选地，所述启动子在免疫细胞中是有功能的。核苷酸序列与启动子的可操作连接是在技术人员的技能范围内。所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、rsv启动子或存在于小鼠干细胞病毒的长末端重复序列中的启动子。在一些实施方案中，启动子包含nfat、nf-κb、ap-1或其他识别序列，如实例所示。
110.在一些实施方案中，包含在本文所述的诱导型表达构建体中的启动子是il-2启动子、细胞表面蛋白启动子(例如，cd69启动子)、细胞因子启动子(例如，tnf启动子)、细胞活化启动子(例如，ctla4、ox40和cd40l)或细胞表面粘附蛋白启动子(例如，vla-1启动子)。对例如强的、弱的、诱导型的、组织特异性的、发育特异性的、具有特定活化动力学(例如，早期和/或晚期活化)的和/或具有特定诱导基因表达(例如，较短或较长表达)动力学的启动子的选择是在技术人员的普通技能范围内。在一些实施方案中，启动子介导以天为单位测量的快速、持久的表达(例如，cd69)。在一些实施方案中，启动子介导延迟的表达，称为晚期诱导型(例如，vla1)。在一些实施方案中，启动子介导快速、瞬时的表达(例如，tnf、即刻早期反应基因和许多其他基因)。
111.在抗原结合受体与抗原结合后，可以例如使用已知途径将信号从本文所述的抗原结合受体的信号传导结构域转导至诱导型表达构建体(参见例如chow等人,mol.cell.biol.19:2300-2307(1999)；castellanos等人,j.immunol.159:5463-73(1997)；kramer等人,jbc270:6577-6583(1995)；gibson等人,j.immunol.179:3831-40(2007)；tsytsykova等人,j.biol.chem.271:3763-70(1996)；goldstein等人,j.immunol.178:201-10(2007))。因此，在抗原结合后，抗原结合受体活化信号转导途径，从而导致诱导表达双互补位融合蛋白(例如，通过转录因子与本文所述的启动子的结合)。
112.双互补位融合蛋白
113.在一些实施方案中，本文所述的细胞治疗剂可包含编码双互补位融合蛋白的表达构建体(例如，组成型表达构建体或诱导型表达构建体)。在一些实施方案中，双互补位融合蛋白包含两种或更多种抗原结合蛋白(例如，抗体或抗体片段，例如fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、scfv片段、fv片段、dsfv双抗体、dab片段、fd'片段、fd片段、cdr区、骆驼抗体、掩蔽抗体(例如，)、单链或串联双抗体vhh、单结构
域抗体(例如，)、锚蛋白重复蛋白或)、锚蛋白重复蛋白或或)以及至少一种多肽抗原。在一些实施方案中，所述两种或更多种抗原结合蛋白结合相同抗原的不同表位。在一些实施方案中，所述两种或更多种抗原结合蛋白结合本文所述的肿瘤抗原(例如，taa或tsa)。在一些实施方案中，双互补位融合蛋白是或包含两个抗体片段和至少一个额外的非抗体多肽。在一些实施方案中，所述两种或更多种抗原结合蛋白包含结合第一肿瘤抗原的两种或更多种抗原结合蛋白和结合第二肿瘤抗原的至少一种抗原结合蛋白。在一些实施方案中，双互补位融合蛋白是或包含scfv、vhh和至少一种多肽抗原(例如，本文所述的cd19或cd19变体)。
114.所述两种或更多种抗原结合蛋白和至少一种多肽抗原可以在双互补位融合蛋白内以任何次序配置。在一些实施方案中，所述多肽抗原连接(例如，融合)至两种或更多种抗原结合蛋白之一的氨基末端。在一些实施方案中，所述多肽抗原连接(例如，融合)至两种或更多种抗原结合蛋白之一的羧基末端。例如，包含抗原结合蛋白a；抗原结合蛋白b；以及多肽抗原的双互补位融合蛋白可以配置为以下配置中的任一种：(i)抗原结合蛋白a-抗原结合蛋白b-多肽抗原；(ii)抗原结合蛋白b-抗原结合蛋白a-多肽抗原；(iii)多肽抗原-抗原结合蛋白a-抗原结合蛋白b；(iv)多肽抗原-抗原结合蛋白b-抗原结合蛋白a；(v)抗原结合蛋白b-多肽抗原-抗原结合蛋白a；(vi)抗原结合蛋白a-多肽抗原-抗原结合蛋白b。例如，在包含scfv(例如，本文所述的scfv)、vhh(例如，本文所述的vhh)和多肽抗原(例如，本文所述的cd19变体)的双互补位融合蛋白中，所述双互补位融合蛋白可以配置为以下配置中的任一种：(i)scfv-vhh-多肽抗原；(ii)scfv-多肽抗原-vhh；(iii)vhh-scfv-多肽抗原；(iv)vhh-多肽抗原-scfv；(v)多肽抗原-scfv-vhh；(vi)多肽抗原-vhh-scfv。
115.多肽抗原
116.在一些实施方案中，双互补位融合蛋白(或其片段)在细胞治疗剂的表面上表达和/或由细胞治疗剂分泌和/或结合到肿瘤细胞的表面。尽管可以从本文所述的表达构建体表达任何多肽抗原，但是在特定实施方案中，选择的双互补位融合蛋白中包含的多肽抗原是本文所述的抗原-结合蛋白(例如，抗体或其片段)、抗体融合蛋白或抗体-药物缀合物的靶标(例如，结合至所述靶标)。在一些实施方案中，所述抗体或抗体融合蛋白可以是例如已知的治疗性抗体(例如，表现出adcc或cdc的抗体)、治疗性融合蛋白或治疗性抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，选择的双互补位融合蛋白中包含的多肽抗原是携带car的细胞(例如，car-t细胞)的靶标(例如，结合至所述靶标)。
117.在一些实施方案中，多肽抗原结合一种或多种已知的抗肿瘤抗体。已经发表了描述有用的抗肿瘤抗体的各种评论文章(参见例如adler等人,hematol.oncol.clin.north am.26:447-81(2012)；li等人,drug discov.ther.7:178-84(2013)；scott等人,cancer immun.12:14(2012)；以及sliwkowski等人,science 341:1192-1198(2013))。表1提供了由已知的可用抗体剂靶向的某些人多肽抗原的非全面列表，并且指出了已提议抗体药物可用的某些癌症适应症：
118.表1：
119.120.[0121][0122]
在一些实施方案中，将本文所述的双互补位融合蛋白(或编码一种或多种此类多肽抗原的表达构建体(例如，组成型表达构建体或诱导型表达构建体))或包含此类表达构建体的细胞治疗剂与这些(或其他)已知抗体或其片段中的一种或多种组合施用至受试者。在一些实施方案中，将本文所述的双互补位融合蛋白(或编码一种或多种此类多肽抗原的表达构建体(例如，组成型表达构建体或诱导型表达构建体))或包含此类表达构建体的细胞治疗剂与表达这些(或其他)已知抗体或其片段中的一种或多种的细胞治疗剂(例如，car-t细胞)组合施用至受试者。
[0123]
在一些实施方案中，结合一种或多种已知的抗体-药物缀合物的多肽抗原可以包含在本文所述的双互补位融合蛋白中。抗体-药物缀合物是已知的并且包括例如本妥昔单抗(seattle genetics)；恩美曲妥珠单抗(roche)；吉妥单抗(wyeth)；cmc-544；sar3419；cdx-011；psma-adc；bt-062；和imgn901(参见例如sassoon等人,methods mol.biol.1045:1-27(2013)；bouchard等人,bioorganic med.chem.lett.24:5357-5363(2014))。在一些此类实施方案中，将本文所述的双互补位融合蛋白(或编码一种或多种此类多肽抗原的表达构建体(例如，组成型表达构建体或诱导型表达构建体))或包含此类表达构建体的细胞治疗剂与这些(或其他)已知抗体-药物缀合物中的一种或多种组合施用至受试者。
[0124]
cd19
[0125]
在一些实施方案中，包含在双互补位融合蛋白中的多肽抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原包含cd19或其片段。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原包含cd19变体或其片段。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原包含cd19或cd19变体的细胞外结构域(ecd)或其片段。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原包含由fmc63识别的表位(nadler,lee m“b cell/leukemia panel workshop:summary and comments”leukocyte typing ii ed.e.l.reinherz等人,new york,1986；zola等人,immunol cell biol.69:411-422；
nicholson等人,mol immunol.34:1157-1165)。
[0126]
cd19是95kda的i型跨膜糖蛋白，其被用作b细胞发育的生物标记物(wang等人,exp.hematol.oncol.1:36(2012))。cd19在淋巴瘤和白血病中的表达使其成为有效的治疗靶点，尤其是对于嵌合抗原受体(car)t细胞疗法(maude等人,blood 125:4017
–
4024(2015))。基于cd19在car-t细胞疗法中独特地有效表现，已经描述了涉及使用工程化成直接结合至肿瘤生物标记物的抗体-cd19融合物或cd19变体将cd19-肿瘤“转化”成cd19

肿瘤的治疗方法(参见例如wo2017/075537和wo2017/075533)。在这些情况下，cd19细胞外区域的结构完整性(包括正确折叠、生物表位的呈现和稳定性)对分子疗法的性能可能是重要的。
[0127]
假设cd19的细胞外区域含有两个c2样免疫球蛋白结构域(参见例如wang等人,exp.hematol.oncol.1:36(2012)；tedder等人,nat.rev.rheumatol.5:572
–
577(2009))。这得到了同源建模的支持(等人,nucleic acids res.33:244
–
248(2005))(见图3)。然而，最近发表的结构表明cd19不包含c2样免疫球蛋白结构域(teplyakov等人,proteins 86:495-500(2018))。
[0128]
人cd19的核苷酸序列以及cd19的特定结构域的核苷酸序列是已知的(参见genbank登录号m84371.1)。例如，编码cd19的细胞外结构域的核苷酸序列是：cccgaggaacctctagtggtgaaggtg gaagagggagataacgctgtgctgcagtg cctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtcccc gcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgag gcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctac ctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaa tgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgg gctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctc atgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggaga gcctccgtgtctcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctca ccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtc caggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtc tgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggca acctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggc tgctgaggactggtggctggaag(seq id no:1)。
[0129]
cd19的细胞外结构域的氨基酸序列是：peeplvvkveegdna vlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrpl aiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcgl knrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppclpprdslnqslsqdltmapgstl wlscgvppdsvsrgplswthvhpkgpksllslelkddrpardmwvmetglllprataqdagkyychrgnltmsfhleitarpvlwhwllrtggwk(seq id no:2)。
[0130]
在一些实施方案中，本文所述的双互补位融合蛋白包含一种或多种cd19变体。在一些实施方案中，cd19变体是或包含全长cd19多肽或其一部分，其包含本文所述的一种或多种氨基酸取代。在一些实施方案中，cd19变体是或包含cd19细胞外结构域或其一部分，其包含本文所述的一种或多种氨基酸取代。在一些实施方案中，cd19变体是或包含在c-末端处缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸的cd19细胞外结构域，并且包含本文所述的一种或多种氨基酸取代。
[0131]
因此，在一些实施方案中，cd19变体包含表1a、表1b、表2a、表2b、表3、表6、图3、图4b、图5a-图5d或图6中所列出的seq id no:2的一种或多种氨基酸取代。
[0132]
在一些实施方案中，cd19变体包含在seq id no:2的一个或多个以下氨基酸位置处的氨基酸取代：2、3、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、28、29、30、31、32、33、34、38、39、45、47、49、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、66、68、70、72、84、90、93、94、99、100、105、108、111、113、114、115、122、123、124、125、127、130、131、132、135、138、139、140、141、142、143、144、145、146、148、149、154、167、169、171、185、189、193、194、196、198、202、204、206、207、209、211、212、213、215、216、217、219、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、232、235、240、243、247、249、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、264、265、269或271。在这些位置处的示例性氨基酸取代示出在表1a、表2a、表3、表6、图3、图4b、图5a-图5d或图6中。在一些实施方案中，cd19变体表现出增加的与抗cd19抗体(例如，fmc63或4g7)的结合(相对于wt cd19)；表现出改进的对蛋白水解(例如，使用标准测定)的抗性(相对于wt cd19)；且/或在热应激下(例如，使用标准测定)表现出增加的表达(相对于wt cd19)。
[0133]
在一些实施方案中，cd19变体在如表6中所示的一个或多个以下位置处包含一种或多种以下氨基酸取代：
[0134]
表6：
[0135]
[0136]
[0137]
[0138][0139]
在一些实施方案中，cd19变体包含在seq id no:2的以下氨基酸位置集合中的一个或多个处的氨基酸取代：5/7/9；14/16/18；29/31；29/31/33；35/37/39；45/47/49；52/54/56；59/61/63；62/64/66；76/78/80；86/88/90；167/169/171；175/177/179；193/195/197；206/208/210；207/209/211；219/221/223；240/243；224/226/228；247/249/251；253/255/256；255/256；或261/262/264/265。在这些位置集合的示例性氨基酸取代示出在表1b、表2b、表3、表6、图4b、图3、图5a、图5b、图5c、图5d或图6中。
[0140]
表1a
–
与fmc63和4g7的结合得到改进的单突变体：
[0141]
[0142][0143]
表1b：与fmc63和4g7的结合得到改进的单突变体：
[0144]
[0145]
[0146][0147]
表2a：具有改进的蛋白水解抗性的单突变体
[0148]
[0149][0150]
表2b：具有改进的蛋白水解抗性的三突变体
[0151]
[0152][0153]
表3：在热应激下具有改进的表达的突变体
[0154]
[0155]
[0156][0157]
抗cll-1抗体
[0158]
在一些实施方案中，表达的双互补位融合蛋白可以包含结合cll-1的两种或更多种抗体或其片段。人c型凝集素样分子1(cll-1)也称为micl或clec12a，是ii型跨膜糖蛋白并且是参与免疫调节的c型凝集素样受体大家族的成员。先前已从骨髓来源的细胞中鉴定出cll-1。cll-1的细胞内结构域含有基于免疫酪氨酸的抑制基序(itim)和yxxm基序。多种细胞上含itim受体的磷酸化通过募集蛋白质酪氨酸磷酸酶shp-1、shp-2和ship来导致活化途径的抑制。yxxm基序具有pi-3激酶13的p85亚基的潜在sh2结构域结合位点，所述激酶参与细胞活化途径，这揭示了cll-1作为骨髓细胞上的抑制和活化分子的潜在双重作用。事实上，cll-1与shp-1和shp-2的缔合已经在转染的和骨髓来源的细胞系中凭借实验得到证明。
[0159]
抗体包括例如完整的igg、ige和igm、双特异性抗体或多特异性抗体(例如，双互补位的、等)、单链fv、多肽fc融合物、fab、骆驼抗体、掩蔽抗体(例如，)、小型模块化免疫药物(“smipstm”)、单链或串联双抗体vhh、vhh、微型抗体、锚蛋白重复蛋白或锚蛋白重复蛋白或dart、tcr样抗体、dart、tcr样抗体、微蛋白、和
[0160]
在一些实施方案中，双互补位融合蛋白包含至少两种抗体(或抗体片段)，其各自
结合cll-1/clec12a。抗cll-1抗体(和片段，例如scfv)是本领域已知的。在一些实施方案中，双互补位融合蛋白包含结合cll-1/clec12a的一种或多种scfv，例如在美国专利7,741,443；kenderian等人,blood 2016 128:766；laborda等人,int.j.mol.sci.2017,18,2259；tashiro等人,mol.ther.第25卷第9章,2202-2213,2017；wang等人,j hematol oncol.2018jan 10；11(1):7；lu等人,angew chem int ed engl.2014sep 8；53(37):9841-5；国际专利申请wo2016120219；国际专利申请wo2013169625中公开的序列和抗体或其片段。
[0161]
抗cll-1单结构域抗体
[0162]
在一些实施方案中，抗体是单结构域抗体。单结构域抗体是其互补决定区为单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、源自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除源自抗体的那些以外的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域已知的任何单结构域抗体或未来的任何单结构域抗体。单结构域抗体可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔、牛。根据本公开的一个方面，如本文所用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。此类单结构域抗体在例如wo 94/04678中公开。此类源自天然缺乏轻链的重链抗体的可变结构域在本文中称为“vhh”或“纳米抗体”。此类vhh分子可以源自在骆驼科物种(camelidae species)中产生的抗体，例如在骆驼、单峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和原驼中。除骆驼科外的其他物种(例如智人(homo sapiens))可产生天然缺乏轻链的重链抗体；此类vhh是在本公开的范围内。
[0163]
根据由kabat等人,“sequence of proteins of immunological interest”,us public health services,nih(bethesda,md)，公开号91
–
3242(1991)提供的vh结构域的一般编号对来自骆驼科动物的vhh结构域的氨基酸残基进行编号；也参见riechmann等人,j.immunol.methods 231:25-38(1999)。根据此编号，fr1包含在位置1-30处的氨基酸残基，cdr1包含在位置31-35处的氨基酸残基，fr2包含在位置36-49处的氨基酸，cdr2包含在位置50-65处的氨基酸残基，fr3包含在位置66-94处的氨基酸残基，cdr3包含在位置95-102处的氨基酸残基，fr4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
[0164]
然而，应当指出(如本领域对于vh结构域和vhh结构域所熟知的)，每个cdr中的氨基酸残基总数可能不同并且可能不对应于由kabat编号所指示的氨基酸残基的总数(即，根据kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能未被占据，或者实际序列可能含有比kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着通常根据kabat的编号可能对应于或不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
[0165]
用于对vh结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，是本领域已知的，所述方法也可以以类似的方式应用于vhh结构域。然而，在本公开、权利要求和附图中，除非另有指出，否则将遵循根据kabat并且应用于如上所述的vhh结构域的编号。
[0166]
在一些实施方案中，本文所述的双互补位融合蛋白包含一种或多种抗cll-1单结构域抗体。在一些实施方案中，抗cll-1单结构域抗体是或包含具有seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的vh h或其片段(例如，其cll-1结合片段)。如本文提供的序列表中所指出的，seq id no:203-225中的每一者在n末端包含vhh氨基酸，并且在c末端包含以下氨基酸：(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqg a)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的
接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)。因此，在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)的vhh，其中所述部分缺少(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺少(i)-(v)中的一个或多个的一部分)。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cl l-1结合部分)的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中每一者中描绘的c末端氨基酸tsgpggqgaeqkliseedlgahhhh hhgas中的一个或多个。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中每一者中描绘的所有c末端氨基酸tsgpggqgaeqkliseedlgahhhhhhgas。
[0167]
在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)的vhh，其中所述部分缺少(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺少(i)-(v)中的一个或多个的一部分)，并且其中所述部分缺少一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)额外氨基酸(即，除了(i)-(v)中包含的氨基酸)。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中每一者中描绘的c末端氨基酸tsgpggqgaeqkliseedlgahhhhhhgas中的一个或多个，并且其中所述部分缺少一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)额外氨基酸。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中每一者中描绘的所有c末端氨基酸tsgpggqgaeqkliseedlgahhhhhhgas，并且其中所述部分缺少一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)额外氨基酸。
[0168]
在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有与seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vhh，其中所述部分缺少(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺少(i)-(v)中的一个或多个的一部分)。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有与seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vhh，其中所述部分缺少在seqid no:203-225中每一者中描绘的c末端氨基酸tsgpggqgaeqk liseedlgahhhhhhgas中的一个或多个。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有与seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中每一者中描绘的所有c末端氨基酸tsgpggqgaeqkliseedlgahhhhhhgas。
[0169]
在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有与seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)具有
至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vhh，其中所述部分缺少(i)-(v)中的一个或多个(和/或缺少(i)-(v)中的一个或多个的一部分)，并且其中所述部分缺少一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)额外氨基酸(即，除了(i)-(v)中包含的氨基酸)。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有与seq id no:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中每一者中描绘的c末端氨基酸tsgpggqgaeqkliseedlgahhhh hhgas中的一个或多个，并且其中所述部分缺少一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)额外氨基酸。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含具有与seq idno:203-225中任一者的氨基酸序列的一部分(例如，cll-1结合部分)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vhh，其中所述一部分缺少在seq id no:203-225中每一者中描绘的所有c末端氨基酸tsg pggqgaeqkliseedlgahhhhhhgas，并且其中所述部分缺少一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)额外氨基酸。
[0170]
在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含含有在seq id no:203-225中任一者中描绘的至少一个cdr(例如，cdr1、cdr2和/或cdr3)的vhh。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含含有在seq id no:203-225中任一者中描绘的至少一个cdr(例如，cdr1、cdr2和/或cdr3)的一部分的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中任一者中描绘的cdr的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含含有与在seq id no:203-225中任一者中描绘的cdr(例如，cdr1、cdr2和/或cdr3)具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的cdr的vhh。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含含有与在seq id no:203-225中任一者中描绘的至少一个cdr(例如，cdr1、cdr2和/或cdr3)的一部分具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的vhh，其中所述部分缺少在seq id no:203-225中任一者中描绘的cdr的1、2、3、4、5或更多个氨基酸。
[0171]
在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含含有表5a和/或表5b中描绘的组1-13中任一者的cdr1、cdr2和/或cdr3的vhh。在一些实施方案中，本公开提供包含抗体的双互补位融合蛋白，所述抗体是或包含含有(i)cdr1和cdr2；(ii)cdr2和cdr3；(iii)cdr1和cdr3；或(iv)表5a和/或表5b中描绘的组1-13中任一者的cdr1、cdr2和cdr3(例如，其中cdr来自一个特定组，或其中cdr选自两个或更多个不同的组)的vhh。表5a：
[0172][0173]
表5b：基于imgt编号和anarci软件鉴定的cdr(http://opi g.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/anarci.php)
[0174]
组cdr1cdr2cdr31gsifaineinlcasdgntdansrgnyy2gdtrsinlcasdgntdansrgnyy3gsirsinvcasdgntdansrgnyy4gftfnsyainsgggstatelrgsdyyrgpireyay5gltfsnyainwsggttaasyrlritvvvtpdeyhy6gfafddyaiswngggtvklvdsgwysaydy7gatsnvnaissggstaaqdwategyeydy8gtmfsgkdvssdggthflwgrhy9gndisgsavdaprerpgpslrtfhgrewyrppwfts10gsifsinavsrfgetnarirgnygsridy11gnmldlntlgistardynfes12gsdrsinvitsggttkadtrwggmy13grtidngainwsggatasrrgvdlrrnsyeydy
[0175]
如本领域技术人员将理解的，可以例如使用分子生物学技术将任何此类cdr序列容易地与本文提供或本领域另外已知的任何其他抗体序列或结构域(包括如本文公开或本领域另外已知的任何框架区、cdr或恒定结构域或其部分)组合，所述任何其他抗体序列或结构域可存在于如本文公开或本领域另外已知的任何形式的抗体或结合分子中。
[0176]
本文所述的抗体与抗原(例如，cll-1)的结合特性可以通过本领域已知的方法测
量，例如以下方法之一：biacore分析、酶联免疫吸附测定(elisa)、x射线晶体学、序列分析和扫描诱变。可以使用表面等离子体共振(spr)分析抗体和抗原(例如，cll-1)的结合相互作用。spr或生物分子相互作用分析(bia)实时检测生物特异性相互作用，而无需标记任何相互作用物。bia芯片结合表面的质量变化(指示结合事件)导致表面附近的光的折射率发生变化。折射率的变化产生可检测信号，所述信号作为生物分子之间的实时反应的指示来测量。用于使用spr的方法描述于例如
[0177]
美国专利号5,641,640；raether(1988)surface plasmons springer verlag；sjolander和urbaniczky(1991)anal.chem.63:2338-2345；szabo等人,(1995)curr.opin.struct.biol.5:699-705以及由biacore international ab(uppsala,sweden)提供的在线资源中。此外，也可以使用可从sapidyne instruments(boise,id.)获得的(动能排除测定)测定。
[0178]
来自spr的信息可用于提供对抗体与抗原(例如，cll-1)的结合的平衡解离常数(kd)和动力学参数(包括k
on
和k
off
)的准确和定量测量。此类数据可用于比较不同的分子。来自spr的信息也可用于开发构效关系(sar)。可鉴定与特定结合参数(例如，高亲和力)相关的给定位置处的变体氨基酸。
[0179]
在某些实施方案中，本文所述的抗体表现出对结合抗原(例如，cll-1)的高亲和力。在各种实施方案中，本文所述的抗体对抗原(例如，cll-1)的kd小于约10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
、10-11
、10-12
、10-13
、10-14
或10-15
m。在某些情况下，本文所述的抗体对抗原(例如，cll-1)的kd在0.001与1nm之间，例如0.001nm、0.005nm、0.01nm、0.05nm、0.1nm、0.5nm或1nm。
[0180]
其他抗体
[0181]
尽管示例性双互补位融合蛋白包含结合cll-1的抗体，但双互补位融合蛋白可以包含可以结合一种或多种肿瘤抗原的任何抗体，包括表1中所列出的示例性抗体。肿瘤抗原是本领域已知的并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(cea)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-ca ix、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、m-csf、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、lage-1α、p53、前列腺特异性蛋白(prostein)、psma、her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinb2、cd22、胰岛素生长因子(igf)-i、igf-ii、igf-i受体和间皮素。
[0182]
在一些实施方案中，肿瘤抗原是或包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。包含此类表位的恶性肿瘤抗原包括例如组织特异性抗原，诸如黑色素瘤中的mart-1、酪氨酸酶和gp 100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特异性抗原(psa)。其他肿瘤抗原属于转化相关分子(诸如致癌基因her-2/neu/erbb-2)组。而另一组肿瘤抗原是癌胚胎抗原，诸如癌胚抗原(cea)。在b细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了个别肿瘤所独有的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。b细胞分化抗原诸如cd19、cd20和cd37是b细胞淋巴瘤中的其他肿瘤抗原。这些抗原中的一些(例如，cea、her-2、cd19、cd20、独特型)已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶点，但成功有限。
[0183]
本文所述的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。tsa是(或被认为是)肿瘤细胞所独有的并且不会在体内的其他细胞上存在(例如，不会在其他细
胞上显著存在)。taa不是肿瘤细胞所独有的，而是也在正常细胞上表达(例如，在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下表达)。例如，taa可以是在胎儿发育期间当免疫系统是不成熟的且无法反应时在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以较高水平表达的抗原。
[0184]
tsa或taa抗原的非限制性实例包括分化抗原，诸如mart-1/melana(mart-i)、gp100(pmel 17)、酪氨酸酶、trp-1、trp-2，以及肿瘤特异性多谱系抗原，诸如mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、p15；过度表达的胚胎抗原，诸如cea；过表达的致癌基因和突变的抑癌基因，诸如p53、ras、her-2/neu；由染色体易位引起的独特肿瘤抗原，诸如bcr-abl、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar；以及病毒抗原，诸如爱泼斯坦-巴尔二氏病毒抗原(epstein barr virus antigens)ebva和人乳头瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其他肿瘤抗原包括tsp-180、mage-4、mage-5、mage-6、rage、ny-eso、erbb、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、nm-23h1、psa、tag-72、ca 19-9、ca 72-4、cam 17.1、numa、k-ras、β连环蛋白、cdk4、mum-1、p 15、p 16、43-9f、5t4、791tgp72、甲胎蛋白、β-hcg、bca225、btaa、ca 125、ca 15-3\ca 27.29\bcaa、ca 195、ca 242、ca-50、cam43、cd68\p1、co-029、fgf-5、g250、ga733\epcam、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90\mac-2结合蛋白\亲环素c相关蛋白、taal6、tag72、tlp、muc16、il13rα2、frα、vegfr2、lewis y、fap、epha2、ceacam5、egfr、ca6、ca9、gpnmb、egp1、folr1、内皮受体、steap1、slc44a4、结合素4、ags-16、鸟苷酸环化酶c、muc-1、cfc1b、(a3b1(层粘连蛋白受体链)的)整合素α3链和tps。
[0185]
在一些实施方案中，肿瘤抗原是cd19、cd20、cd22、cd30、cd72、cd180、cd171(l1cam)、cd123、cd133、cd138、cd37、cd70、cd79a、cd79b、cd56、cd74、cd166、cd71、cll-1/cleck12a、ror1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)、间皮素、cd33/il3ra、il1rap、c-met、psca、psma、糖脂f77、egfrviii、gd-2、my-eso-1或mage a3。可以例如通过对肿瘤基因组和外显子组测序，和/或通过肿瘤蛋白质组进行高灵敏度质谱分析来鉴定额外肿瘤抗原，其中任一者均可用于本文所述的方法中。其他肿瘤抗原描述于例如wo2017/075537中。
[0186]
在一些实施方案中，肿瘤抗原是通用的或“管家”膜蛋白，例如存在于每个细胞上。在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤干细胞标记物。在一些实施方案中，肿瘤抗原是新抗原(即，在肿瘤本身中产生的抗原，例如由于异常增殖)。
[0187]
具有可裂解接头的双互补位融合蛋白
[0188]
在一些实施方案中，本文所述的双互补位融合蛋白中的任一个可以包含融合蛋白的任何组分(例如，scfv、vhh、cd19变体)之间的接头。多种合适的接头和用于制备包含接头的融合蛋白的方法是本领域已知的。所述接头可以是可裂解的(例如，在生理条件下，例如，在细胞内条件下)，从而使得接头的裂解释放融合配偶体。所述接头可以是例如被例如血浆肽酶或蛋白酶裂解的肽基接头，所述酶包括但不限于氨肽酶、纤溶酶和激肽-激肽释放酶。在一些实施方案中，所述接头可以被肿瘤相关蛋白酶(例如，蛋白裂解酶和组织蛋白酶b)裂解。在一些实施方案中，由肿瘤相关蛋白酶进行的裂解诱导cd19的构象变化，从而允许car表位的结合和/或表达以允许杀伤。在一些实施方案中，所述肽基接头的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽基接头是p2a。
[0189]
掩蔽的双互补融合蛋白
[0190]
在一些实施方案中，表达的双互补位融合蛋白是或包含本文所述的一种或多种抗
原结合蛋白(例如，本文所述的抗体或抗体片段)的掩蔽形式。在一些实施方案中，表达的双互补位融合蛋白包含本文所述的抗体或抗体片段的掩蔽形式(例如，在例如sandersjoo等人,cell.mol.life sci.(2015)72:1405
–
1415；us 2015/0183875；us 8,513,390；和us 9,120,853中所述的)。在一些实施方案中，掩蔽的融合蛋白包含抗体或其片段、掩蔽部分、可裂解部分和/或接头。
[0191]
在一些实施方案中，掩蔽的融合蛋白包含两种或更多种抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)和掩蔽部分。在一些实施方案中，掩蔽部分是与抗原结合蛋白(例如，抗体或片段)偶联并且所处位置使得其减小蛋白质特异性结合其靶标的能力(“掩蔽”抗原结合蛋白)的氨基酸序列。在一些实施方案中，掩蔽部分通过接头与抗原结合蛋白偶联。在一些实施方案中，与“未掩蔽”的抗原结合蛋白与靶标的特异性结合相比，或与亲本抗原结合蛋白与靶标的特异性结合相比，掩蔽的抗原结合蛋白与其靶标的特异性结合被降低或抑制。在一些实施方案中，例如，当在体内或在靶置换体外免疫吸收测定(描述于美国8,513,390中)中测量时，例如，在至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96个小时，或者5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或者更长时间内，与未掩蔽的抗原结合蛋白与靶标的结合相比，或与亲本抗原结合蛋白与靶标的结合相比，掩蔽的抗原结合蛋白与靶标的结合表现为不可测量或基本上不可测量，和/或与靶标的结合表现为不超过0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％。
[0192]
在一些实施方案中，与未掩蔽的抗原结合蛋白与靶标的特异性结合相比，或与亲本抗原结合蛋白与靶标的特异性结合相比，掩蔽的抗原结合蛋白与其靶标的特异性结合被降低或抑制。掩蔽的抗原结合蛋白对靶标的kd可为比未掩蔽的抗原结合蛋白或亲本抗原结合蛋白对靶标的kd大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大倍，或者大5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍之间。相反，掩蔽的抗原结合蛋白对靶标的结合亲和力可为比未掩蔽的抗原结合蛋白或亲本抗原结合蛋白对靶标的结合亲和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大倍，或者低5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000倍之间。
[0193]
掩蔽部分是本领域已知的并且包括例如抗体或其片段的已知的结合配偶体。在一些实施方案中，掩蔽部分是在抗原结合蛋白的n-末端、c-末端和/或内部位点(例如，抗原结合环)内的氨基酸序列。在一些实施方案中，掩蔽部分是或包含一对或多对半胱氨酸残基(例如，导致在半胱氨酸对之间形成二硫键)。在一些此类实施方案中，二硫键导致构象受限结构，其可通过例如还原剂裂解二硫键而“去掩蔽”。示例性掩蔽部分描述于例如
sandersjoo等人,cell.mol.life sci.(2015)72:1405
–
1415；us 2015/0183875；us 8,513,390；和us 9,120,853中。
[0194]
在一些实施方案中，掩蔽的双互补位融合蛋白包含一种或多种抗原结合蛋白上的掩蔽部分。在一些实施方案中，掩蔽部分位于在表达的双互补位融合蛋白中包含的一种或多种抗原结合蛋白的n末端。在一些实施方案中，掩蔽部分位于在表达的双互补位融合蛋白中包含的一种或多种抗原结合蛋白的c末端。在一些实施方案中，掩蔽抗体额外地包含一个或多个可裂解部分。在一些实施方案中，可裂解部分是或包含例如一种或多种氨基酸序列，其可用作一种或多种蛋白酶(诸如一种或多种细胞外蛋白酶)的底物。在一些实施方案中，可裂解部分是或包含能够形成二硫键的半胱氨酸-半胱氨酸对，其可以通过还原剂的作用被裂解。在其他实施方案中，可裂解部分是或包含能够在光解作用下被裂解的底物。
[0195]
在一些实施方案中，可裂解部分基于具有抗体或其片段的预期靶标的组织中或附近的蛋白酶的存在来选择。在一些实施方案中，靶组织是癌组织。在许多癌症(例如，实体瘤)中具有底物的蛋白酶是本领域已知的(参见例如la rocca等人,(2004)british j.of cancer 90(7):1414-1421)。在一些实施方案中，可裂解部分是或包含例如豆荚蛋白、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mt1-mmp、adam(去整合素和金属蛋白酶，例如adams1-20，例如adam8、adam10和adam17)、组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶a、b、c、d、e、f、g、h、l、k、o、s、v或w(tan等人,world j.biol.chem.4:91-101(2013))、半胱天冬酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、β分泌酶、蛋白裂解酶、upa或psa的靶标。
[0196]
在一些实施方案中，本文所述的掩蔽的融合蛋白包含接头，例如掩蔽部分的c末端和/或n末端和/或可裂解部分。在一些实施方案中，接头可为掩蔽部分提供灵活性以可逆地抑制抗原结合蛋白与其靶标的结合。合适的接头可以容易地选择并且可以是任何合适的不同长度，诸如1个氨基酸(例如，gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸(包括4个氨基酸至10个氨基酸)、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。在一些实施方案中，掩蔽部分通过多肽接头与抗原结合蛋白融合。在一些实施方案中，用于将掩蔽部分与抗原结合蛋白融合的接头是本文所述的可裂解部分。在一些实施方案中，掩蔽部分与抗原结合蛋白的n末端直接融合或通过接头融合。在一些实施方案中，掩蔽部分与抗原结合蛋白的c末端直接融合或通过接头融合。
[0197]
在一些实施方案中，本文所述的掩蔽的融合蛋白可以使用已知的方法另外或可替代地产生和/或纯化。在一些实施方案中，如本文所述，此类产生和/或纯化的掩蔽的融合蛋白可用作蛋白质治疗剂。
[0198]
产生细胞治疗剂的方法
[0199]
一般而言，本文所述的细胞治疗剂可由免疫细胞(例如，可用于或能够用于过继细胞疗法的细胞)产生。在一些实施方案中，细胞治疗剂由选自由以下组成的组的细胞类型产生：til、t细胞、病毒特异性t细胞(vst)、cd8

细胞、cd4

细胞、nk细胞、δγt细胞、调节性t细胞、外周血单核细胞或ipsc衍生细胞。如本文所用，“肿瘤浸润淋巴细胞”或til是指已经离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。淋巴细胞可分为三组，包括b细胞、t细胞和自然杀伤细胞。如本文所用，“t细胞”是指cd3

细胞，包括cd4

辅助细胞、cd8

细胞毒性t细胞和δγt细胞。
[0200]
在某些实施方案中，细胞治疗剂是通过用本文所述的编码抗原结合受体的核酸和/或表达构建体(例如，(i)包含编码抗原结合受体的核酸的第一重组表达载体和包含诱导型表达构建体的第二重组表达载体；(ii)包含编码抗原结合受体的核酸和诱导型表达构建体的单一重组表达载体；或(iii)包含组成型表达构建体的重组表达载体)对细胞(例如，免疫细胞)进行基因修饰(例如，转化)来产生的。所述重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于dna和rna，其可以是单链或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然存在或非天然存在的核苷酸间键联，或两种类型的键联。在一些实施方案中，重组表达载体可以是或包含转座子。
[0201]
重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括设计用于增殖和扩增或用于表达或两者的那些载体，诸如质粒和病毒。例如，载体可以选自puc系列(fermentas life sciences,glen burnie,md.)、pbluescript系列(stratagene,lajolla,calif.)、pet系列(novagen,madison,wis.)、pgex系列(pharmacia biotech,uppsala,sweden)和pex系列(clontech,palo alto,calif.)。也可以使用噬菌体载体，诸如λgt10、λgt11、λzapii(stratagene)、λembl4和λnm1149。可用于本公开的上下文中的植物表达载体的实例包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。可用于本公开的上下文中的动物表达载体的实例包括pcdna、peuk-cl、pmam和pmamneo(clontech)。在一些实施方案中，双顺反子ires载体(例如，来自clontech)用于包含本文所述的编码抗原结合受体的核酸和诱导型表达构建体。
[0202]
在一些实施方案中，重组表达载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、甲病毒载体、疫苗载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体和禽痘病毒载体，并且优选具有转化免疫细胞(例如，t细胞)的天然的或工程化的能力。
[0203]
重组表达载体可以使用描述于例如sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,第三版,cold spring harbor press,cold spring harbor,n.y.2001；和ausubel等人,current protocols in molecular biology,greene publishing associates and john wiley&sons,ny,1994中的标准重组dna或rna技术来制备。可以制备环状的或线性的表达载体的构建体以含有在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。
[0204]
复制系统可以源自例如colel、2μ质粒、λ、sv40、牛乳头状瘤病毒等。
[0205]
重组表达载体可以包含一种或多种标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀生物剂抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)、在营养缺陷型宿主中提供原养的互补作用等。重组表达载体的合适的标记基因包括例如新霉素/g418抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
[0206]
可用于本公开的上下文中的载体可以是“裸”核酸载体(即，几乎不具有或不具有包裹它们的蛋白质、糖和/或脂质的载体)，或与其他分子复合的载体。可与载体适当地组合的其他分子包括但不限于病毒外壳、阳离子脂质、脂质体、多胺、金颗粒和靶向部分，诸如靶向细胞分子的配体、受体或抗体。
[0207]
载体dna或rna可以经由常规转化或转染技术引入到细胞，例如免疫细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”意欲指用于将外源核酸(例如，dna或rna)引入到细胞中的多
种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、deae葡聚糖介导的转染、脂质转染、基因枪或电穿孔。
[0208]
蛋白质治疗剂
[0209]
在一些方面，本文所述的双互补位融合蛋白可以作为蛋白质治疗剂产生并使用，而不是或者除了由本文所述的细胞(例如，细胞治疗剂)产生。此类多肽可包含在组合物(例如，药物组合物)中，并用作蛋白质治疗剂。例如，包含多肽(所述多肽是或包含细胞治疗剂(例如，car-t细胞或adc)的靶标)的蛋白质治疗剂可以与此类细胞治疗剂(例如，car-t细胞或adc)组合施用。
[0210]
在一个实例中，蛋白质治疗剂包含双互补位融合蛋白，其包含本文所述的第一抗体(例如抗cll-1抗体，例如抗cll-1scfv，例如本文所述的抗cll-1scfv)、第二抗体(例如抗cll-1抗体，例如抗cll-1vhh，例如本文所述的抗cll-1vhh)和cd19变体。
[0211]
多种制备多肽的方法是本领域已知的并且可用于制备包含在蛋白质治疗剂中的多肽。例如，多肽可以通过利用被工程化以表达编码多肽的核酸的宿主细胞系统来重组产生。基因的重组表达可包括构建含有编码多肽的多核苷酸的表达载体。一旦获得多核苷酸，就可以使用本领域已知的技术通过重组dna或rna技术产生用于产生多肽的载体。可以使用已知的方法构建含有多肽编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组dna或rna技术、合成技术和体内基因重组。
[0212]
可以通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，并且然后可以通过常规技术培养转染的细胞以产生多肽。
[0213]
可以使用多种宿主表达载体系统(参见例如美国专利号5,807,715)。此类宿主表达系统可用于产生多肽，并在需要时随后进行纯化。此类宿主表达系统包括微生物，诸如用含有多肽编码序列的重组噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌属(saccharomyces)和毕赤酵母属(pichia))；用含有多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)感染或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如，ti质粒)转化的植物细胞系统；或者拥有含有源自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5k启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，cos、cho、bhk、293、ns0和3t3细胞)。
[0214]
对于细菌系统，可以使用多种表达载体，包括但不限于大肠杆菌表达载体pur278(ruther等人,1983,embo 12:1791)；pin载体(inouye和inouye,1985,nucleic acids res.13:3101-3109；van heeke和schuster,1989,j.biol.chem.24:5503-5509)等。pgex载体还可用于表达外源多肽，诸如具有谷胱甘肽5转移酶(gst)的融合蛋白。
[0215]
对于在哺乳动物宿主细胞中的表达，可以利用基于病毒的表达系统(参见例如logan和shenk,1984,proc.natl.acad.sci.usa 81:355-359)。表达的效率可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见例如bittner等人,1987,methods in enzymol.153:516-544)。
[0216]
此外，可选择以所需的特定方式调节插入序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞株。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异
性的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的多肽的正确修饰和加工。此类细胞包括例如已建立的哺乳动物细胞系和昆虫细胞系、动物细胞、真菌细胞和酵母细胞。哺乳动物细胞包括例如balb/c小鼠骨髓瘤细胞系(nso/l，ecacc no:85110503)；人成视网膜细胞(per.c6，crucell,leiden,the netherlands)；通过sv40转化的猴肾cv1细胞系(cos-7，atcc crl 1651)；人胚胎肾细胞系(293细胞或被亚克隆以在悬浮培养基中生长的293细胞，graham等人,j.gen virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如，ht1080)；婴儿仓鼠肾细胞(bhk,atcc ccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞 /-dhfr(cho，urlaub和chasin,proc.natl.acad.sci.usa,77:4216,1980)；小鼠塞尔托利细胞(mouse sertoli cell)(tm4，mather,biol.reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(cv1 atcc ccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1 587)；人宫颈癌细胞(hela,atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；水牛大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞(mather等人,annals n.y.acad.sci.,383:44-68,1982)；mrc5细胞；fs4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(hep g2)。
[0217]
为了长期高产率生产重组蛋白，将宿主细胞工程化以稳定表达多肽。宿主细胞可以用由本领域已知的适当的表达控制元件控制的dna进行转化，所述表达控制元件包括启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点和可选标记物。可以使用重组dna技术领域公知的方法来选择所需的重组克隆。
[0218]
一旦通过重组表达产生了本文所述的多肽和/或融合蛋白，就可以通过本领域已知的任何纯化方法，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术来对其进行纯化。例如，可通过适当选择亲和柱(诸如具有色谱柱的蛋白质a柱)、过滤、超滤、盐析和透析程序并将其组合来分离和纯化抗体(参见antibodies:alaboratory manual,ed harlow,david lane,cold spring harbor laboratory,1988)。此外，如本文所述，多肽和/或融合蛋白可以与异源多肽序列融合以促进纯化。或者或另外，多肽和/或融合蛋白可部分或完全通过化学合成来制备。例如，可以产生(例如，重组和/或化学合成)并缀合(例如，化学缀合)包含在本文所述的双互补位融合蛋白中的多肽以产生融合蛋白。或者或另外，多肽可以从天然来源纯化得到。
[0219]
病毒递送
[0220]
在一些实施方案中，编码所述双互补位融合蛋白的核酸可被引入病毒载体中。在一些实施方案中，此类病毒载体可用于将双互补位融合蛋白引入到癌细胞(例如，肿瘤细胞)中。此类双互补位融合蛋白的引入可增加对受试者免疫系统和/或一种或多种额外治疗剂的易感性(参见例如wo2017/075533)。
[0221]
载体设计
[0222]
编码本文所述的双互补位融合蛋白的核酸序列可被克隆到多种类型的载体内。例如，核酸可被克隆到质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒内。其他载体可以包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体和病毒载体。在其他实例中，所述载体可以是泡沫病毒(fv)载体，一种由泡沫病毒属(spumavirus)制成的逆转录病毒载体。病毒载体设计和技术是本领域熟知的，如sambrook等人,(molecular cloning:a laboratory manual,
2001)以及其他病毒学和分子生物学手册中所述。
[0223]
病毒转导
[0224]
病毒在将核酸递送至特定细胞类型方面非常有效，同时通常避免被感染的宿主免疫系统检测到。这些特征使某些病毒成为作为将细胞治疗靶标引入到癌细胞(例如，实体瘤细胞)中的媒介物的有吸引力的候选者。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、1型单纯疱疹病毒、疱疹病毒、癌病毒(例如，鼠白血病病毒)等。一般而言，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选标记物(例如，wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0225]
慢病毒和逆转录病毒转导可以通过添加聚凝胺(santacruz sc-134220；millipore tr-1003-g；sigma 107689)来增强，所述聚凝胺(也称为海美溴铵(hexamehtrine bromide))是用于增加逆转录病毒转导效率的阳离子聚合物。
[0226]
例如，逆转录病毒提供了基因递送系统的平台。逆转录病毒是属于逆转录病毒科(viral family retroviridae)的包膜病毒。一旦进入宿主细胞，所述病毒就会通过使用病毒逆转录酶将其rna转录成dna进行复制。逆转录病毒dna作为宿主基因组的一部分进行复制，并且被称为前病毒。可以使用本领域已知的技术将所选的基因插入到载体中并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并递送到受试者体内的细胞中。许多逆转录病毒系统是本领域已知的(参见例如美国专利号5,994,136、6,165,782和6,428,953)。
[0227]
逆转录病毒包括α逆转录病毒属(alpharetrovirus)(例如，禽白血病病毒)、β逆转录病毒属(betaretrovirus)(例如，小鼠乳腺肿瘤病毒)、δ逆转录病毒属(deltaretrovirus)(例如，牛白血病病毒和人嗜t淋巴细胞病毒)、ε逆转录病毒属(epsilonretrovirus)(例如，大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(walleye dermal sarcoma virus))和慢病毒属(lentivirus)。在一些实施方案中，逆转录病毒是逆转录病毒科慢病毒属，例如其特征在于长孵育期。慢病毒能够感染非分裂细胞，这在逆转录病毒中是独特的；慢病毒可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的dna中，因此可以用作有效的基因递送载体。在一些实例中，慢病毒可以是但不限于人免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、猴免疫缺陷病毒(s1v)、貓免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血(eia)和维斯纳病毒(visna virus)。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
[0228]
在一些实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是一大类含有双链dna的病毒。腺病毒复制宿主细胞的dna，同时使用宿主的细胞机制合成病毒rna dna和蛋白质。本领域已知腺病毒影响复制和非复制细胞，容纳大的转基因，并且编码蛋白质而无需整合到宿主细胞基因组中。
[0229]
在一些实施方案中，使用aavp载体。aavp载体是原核-真核载体的杂合体，所述杂合体是重组腺相关病毒和噬菌体的遗传顺式元件的嵌合体。aavp将噬菌体和aav载体系统的所选元件组合，从而提供在细菌中易于产生并且几乎没有或没有包装限制，同时允许感染哺乳动物细胞并整合到宿主染色体中的载体。含有许多适当的元件的载体是可商购获得的，并且可以通过标准方法进一步修饰以包含必要的序列。除此之外，aavp不需要辅助病毒或反式作用因子。此外，因为不形成aav衣壳，所以消除了aav对哺乳动物细胞的天然趋向
性。其他方法和细节见美国专利8,470,528和hajitou a.等人,cell,125:358-398。
[0230]
在一些实施方案中，使用人乳头状瘤(hpv)假病毒。dna质粒可以被包装到乳头状瘤病毒l1和l2衣壳蛋白中，以产生可以有效递送dna的假病毒粒子。封装可以保护dna免受核酸酶的影响，并提供具有高稳定性水平的靶向递送。许多与使用病毒载体相关的安全性问题可以用hpv假病毒来减轻。其他方法和实例见hung,c.,等人,plos one,7:7(e40983)；2012美国专利8,394,411以及kines,r.等人,int j of cancer,2015。
[0231]
在一些实施方案中，使用溶瘤病毒。溶瘤病毒疗法可以选择性地在癌细胞中复制病毒，并且随后可以在肿瘤内扩散，例如不影响正常组织。或者，溶瘤病毒可以优先感染并杀死细胞而不会对正常组织造成损害。溶瘤病毒还可以有效地诱导对自身以及受感染的肿瘤细胞的免疫反应。通常，溶瘤病毒分为两类：(i)天然优先在癌细胞中复制并且在人类中不致病的病毒。示例性的(i)类溶瘤病毒包括自主细小病毒、粘液瘤病毒(痘病毒)、新城病病毒(ndv；副粘病毒)、呼肠孤病毒和塞内卡谷病毒(seneca valley virus)(微小核糖核酸病毒)。第二类(ii)包括进行基因操作以用作疫苗载体的病毒，包括麻疹病毒(副粘病毒)、脊髓灰质炎病毒(微小核糖核酸病毒)和痘苗病毒(痘病毒)。此外，溶瘤病毒可包括被基因工程化成具有在正常细胞而非癌细胞中复制所需的基因突变/缺失的那些病毒，包括腺病毒、单纯疱疹病毒和水泡性口炎病毒。溶瘤病毒可因其低遗传抗性的可能性而被用作病毒转导方法，因为溶瘤病毒可以靶向多种途径并以肿瘤选择性方法复制。由于原位病毒扩增，肿瘤内的病毒剂量可以随时间增加(与随时间减少的小分子疗法相比)，并且可以建立安全特性(即，药物和免疫敏感性)。
[0232]
施用
[0233]
本公开的某些实施方案包括向受试者施用例如有效于治疗受试者的量的本文所述的细胞治疗剂(或其群体)、本文所述的蛋白质治疗剂、包含细胞治疗剂的组合物和/或包含蛋白质治疗剂的组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法有效地治疗受试者的癌症。
[0234]
在一些实施方案中，免疫细胞从受试者获得并用本文所述的诱导型表达构建体或组成型表达构建体(例如，包含本文所述的诱导型表达构建体或组成型表达构建体的表达载体)转化(例如，转导)，以获得细胞治疗剂。因此，在一些实施方案中，细胞治疗剂包含向获得免疫细胞的同一受试者施用的自体细胞。或者，免疫细胞从受试者获得并用本文所述的诱导型表达构建体或组成型表达构建体(例如，包含本文所述的诱导型表达构建体或组成型表达构建体的表达载体)转化(例如，转导)，以获得细胞治疗剂，其被同种异体转移至另一个受试者。
[0235]
在一些实施方案中，细胞治疗剂对于受试者是自体的，并且在从所述受试者分离免疫细胞之前，所述受试者可以是免疫幼稚的、免疫的、患病的或处于另一种状况下。
[0236]
在一些实施方案中，可以在施用至受试者之前进行额外步骤。例如，在用本文所述的诱导型表达构建体或组成型表达构建体(例如，包含诱导型表达构建体或组成型表达构建体的表达载体)接触(例如，转导或转染)免疫细胞后，但在施用至受试者之前，细胞治疗剂可以在体外扩增。在施用至受试者之前，体外扩增可以进行1天或更多天，例如2天或更多天、3天或更多天、4天或更多天、6天或更多天、或者8天或更多天。或者或此外，在施用至受试者之前，体外扩增可进行21天或更少天，例如18天或更少天、16天或更少天、14天或更少天、10天或更少天、7天或更少天、或者5天或更少天。例如，在施用至受试者之前，体外扩增
可进行1-7天、2-10天、3-5天或8-14天。
[0237]
在一些实施方案中，在体外扩增期间，可以用抗原(例如，tcr抗原)刺激细胞治疗剂。抗原特异性扩增可任选地补充有在非特异性地刺激淋巴细胞增殖的条件下进行的扩增，例如像抗cd3抗体、抗tac抗体、抗cd28抗体或植物血凝素(pha)。扩增的细胞治疗剂可以直接施用至受试者或可以冷冻以备将来使用，即用于随后施用至受试者。
[0238]
在一些实施方案中，在输注到癌症患者中之前用白介素2(il-2)离体处理细胞治疗剂，并且在输注后用il-2治疗癌症患者。在一些实施方案中，用il-2和/或其他细胞因子(例如，il-7、il-15和/或il-21)离体处理细胞治疗剂。此外，在一些实施方案中，癌症患者可以在施用细胞治疗剂之前经历预备性淋巴细胞消耗(免疫系统的临时消融)。细胞因子处理和预备性淋巴细胞消耗的组合可以增强细胞治疗剂的持久性。
[0239]
在一些实施方案中，用编码细胞因子的核酸转导或转染细胞治疗剂，所述核酸可以被工程化以提供细胞因子的组成型的、可调节的或临时控制的表达。合适的细胞因子包括例如在收缩期期间起到增强t淋巴细胞存活作用的细胞因子，其可促进记忆t淋巴细胞的形成和存活。
[0240]
在某些实施方案中，细胞治疗剂在施用另一种治疗剂(例如，癌症治疗剂)之前、基本上同时或之后施用。所述癌症治疗剂可以是例如化学治疗剂、生物剂或放射治疗。在一些实施方案中，未向接受细胞治疗剂的受试者施用足以引起免疫细胞消耗的治疗，诸如淋巴细胞消耗性化学疗法或放射疗法。
[0241]
本文所述的细胞治疗剂可以形成为组合物，例如细胞治疗剂和药学上可接受的载剂。在某些实施方案中，组合物是包含至少一种本文所述的细胞治疗剂和药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。
[0242]
本文所述的药学上可接受的载剂(例如，媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂)是本领域技术人员熟知的且容易获得的。优选地，药学上可接受的载剂对活性剂(例如，细胞治疗剂)是化学惰性的，并且在使用条件下不引起任何有害的副作用或毒性。
[0243]
组合物可被配制用于通过任何合适的路径施用，所述路径例如像静脉内、肿瘤内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、硬膜外和/或皮下施用路径。优选地，所述组合物被配制用于肠胃外施用路径。
[0244]
适用于肠胃外施用的组合物可以是水性或非水性的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，例如使得所述组合物与预期接受者的血液等渗。水性或非水性的无菌悬浮液可含有一种或多种悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
[0245]
向受试者(特别是人)施用的剂量将随着特定实施方案、所用组合物、施用方法以及被治疗的特定部位和受试者而变化。然而，剂量应足以提供治疗反应。本领域的临床医生可以确定要向人或其他受试者施用以便治疗或预防特定医学病状的组合物的治疗有效量。为了治疗有效所需要的组合物的精确量将取决于许多因素，例如像细胞治疗剂的比活性和施用路径，以及本领域技术人员考虑的许多受试者特异性考虑因素。
[0246]
任何合适数量的细胞治疗细胞可向受试者施用。虽然本文所述的单个细胞治疗细胞能够扩增并提供治疗益处，但在一些实施方案中，施用了102或更多(例如，103或更多、104或更多、105或更多、或者108或更多)个细胞治疗细胞。或者或另外，向受试者施用10
12
或更少(例如，10
11
或更少、109或更少、107或更少、或者105或更少)个本文所述的细胞治疗细胞。
在一些实施方案中，施用了10
2-105、10
4-107、10
3-109或10
5-10
10
个本文所述的细胞治疗细胞。
[0247]
本文所述的细胞治疗剂的剂量可以一次性施用或在合适的时间段内以一系列亚剂量施用至哺乳动物，所述时间段例如根据需要以每天、每半周、每周、每两周，每半月、每两月、每半年或每年为基础。包含有效量的细胞治疗剂的剂量单位可以单日剂量施用，或者总日剂量可以根据需要以二、三、四或更多个分剂量每日施用的方式施用。
[0248]
本文所述的多肽可以并入药物组合物中(例如，用作蛋白质治疗剂)。包含多肽的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法配制(参见例如remington’s pharmaceutical sciences第1447-1676页(alfonso r.gennaro编,第19版1995))。药物组合物可以以可注射制剂的形式肠道外施用，所述制剂包含水或另一种药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液。例如，药物组合物可以通过将多肽与药学上可接受的媒介物或介质(诸如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味赋形剂、稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂)适当地组合，然后以普遍接受的制药实践所需的单位剂量形式混合来配制。在药物制剂中包含的活性成分的量能够提供在指定范围内的合适剂量。
[0249]
注射用无菌组合物可根据常规制药实践使用注射用蒸馏水作为媒介物进行配制。例如，生理盐水或含有葡萄糖和其他补充剂(诸如d-山梨糖醇、d-甘露糖、d-甘露糖醇、丙二醇、聚乙二醇和氯化钠)的等渗溶液可用作注射用水溶液。
[0250]
可包含的其他项目是缓冲剂(诸如磷酸盐缓冲剂或乙酸钠缓冲剂)、镇痛剂(诸如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(诸如苯甲醇或苯酚)和抗氧化剂。配制的注射剂可以包装在合适的安瓿中。
[0251]
施用路径可以是肠道外的，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。施用可以是全身的或局部的，通过静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射。
[0252]
可以根据受试者的年龄和状况选择合适的施用方式。含有多肽的药物组合物的单剂量可选自0.001至1000mg/kg体重的范围。另一方面，剂量可以在0.001至100000mg/体重的范围内选择，但本公开不限于这些范围。施用剂量和方法可以根据受试者的体重、年龄、健康等而变化，并且可以根据本领域技术人员的需要适当地选择。
[0253]
肿瘤
[0254]
本公开提供了可用于治疗任何肿瘤的技术。在一些实施方案中，肿瘤是或包括血液恶性肿瘤，包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、毛细胞白血病、aids相关性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、多发性骨髓瘤或骨髓增生性肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是黑色素瘤。在一些实施方案中，肿瘤是b细胞肿瘤。
[0255]
在一些实施方案中，肿瘤是或包括实体瘤，包括但不限于乳腺癌、鳞状细胞癌、结肠癌(例如，结直肠癌)、头颈癌、卵巢癌、肺癌、间皮瘤、泌尿生殖癌症(genitourinary cancer)、直肠癌、胃癌或食道癌。
[0256]
在一些特定实施方案中，肿瘤是或包括晚期肿瘤和/或难治性肿瘤。在一些实施方案中，当在肿瘤中(例如，在从肿瘤获得的组织样品诸如活检样品中)观察到某些病理且/或当通常不认为患有此类肿瘤的癌症患者是常规化学疗法的候选者时，肿瘤表征为晚期肿瘤。在一些实施方案中，将肿瘤表征为晚期肿瘤的病理可包括肿瘤大小、遗传标记物的表达
改变以及肿瘤细胞对邻近器官和/或淋巴结的侵袭。在一些实施方案中，当患有肿瘤的患者对一种或多种已知的治疗方式(例如，一种或多种常规化学治疗方案)有抗性时且/或当特定患者已表现出对一种或多种此类已知的治疗方式的抗性(例如，缺乏反应性)时，肿瘤表征为难治性肿瘤。
[0257]
组合疗法
[0258]
如本文所述，在一些实施方案中，细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂与第二细胞治疗剂、抗体-药物缀合物、抗体和/或多肽组合施用。在一些实施方案中，第二细胞治疗剂(例如，car-t细胞)靶向和/或杀伤肿瘤的程度高于在不与本文所述的细胞治疗剂或蛋白质治疗剂组合治疗的情况下观察或测量到的水平。
[0259]
包含本文所述的细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂的药物组合物可以任选地含有一种或多种额外治疗剂(诸如癌症治疗剂，例如化学治疗剂或生物剂)和/或与其组合施用。可与本文所述的细胞治疗剂组合使用的化学治疗剂的实例包括铂化合物(例如，顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin))、烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、噻替哌(thiotepa)、美法仑(melphalan)、白消安(busulfan)、丙卡巴肼(procarbazine)、链脲佐菌素、替莫唑胺(temozolomide)、达卡巴嗪(dacarbazine)和苯达莫司汀(bendamustine))、抗肿瘤抗生素(例如，柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素c(mytomycin c)、普卡霉素(plicamycin)和更生霉素(dactinomycin))、紫杉烷(例如，紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel))、抗代谢药(例如，5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、培美曲塞(pemetrexed)、硫鸟嘌呤、氟尿苷、卡培他滨(capecitabine)和甲氨蝶呤)、核苷类似物(例如，氟达拉滨(fludarabine)、氯法拉滨(clofarabine)、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)和奈拉滨(nelarabine))、拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan))、去甲基化剂(例如，阿扎胞苷(azacitidine)和地西他滨(decitabine))、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))、表鬼臼毒素(例如，依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide))、dna合成抑制剂(例如，羟基脲)、长春花生物碱(例如，长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)和长春花碱(vinblastine))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib))、亚硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)、福莫司汀(fotemustine)和洛莫司汀(lomustine))、六甲嘧胺(hexamethylmelamine)、米托坦(mitotane)、血管生成抑制剂(例如，沙利度胺(thalidomide)和来那度胺(lenalidomide))、类固醇(例如，泼尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)和泼尼松龙(prednisolone))、激素类药物(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、亮丙瑞林(leuprolide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、格拉司琼(granisetron)和氟他胺(flutamide))、芳香化酶抑制剂(例如，来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole))、三氧化二砷、维甲酸、非选择性环氧合酶抑制剂(例如，非类固醇抗炎药、水杨酸盐、阿司匹林(aspirin)、吡罗昔康(piroxicam)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、萘普生(naprosyn)、双氯芬酸(diclofenac)、托美丁(tolmetin)、酮洛芬(ketoprofen)、萘布美通(nabumetone)和奥沙普秦(oxaprozin))、选
择性环氧合酶2(cox-2)抑制剂或其任何组合。
[0260]
可在本文所述的组合物和方法中使用的生物剂的实例包括单克隆抗体(例如，利妥昔单抗、西妥昔单抗、盘尼图玛单抗(panetumumab)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、吉妥单抗、贝伐珠单抗、卡妥索单抗、地舒单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、雷莫芦单抗(ramucirumab)、帕妥珠单抗、伊匹单抗、纳武单抗(nivolumab)、尼妥珠单抗、派姆单抗(lambrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、bms-936559、rg7446/mpdl3280a、medi4736、曲美木单抗(tremelimumab)或本文表1中所列出的其他单克隆抗体)、酶(例如，l-门冬酰胺酶)、细胞因子(例如，干扰素和白介素)、生长因子(例如，集落刺激因子和促红细胞生成素)、癌症疫苗、基因治疗载体或其任何组合。
[0261]
在一些实施方案中，本文所述的治疗方法是针对医学病状的其他治疗已失效或通过其他方式在治疗中不太成功的受试者进行的。此外，本文所述的治疗方法可以与医学病状的一种或多种额外治疗结合进行。例如，所述方法可以包括在施用本文所述的细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂或其组合物之前、基本上同时或之后施用癌症方案，例如非清髓性化学疗法、手术、激素疗法和/或放射。在某些实施方案中，已施用本文所述的细胞治疗剂和/或蛋白质治疗剂的受试者还可以用抗生素和/或一种或多种额外药剂来治疗。
[0262]
本公开的示例性氨基酸和核苷酸序列列出于下表中：
[0263]
表7
[0264][0265]
在本文所述的任何实施方案中，本文所述的蛋白质和/或融合蛋白具有与公开的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％同一性的氨基酸序列，和/或由与本文公开的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
[0266]
本文引用的所有出版物(包括genbank序列)均以引用的方式明确并入本文。
[0267]
实施例
[0268]
实施例1：双互补位融合蛋白的结合
[0269]
相对于含有由cd19变体和抗cll-1vhh组成的融合蛋白(#330)的表达的构建体和含有由野生型cd19和抗cll-1scfv组成的融合蛋白(#186)的表达的构建体的结合，对包含含有cd19变体、抗cll-1scfv和抗cll-1vhh的融合蛋白(#357)的表达的双互补位构建体结合cll-1阳性u937细胞的能力进行评价。简言之，通过以下方法测定结合亲和力：将u937细胞用fb(facs缓冲液pbs 1％bsa 0.1％叠氮化钠)洗涤，并且然后悬浮于fb中并在室温(rt)下用人fc封闭剂(becton dickinson)封闭10分钟。每个样品等分大约5x105个细胞。将细胞旋转，用fb洗涤，并且然后悬浮于100μl于fb中的双互补位或单特异性融合蛋白稀释液(上清液或以10μg/ml开始纯化)中。将细胞/融合蛋白混合物在4℃下孵育30分钟，并且然后用fb洗涤2次。将细胞悬浮于100μl fb中并且用fmc63-pe(millipore 5μl/测试)染色，并在4℃下孵育30分钟。在用fb洗涤2次之后，将细胞用pbs中最终浓度为1％的pfa(thermo scientific)固定，并且然后通过流式细胞术(accuri c6,becton-dickinson)进行分析。
[0270]
如图7所示，表达的双互补位融合蛋白和包含抗cll-1vhh的融合蛋白似乎以相似的亲和力(分别为0.7nm和1.0nm)结合。融合蛋白#330和#357的ec
50
值的差异似乎没有统计学意义。值得注意的是，表达的双互补位融合蛋白和含有vhh的融合蛋白都以比含有野生型cd19和抗cll-1scfv的融合蛋白(亲和力为约10nm)更大的亲和力结合。值得注意的是，一旦融合蛋白被纯化并且蛋白质浓度被确定提供比上清液更准确的稀释液，双互补位融合蛋白就比包含抗cll-1vhh的融合蛋白结合得更好，并且两者都比含有野生型cd19和抗cll-1scfv的融合蛋白结合得更好。(图14)
[0271]
双互补位融合蛋白与clec12a的结合也通过elisa检查。将96孔elisa板用0.1m碳酸盐溶液ph 9.5中的1μg/ml抗cd19单克隆抗体fmc63包被。将板在4℃下孵育过夜。将包被的板在室温下用tbs/0.3％脱脂奶粉(nfd)封闭60分钟。将板用tbst(0.1m tris、0.5m nacl、0.05％吐温20)洗涤。将纯化的双互补位融合蛋白稀释在tbs/bsa中，并以0.005μg/ml至1μg/ml的不同量添加，覆盖超过三个的最终浓度的对数。按照制造商的说明，使双互补位融合蛋白在室温下孵育1小时，然后将板洗涤并在室温下添加hrp偶联的抗his抗体60分钟，然后用于酶促检测。使用softmax软件的4参数曲线拟合函数计算表观ec
50
。
[0272]
此结合实验的结果示出在表8中。双互补位融合蛋白#357如单一vhh#330融合蛋白一样以0.01nm的ec
50
结合。scfv融合蛋白的结合亲和力要弱得多，为约2.5nm。
[0273]
表8：
[0274]
[0275]
实施例2：由表达的双互补位融合蛋白介导的细胞毒性
[0276]
将几种融合蛋白纯化并评价它们桥接靶向cd19的car-t细胞对表达cll-1的细胞的杀伤的能力。通过慢病毒转导将荧光素酶引入到u937细胞和29t-cll细胞中。在第1天将u937细胞以1x104/孔接种到圆底96孔板(thermo fisher)或将293t-cll-1细胞接种到平底板中的细胞培养基(rpmi 1640,10％fbs)中。在第2天，以0.2μg/ml(20ng/孔)(按照指示连续3倍稀释)添加融合蛋白#357、#330和#321，然后使用细胞培养孵育箱在37℃下孵育1小时。
[0277]
将car-cd19定向t细胞或未转导的细胞(utd)从保持在液氮中的预先等分的小瓶中新鲜解冻，并且用培养基洗涤一次以去除dmso。然后按照指示使用10:1或1:1的t细胞:靶细胞(又名效应子:靶标)细胞比率将car19 t细胞添加到96孔板，其中靶细胞是u937细胞。
[0278]
在第3天，将板在550rcf下旋转5分钟并用pbs冲洗，然后再次旋转以去除pbs。加入20μl 1x裂解缓冲液(荧光素酶测定系统promega)并将裂解物转移到96孔不透明组织培养板中。将每孔含有20μl细胞裂解物的96孔不透明组织培养板置于具有注射器的光度计(来自promega的glomax multi detection system)中。用注射器向每孔添加100μl荧光素酶测定试剂，然后立即读取孔。然后将板推进至下一个孔以重复注入然后读取的过程。293t-cll-1细胞系的细胞毒性测定是相似的，除了细胞被接种到平底板中并且细胞在裂解前不旋转。
[0279]
％细胞死亡(又名细胞毒性)计算如下：
[0280]
％杀伤＝[1-luc读数(实验孔)/luc读数(无car t细胞的肿瘤细胞)]x100。
[0281]
如图8所示，纯化的融合蛋白#186对u937和表达cll-1的293t细胞持续产生大约100pm的ic
50
值。在图8a中，阴性对照是蛋白#28(cd19蛋白)。在图8b中，未转导的t细胞(utd)作为阴性对照。如图9所示，由双互补位构建体#357产生的纯化的融合蛋白介导的杀伤比融合蛋白#330(约8倍)和融合蛋白#321(约25倍)更强效。在类似但使用5:1的较低e:t比率的实验中，双互补位融合蛋白的效力的增加甚至更加显著。结果(图10)显示双互补位融合蛋白#357介导的car-cd19细胞毒性比融合蛋白#330高约15倍。在这个特定实验中，融合蛋白#186的效力低至1nm。图15所示的实验结果进一步证实了这些结果。
[0282]
使用5:1e:t比率进行的第三细胞毒性测定示出了相似的效力趋势(图11)，使得双互补位融合蛋白#357介导的car-cd19的细胞毒性比融合蛋白#330高约15倍。
[0283]
实施例3：组成型表达的双互补位构建体的细胞毒性。
[0284]
为了测试组成型表达的双互补位构建体的细胞毒性，通过慢病毒转导将编码双互补位融合蛋白上游的cd19结合car的序列引入到t细胞中。简言之，将源自具有flag标签、cd28接头和跨膜结构域加cd28、4-1bb和cd3ζ细胞内结构域的fmc63抗体(vl-vh)的抗cd19 car序列(car-cd19)、然后p2a位点以及然后抗cll-1vhh 2h3变体cd19融合蛋白序列化学合成并通过lentigen technologies载体克隆到慢病毒载体中。通过lentigen产生病毒颗粒以供进一步研究。对于抗cll-1car对照(a260)，将序列合成并克隆到来自systems biosciences的修饰的载体中。为了制备仅car慢病毒颗粒，如sbi方案所述，通过瞬时转染hek 293ft细胞生成含有慢病毒的上清液。
[0285]
将沉淀的慢病毒颗粒悬浮于pbs中并用于原代t细胞转导。将所选cd3 人原代t细胞在补充有20iu/ml il-2的immunocult-xf t细胞扩增培养基(无血清/无异源物)中以
3x105个细胞/ml密度培养，用cd3/cd28 t细胞活化剂(stemcell technologies)活化并在第1天在1x transdux(sbi)的存在下用car-cd19加融合蛋白或抗cll-1car慢病毒颗粒转导。使细胞增殖直到在第10天收获，此时使用抗flag抗体(invitrogen)通过流式细胞术评估car-cd19的表面表达。表达构建体包含将cd19 car与双互补位融合蛋白分隔开的“p2a”裂解位点，使得所得转录/翻译将产生在t细胞表面上表达的car-cd19并导致双互补位融合蛋白的分泌。测试了三种构建体：lg405表达car-cd19并分泌变体cd19-双互补位抗clec12a融合蛋白；lg142(对照构建体)表达car-cd19并分泌野生型cd19-抗her2 scfv融合蛋白；并且a260是直接识别cll-1(clec12a)(car-clec12a)的对照car。将表达lg405构建体的细胞与cd19阳性nalm6细胞和cll-1阳性u937细胞以不同的效应子与靶标比共培养。nalm6细胞毒性的阳性对照是也表达car-cd19的lg142。u937细胞毒性的阳性对照是a260(car-clec12a)。图12示出了表达car-cd19并分泌双互补位融合蛋白的lg405转导的t细胞能够诱导cd19阳性nalm6细胞和cll-1阳性u937细胞两者的杀伤。值得注意的是，即使在3:1e:t比率下，针对u937细胞的细胞毒活性也达到了100％。
[0286]
分泌基于单个scfv或基于单个vhh的融合蛋白的car t细胞针对u937细胞的效力较低。测试了三种构建体：lg221转导的t细胞表达car-cd19并分泌cd19-抗cll-1scfv融合蛋白；lg355转导的t细胞表达car-cd19并分泌cd19-抗cll-1vhh(1b12)融合蛋白；并且lg356转导的t细胞表达car-cd19并分泌抗cll-1vhh(2h3)-cd19融合蛋白。在两项测定中，由lg221、lg355和lg356制备的car t细胞在低于30:1的e:t比率时失去了针对u937细胞的活性，并且因此其效力远低于由lg405制备的分泌变体cd19-双互补位抗clec12a融合蛋白的car t细胞(图13)。
[0287]
实施例4：额外双互补位构建体的结合
[0288]
为了进一步证实包含cd19变体、抗cll-1scfv和抗cll-1vhh的表达的双互补位融合蛋白的结合和细胞毒性能力，生成了具有与构建体#357相同的特性但缺少his标签的构建体。按照供应商的详细说明，培养u937(atcc)和oci-aml-5(dsmz)细胞。将细胞用pbs洗涤，悬浮于50μl facs缓冲液(pbs 1％bsa和0.1％叠氮化钠)中，并在室温下用人fc封闭剂(becton dickinson)封闭10分钟。然后，添加从1μg/ml开始以facs缓冲液稀释3倍的50μl融合蛋白(#357或#518)。将细胞/融合蛋白混合物在4℃下孵育30分钟，并且然后用facs缓冲液洗涤两次。将细胞悬浮于100μl facs缓冲液中，用fmc63-pe(millipore 5μl/测试)染色，并在4℃孵育30分钟。将细胞用facs缓冲液洗涤两次，用pbs中最终浓度为1％的pfa(thermo scientific)固定，并且然后通过流式细胞术分析。
[0289]
为了测试细胞毒性，将50μ1携带荧光素酶基因的u937细胞(u937-luc)于无抗生素的rpmi 1640培养基/10％fbs(rpmi/fbs)中以1
×
104个细胞/孔接种到96孔圆底板中。从60ng/ml开始稀释3倍制备25μl rpmi/fbs中的双互补位融合蛋白#357或#518稀释液，并且将其添加到细胞中。将car-cd19 t细胞(car254)解冻并通过在550rcf下离心10分钟用rpmi/fbs洗涤一次。将car t细胞添加到孔中，使car:靶细胞比率(e:t)为10:1。将板在37℃下孵育48小时。将板在550rcf下离心5分钟，用pbs冲洗沉淀，并再次旋转。然后，将20μl 1
×
裂解缓冲液(promega目录号e1500)添加到沉淀，并将裂解物转移到96孔不透明组织培养板(fisher scientific目录号353296)中。在具有分配底物(promega目录号e1500)的注射器的光度计中读取板。基于实验细胞相对于对照(未处理)细胞的平均发光损失来计算杀伤百
分比。
[0290]
图16a示出了带有his标签的双互补位构建体(#357)和不带his标签的构建体(#518)，通过facs证明在clec12a阳性细胞系aml5上的等效结合。使用clec12a阳性细胞系u937可观察到类似的等效性(图16b)。图16c证明了两种融合蛋白桥接car-cd19 t细胞与u937靶细胞并介导强效的细胞毒性的能力是等效的。
[0291]
实施例5：无his标签的组成型表达的双互补位构建体的细胞毒性
[0292]
为了进一步证实组成型表达的双互补位构建体的细胞毒性，通过慢病毒转导将编码缺少his标签的双互补位融合蛋白上游的cd19结合car的序列引入到t细胞中。此外，从car-cd19序列中去除flag标签。所得构建体称为#468。
[0293]
为了产生分泌cd19-抗cll融合蛋白的car-cd19 t细胞，将来自2个供体的cd3阳性人原代t细胞在补充有20iu/ml il-2的immunocult-xf t细胞扩增培养基(无血清/无异源物)中以3x 105个细胞/ml密度培养，用抗cd3/抗cd28 t细胞活化剂试剂(stemcell technologies)活化，并在第1天在1x transdux(sbi)的存在下用car-405慢病毒颗粒(lentigen,1.6-3.3x 106tu/ml)或car-468慢病毒颗粒(flash,qpcr为：4.3x 109tu/ml)转导。使细胞增殖直到在第10天收获。对于对照car即car-254、car-260和car408，基于supt1滴度添加颗粒。通过用抗flag抗体或cd19-fc(car-468)染色car t细胞来测量car-cd19表达百分比。简言之，将500,000个细胞与1:100稀释的抗flag抗体(thermo fisher)一起孵育，然后与抗兔apc(1:100稀释，thermo fisher)或0.25μg/ml cd19-fc(r&dsystems)一起孵育，然后与1:200稀释的抗fcγ(jackson immunoresearch)一起孵育。用2％多聚甲醛固定细胞，并使用bd accuri c6流式细胞仪测量flag阳性细胞群百分比。在这个比较中，所有car-t制剂的最低％为48％。如表9所示，在将car-t细胞添加到测定之前，通过用utd细胞稀释将其他car-ts标准化为48％阳性car表达。
[0294]
为了评估细胞毒性，按照供应商的详细说明，培养u937(atcc)、pl-21和oci-aml-5(dsmz)细胞。使用慢病毒(genecopoeia)和嘌呤霉素选择来生成荧光素酶表达细胞系。将携带荧光素酶基因的细胞在无抗生素的rpmi 1640 10％fbs中以1
×
104个细胞/孔(50μl)接种在96孔圆底板中。将car t细胞解冻并通过在450rcf下离心10分钟用rpmi/fbs洗涤一次。添加car t细胞，使e:t细胞比率分别为30:1、10:1、3:1或1:1。将板在37℃下孵育48小时。将板在450rcf下离心5分钟，并且用pbs冲洗沉淀，并再次旋转。然后，将20μl 1
×
裂解缓冲液(promega)添加到沉淀，并将裂解物转移到96孔不透明组织培养板(fisher)中。在具有注射器的光度计(glomax multi detection system,promega)中读取板。基于实验细胞相对于对照细胞(仅靶细胞)的平均发光损失计算杀伤百分比。
[0295]
在car-405扩增培养基(分批融合蛋白)中以及通过冷冻后刺激(融合蛋白分泌)测定双互补位融合蛋白浓度。为了在收获时(第10天)测量扩增期间的双互补位融合蛋白，收集了0.5ml无细胞培养基并在-20℃下冷冻。对于活化后的双互补位融合蛋白分泌，将car-405t细胞解冻并以3x 106个细胞/ml重悬浮于rpmi-1640/10％fbs中。将约6x 105个细胞(200μl重悬液)接种在96孔u型底板中，并用cd3/cd28 t细胞活化剂试剂(stemcell technologies)刺激。4天后，收获上清液并通过elisa测量双互补位蛋白的量。将96孔板用0.1m碳酸盐ph 9.5中的1.0μg/ml抗cd19 fmc63(novus)在4℃下包被过夜。将板在室温下用tbs中的0.3％脱脂牛奶封闭1小时。在tbst(0.1m tris、0.5m nacl、0.05％吐温20)中洗涤3
次之后，将100μl细胞培养上清液添加到板中，并在室温下孵育1小时。使用纯化的cd19-抗her2 scfv蛋白生成标准曲线。将板在tbst中洗涤3次，然后在室温下于黑暗中以1:2000添加hrp-抗his(biolegend)持续1小时。为了对结合的过氧化物酶进行酶促定量，添加1-step ultra tmb-elisa(thermo fisher)溶液并在405nm处读取板。使用四参数逻辑(4pl)回归拟合曲线以计算ec
50
。
[0296]
因为car-468t细胞分泌的双互补位融合蛋白在c末端缺少his标签，所以开发了另外的elisa测定。如上文对于car-405t细胞所述，收集样品。将96孔板用0.1m碳酸盐ph 9.5中的1.0μg/ml纯化的clec12a(sino biological)在4℃下包被过夜。将板在室温下用tbs中的0.3％脱脂牛奶封闭1小时。在tbst(0.1m tris、0.5mnacl、0.05％吐温20)中洗涤3次之后，将100μl细胞培养上清液添加到板中，并在室温下孵育1小时。使用纯化的融合蛋白#357生成标准曲线。
[0297]
将板在tbst中洗涤3次，并且然后在室温下于黑暗中添加1μg/ml抗cd19抗体fmc63(novus)持续1小时。再次洗涤板并在室温下添加hrp-抗小鼠igg抗体(jackson immunoresearch)持续30分钟。为了对与孔结合的过氧化物酶进行酶促定量，添加1-step ultra tmb-elisa(thermo fisher)溶液并在405nm处读取板。使用四参数逻辑(4pl)回归拟合曲线以计算ec50。
[0298]
为了确定ifnγ的产生，将car t细胞添加到u937细胞中，使e:t细胞比率分别为3:1。将板在37℃下孵育48小时。将板在450rcf下离心5分钟并收集上清液。然后在bd accuri c6仪器上实施细胞计数珠测定(cba)(becton dickinson，目录号551809)，以测量共培养上清液中存在的细胞因子。然后使用fcap阵列软件(soft flow hungary ltd，目录号641488)生成标准曲线并测定未知样品的浓度。
[0299]
将t细胞用表达car-cd19并分泌无his标签形式的双互补位构建体(#518)的慢病毒颗粒转导。使用来自不同供体的原代t细胞制备car t细胞(car468)，评估其表达和活性，并且将其与来自相同供体的car405 t细胞相比较。car t细胞(car468和car405)在许多参数上是等效的，如表9所概述。
[0300]
表9：
[0301][0302]
此外，如图17所示，表达不具有his标签的双互补位融合蛋白的car468 t细胞对多种表达clec12a的aml细胞系(u937；pl21；aml5)的杀伤与表达具有his标签的相同双互补位融合蛋白的car405一样或较之更好。
[0303]
实施例6：双互补位构建体的体内细胞毒性
[0304]
为了证实分泌双互补位融合蛋白的car-cd19 t细胞的体内功效，将其引入到nsg
tm
小鼠。所有动物研究均根据tufts university iacuc批准的指南进行。使用6-8周龄的
facs缓冲液(fb，pbs 1％bsa和0.1％叠氮化钠)中，并在室温下用人fc封闭剂(becton dickinson)封闭10分钟。然后，添加以facs缓冲液稀释(从3μg/ml开始，稀释3倍)的50μl纯化的融合蛋白#186、#330或#357。将细胞/融合蛋白混合物在4℃下孵育30分钟，并且然后用facs缓冲液洗涤两次。将细胞悬浮于100μl facs缓冲液中，用hib19-pe(biolegend 5μl/测试)染色，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用facs缓冲液洗涤两次，用pbs中最终浓度为1％的pfa(thermo scientific)固定，并且然后通过流式细胞术分析。
[0313]
图19示出抗clec12a vhh(在融合蛋白#330中)与q形式的结合非常好，但与k形式的结合非常弱(弱超过10,000倍)。相比之下，抗clec12a scfv(在融合蛋白#186中)与两种形式的结合都比较弱，但有相似的效力。值得注意的是，双互补位融合蛋白(#357)与两种形式(红线和黄线)的结合都非常好。双互补位构建体与q形式的结合较好(11.8pm)，但与k形式的结合非常好(43.1pm)。这些数据证实双互补位融合蛋白可以增强与靶蛋白(clec12a)的结合。
[0314]
实施例8：双抗原结合构建体的另外的实例
[0315]
为了进一步证明结合超过一种抗原的构建体的效用和有效性，产生了包含抗clec12a vhh；抗cd33 scfv；和cd19 ecd多肽的融合蛋白。含有cd19 ecd和抗cd33 scfv的融合蛋白称为#410。包含抗clec12a vhh、抗cd33 scfv和cd19 ecd的融合蛋白称为#440。
[0316]
使用纯化的融合蛋白#330、#410和#440运行对于与cd19、clec12a和cd33的结合进行的elisa。将96孔板用0.1m碳酸盐ph 9.5中的1.0μg/ml fmc63(novus)在4℃下包被过夜。将板在室温下用tbs中的0.3％脱脂牛奶封闭1小时。在tbst(0.1m tris、0.5mnacl、0.05％吐温20)中洗涤3次之后，使用tbs中的1％bsa的3倍稀释液滴定融合蛋白上清液，并在室温下孵育1小时。对于通过抗his进行的检测，在tbst中洗涤3次之后，以1:2000添加hrp-抗his(biolegend)。将板在室温下在黑暗中孵育1小时。为了检测与clec12a的结合，以0.5μg/ml添加生物素化的clec12a并孵育1小时。然后以1:2000添加hrp-sa(pierce)并在室温下于黑暗中孵育1小时。为了测试与cd33的结合，以0.5μg/ml添加生物素化的cd33并孵育1小时。然后以1:2000添加hrp-sa(pierce)并在室温下于黑暗中孵育1小时。然后，添加1-step ultra tmb-elisa(thermo fisher)溶液并在405nm处读取板。使用四参数逻辑(4pl)回归拟合曲线以计算ec
50
。
[0317]
为了测试融合蛋白与细胞的结合，将u937或molm14细胞用pbs洗涤，悬浮于50μl facs缓冲液(fb、pbs 1％bsa和0.1％叠氮化钠)中，并在室温下用人fc封闭剂(becton dickinson)封闭10分钟。然后，添加50μl于fb中的纯化的融合蛋白#330、#410或#440稀释液(从3μg/ml开始，稀释3倍)。将细胞/融合蛋白混合物在4℃下孵育30分钟，并且然后用fb洗涤两次。将细胞悬浮于100μl fb中，用抗cd19抗体fmc63-pe(millipore 5μl/测试)染色，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用fb洗涤两次，用pbs中最终浓度为1％的pfa(thermo scientific)固定，并且然后通过流式细胞术分析。
[0318]
为了测试细胞毒性，使用car19 t细胞制剂靶向荧光素酶标记的molm14或u937细胞的细胞毒性杀伤并且在一个剂量滴定中添加纯化的蛋白质#330、#410和#440。向每个孔(96透明圆底板)中添加rpmi培养基中的1x104个靶细胞。蛋白质滴定从180ng/ml开始，3倍连续滴定到相应孔中(每孔25μl)。将car-cd19 t细胞以不同的e:t比率添加到靶细胞中。48小时之后，将板离心(450rcf 5分钟)，并用pbs洗涤细胞1次，然后进行第二次离心。将20μl
裂解缓冲液添加到每个孔中。将细胞裂解物转移到96不透明白色板。在具有注射器的光度计(glomax multi detection system,promega)中读取板。基于实验细胞相对于对照细胞(仅靶细胞或仅靶细胞加融合蛋白)的平均发光损失来计算杀伤百分比。
[0319]
表10提供了表明双抗原结合融合蛋白(#440)；抗clec12a vhh2h3融合蛋白(#330)；以及抗cd33 scfv融合蛋白(#410)与clec12a和cd33的结合能力的elisa结果。双抗原结合融合蛋白与两种组分(clec12a和cd33)的结合同样好，具有相似的ec
50
值，这表明双抗原构建体中的每个单独组分都独立地起作用。图20表明双抗原结合融合蛋白能够结合表达每个单独抗原的u937细胞。图21示出了三种融合蛋白对u937(图21b)和molm14(图21a)细胞系的细胞毒性。融合蛋白对u937细胞的细胞毒性与结合数据相匹配，即最高的细胞毒性与最强效的结合物vhh的结合相匹配，尽管双抗原蛋白具有基本上相同的活性。有趣的是，在molm14细胞系上，scfv对cd33和双抗原结合物的效力大致相同，而vhh对clec12a的效力较低(仅vhh 2h3)。这可能是由于molm14细胞中两种等位基因都表达了clec12a的k变体。
[0320]
表10
[0321][0322]
序列表
[0323]
seq id no:1
[0324]
cccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtg cctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtcccc gcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgag gcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctac ctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaa tgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctc atgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggaga gcctccgtgtctcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctca ccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtc caggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgag cctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtc tgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggca acctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggc tgctgaggactggtggctggaag
[0325]
seq id no:2
[0326]
peeplvvkveegdnavlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrpl aiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcgl knrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppclpprdslnqslsqdltmapgstl wlscgvppdsvsrgplswthvhpkgpksllslelkddrpardmwvmetglllprataq dagkyychrgnltmsfhleitarpvlwhwllrtggwk
[0327]
vhh克隆序列
[0328]
seq id no:203(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头
(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas))
[0329][0330]
seq id no:204(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas))
[0331][0332][0333]
seq id no:205(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas))
[0334][0335]
seq id no:206(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0336][0337]
seq id no:207(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0338][0339]
[0340]
seq id no:208(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0341][0342]
seq id no:209(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0343][0344]
seq id no:210(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0345][0346]
seq id no:211(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0347][0348]
seq id no:212(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0349][0350]
seq id no:213(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0351][0352]
seq id no:214(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0353][0354]
seq id no:215(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0355][0356]
seq id no:216(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0357][0358]
seq id no:217(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表
示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0359][0360][0361]
seq id no:218(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0362][0363]
seq id no:219(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0364][0365]
seq id no:220(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0366][0367][0368]
seq id no:221(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0369][0370]
seq id no:222(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0371][0372]
seq id no:223(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0373][0374]
seq id no:224(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0375][0376]
seq id no:225(加下划线的序列依次表示cdr1、cdr2和cdr3；在c末端的粗斜体表示(i)9个氨基酸的接头(tsgpggqga)；(ii)myc标签(eqkliseedl)；(iii)2个氨基酸的接头(ga)；(iv)六组氨酸标签(hhhhhh)；以及(v)额外3个氨基酸(gas)):
[0377][0378]
双互补位构建体序列
[0379]
序列特征的关键：信号序列加下划线；cd19序列以斜体显示；抗体或其片段(例如，scfv或vhh)以粗体显示，cdr以粗体显示并加划线；间隔区/标签序列(myc-his或his)以粗体和斜体显示；car序列以灰色阴影显示，car内的flag标签以粗体显示；弗林蛋白酶裂解和p2a位点加下划线且以斜体和粗体显示
[0380]
构建体#186
[0381]
核苷酸：seq id no:300
[0382]
atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaac ctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatg gccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctgg ggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctca acagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggct ggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctg ggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccc caagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtctcccacc gagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggc tgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcacccca aggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaa tggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtg gcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccaggaggaggtgggtctggaggtg gaggatctggtggaggtgggtctggaggaggtgggtctgacatggcccaggtgcagctgcaggag agcggccccggcctggtgaagcccagcgagaccctgagcctgacctgcgtggtgagcggcggca gcatcagcagcagcaactggtggagctgggtgaggcagccccccggcaagggcctggagtggatc ggcgagatctaccacagcggcagccccgactacaaccccagcctgaagagcagggtgaccatcag cgtggacaagagcaggaaccagttcagcctgaagctgagcagcgtgaccgccgccgacaccgccgtgtactactgcgccaaggtgagcaccggcggcttcttcgactactggggccagggcaccctggtg accgtgagcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgagatcgagctgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcag ggccagccagagcatcagcagctacctgaactggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagc tgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagc ggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccag cagagctacagcaccccccccaccttcggccccggcaccaaggtggagatcaagaggacccacca ccaccaccaccac
[0383]
氨基酸：seq id no:301
[0384][0385]
构建体#321
[0386]
核苷酸：seq id no:302
[0387]
atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggc ccgaggagcccctggtggtgaaggtggaggagggcgacaccgccgtgctgccctgc ctgaagggcaccagcgacggccccacccagcagctgacctggagcagggagagccc cctgaagcccttcctgaagtacagcctgggcgtgcccggcctgggcgtgcacgtga ggcccgacgccatcagcgtggtgatcaggaacgtgagccagcagatgggcggcttc tacctgtgccagcccggcccccccagcgagaaggcctggcagcccggctggaccgt gaacgtggagggcagcggcgagctgttcaggtggaacgtgagcgacctgggcggcc tgggctgcggcctgaagaacaggagcagcgagggccccagcagccccagcggcaa gctgatgagccccaagctgtacgtgtgggccaaggacaggcccgagatctgggagg gcgagcccccctgcctgccccccagggacagcctgaaccagagcctgagccaggac ctgaccatggcccccggcagcaccctgtggctgagctgcggcgtgccccccgacag cgtgagcaggggccccctgagctggacccacgtgcaccccaagggccccaagagcc tgctgagcctggagctgaaggacgacaggcccgccagggagatgatcgtggacgag accggcctgctgctgcccagggccaccgcccaggacgccggcaagtggtactgcag caggggcaacgtgaccaccagctaccacctggagatcaccgccaggcccgtgaaggcccacagcgacctgaggaccggcggctggaagggaggaggtgggtctggaggtgg aggatctggtggaggtgggtctggaggaggtggatcccaggtgcagctgcaagcgt ctgggggaggcttggtgcaggctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctcaggaagcatcttcgctattaatgaaatcaatcttatggggtggtaccgccaggctccag ggaagcagcgcgagttggtcgcagcttgtgctagtgatggcaacacatactatgcg gactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccgagaaaacggtgtatctgcagatgaacaacctgaaacctgacgacacagccgtctattactgtgatgcgaa ttcgagggggaattattattcgggccaggggacccaggtcaccgtttcctcaactag tggcccgggaggccaaggcgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgggcgcacaccatcaccaccatcatggcgcatct
[0388]
氨基酸：seq id no:303
[0389][0390]
构建体#330
[0391]
核苷酸：seq id no:304
[0392]
atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctctttttagaggtgtccagtgtc aggtgcagctgcaggagtctgggggaggcttggtgcaggctggggggtcccttaga ctctcctgtgtagcctctggaagcatcagaagtatcaatgtcatgggctggtaccgc caggctccagggaagcagcgcgagttggtcgcagcttgtgctagtgatggcaacac atactatgcggactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccgaga aaacggtgtatctgcagatgaacaacctgaaacctgacgacacagccgtctattact gtgatgcgaattcgagggggaattattattcgggccaggggacccaggtcaccgttt cctcaactagtggcccgggaggccaaggcgcaggaggaggtgggtctggaggtgga ggatctggtggaggtgggtctggaggaggtggatcccccgaggaacctctagtggt gaaggtggaagagggagataccgctgccctgtggtgcctcaaggggacctcagatg gccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaat acagcctgggggtgccaggcctgggagtgcacgtgaggcccgacgccatcagcgtggttatccggaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggccc ccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcgggga gctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacag gtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgt gtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtctcccaccga gggacagcctgaaccagagcctcagccgggacctcaccgttgcccctggctccaca ctctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctgg acccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacga tcgcccggccagagatatgtgggtaatgggcacgagcctgatgttgccccgggcca cagctcaagacgctggaaagtggtattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattcc acctggagatcactgctcggccatctagacatcatcaccatcaccat
[0393]
氨基酸：seq id no:305
[0394][0395]
构建体#357
[0396]
核苷酸：seq id no:306
[0397]
atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctctttttagaggtgtccagtgtg acatggcccaggtgcagctgcaggagagcggccccggcctggtgaagcccagcgag accctgagcctgacctgcgtggtgagcggcggcagcatcagcagcagcaactggtg gagctgggtgaggcagccccccggcaagggcctggagtggatcggcgagatctacc acagcggcagccccgactacaaccccagcctgaagagcagggtgaccatcagcgtg gacaagagcaggaaccagttcagcctgaagctgagcagcgtgaccgccgccgacac cgccgtgtactactgcgccaaggtgagcaccggcggcttcttcgactactggggcca gggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc ggcggcggcggcagcgagatcgagctgacccagagccccagcagcctgagcgcca gcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagagcatcagcagctac ctgaactggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgc cagcagcctgcagagcggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccg acttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagagctacagcaccccccccaccttcggccccggcaccaaggtggagatcaag aggaccggcggcggaggatctggcggaggtggaagcggaggcggaggaagcggtg gcggcggatctcaggtgcagctgcaggagtctgggggaggcttggtgcaggctggg gggtcccttagactctcctgtgtagcctctggaagcatcagaagtatcaatgtcatg ggctggtaccgccaggctccagggaagcagcgcgagttggtcgcagcttgtgctag tgatggcaacacatactatgcggactccgtgaagggccgattcaccatctccagag acaacgccgagaaaacggtgtatctgcagatgaacaacctgaaacctgacgacaca gccgtctattactgtgatgcgaattcgagggggaattattattcgggccaggggacc caggtcaccgtttcctcaactagtggcccgggaggccaaggtgcaggaggaggggg gtctgggggtggaggatctggtggaggtgggtctggaggaggtggatcccccgagg aacctctagtggtgaaggtggaagagggagataccgctgccctgtggtgcctcaag gggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaa cccttcttaaaatacagcctgggggtgccaggcctgggagtgcacgtgaggcccga cgccatcagcgtggttatccggaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtg ccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtgg agggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgt ggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgag ccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctc cgtgtctcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccggg
acctcaccgtt gcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccagg ggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagccta gagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatgggcacgagcctgat gttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtggtattgtcaccgtggcaacc tgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccatctagacatcatcaccatc accat
[0398]
氨基酸：seq id no:307
[0399][0400][0401]
构建体#221
[0402]
核苷酸：seq id no:308
[0403]
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在akbarzadeh-sharbaf等人,2012adv biomed res.1:21中的曲妥珠单抗的cdr
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