治疗胆汁酸性腹泻的方法1.政府权利2.本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号dk099803、dk072517、dk101373、ey013574和dk089502的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
技术领域：
：3.本发明涉及通过施用cftr氯离子通道抑制剂来治疗胆汁酸性腹泻的方法。
背景技术：
：：4.胆汁酸性腹泻(bad)常见于回肠切除术后和克罗恩病中，据信发生在超过三分之一的患有腹泻型肠易激综合征(ibs-d)或慢性功能性腹泻患者中，据估计，西方国家的总体患病率高达1％。bad可以由肝胆汁酸合成或肠肝循环中的异常引起，这导致过量的胆汁酸输送到结肠，在此处导致液体分泌并增加运动性。5.目前对原发性bad或由回肠切除术或克罗恩病引起的bad的疗法包括胆汁酸结合剂如消胆胺、考来替泊和考来维仑，以及法尼醇x受体(fxr)激动剂如奥贝胆酸正在开发中。对于ibs-d(其中bad可能与超过三分之一患者的发病机制有关)，fda批准的疗法包括5-ht3拮抗剂阿洛司琼、混合μ阿片受体激动剂伊卢多啉和广谱肠道特异性抗生素利福昔明。ibs-d的其他常用疗法包括洛哌丁胺、胆汁酸螯合剂、镇痉剂和三环抗抑郁剂。这些疗法中的一些与严重的副作用例如与阿洛司琼有关的缺血性结肠炎和与伊卢多啉有关的胰腺炎相关。6.对bad的改善和替代疗法的需求仍未得到满足。7.囊性纤维化跨膜传导调节子(cftr)蛋白是在某些哺乳动物上皮细胞(包括肠上皮细胞)中表达的氯离子通道。cftr氯离子通道功能与分泌性腹泻相关。8.cftr抑制剂在分泌性腹泻的疗法中有临床应用。由肠毒素引起的分泌性腹泻，例如霍乱和旅行者腹泻(肠致病性大肠杆菌)，需要功能性cftr用于将主要氯离子分泌到肠腔，进而驱动钠和水分泌(参见，例如，kunzelmann等人，physiol.rev.82:245-89(2002)；thiagarajah等人，curr.opin.pharmacol.3:594-9(2003))。细胞培养和动物模型表明肠毒素介导的分泌性腹泻中的肠氯离子分泌主要通过cftr发生(参见，例如，clarke等人，science257:1125-28(1992)；gabriel等人，science266:107-109(1994)；kunzelmannandmall,physiol.rev.82:245-89(2002)；field,15j.clin.invest.111:931-43(2003)；和thiagarajah等人，gastroenterology126:511-519(2003))。先前已经描述了几类小分子cftr抑制剂(参见，例如，verkman等人的综述，nat.rev.drugdiscov.8:153-71(2009))。9.美国专利第9,062,073号描述了一系列苯并嘧啶并-吡咯并-噁嗪-二酮(bpo)化合物和某些嘧啶并-吡咯并-喹喔啉二酮(ppq)化合物，它们可用作cftr氯离子通道抑制剂。bpo化合物具有通式：[0010][0011]其中：[0012]m是1、2、3或4；[0013]n是1、2、3、4或5；[0014]p是0至4的整数；[0015]q是1至4的整数；[0016]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0017]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0018]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h、或c1-c6烷基；[0019]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、或氨基酸残基；[0020]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-c20烷基、糖类、或氨基酸残基；以及[0021]z是芳基或杂芳基，[0022]其中氨基酸残基选自以下的残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺、鸟氨酸、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、甲基丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸、甲硫氨酸砜、叔丁基甘氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、糖基化苏氨酸、糖基化丝氨酸和糖基化天冬酰胺。[0023]ppq化合物具有通式：[0024][0025]其中：[0026]m是1、2、3或4；[0027]n是1、2、3、4或5；[0028]p是0至4的整数；[0029]q是1至4的整数；[0030]x是o或s；[0031]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0032]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0033]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h或c1-6烷基；[0034]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、氨基酸残基、或肽；[0035]r4是h、—n(═o)、c1-6烷基、或卤代烷基；[0036]r5是h、卤素、或c1-6烷基；[0037]r6是卤素、c1-6烷基、或c1-6卤代烷基；以及[0038]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-20烷基、糖类、氨基酸残基、或肽。技术实现要素：[0039]本发明的方面涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向所述个体施用有效治疗所述胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0040]本发明的其他方面涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向所述个体施用包含有效治疗所述胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0041]此外，本发明的方面还涉及减少有需要的个体中由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端(apical)cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向所述个体施用有效减少由胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活引起的所述肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0042]本发明的其他方面涉及减少有需要的个体中由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向所述个体施用包含有效减少由胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活引起的所述肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0043]本发明的另外的方面涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道电流的方法，包括向所述个体施用有效减少所述胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0044]本发明的其他方面涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道电流的方法，包括向所述个体施用包含有效减少所述胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0045]在一些方面，本发明涉及用于在经历回肠切除术的个体中治疗腹泻或减轻与腹泻相关的症状的方法，包括向所述个体施用有效治疗所述腹泻或减轻所述腹泻的症状的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0046]本发明的其他方面涉及用于在经历回肠切除术的个体中治疗腹泻或减轻与腹泻相关的症状的方法，包括向所述个体施用包含有效治疗所述腹泻或减轻所述腹泻的症状的量的cftr氯离子通道的药物组合物。附图说明[0047]图1.cftr抑制剂阻断t84细胞中胆汁酸诱导的分泌电流。(a.)示出对添加到顶端和基底外侧(basolateral)浸浴溶液二者中的指定胆汁酸的响应的短路电流(isc)。(r)-bpo-27以10μm(代表针对胆酸、熊去氧胆酸和石胆酸研究的3个过滤器；以及针对去氧胆酸、鹅去氧胆酸及其牛磺结合物的5个过滤器)添加。(b.)将cdca(0.75mm)添加到两种浸浴溶液中，并按指示添加(r)-bpo-27(10μm)或cftrinh-172(10μm)。(c.)峰值cdca诱导电流和(r)-bpo-27或cftrinh-172之后电流减少的总结(△isc，平均值±s.e.m.，每个条件n＝7-8个过滤器)。(d.)示出添加到基底外侧或顶端浸浴溶液的cdca(1mm)以及按指示添加的(r)-bpo-27(10μm)的影响的小鼠结肠中的短路电流。[0048]图2.cdca从t84细胞单层的顶端侧作用以激活顶端cftr。(a.)在基底外侧或顶端浸浴溶液中添加cdca。(上图)代表性短路电流曲线，(r)-bpo-27以10μm添加。(下图)峰值cdca诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝7-8，**p《0.01，ns，与零影响相比不显著)。(b.)将从0.75mm增加到2mm的cdca添加到基底外侧浸浴溶液中，随后添加毛喉素(10μm添加到两侧)和(r)-bpo-27(10μm)。(c.)在基底外侧到顶端溶液cl-梯度(基底外侧[cl-]120mm，顶端[cl-]5mm)的存在下，用250μg/ml两性霉素b进行基底外侧膜透化后t84细胞中的短路电流。将cdca(0.75mm或1mm)添加到顶端浸浴溶液中，随后添加(r)-bpo-27(10μm)。[0049]图3.cdca对t84细胞中的camp信号传导的影响很小。(a.)示出指定浓度的cdca然后毛喉素(10μm)并且随后(r)-bpo-27(10μm)的影响的短路电流。(b.)峰值毛喉素诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝4-6，**p《0.01，ns，与具有0mmcdca的毛喉素响应相比不显著)。(c.)在与指定浓度的cdca在有或没有10μm毛喉素的情况下孵育之后30分钟测量的t84细胞中的camp(平均值±s.e.m.，n＝3-6，**p《0.01，ns，不显著)。[0050]图4.t84细胞中的cdca作用涉及ca2 信号传导。(a.)示出在bapta-am(30μm)预处理25分钟之后cdca(1mm)然后(r)-bpo-27(10μm)的影响的短路电流。(b.)有或没有bapta-am预处理的情况下的峰值cdca诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝4-5，**p《0.01)。(c.)通过fluo-4荧光测量的细胞质ca2 浓度。将cdca(0.75，1mm)、atp(100μm)或碳酰胆碱(100μm)添加到有或没有bapta-am(30μm)预处理30分钟的顶端浸浴溶液中。(d.)fluo-4荧光中的峰值增加(平均值±s.e.m.，n＝3-6，**p《0.01，ns，不显著)。[0051]图5.由结肠样体(colonoids)产生的平面单层培养物组成的人结肠上皮细胞原代培养物中的cdca分泌反应。(a.)(上图)示出向顶端或基底外侧浸浴溶液中添加的指定的cdca浓度、然后毛喉素(10μm)和(r)-bpo-27(5μm)的影响的短路电流。(b.)峰值cdca诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝9-13)。(c.)示出在bapta-am(30μm)预处理20分钟之后cdca(0.5mm)然后毛喉素(10μm)和(r)-bpo-27(5μm)的影响的短路电流。(d.)添加cdca(0.75mm)或atp(100μm)的细胞质ca2 浓度的荧光测量。[0052]图6.在小鼠中的闭合肠袢中的cdca诱导的液体分泌。(a.)cdca诱导的液体分泌的时间过程。将pbs(10mm)中的100μlcdca或pbs注射到中段空肠闭合袢中，并在不同时间切下袢以测量袢重量和长度(平均值±s.e.m.，每组n＝5-9个袢，**p《0.01)。(b.)闭合空肠袢中cdca影响的浓度依赖性。将100μlcdca或pbs注射到闭合中段空肠袢中(平均值±s.e.m.，n＝每组3-14个袢，**p《0.01，ns，不显著)。(c.)闭合结肠袢中cdca影响的浓度依赖性。将100μlcdca或pbs注射到闭合结肠袢中(平均值±s.e.m.，n＝每组3-5个袢，**p《0.01，ns，不显著)。[0053]图7.(r)-bpo-27抑制小鼠闭合肠袢中cdca诱导的液体分泌。(a.)实验方案。(b.)(左图)在有或没有bpo-27(r或s对映异构体)的情况下用cdca(10mm)或pbs注射的中段空肠袢的重量/长度比(平均值±s.e.m.，每组n＝6-7个s.e.m.)，**p《0.01，ns，不显著)。(右图)在有或没有bpo-27的情况下cdca和pbs注射的袢的代表性照片。(c.)(左图)在有或没有(r)-bpo-27的情况下用cdca(2.5，10mm)或pbs注射的结肠袢的重量/长度比(平均值±s.e.m.，每组n＝4-7个袢，**p《0.01，ns，不显著)。(右图)在有或没有(r)-bpo-27的情况下cdca和pbs注射的袢代表性照片。(d.)用cdca(2.5，10mm)注射的囊性纤维化(cftr缺乏)小鼠的中段空肠袢或结肠袢的重量/长度比(平均值±s.e.m.，n＝每组4个袢，**p《0.01，ns，不显著)。[0054]图8.(r)-bpo-27减少了胆汁酸性腹泻的大鼠模型中粪便含水量的增加。(a.)实验方案(上图)和在中段结肠输注500μl含有伊文思蓝染料的pbs后10分钟拍摄的照片(下图)。(b.)在有或没有(r)-bpo-27预处理的大鼠中中结肠输注后的4小时粪便排出量(湿重)(平均值±s.e.m.，pbs治疗组中n＝4只大鼠，cdca治疗组中n＝8只大鼠)，*p《0.05，ns，不显著)。(c.)(左图)来自b中收集的粪便的粪便含水量(来自湿重/干重测量的水百分比)(**p《0.01，ns，不显著)。(右图)示出各个大鼠的粪便含水量增加的配对分析(在相同大鼠中0-4小时的粪便水减去输注前的粪便水)(*p《0.05，**p《0.01，ns，不显著)。[0055]示例性性实施方案的详细描述[0056]本发明可以通过参考以下形成本公开内容一部分的详细描述来理解。本发明不限于在此描述和/或示出的特定方法、条件或参数，并且在此使用的术语仅用于通过实例的方式描述特定实施方案的目的，并不旨在限制要求保护的发明。[0057]除非本文另有定义，否则与本技术相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。[0058]如本文所用，术语“组合物”、“化合物”、“药物”、“药理学活性剂”、“活性剂”或“药物”在本文中可互换使用以指代物质的一种化合物或多种化合物或组合物，当将其向个体(人或哺乳动物)施用时通过局部和/或全身作用诱导期望的药理学和/或生理学作用。[0059]如本文所用，术语“治疗”或“疗法”(及其不同形式)包括预防性(例如，预防性)、治愈性或姑息性治疗。如本文所用，术语“治疗”包括减轻或减少病况、疾病或病症的至少一种不利或负面影响或症状。[0060]术语“施用”意指直接施用本发明的化合物或组合物。[0061]术语“个体”在本文中用于指对其提供用根据本发明的化合物的治疗，包括预防性治疗的人或驯养哺乳动物(例如，狗、猫)。[0062]在本发明中，所公开的化合物可以以药学上可接受的盐的形式制备。“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，碱性残基如胺的矿物盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括由例如无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒盐包括衍生自以下无机酸的那些，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和由以下有机酸制备的盐，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。这些药学上可接受的盐通过本领域已知的方法，例如通过将游离胺碱用过量的酸溶解在含水醇中，或用碱金属碱如氢氧化物或用胺中和游离羧酸制备。[0063]本发明涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向个体施用有效治疗胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0064]在一些方面中，本发明涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法。胆汁酸性腹泻(bad)是临床诊断的病况，其中腹泻被认为是由胆汁酸吸收不良或失调引起的。参见，例如，m.camilleri,advancesinunderstandingofbileaciddiarrhea,expertrevgastroenterolhepatol.2014年1月；8(1):49–61。诊断bad的方法是本领域已知的。参见，例如，id。[0065]在本文公开的方法的一些方面中，向个体施用一定量的cftr氯离子通道抑制剂(cftr-cci)。如本文所用，cftr氯离子通道是指囊性纤维化跨膜传导调节子(cftr)，其为在肺、肠、胰腺、睾丸和其他组织的上皮中表达的camp激活的氯离子通道。如本文所用的术语cftr氯离子通道抑制剂(或“cftr-cci”)是指现有技术中描述的可用于一种或多种医学目的的任何囊性纤维化跨膜传导调节子氯离子通道抑制剂，包括在以下中描述的那些：u.s.专利号9,062,073、7,235,573、7,638,543、7,414,037和7,888,332；u.s.申请公开号2009/0253799；国际专利申请公开号wo09/120803和wo09/146144；以及mat,等人thiazolidinonecftrinhibitoridentifiedbyhigh-throughputscreeningblockscholeratoxin-inducedintestinalfluidsecretion.j.clin.invest.2002；110:1651–1658；sonawanen,verkmanas.thiazolidinonecftrinhibitorswithimprovedwatersolubilityidentifiedbystructure-activityanalysis.bioorg.med.chem.2008；16:8187–8195,andmuanprasatc,等人discoveryofglycinehydrazidepore-occludingcftrinhibitors:mechanism,structure-activityanalysis,andinvivoefficacy.j.gen.physiol.2004；124:125–137。这些参考文献中的每一个均通过引用整体并入本文。[0066]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpocftr氯离子通道抑制剂(bpo-cftr-cci)。bpo-cftr-cci是一般结构[0067][0068]所包含的化合物[0069]其中：[0070]m是1、2、3或4；[0071]n是1、2、3、4或5；[0072]p是0至4的整数；[0073]q是1至4的整数；[0074]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0075]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0076]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h、或c1-c6烷基；[0077]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、或氨基酸残基；[0078]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-c20烷基、糖类、或氨基酸残基；以及[0079]z是芳基或杂芳基，[0080]其中氨基酸残基选自以下的残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺、鸟氨酸、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、甲基丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸、甲硫氨酸砜、叔丁基甘氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、糖基化苏氨酸、糖基化丝氨酸和糖基化天冬酰胺。[0081]在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是下式的化合物[0082][0083]其中：[0084]r1是h、卤素、或c1-6烷基；[0085]r2和r3各自相同或不同且独立地为h、卤素、—no2、c1-6烷基、四唑基、—s(o)2or7,或—c(═o)or7；[0086]r5是h、卤素,或c1-6烷基；[0087]r6是卤素、c1-6烷基,或c1-6卤代烷基；以及[0088]r7是h、c1-6烷基、糖类、氨基酸残基、或肽。[0089]bpo-cftr-cci在美国专利号9,062,073中描述，该专利通过引用整体并入本文。[0090]在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是(r)-bpo-27，其为具有下述结构的化合物：[0091][0092]在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppqcftr氯离子通道抑制剂(ppq-cftr-cci)。ppq-cftr-cci是一般结构[0093]所包含的化合物[0094]其中：[0095]m是1、2、3或4；[0096]n是1、2、3、4或5；[0097]p是0至4的整数；[0098]q是1至4的整数；[0099]x是o或s；[0100]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0101]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0102]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h或c1-6烷基；[0103]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、氨基酸残基、或肽；[0104]r4是h、—n(═o)、c1-6烷基或卤代烷基；[0105]r5是h、卤素或c1-6烷基；[0106]r6是卤素、c1-6烷基或c1-6卤代烷基；以及[0107]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-20烷基、糖类、氨基酸残基、或肽。[0108]ppq-cftr-cci在美国专利号9,062,073中描述，该专利通过引用整体并入本文。[0109]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是噻唑烷酮cftr氯离子通道抑制剂(td-cftr-cci)。td-cftr-cci是一般结构:[0110]所包含的化合物[0111]或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，[0112]其中[0113]y是-nh-或不存在；[0114]w是＝ch-、-s-、-o-、-c(＝s)-、或-c(＝o)-；[0115]z1、z2、z3、z4和z5各自独立地是o或s；[0116]j是c、s、o、或n；[0117]q是c或n；[0118]r1、r2、r3和r9各自独立地是h、c1-6烷基、烷氧基、卤素、-cf3、-cf2cf3、或-ocf3；[0119]r5是h、卤素、c1-6烷基或不存在；[0120]x1、x2、x3和x4各自独立地是h、-oh、-sh、卤素、四唑并、-p(＝o)(oh)2、-c(＝z3)z4h、-z5-c(＝z3)z4h、或-z5-ch2-c(＝z3)z4h；以及[0121]x5是–o-、四唑并、-c(＝o)oh、-o-c(＝o)oh或不存在。[0122]td-cftr-cci也是一般结构：[0123]所包含的化合物[0124]其中x1是三氟甲基；[0125]x2和x3独立地选自氢和卤素基团；[0126]y1、y2和y3独立地选自氢、c1-c8烷基、c1-c7烷氧基、碳酸酯、氨基甲酸酯、羧基、卤基、硝基、偶氮基、羟基和巯基。[0127]td-cftr-cci也是在以下中描述的化合物：mat,等人thiazolidinonecftrinhibitoridentifiedbyhigh-throughputscreeningblockscholeratoxin-inducedintestinalfluidsecretion.j.clin.invest.2002；110:1651–1658；和sonawanen,verkmanas.thiazolidinonecftrinhibitorswithimprovedwatersolubilityidentifiedbystructure-activityanalysis.bioorg.med.chem.2008；16:8187–8195；u.s.专利号7,235,573、7,638,543以及国际专利申请公开号wo09/120803。这些参考文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。[0128]在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172，其具有结构[0129]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是甘氨酸酰肼cftr氯离子通道抑制剂(gh-cftr-cci)。gh-cftr-cci是结构：[0130]所包含的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，[0131]其中x1是氢或者经取代或未经取代的、饱和线性或支化的烷基；[0132]y是氢或经取代或未经取代的、饱和线性或支化的烷基；[0133]r1是未经取代的苯基，[0134]经取代的苯基，其中苯基经羟基、烷基和卤素中的一个或多个取代，[0135]经取代或未经取代的喹啉基，[0136]经取代或未经取代的蒽基，或者[0137]经取代或未经取代的萘基；[0138]r2是未经取代的苯基，[0139]经取代的苯基，其中苯基经溴或羧基取代，[0140]二(羟基)苯基，[0141]单-(卤素)-单(羟基)苯基，[0142]单(卤素)-二(羟基)苯基，[0143]单(卤素)-三(羟基)苯基，[0144]二(卤素)-单(羟基)苯基，[0145]二(卤素)-二(羟基)苯基，[0146]二(卤素)-三(羟基)苯基，[0147]单(卤素)-单(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0148]单(卤素)-二(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0149]单(卤素)-单(羟基)-二(烷氧基)苯基，[0150]单(卤素)-二(羟基)-二(烷氧基)苯基，[0151]二(卤素)-单(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0152]二(卤素)-二(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0153]二(卤素)-单(羟基)-二(烷氧基)苯基；以及[0154]r3是氢或经取代或未经取代的烷基。[0155]gh-cftr-cci也是通式：[0156]所包含的化合物[0157]或其药学上可接受的盐或立体异构体，[0158]其中y″是经取代或未经取代的、饱和线性或支化的烷基；或连接至极性分子的酰胺或醚接头，其中极性分子选自经取代或未经取代的苯基、聚氧烷基聚醚、聚乙烯亚胺、二糖、三糖、聚烷基亚胺和小氨基葡聚糖；[0159]r1是未经取代或经取代的苯基、经取代或未经取代的喹啉基、经取代或未经取代的蒽基、或经取代或未经取代的萘基；[0160]r2是未经取代或经取代的苯基；以及[0161]r3是氢或经取代或未经取代的烷基，从而抑制cftr[0162]gh-cftr-cci也是通式：[0163][0164]所包含的化合物[0165]或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，[0166]其中：[0167]r1和r1相同或不同且独立地是任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、任选取代的喹啉基、任选取代的蒽基、或任选取代的萘基；[0168]r2、r2'、r3、r3'、r4、r4'、r5、r5'、r6和r6'各自相同或不同且独立地为氢、羟基、cig烷基、cig烷氧基、羧基、卤素、硝基、氰基、-so3h、-s(＝o)2nh2、芳基、和杂芳基；[0169]r13、r13、r14和r14各自相同或不同且独立地为氢或c1-8烷基；[0170]x和x'各自是相同或不同的接头部分；[0171]j和j'各自是相同或不同的间隔部分；[0172]a是聚合物亚单元；以及n是0至2500之间的整数。[0173]gh-cftr-cci也是在以下中描述的化合物：muanprasatc,等人discoveryofglycinehydrazidepore-occludingcftrinhibitors:mechanism,structure-activityanalysis,andinvivoefficacy.j.gen.physiol.2004；124:125–137；u.s.专利号7,414,037和7,888,332；u.s.申请公开号2009/0253799；国际专利申请公开号wo09/146144。这些参考文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。[0174]在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101，其具有结构[0175][0176]其他cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐、和尼氟灭酸。[0177]在本文公开的方法的一些实施方案中，向个体施用cftr氯离子通道抑制剂，其为bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci。[0178]在本文公开的方法的一些实施方案中，向个体施用(r)-bpo-27、cftrinh-172、glyh-101、格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐、或尼氟灭酸；或者其组合。[0179]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。[0180]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。[0181]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。[0182]在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172。[0183]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。[0184]在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。[0185]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是二苯胺-2-羧酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是尼氟灭酸。[0186]在本公开内容的方法的一些实施方案中，向个体施用包含药物赋形剂和一定量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0187]在一些方面中，本公开内容涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向个体施用包含有效治疗胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，药物组合物还包含(s)-bpo-27。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。在又一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸、或者其组合。[0188]在其中向个体施用包含为(r)-bpo-27的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物的那些实施方案中，药物组合物还可以包含(s)-bpo-27。在这些实施方案中，药物组合物中(r)-bpo-27的量将基本上等于或大于药物组合物中存在的(s)-bpo-27的量。例如，在一些实施方案中，药物组合物可以包含(r/s)-bpo-27的外消旋混合物。在一些方面中，与(s)-bpo-27相比，(r)-bpo-27将以对映体过量值(ee)存在。例如，(r)-bpo-27可以以约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％ee存在。在一些实施方案中，药物组合物将包含(r)-bpo-27，其中％ee大于99％。[0189]所施用的cftr氯离子通道抑制剂的量是有效治疗胆汁酸性腹泻的量。在这方面有效的量将根据个体的特征和状况而变化。[0190]在所公开方法的一些方面中，cftr氯离子通道抑制剂的量有效减少由胆汁酸性腹泻引起的肠液分泌。[0191]在所公开方法的另一些方面中，cftr氯离子通道抑制剂的量有效减少胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活。[0192]在所公开方法的一些方面中，还向个体施用有效治疗胆汁酸性腹泻的量的第二试剂。在一些实施方案中，第二试剂是胆汁酸结合剂、法尼醇x受体(fxr)激动剂、5-ht3拮抗剂、阿片受体激动剂、混合μ阿片受体激动剂、广谱肠道特异性抗生素、镇痉剂、或三环抗抑郁剂。在一些实施方案中，第二试剂是胆汁酸结合剂，优选是消胆胺、考来替泊、或考来维仑。在其他实施方案中，第二试剂是法尼醇x受体(fxr)激动剂，优选是奥贝胆酸。在其他实施方案中，第二试剂是5-ht3拮抗剂，优选是阿洛司琼。在其他实施方案中，第二试剂是阿片受体激动剂，优选是洛哌丁胺。在其他实施方案中，第二试剂是混合μ阿片受体激动剂，优选是伊卢多啉。在其他实施方案中，第二试剂是广谱肠道特异性抗生素，优选是利福昔明。[0193]在一些方面中，本发明涉及减少有需要的个体中的由胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向个体施用有效减少由胆汁酸诱导的cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0194]如本文所用，肠液分泌是指液体从肠上皮分泌到肠腔中。[0195]在一些实施方案中，肠液分泌由胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道的激活引起。在其他实施方案中，cftr氯离子通道是肠上皮中顶端cftr氯离子通道。顶端cftr氯离子通道是位于顶端细胞膜(即，面向肠腔的细胞膜)中的cftr氯离子通道。因此，在一些实施方案中，本发明涉及减少有需要的个体中由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向个体施用有效减少由胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0196]在一些方面中，通过施用有效减少所述肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂来减少肠液分泌。如本文所用，肠液分泌的减少是指分泌到肠腔中的液体量相对于在不施用cftr氯离子通道抑制剂的情况下分泌到肠腔中的液体量的减少。测量液体分泌减少的方法是本领域技术人员已知的，包括测量肠腔内容物的含水量、以及腹泻排出量。[0197]在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci或gh-cftr-cci)来减少肠液分泌。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其为(r)-bpo-27、cftrinh-172、glyh-101、格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸或者其组合)来减少肠液分泌。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是cftrinh-172。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是glyh-101。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是二苯胺-2-羧酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是尼氟灭酸。[0198]在本发明的这个方面，所施用的cftr氯离子通道抑制剂的量是有效减少由胆汁酸诱导的cftr氯离子通道(例如，顶端cftr氯离子通道)的激活引起的所述肠液分泌的量。在这方面有效的量将根据个体的特征和状况而变化。[0199]在一些方面中，本发明涉及在有需要的个体中减少由胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向个体施用包含有效减少由胆汁酸诱导的cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，药物组合物还包含(s)-bpo-27。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。在又一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸、或者其组合。[0200]在其他方面中，本公开内容涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流的方法，包括向个体施用有效减少所述胆汁酸诱导的cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0201]如本文所用，“电流”是指离子通过通道的通路(passage)。因此，cftr氯离子通道电流是指氯离子通过cftr氯离子通道的通路。[0202]在一些实施方案中，cftr氯离子通道电流由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道的激活引起。因此，在一些实施方案中，本发明涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道电流的方法，包括向个体施用有效减少所述胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0203]在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci)来减少胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其是(r)-bpo-27、cftrinh-172、glyh-101、格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸或者其组合)来减少胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流。[0204]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是cftrinh-172。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是glyh-101。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是二苯胺-2-羧酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是尼氟灭酸。[0205]在本发明的这个方面，所施用的cftr氯离子通道抑制剂的量是有效减少胆汁酸诱导的cftr氯离子通道(例如，顶端cftr氯离子通道)电流的量。在这方面有效的量将根据个体的特征和状况而变化。[0206]在一些方面中，本发明涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流的方法，包括向个体施用包含有效减少所述胆汁酸诱导的cftr氯离子通道电流cci。在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。在又一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸、或者其组合。[0212]在本公开内容的所有方法中，cftr氯离子通道抑制剂被施用至个体。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在其他实施方案中，个体是人。[0213]在一些实施方案中，个体已被诊断患有克罗恩病。[0214]在其他实施方案中，个体已被诊断患有ibs-d。[0215]在又一些实施方案中，个体已被诊断患有功能性腹泻。[0216]在一些方面中，本发明的方法导致个体的粪便含水量的减少。水减少的程度可以通过在施用cftr氯离子通道抑制剂之前测量个体的粪便中的水量，并将该量与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的粪便中的水量进行比较来确定。[0217]在一些实施方案中，个体的粪便含水量的减少通过使用临床仪器例如bristol粪便性状量表(bsfs)的测量来证明。本领域已知的bsfs为个体的粪便分配范围从1(硬)至7(水样)的一致性得分。因此，在一些实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表的得分的降低来证明。在一些实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低1个点(例如，7到6、6到5、5到4、4到3、3到2、2到1)来证明。在其他实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低2个点(例如，7到5、6到4、5到3、4到2、3到1)来证明。在其他实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低3个点(例如，7到4、6到3、5到2、4到1)来证明。在其他实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低超过3个点来证明。[0218]本领域技术人员将理解，可以使用本领域已知的其他临床量表来证明个体的粪便含水量的减少。[0219]在一些方面中，本发明的方法导致个体的排便频率减少。排便频率减少的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的排便频率与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的排便频率进行比较来确定。在此，排便频率可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器来测量。确定排便频率的方法是本领域技术人员已知的。[0220]在其他方面中，本发明的方法导致个体的粪便排出量减少。粪便排出量减少的程度可以通过测量施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的粪便量，并将该量与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的粪便量进行比较来确定。在此，该量可以按重量或按体积测量。测量粪便排出量的方法是本领域技术人员已知的。[0221]在其他方面中，本发明的方法导致个体的腹痛减轻。腹痛减轻的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的腹痛与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的腹痛进行比较来确定。在此，腹痛可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器来测量。确定腹痛的方法是本领域技术人员已知的。[0222]在其他方面中，本发明的方法导致个体的腹胀减少。腹胀减少的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的腹胀与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的腹胀进行比较来确定。在此，腹胀可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器来测量。确定腹胀的方法是本领域技术人员已知的。[0223]在其他方面中，本发明的方法导致个体的恶心减少。恶心减少的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的恶心与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的恶心进行比较来确定。在此，恶心可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器，例如nauseaquestionnaire来测量。测量恶心的方法是本领域技术人员已知的。实施例[0224]提供以下实施例以提供对本文所描述主题的更好理解。这些实施例不应被视为限制所描述的主题。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其进行的各种修改或改变对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且将被包括在本发明的范围内并且可以在不脱离本发明的范围的情况下做出。[0225]缩写[0226]bad：胆汁酸性腹泻[0227]bapta-am：1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′‑四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)[0228]bpo-27：6-(5-溴呋喃-2-基)-7,9-二甲基-8,10-二氧代-11-苯基-7,8,9,10-四氢-6h-苯并[b]嘧啶并[4',5':3,4]吡咯并[1,2-d][1,4]噁嗪-2-羧酸[0229]cacc：钙激活的氯离子通道[0230]cdca：鹅去氧胆酸[0231]cftr：囊性纤维化跨膜传导调节子[0232]cftrinh-172：4-[[4-氧代-2-硫代-3-[3-(三氟甲基)苯基]-5-噻唑烷亚基]甲基]苯甲酸[0233]dca：去氧胆酸[0234]dra：在腺瘤中下调[0235]enac：上皮钠通道[0236]fgf-19：成纤维细胞生长因子19[0237]fxr：法尼醇x受体[0238]glyh-101：n-2-萘基-[(3,5-二溴-2,4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼[0239]ibs-d：腹泻型肠易激综合征[0240]ic50：半数最大抑制浓度[0241]化学品[0242]除非另有说明，否则所有化学品均购自sigma-aldrich(st.louis,mo)。牛磺-鹅去氧胆酸和牛磺-去氧胆酸的钠盐购自spectrumchemicals(gardena,ca)。所有胆汁酸溶液均在pbs中制备，除了石胆酸，其溶解在dmso中。bapta-am购自emdmillipore(billerica,ma)。毛喉素购自lclaboratories(woburn,ma)。cftrinh-172和(r)-bpo-27如所述合成和纯化。参见，例如，snyder,d.s.,tradtrantip,l.,yao,c.,kurth,m.j.,和verkman,a.s.(2011)potent,metabolicallystablebenzopyrimido-pyrrolo-oxazine-dione(bpo)cftrinhibitorsforpolycystickidneydisease.jmedchem54,5468-5477；snyder,d.s.,tradtrantip,l.,battula,s.,yao,c.,phuan,p.w.,fettinger,j.c.,kurth,m.j.,和verkman,a.s.(2013)absoluteconfigurationandbiologicalpropertiesofenantiomersofcftrinhibitorbpo-27.acsmedchemlett4,456-459；ma,t.,thiagarajah,j.r.,yang,h.,sonawane,n.d.,folli,c.,galietta,l.j.,和verkman,a.s.(2002)thiazolidinonecftrinhibitoridentifiedbyhigh-throughputscreeningblockscholeratoxin-inducedintestinalfluidsecretion.jclininvest110,1651-1658。[0243]实施例1.t84细胞培养[0244]t84细胞(atccccl-248)在dmem/ham'sf-12培养基的1:1混合物中培养，该培养基补充有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞在snapwell池(costarcorning,horseheads,ny)上于37℃在5％co2/95％空气中生长，并在接种后7至14天使用。[0245]实施例2.人结肠样体培养物[0246]人结肠样培养物是从三个不同个体的内窥镜术或外科手术中获得的去识别的组织样本(年龄和性别除外)产生的。人培养物由嵌入24孔板中matrigel(corning,tewksbury,ma)的分离的肠隐窝产生，并在wnt3a、r-spondin-1和含有未分化培养基(udm)的noggin的存在下培养，如在以下中所描述的：zachos,n.c.等人(2016)humanenteroids/colonoidsandintestinalorganoidsfunctionallyrecapitulatenormalintestinalphysiologyandpathophysiology.jbiolchem291,3759-3766；in,j.,等人(2016)enterohemorrhagicescherichiacolireducemucusandintermicrovillarbridgesinhumanstemcell-derivedcolonoids.cellmolgastroenterolhepatol2,48-62。udm培养基中的matrigel培养物用于结肠样体的增殖。为了产生单层培养物，在cultrex类器官收集获取溶液(trevigen,gaithersburg,md)中研磨结肠样体，通过离心收集碎片并重新悬浮在udm中。将结肠样体片段(100μl)接种到0.4μm孔聚酯膜24孔细胞培养池(transwell；corning,tewksbury,ma)上，该池预涂有人胶原iv(34μg/ml；milliporesigma)。单层细胞在udm中于37℃、5％co2下培养。在这些条件下，培养物在7至14天内达到融合，如通过跨上皮电阻所监测的。[0247]实施例3.短路电流测量[0248]t84细胞安装在ussing室中并浸浴在包含(以mm计)：120nacl,5kcl、1mgcl2、1cacl2、10d-葡萄糖、5hepes和25nahco3(ph7.4)的匀称的hco3-缓冲溶液中。溶液用95％o2/5％co2充气并保持在37℃。在一项研究中，为了测量顶端cl-电导，应用了基底外侧到顶端cl-梯度，其中基底外侧半室包含(以mm计)：120nacl、1mgcl2、1cacl2、10d-葡萄糖、5hepes和25nahco3(ph7.4)；在顶端溶液中，120mmnacl被5mmnacl和115mmna-葡萄糖酸盐代替，基底外侧膜用250μg/ml两性霉素b进行透化。短路电流使用evc4000多通道电压钳(worldprecisioninstruments,sarasota,fl)测量。[0249]对于肠短路电流测量，用异氟醚麻醉cd1小鼠。取出结肠，用冰冷的krebs缓冲液冲洗，沿肠系膜边界打开，将全层碎片安装在微型ussing室(面积0.7cm2，worldprecisioninstruments)中。半室充满了氧化的krebs-碳酸氢盐溶液。[0250]人结肠样体培养物中的测量如(18)所描述的进行。顶端和基底外侧半室填充有在37℃下用95％o2/5％co2充气的krebs-ringer碳酸氢盐(kbr)缓冲液。基底外侧半室补充有10mm葡萄糖，顶端半室补充有10mm甘露醇以维持渗透平衡。[0251]实施例4.细胞内ca2 和camp测量[0252]t84细胞接种在96孔黑壁微板中。接种后72小时，将融合的细胞装入fluo-4nw(invitrogen,carlsbad,ca)。对于ca2 测量，用fluostar荧光读板仪(bmglabtechnologies,durham,northcarolina)在485/538nm的激发/发射波长下测量fluo-4荧光。在一些研究中，细胞用bapta-am预处理30分钟。人结肠样体培养物中的ca2 测量是在经荧光ca2 传感器adeno-gcsmp6s转导的单层中进行的。对于camp测定，t84细胞在24孔板中生长，用cdca和/或毛喉素处理30分钟，通过重复冷冻/解冻进行裂解，离心以去除细胞碎片，并根据制造商的说明(r&dsystems,minneapolis,nm)，使用参数camp免疫测定试剂盒测定上清液中的camp。[0253]实施例5.小鼠闭合肠袢中的肠液分泌[0254]在实验前24小时给予cd1小鼠(8至10周龄)5％葡萄糖水，但没有固体食物。在创建闭合肠(中段空肠或远端结肠)袢并注射cdca或pbs载体前60分钟向小鼠腹膜内施用(r)-bpo-27(5mg/kg)或载体(5％dmso，盐水中的10％kolliphorhs)。先前已显示该剂量的(r)-bpo-27在小鼠体内提供治疗性血清水平数小时。参见cil,o.,等人(2017)benzopyrimido-pyrrolo-oxazine-dionecftrinhibitor(r)-bpo-27forantisecretorytherapyofdiarrheascausedbybacterialenterotoxins.fasebj31,751-760。为了创建袢，小鼠用异氟醚麻醉，并在手术期间使用加热垫将体温保持在36℃至38℃。做一个小腹部切口以使肠暴露。对于中段空肠闭合袢模型，通过缝合线创建2cm至3cm的袢。用含有cdca或pbs载体的100μlpbs注射袢。腹部切口用缝合闭合，使小鼠从麻醉中恢复。在结肠闭合袢模型中，小鼠在手术前12小时接受灌肠(500μl矿物油)以清洁结肠的固体，如先前报道的(haggie,p.m.,等人(2018)slc26a3inhibitoridentifiedinsmallmoleculescreenblockscolonicfluidabsorptionandreducesconstipation.jciinsight3,e121370)并且通过缝合线形成1cm至2cm的闭合袢。在指定时间通过外科手术取除肠袢，并测量袢长度和重量以量化液体分泌。在一些实验中，使用了cf小鼠(δf508纯合子，8至10周龄)。[0255]实施例6.胆汁酸性腹泻的大鼠模型[0256]雌性sprague-dawley大鼠(8至10周龄)通过使用柔性塑料管(15号，78mm长，instechlaboratories,plymouthmeeting,pa)的中段结肠输注施用500μlcdca(在pbs中10mm)或pbs载体。在输注前30分钟向大鼠腹膜内施用(r)-bpo-27(10mg/kg)(或载体对照)。(r)-bpo-27溶解在含有5％dmso和10％kolliphorhs的盐水中。输注后，大鼠被单独放置在代谢笼中，并自由获取水和食物。在输注前(用于基线粪便含水量)和输注后4小时内收集粪便样本。粪便在可视时立即称重以确定湿重。为了确定粪便含水量，粪便样品在70℃下干燥24小时，含水量计算为(湿重-干重)/湿重。[0257]实施例7.统计[0258]数据表示为平均值±s.e.m.。使用prism5graphpad软件包(sandiego,ca)进行统计分析。当有两个组时使用学生t-检验进行统计比较，或者当有三个或更多组时使用单因素方差分析进行统计比较。《0.05的p值被认为是统计学上显著的。[0259]cftr抑制阻断t84细胞中胆汁酸诱导的分泌反应[0260]在初步研究中，通过短路电流测量筛选多种胆汁酸，以确定它们在t84结肠上皮细胞系中诱导促分泌反应的能力。参见实施例3。当添加到顶端(粘膜)和基底外侧(浆膜)浸浴溶液二者中时，胆汁酸cdca和dca及其牛磺酸结合物产生稳健的分泌电流，该电流被(r)-bpo-27阻断(图1a)。对于胆酸和熊去氧胆酸未观察到短路电流增加，对于石胆酸仅观察到小的瞬态响应。[0261]cdca应用之后短路电流的增加被选择性和化学无关的抑制剂(r)-bpo-27和cftrinh-172(图1b、图1c)完全阻断。浓度依赖性研究显示该模型中对于(r)-bpo-27抑制的ic50《1μm(数据未显示)。小鼠远端结肠中的短路电流测量显示，在顶端浸浴溶液中添加cdca，电流增加了5.2±1.4μa/cm2(平均值±s.e.m.，n＝3)，这完全被(r)-bpo-27逆转(-5.2±1.7μa/cm2)(图1d)。在基底外侧浸浴溶液中添加cdca后，没有观察到短路电流的增加。[0262]为了研究t84细胞中cdca作用的方向性，将cdca添加到顶端或基底外侧浸浴溶液中。图2a显示了在向顶端溶液添加0.75mm或1mmcdca后的稳健电流响应，而向基底外侧溶液中添加1mmcdca没有影响。观察到向基底外侧溶液添加高达2mmcdca几乎没有影响(图2b)，在研究结束时添加毛喉素作为阳性对照，以证明t84细胞单层的完整性。cdca对顶端cftr的作用和通过(r)-bpo-27的抑制在存在顶端到基底外侧cl-浓度梯度的情况下在基底外侧膜透化的t84细胞单层的短路电流测量中得到证实，其中短路电流提供了顶端cftrcl-电流的直接测量(图2c)。[0263]研究了cdca对t84细胞中camp和ca2 信号通路的可能作用。参见实施例4。高达0.75mm的cdca未显著影响对添加camp激动剂毛喉素的短路响应，但在1mmcdca中观察到毛喉素诱导电流的小幅降低(图3a、图3b)。在每种情况下，增加的电流被(r)-bpo-27完全阻断。细胞内camp测量显示，高达1mm的cdca本身未使camp增加。然而，0.75mm和1mmcdca使camp增加以对最大(10μm)毛喉素响应(图3c)。[0264]在t84细胞中，cdca诱导的短路电流增加在很大程度上通过用ca2 螯合剂bapta-am预处理所阻断(图4a、图4b)。使用荧光传感器fluo-4对细胞内ca2 浓度的测量显示在0.75mm或1mmcdca后ca2 持续升高，其幅度与使用胆碱能激动剂卡巴胆碱或嘌呤能激动剂atp观察到的峰值ca2 升高相当(图4c、图4d)。ca2 升高在很大程度上被bapta-am预处理阻止。这些实验支持ca2 信号参与t84细胞中对cdca的促分泌反应，这是出乎意料的，因为分泌反应似乎完全由cftr(camp激活的cl-通道)介导，而不是由ca2 激活的cl-通道介导。[0265]原代人结肠样体培养物的研究[0266]在原代人结肠样体培养物中研究了使用t84细胞获得的主要发现，包括对顶端cdca的cftrcl-分泌反应和参与ca2 信号传导。参见实施例2。正如在t84细胞中所观察到的，cdca在添加到顶端而不是基底外侧浸浴溶液时产生浓度依赖性的短路电流增加，这被(r)-bpo-27逆转(图5a、图5b)。此外，bapta-am预处理大大降低了短路电流的增加(图5c)，并且cdca使细胞质ca2 浓度升高，峰值幅度与atp产生的峰值幅度相当(图5d)，尽管这比在t84细胞中观察到的更短暂。[0267]bpo-27抑制闭合小鼠肠袢中的液体分泌[0268]在小鼠中建立闭合肠袢模型以研究cdca在体内的促分泌作用。参见实施例5。最初的研究是在中段空肠袢进行的，因为在单个动物中获得多个袢在技术上是容易的，并且它们在研究霍乱和旅行者腹泻模型中的肠液分泌中有广泛的先前用途。图6a显示在中段空肠袢中注射10mmcdca会在1小时内产生液体的大量积聚。使用在2小时测量的用袢液进行的cdca浓度依赖性研究显示，使用5mm和10mmcdca时袢液积聚显著增加(图6b)。闭合远端结肠袢中的类似实验显示，用2.5mmcdca有显著的袢液积聚(图6c)。[0269]为了研究cftr抑制的影响，在创建闭合肠袢和注射cdca(或对照pbs载体)之前60分钟施用(r)-bpo-27(图7a)。在闭合中段空肠袢中，活性bpo-27对映异构体(r)-bpo-27使袢液积聚显著减少55％，而非活性对映异构体(s)-bpo-27没有显著影响(图7b)。在闭合结肠袢中发现用(r)-bpo-27的袢液积聚～70％的更大的减少(图7c)。[0270]由于cftr抑制在很大程度上但不完全阻断袢液积聚，因此研究了cftr依赖性机制是否可能部分是由cdca影响引起的。对于这些实验，在缺乏功能性cftr的囊性纤维化小鼠中进行了闭合袢研究。与注射pbs载体的对照袢相比，注射10mmcdca的中段空肠闭合袢和远端结肠闭合袢显示出少量但显著更大的袢液含量，这表明cftr以外的机制也在cdca诱导的液体积聚中起作用，基于先前的研究其可能包括na /h 和cl-/hco3-交换剂的抑制(促吸收过程)、增加的细胞间渗透性或粘液分泌的刺激。参见alrefai,w.a.,等人(2007)taurodeoxycholatemodulatesapicalcl-/oh-exchangeactivityincaco2cells.digdissci52,1270-1278；pallagi-kunstar,e.,等人(2015)bileacidsinhibitna /h exchangerandcl-/hco3-exchangeractivitiesviacellularenergybreakdownandca2 overloadinhumancoloniccrypts.pflugersarch467,1277-1290；sarathy,j.,等人(2017)theyinandyangofbileacidactionontightjunctionsinamodelcolonicepithelium.physiolrep5,e13294；barcelo,a.,等人(2001)effectofbilesaltsoncolonicmucussecretioninisolatedvascularlyperfusedratcolon.digdissci46,1223-1231。[0271]bpo-27减少胆汁酸性腹泻大鼠模型中的粪便含水量[0272]建立模型以测试(r)-bpo-27影响，其中通过中段结肠输注向大鼠施用cdca(或载体对照)，收集4小时内的粪便以测量粪便重量和含水量(按湿干重量比)(图8a，上图)。参见实施例6。如使用伊文思蓝染料所见，该模型中输注的液体通过结肠腔迅速分布(图8a，下图)。在4小时内从输注cdca的大鼠收集了更大量的粪便，粪便含水量显著增加了～25％(图8b、图8c)。虽然(r)-bpo-27预处理不影响接受中段结肠输注pbs的大鼠的粪便量或含水量，但接受cdca输注的大鼠的粪便含水量的增加被抑制了～55％(图8c)。[0273]不受理论的束缚，本文的数据支持cftr抑制剂(特别是(r)-bpo-27)在胆汁酸相关腹泻的治疗中的cftr抑制效用。t84细胞和人结肠样体培养物中的短路电流测量显示响应于细胞顶端表面暴露于cdca时的促分泌电流，其完全被cftr抑制逆转。(r)-bpo-27对分泌电流的完全抑制也见于暴露于cdca的体外小鼠结肠组织中。全身施用(r)-bpo-27在很大程度上防止小鼠体内闭合结肠袢中的液体积聚，并防止在结肠内输注含有cdca的溶液后粪便水分的增加。这些结果表明cftr是人结肠细胞培养物和啮齿动物中cdca诱导的腹泻中的主要促分泌离子通道。[0274]本技术要求于2019年6月12日提交的美国临时申请第62/860,539号的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：3.本发明涉及通过施用cftr氯离子通道抑制剂来治疗胆汁酸性腹泻的方法。
背景技术：
：：4.胆汁酸性腹泻(bad)常见于回肠切除术后和克罗恩病中，据信发生在超过三分之一的患有腹泻型肠易激综合征(ibs-d)或慢性功能性腹泻患者中，据估计，西方国家的总体患病率高达1％。bad可以由肝胆汁酸合成或肠肝循环中的异常引起，这导致过量的胆汁酸输送到结肠，在此处导致液体分泌并增加运动性。5.目前对原发性bad或由回肠切除术或克罗恩病引起的bad的疗法包括胆汁酸结合剂如消胆胺、考来替泊和考来维仑，以及法尼醇x受体(fxr)激动剂如奥贝胆酸正在开发中。对于ibs-d(其中bad可能与超过三分之一患者的发病机制有关)，fda批准的疗法包括5-ht3拮抗剂阿洛司琼、混合μ阿片受体激动剂伊卢多啉和广谱肠道特异性抗生素利福昔明。ibs-d的其他常用疗法包括洛哌丁胺、胆汁酸螯合剂、镇痉剂和三环抗抑郁剂。这些疗法中的一些与严重的副作用例如与阿洛司琼有关的缺血性结肠炎和与伊卢多啉有关的胰腺炎相关。6.对bad的改善和替代疗法的需求仍未得到满足。7.囊性纤维化跨膜传导调节子(cftr)蛋白是在某些哺乳动物上皮细胞(包括肠上皮细胞)中表达的氯离子通道。cftr氯离子通道功能与分泌性腹泻相关。8.cftr抑制剂在分泌性腹泻的疗法中有临床应用。由肠毒素引起的分泌性腹泻，例如霍乱和旅行者腹泻(肠致病性大肠杆菌)，需要功能性cftr用于将主要氯离子分泌到肠腔，进而驱动钠和水分泌(参见，例如，kunzelmann等人，physiol.rev.82:245-89(2002)；thiagarajah等人，curr.opin.pharmacol.3:594-9(2003))。细胞培养和动物模型表明肠毒素介导的分泌性腹泻中的肠氯离子分泌主要通过cftr发生(参见，例如，clarke等人，science257:1125-28(1992)；gabriel等人，science266:107-109(1994)；kunzelmannandmall,physiol.rev.82:245-89(2002)；field,15j.clin.invest.111:931-43(2003)；和thiagarajah等人，gastroenterology126:511-519(2003))。先前已经描述了几类小分子cftr抑制剂(参见，例如，verkman等人的综述，nat.rev.drugdiscov.8:153-71(2009))。9.美国专利第9,062,073号描述了一系列苯并嘧啶并-吡咯并-噁嗪-二酮(bpo)化合物和某些嘧啶并-吡咯并-喹喔啉二酮(ppq)化合物，它们可用作cftr氯离子通道抑制剂。bpo化合物具有通式：[0010][0011]其中：[0012]m是1、2、3或4；[0013]n是1、2、3、4或5；[0014]p是0至4的整数；[0015]q是1至4的整数；[0016]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0017]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0018]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h、或c1-c6烷基；[0019]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、或氨基酸残基；[0020]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-c20烷基、糖类、或氨基酸残基；以及[0021]z是芳基或杂芳基，[0022]其中氨基酸残基选自以下的残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺、鸟氨酸、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、甲基丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸、甲硫氨酸砜、叔丁基甘氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、糖基化苏氨酸、糖基化丝氨酸和糖基化天冬酰胺。[0023]ppq化合物具有通式：[0024][0025]其中：[0026]m是1、2、3或4；[0027]n是1、2、3、4或5；[0028]p是0至4的整数；[0029]q是1至4的整数；[0030]x是o或s；[0031]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0032]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0033]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h或c1-6烷基；[0034]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、氨基酸残基、或肽；[0035]r4是h、—n(═o)、c1-6烷基、或卤代烷基；[0036]r5是h、卤素、或c1-6烷基；[0037]r6是卤素、c1-6烷基、或c1-6卤代烷基；以及[0038]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-20烷基、糖类、氨基酸残基、或肽。技术实现要素：[0039]本发明的方面涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向所述个体施用有效治疗所述胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0040]本发明的其他方面涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向所述个体施用包含有效治疗所述胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0041]此外，本发明的方面还涉及减少有需要的个体中由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端(apical)cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向所述个体施用有效减少由胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活引起的所述肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0042]本发明的其他方面涉及减少有需要的个体中由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向所述个体施用包含有效减少由胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活引起的所述肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0043]本发明的另外的方面涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道电流的方法，包括向所述个体施用有效减少所述胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0044]本发明的其他方面涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道电流的方法，包括向所述个体施用包含有效减少所述胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0045]在一些方面，本发明涉及用于在经历回肠切除术的个体中治疗腹泻或减轻与腹泻相关的症状的方法，包括向所述个体施用有效治疗所述腹泻或减轻所述腹泻的症状的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0046]本发明的其他方面涉及用于在经历回肠切除术的个体中治疗腹泻或减轻与腹泻相关的症状的方法，包括向所述个体施用包含有效治疗所述腹泻或减轻所述腹泻的症状的量的cftr氯离子通道的药物组合物。附图说明[0047]图1.cftr抑制剂阻断t84细胞中胆汁酸诱导的分泌电流。(a.)示出对添加到顶端和基底外侧(basolateral)浸浴溶液二者中的指定胆汁酸的响应的短路电流(isc)。(r)-bpo-27以10μm(代表针对胆酸、熊去氧胆酸和石胆酸研究的3个过滤器；以及针对去氧胆酸、鹅去氧胆酸及其牛磺结合物的5个过滤器)添加。(b.)将cdca(0.75mm)添加到两种浸浴溶液中，并按指示添加(r)-bpo-27(10μm)或cftrinh-172(10μm)。(c.)峰值cdca诱导电流和(r)-bpo-27或cftrinh-172之后电流减少的总结(△isc，平均值±s.e.m.，每个条件n＝7-8个过滤器)。(d.)示出添加到基底外侧或顶端浸浴溶液的cdca(1mm)以及按指示添加的(r)-bpo-27(10μm)的影响的小鼠结肠中的短路电流。[0048]图2.cdca从t84细胞单层的顶端侧作用以激活顶端cftr。(a.)在基底外侧或顶端浸浴溶液中添加cdca。(上图)代表性短路电流曲线，(r)-bpo-27以10μm添加。(下图)峰值cdca诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝7-8，**p《0.01，ns，与零影响相比不显著)。(b.)将从0.75mm增加到2mm的cdca添加到基底外侧浸浴溶液中，随后添加毛喉素(10μm添加到两侧)和(r)-bpo-27(10μm)。(c.)在基底外侧到顶端溶液cl-梯度(基底外侧[cl-]120mm，顶端[cl-]5mm)的存在下，用250μg/ml两性霉素b进行基底外侧膜透化后t84细胞中的短路电流。将cdca(0.75mm或1mm)添加到顶端浸浴溶液中，随后添加(r)-bpo-27(10μm)。[0049]图3.cdca对t84细胞中的camp信号传导的影响很小。(a.)示出指定浓度的cdca然后毛喉素(10μm)并且随后(r)-bpo-27(10μm)的影响的短路电流。(b.)峰值毛喉素诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝4-6，**p《0.01，ns，与具有0mmcdca的毛喉素响应相比不显著)。(c.)在与指定浓度的cdca在有或没有10μm毛喉素的情况下孵育之后30分钟测量的t84细胞中的camp(平均值±s.e.m.，n＝3-6，**p《0.01，ns，不显著)。[0050]图4.t84细胞中的cdca作用涉及ca2 信号传导。(a.)示出在bapta-am(30μm)预处理25分钟之后cdca(1mm)然后(r)-bpo-27(10μm)的影响的短路电流。(b.)有或没有bapta-am预处理的情况下的峰值cdca诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝4-5，**p《0.01)。(c.)通过fluo-4荧光测量的细胞质ca2 浓度。将cdca(0.75，1mm)、atp(100μm)或碳酰胆碱(100μm)添加到有或没有bapta-am(30μm)预处理30分钟的顶端浸浴溶液中。(d.)fluo-4荧光中的峰值增加(平均值±s.e.m.，n＝3-6，**p《0.01，ns，不显著)。[0051]图5.由结肠样体(colonoids)产生的平面单层培养物组成的人结肠上皮细胞原代培养物中的cdca分泌反应。(a.)(上图)示出向顶端或基底外侧浸浴溶液中添加的指定的cdca浓度、然后毛喉素(10μm)和(r)-bpo-27(5μm)的影响的短路电流。(b.)峰值cdca诱导电流的总结(△isc，平均值±s.e.m.，n＝9-13)。(c.)示出在bapta-am(30μm)预处理20分钟之后cdca(0.5mm)然后毛喉素(10μm)和(r)-bpo-27(5μm)的影响的短路电流。(d.)添加cdca(0.75mm)或atp(100μm)的细胞质ca2 浓度的荧光测量。[0052]图6.在小鼠中的闭合肠袢中的cdca诱导的液体分泌。(a.)cdca诱导的液体分泌的时间过程。将pbs(10mm)中的100μlcdca或pbs注射到中段空肠闭合袢中，并在不同时间切下袢以测量袢重量和长度(平均值±s.e.m.，每组n＝5-9个袢，**p《0.01)。(b.)闭合空肠袢中cdca影响的浓度依赖性。将100μlcdca或pbs注射到闭合中段空肠袢中(平均值±s.e.m.，n＝每组3-14个袢，**p《0.01，ns，不显著)。(c.)闭合结肠袢中cdca影响的浓度依赖性。将100μlcdca或pbs注射到闭合结肠袢中(平均值±s.e.m.，n＝每组3-5个袢，**p《0.01，ns，不显著)。[0053]图7.(r)-bpo-27抑制小鼠闭合肠袢中cdca诱导的液体分泌。(a.)实验方案。(b.)(左图)在有或没有bpo-27(r或s对映异构体)的情况下用cdca(10mm)或pbs注射的中段空肠袢的重量/长度比(平均值±s.e.m.，每组n＝6-7个s.e.m.)，**p《0.01，ns，不显著)。(右图)在有或没有bpo-27的情况下cdca和pbs注射的袢的代表性照片。(c.)(左图)在有或没有(r)-bpo-27的情况下用cdca(2.5，10mm)或pbs注射的结肠袢的重量/长度比(平均值±s.e.m.，每组n＝4-7个袢，**p《0.01，ns，不显著)。(右图)在有或没有(r)-bpo-27的情况下cdca和pbs注射的袢代表性照片。(d.)用cdca(2.5，10mm)注射的囊性纤维化(cftr缺乏)小鼠的中段空肠袢或结肠袢的重量/长度比(平均值±s.e.m.，n＝每组4个袢，**p《0.01，ns，不显著)。[0054]图8.(r)-bpo-27减少了胆汁酸性腹泻的大鼠模型中粪便含水量的增加。(a.)实验方案(上图)和在中段结肠输注500μl含有伊文思蓝染料的pbs后10分钟拍摄的照片(下图)。(b.)在有或没有(r)-bpo-27预处理的大鼠中中结肠输注后的4小时粪便排出量(湿重)(平均值±s.e.m.，pbs治疗组中n＝4只大鼠，cdca治疗组中n＝8只大鼠)，*p《0.05，ns，不显著)。(c.)(左图)来自b中收集的粪便的粪便含水量(来自湿重/干重测量的水百分比)(**p《0.01，ns，不显著)。(右图)示出各个大鼠的粪便含水量增加的配对分析(在相同大鼠中0-4小时的粪便水减去输注前的粪便水)(*p《0.05，**p《0.01，ns，不显著)。[0055]示例性性实施方案的详细描述[0056]本发明可以通过参考以下形成本公开内容一部分的详细描述来理解。本发明不限于在此描述和/或示出的特定方法、条件或参数，并且在此使用的术语仅用于通过实例的方式描述特定实施方案的目的，并不旨在限制要求保护的发明。[0057]除非本文另有定义，否则与本技术相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。[0058]如本文所用，术语“组合物”、“化合物”、“药物”、“药理学活性剂”、“活性剂”或“药物”在本文中可互换使用以指代物质的一种化合物或多种化合物或组合物，当将其向个体(人或哺乳动物)施用时通过局部和/或全身作用诱导期望的药理学和/或生理学作用。[0059]如本文所用，术语“治疗”或“疗法”(及其不同形式)包括预防性(例如，预防性)、治愈性或姑息性治疗。如本文所用，术语“治疗”包括减轻或减少病况、疾病或病症的至少一种不利或负面影响或症状。[0060]术语“施用”意指直接施用本发明的化合物或组合物。[0061]术语“个体”在本文中用于指对其提供用根据本发明的化合物的治疗，包括预防性治疗的人或驯养哺乳动物(例如，狗、猫)。[0062]在本发明中，所公开的化合物可以以药学上可接受的盐的形式制备。“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，碱性残基如胺的矿物盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括由例如无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这样的常规无毒盐包括衍生自以下无机酸的那些，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和由以下有机酸制备的盐，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。这些药学上可接受的盐通过本领域已知的方法，例如通过将游离胺碱用过量的酸溶解在含水醇中，或用碱金属碱如氢氧化物或用胺中和游离羧酸制备。[0063]本发明涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向个体施用有效治疗胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0064]在一些方面中，本发明涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法。胆汁酸性腹泻(bad)是临床诊断的病况，其中腹泻被认为是由胆汁酸吸收不良或失调引起的。参见，例如，m.camilleri,advancesinunderstandingofbileaciddiarrhea,expertrevgastroenterolhepatol.2014年1月；8(1):49–61。诊断bad的方法是本领域已知的。参见，例如，id。[0065]在本文公开的方法的一些方面中，向个体施用一定量的cftr氯离子通道抑制剂(cftr-cci)。如本文所用，cftr氯离子通道是指囊性纤维化跨膜传导调节子(cftr)，其为在肺、肠、胰腺、睾丸和其他组织的上皮中表达的camp激活的氯离子通道。如本文所用的术语cftr氯离子通道抑制剂(或“cftr-cci”)是指现有技术中描述的可用于一种或多种医学目的的任何囊性纤维化跨膜传导调节子氯离子通道抑制剂，包括在以下中描述的那些：u.s.专利号9,062,073、7,235,573、7,638,543、7,414,037和7,888,332；u.s.申请公开号2009/0253799；国际专利申请公开号wo09/120803和wo09/146144；以及mat,等人thiazolidinonecftrinhibitoridentifiedbyhigh-throughputscreeningblockscholeratoxin-inducedintestinalfluidsecretion.j.clin.invest.2002；110:1651–1658；sonawanen,verkmanas.thiazolidinonecftrinhibitorswithimprovedwatersolubilityidentifiedbystructure-activityanalysis.bioorg.med.chem.2008；16:8187–8195,andmuanprasatc,等人discoveryofglycinehydrazidepore-occludingcftrinhibitors:mechanism,structure-activityanalysis,andinvivoefficacy.j.gen.physiol.2004；124:125–137。这些参考文献中的每一个均通过引用整体并入本文。[0066]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpocftr氯离子通道抑制剂(bpo-cftr-cci)。bpo-cftr-cci是一般结构[0067][0068]所包含的化合物[0069]其中：[0070]m是1、2、3或4；[0071]n是1、2、3、4或5；[0072]p是0至4的整数；[0073]q是1至4的整数；[0074]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0075]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-c6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0076]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h、或c1-c6烷基；[0077]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、或氨基酸残基；[0078]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-c20烷基、糖类、或氨基酸残基；以及[0079]z是芳基或杂芳基，[0080]其中氨基酸残基选自以下的残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺、鸟氨酸、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、甲基丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸、甲硫氨酸砜、叔丁基甘氨酸、3,5-二溴酪氨酸、3,5-二碘酪氨酸、糖基化苏氨酸、糖基化丝氨酸和糖基化天冬酰胺。[0081]在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是下式的化合物[0082][0083]其中：[0084]r1是h、卤素、或c1-6烷基；[0085]r2和r3各自相同或不同且独立地为h、卤素、—no2、c1-6烷基、四唑基、—s(o)2or7,或—c(═o)or7；[0086]r5是h、卤素,或c1-6烷基；[0087]r6是卤素、c1-6烷基,或c1-6卤代烷基；以及[0088]r7是h、c1-6烷基、糖类、氨基酸残基、或肽。[0089]bpo-cftr-cci在美国专利号9,062,073中描述，该专利通过引用整体并入本文。[0090]在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是(r)-bpo-27，其为具有下述结构的化合物：[0091][0092]在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppqcftr氯离子通道抑制剂(ppq-cftr-cci)。ppq-cftr-cci是一般结构[0093]所包含的化合物[0094]其中：[0095]m是1、2、3或4；[0096]n是1、2、3、4或5；[0097]p是0至4的整数；[0098]q是1至4的整数；[0099]x是o或s；[0100]r1在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0101]r1a在每次出现时相同或不同且独立地为h、卤素、卤代烷基、c1-6烷基、—(ch2)p—c(o)—r4a、—s(o)2r4a、—no2、或四唑基；[0102]r2a和r2b各自相同或不同且独立地为h或c1-6烷基；[0103]r4a是—or7、—nr7r8、—o(ch2)q—oc(o)r7、氨基酸残基、或肽；[0104]r4是h、—n(═o)、c1-6烷基或卤代烷基；[0105]r5是h、卤素或c1-6烷基；[0106]r6是卤素、c1-6烷基或c1-6卤代烷基；以及[0107]r7和r8各自相同或不同且独立地为h、c1-20烷基、糖类、氨基酸残基、或肽。[0108]ppq-cftr-cci在美国专利号9,062,073中描述，该专利通过引用整体并入本文。[0109]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是噻唑烷酮cftr氯离子通道抑制剂(td-cftr-cci)。td-cftr-cci是一般结构:[0110]所包含的化合物[0111]或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，[0112]其中[0113]y是-nh-或不存在；[0114]w是＝ch-、-s-、-o-、-c(＝s)-、或-c(＝o)-；[0115]z1、z2、z3、z4和z5各自独立地是o或s；[0116]j是c、s、o、或n；[0117]q是c或n；[0118]r1、r2、r3和r9各自独立地是h、c1-6烷基、烷氧基、卤素、-cf3、-cf2cf3、或-ocf3；[0119]r5是h、卤素、c1-6烷基或不存在；[0120]x1、x2、x3和x4各自独立地是h、-oh、-sh、卤素、四唑并、-p(＝o)(oh)2、-c(＝z3)z4h、-z5-c(＝z3)z4h、或-z5-ch2-c(＝z3)z4h；以及[0121]x5是–o-、四唑并、-c(＝o)oh、-o-c(＝o)oh或不存在。[0122]td-cftr-cci也是一般结构：[0123]所包含的化合物[0124]其中x1是三氟甲基；[0125]x2和x3独立地选自氢和卤素基团；[0126]y1、y2和y3独立地选自氢、c1-c8烷基、c1-c7烷氧基、碳酸酯、氨基甲酸酯、羧基、卤基、硝基、偶氮基、羟基和巯基。[0127]td-cftr-cci也是在以下中描述的化合物：mat,等人thiazolidinonecftrinhibitoridentifiedbyhigh-throughputscreeningblockscholeratoxin-inducedintestinalfluidsecretion.j.clin.invest.2002；110:1651–1658；和sonawanen,verkmanas.thiazolidinonecftrinhibitorswithimprovedwatersolubilityidentifiedbystructure-activityanalysis.bioorg.med.chem.2008；16:8187–8195；u.s.专利号7,235,573、7,638,543以及国际专利申请公开号wo09/120803。这些参考文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。[0128]在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172，其具有结构[0129]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是甘氨酸酰肼cftr氯离子通道抑制剂(gh-cftr-cci)。gh-cftr-cci是结构：[0130]所包含的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，[0131]其中x1是氢或者经取代或未经取代的、饱和线性或支化的烷基；[0132]y是氢或经取代或未经取代的、饱和线性或支化的烷基；[0133]r1是未经取代的苯基，[0134]经取代的苯基，其中苯基经羟基、烷基和卤素中的一个或多个取代，[0135]经取代或未经取代的喹啉基，[0136]经取代或未经取代的蒽基，或者[0137]经取代或未经取代的萘基；[0138]r2是未经取代的苯基，[0139]经取代的苯基，其中苯基经溴或羧基取代，[0140]二(羟基)苯基，[0141]单-(卤素)-单(羟基)苯基，[0142]单(卤素)-二(羟基)苯基，[0143]单(卤素)-三(羟基)苯基，[0144]二(卤素)-单(羟基)苯基，[0145]二(卤素)-二(羟基)苯基，[0146]二(卤素)-三(羟基)苯基，[0147]单(卤素)-单(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0148]单(卤素)-二(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0149]单(卤素)-单(羟基)-二(烷氧基)苯基，[0150]单(卤素)-二(羟基)-二(烷氧基)苯基，[0151]二(卤素)-单(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0152]二(卤素)-二(羟基)-单(烷氧基)苯基，[0153]二(卤素)-单(羟基)-二(烷氧基)苯基；以及[0154]r3是氢或经取代或未经取代的烷基。[0155]gh-cftr-cci也是通式：[0156]所包含的化合物[0157]或其药学上可接受的盐或立体异构体，[0158]其中y″是经取代或未经取代的、饱和线性或支化的烷基；或连接至极性分子的酰胺或醚接头，其中极性分子选自经取代或未经取代的苯基、聚氧烷基聚醚、聚乙烯亚胺、二糖、三糖、聚烷基亚胺和小氨基葡聚糖；[0159]r1是未经取代或经取代的苯基、经取代或未经取代的喹啉基、经取代或未经取代的蒽基、或经取代或未经取代的萘基；[0160]r2是未经取代或经取代的苯基；以及[0161]r3是氢或经取代或未经取代的烷基，从而抑制cftr[0162]gh-cftr-cci也是通式：[0163][0164]所包含的化合物[0165]或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，[0166]其中：[0167]r1和r1相同或不同且独立地是任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、任选取代的喹啉基、任选取代的蒽基、或任选取代的萘基；[0168]r2、r2'、r3、r3'、r4、r4'、r5、r5'、r6和r6'各自相同或不同且独立地为氢、羟基、cig烷基、cig烷氧基、羧基、卤素、硝基、氰基、-so3h、-s(＝o)2nh2、芳基、和杂芳基；[0169]r13、r13、r14和r14各自相同或不同且独立地为氢或c1-8烷基；[0170]x和x'各自是相同或不同的接头部分；[0171]j和j'各自是相同或不同的间隔部分；[0172]a是聚合物亚单元；以及n是0至2500之间的整数。[0173]gh-cftr-cci也是在以下中描述的化合物：muanprasatc,等人discoveryofglycinehydrazidepore-occludingcftrinhibitors:mechanism,structure-activityanalysis,andinvivoefficacy.j.gen.physiol.2004；124:125–137；u.s.专利号7,414,037和7,888,332；u.s.申请公开号2009/0253799；国际专利申请公开号wo09/146144。这些参考文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。[0174]在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101，其具有结构[0175][0176]其他cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐、和尼氟灭酸。[0177]在本文公开的方法的一些实施方案中，向个体施用cftr氯离子通道抑制剂，其为bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci。[0178]在本文公开的方法的一些实施方案中，向个体施用(r)-bpo-27、cftrinh-172、glyh-101、格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐、或尼氟灭酸；或者其组合。[0179]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。[0180]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。[0181]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。[0182]在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172。[0183]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。[0184]在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。[0185]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是二苯胺-2-羧酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是尼氟灭酸。[0186]在本公开内容的方法的一些实施方案中，向个体施用包含药物赋形剂和一定量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。[0187]在一些方面中，本公开内容涉及治疗患有胆汁酸性腹泻的个体的方法，包括向个体施用包含有效治疗胆汁酸性腹泻的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，药物组合物还包含(s)-bpo-27。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。在又一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸、或者其组合。[0188]在其中向个体施用包含为(r)-bpo-27的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物的那些实施方案中，药物组合物还可以包含(s)-bpo-27。在这些实施方案中，药物组合物中(r)-bpo-27的量将基本上等于或大于药物组合物中存在的(s)-bpo-27的量。例如，在一些实施方案中，药物组合物可以包含(r/s)-bpo-27的外消旋混合物。在一些方面中，与(s)-bpo-27相比，(r)-bpo-27将以对映体过量值(ee)存在。例如，(r)-bpo-27可以以约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％ee存在。在一些实施方案中，药物组合物将包含(r)-bpo-27，其中％ee大于99％。[0189]所施用的cftr氯离子通道抑制剂的量是有效治疗胆汁酸性腹泻的量。在这方面有效的量将根据个体的特征和状况而变化。[0190]在所公开方法的一些方面中，cftr氯离子通道抑制剂的量有效减少由胆汁酸性腹泻引起的肠液分泌。[0191]在所公开方法的另一些方面中，cftr氯离子通道抑制剂的量有效减少胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活。[0192]在所公开方法的一些方面中，还向个体施用有效治疗胆汁酸性腹泻的量的第二试剂。在一些实施方案中，第二试剂是胆汁酸结合剂、法尼醇x受体(fxr)激动剂、5-ht3拮抗剂、阿片受体激动剂、混合μ阿片受体激动剂、广谱肠道特异性抗生素、镇痉剂、或三环抗抑郁剂。在一些实施方案中，第二试剂是胆汁酸结合剂，优选是消胆胺、考来替泊、或考来维仑。在其他实施方案中，第二试剂是法尼醇x受体(fxr)激动剂，优选是奥贝胆酸。在其他实施方案中，第二试剂是5-ht3拮抗剂，优选是阿洛司琼。在其他实施方案中，第二试剂是阿片受体激动剂，优选是洛哌丁胺。在其他实施方案中，第二试剂是混合μ阿片受体激动剂，优选是伊卢多啉。在其他实施方案中，第二试剂是广谱肠道特异性抗生素，优选是利福昔明。[0193]在一些方面中，本发明涉及减少有需要的个体中的由胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向个体施用有效减少由胆汁酸诱导的cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0194]如本文所用，肠液分泌是指液体从肠上皮分泌到肠腔中。[0195]在一些实施方案中，肠液分泌由胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道的激活引起。在其他实施方案中，cftr氯离子通道是肠上皮中顶端cftr氯离子通道。顶端cftr氯离子通道是位于顶端细胞膜(即，面向肠腔的细胞膜)中的cftr氯离子通道。因此，在一些实施方案中，本发明涉及减少有需要的个体中由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向个体施用有效减少由胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0196]在一些方面中，通过施用有效减少所述肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂来减少肠液分泌。如本文所用，肠液分泌的减少是指分泌到肠腔中的液体量相对于在不施用cftr氯离子通道抑制剂的情况下分泌到肠腔中的液体量的减少。测量液体分泌减少的方法是本领域技术人员已知的，包括测量肠腔内容物的含水量、以及腹泻排出量。[0197]在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci或gh-cftr-cci)来减少肠液分泌。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其为(r)-bpo-27、cftrinh-172、glyh-101、格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸或者其组合)来减少肠液分泌。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是cftrinh-172。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是glyh-101。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是二苯胺-2-羧酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是尼氟灭酸。[0198]在本发明的这个方面，所施用的cftr氯离子通道抑制剂的量是有效减少由胆汁酸诱导的cftr氯离子通道(例如，顶端cftr氯离子通道)的激活引起的所述肠液分泌的量。在这方面有效的量将根据个体的特征和状况而变化。[0199]在一些方面中，本发明涉及在有需要的个体中减少由胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的方法，包括向个体施用包含有效减少由胆汁酸诱导的cftr氯离子通道的激活引起的肠液分泌的量的cftr氯离子通道抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，bpo-cftr-cci是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，药物组合物还包含(s)-bpo-27。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，td-cftr-cci是cftrinh-172。在其他实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。在又一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸、或者其组合。[0200]在其他方面中，本公开内容涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流的方法，包括向个体施用有效减少所述胆汁酸诱导的cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0201]如本文所用，“电流”是指离子通过通道的通路(passage)。因此，cftr氯离子通道电流是指氯离子通过cftr氯离子通道的通路。[0202]在一些实施方案中，cftr氯离子通道电流由胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道的激活引起。因此，在一些实施方案中，本发明涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中顶端cftr氯离子通道电流的方法，包括向个体施用有效减少所述胆汁酸诱导的顶端cftr氯离子通道电流的量的cftr氯离子通道抑制剂。[0203]在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其是bpo-cftr-cci、ppq-cftr-cci、td-cftr-cci、或gh-cftr-cci)来减少胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是bpo-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是ppq-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是td-cftr-cci。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是gh-cftr-cci。在一些实施方案中，通过施用cftr氯离子通道抑制剂(其是(r)-bpo-27、cftrinh-172、glyh-101、格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸或者其组合)来减少胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流。[0204]在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是(r)-bpo-27。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是cftrinh-172。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是glyh-101。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是二苯胺-2-羧酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐。在一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是尼氟灭酸。[0205]在本发明的这个方面，所施用的cftr氯离子通道抑制剂的量是有效减少胆汁酸诱导的cftr氯离子通道(例如，顶端cftr氯离子通道)电流的量。在这方面有效的量将根据个体的特征和状况而变化。[0206]在一些方面中，本发明涉及减少有需要的个体的胆汁酸诱导的肠上皮中cftr氯离子通道电流的方法，包括向个体施用包含有效减少所述胆汁酸诱导的cftr氯离子通道电流cci。在一些实施方案中，gh-cftr-cci是glyh-101。在又一些实施方案中，cftr氯离子通道抑制剂是格列本脲、二苯胺-2-羧酸盐、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸盐或尼氟灭酸、或者其组合。[0212]在本公开内容的所有方法中，cftr氯离子通道抑制剂被施用至个体。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在其他实施方案中，个体是人。[0213]在一些实施方案中，个体已被诊断患有克罗恩病。[0214]在其他实施方案中，个体已被诊断患有ibs-d。[0215]在又一些实施方案中，个体已被诊断患有功能性腹泻。[0216]在一些方面中，本发明的方法导致个体的粪便含水量的减少。水减少的程度可以通过在施用cftr氯离子通道抑制剂之前测量个体的粪便中的水量，并将该量与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的粪便中的水量进行比较来确定。[0217]在一些实施方案中，个体的粪便含水量的减少通过使用临床仪器例如bristol粪便性状量表(bsfs)的测量来证明。本领域已知的bsfs为个体的粪便分配范围从1(硬)至7(水样)的一致性得分。因此，在一些实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表的得分的降低来证明。在一些实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低1个点(例如，7到6、6到5、5到4、4到3、3到2、2到1)来证明。在其他实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低2个点(例如，7到5、6到4、5到3、4到2、3到1)来证明。在其他实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低3个点(例如，7到4、6到3、5到2、4到1)来证明。在其他实施方案中，使用本发明方法的个体的粪便含水量的减少通过使用bristol粪便性状量表降低超过3个点来证明。[0218]本领域技术人员将理解，可以使用本领域已知的其他临床量表来证明个体的粪便含水量的减少。[0219]在一些方面中，本发明的方法导致个体的排便频率减少。排便频率减少的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的排便频率与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的排便频率进行比较来确定。在此，排便频率可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器来测量。确定排便频率的方法是本领域技术人员已知的。[0220]在其他方面中，本发明的方法导致个体的粪便排出量减少。粪便排出量减少的程度可以通过测量施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的粪便量，并将该量与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的粪便量进行比较来确定。在此，该量可以按重量或按体积测量。测量粪便排出量的方法是本领域技术人员已知的。[0221]在其他方面中，本发明的方法导致个体的腹痛减轻。腹痛减轻的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的腹痛与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的腹痛进行比较来确定。在此，腹痛可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器来测量。确定腹痛的方法是本领域技术人员已知的。[0222]在其他方面中，本发明的方法导致个体的腹胀减少。腹胀减少的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的腹胀与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的腹胀进行比较来确定。在此，腹胀可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器来测量。确定腹胀的方法是本领域技术人员已知的。[0223]在其他方面中，本发明的方法导致个体的恶心减少。恶心减少的程度可以通过将施用cftr氯离子通道抑制剂之前个体的恶心与施用cftr氯离子通道抑制剂之后个体的恶心进行比较来确定。在此，恶心可以通过例如访问个体或者向个体施用设计用于得出该信息的仪器，例如nauseaquestionnaire来测量。测量恶心的方法是本领域技术人员已知的。实施例[0224]提供以下实施例以提供对本文所描述主题的更好理解。这些实施例不应被视为限制所描述的主题。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据其进行的各种修改或改变对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且将被包括在本发明的范围内并且可以在不脱离本发明的范围的情况下做出。[0225]缩写[0226]bad：胆汁酸性腹泻[0227]bapta-am：1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′‑四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)[0228]bpo-27：6-(5-溴呋喃-2-基)-7,9-二甲基-8,10-二氧代-11-苯基-7,8,9,10-四氢-6h-苯并[b]嘧啶并[4',5':3,4]吡咯并[1,2-d][1,4]噁嗪-2-羧酸[0229]cacc：钙激活的氯离子通道[0230]cdca：鹅去氧胆酸[0231]cftr：囊性纤维化跨膜传导调节子[0232]cftrinh-172：4-[[4-氧代-2-硫代-3-[3-(三氟甲基)苯基]-5-噻唑烷亚基]甲基]苯甲酸[0233]dca：去氧胆酸[0234]dra：在腺瘤中下调[0235]enac：上皮钠通道[0236]fgf-19：成纤维细胞生长因子19[0237]fxr：法尼醇x受体[0238]glyh-101：n-2-萘基-[(3,5-二溴-2,4-二羟基苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼[0239]ibs-d：腹泻型肠易激综合征[0240]ic50：半数最大抑制浓度[0241]化学品[0242]除非另有说明，否则所有化学品均购自sigma-aldrich(st.louis,mo)。牛磺-鹅去氧胆酸和牛磺-去氧胆酸的钠盐购自spectrumchemicals(gardena,ca)。所有胆汁酸溶液均在pbs中制备，除了石胆酸，其溶解在dmso中。bapta-am购自emdmillipore(billerica,ma)。毛喉素购自lclaboratories(woburn,ma)。cftrinh-172和(r)-bpo-27如所述合成和纯化。参见，例如，snyder,d.s.,tradtrantip,l.,yao,c.,kurth,m.j.,和verkman,a.s.(2011)potent,metabolicallystablebenzopyrimido-pyrrolo-oxazine-dione(bpo)cftrinhibitorsforpolycystickidneydisease.jmedchem54,5468-5477；snyder,d.s.,tradtrantip,l.,battula,s.,yao,c.,phuan,p.w.,fettinger,j.c.,kurth,m.j.,和verkman,a.s.(2013)absoluteconfigurationandbiologicalpropertiesofenantiomersofcftrinhibitorbpo-27.acsmedchemlett4,456-459；ma,t.,thiagarajah,j.r.,yang,h.,sonawane,n.d.,folli,c.,galietta,l.j.,和verkman,a.s.(2002)thiazolidinonecftrinhibitoridentifiedbyhigh-throughputscreeningblockscholeratoxin-inducedintestinalfluidsecretion.jclininvest110,1651-1658。[0243]实施例1.t84细胞培养[0244]t84细胞(atccccl-248)在dmem/ham'sf-12培养基的1:1混合物中培养，该培养基补充有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞在snapwell池(costarcorning,horseheads,ny)上于37℃在5％co2/95％空气中生长，并在接种后7至14天使用。[0245]实施例2.人结肠样体培养物[0246]人结肠样培养物是从三个不同个体的内窥镜术或外科手术中获得的去识别的组织样本(年龄和性别除外)产生的。人培养物由嵌入24孔板中matrigel(corning,tewksbury,ma)的分离的肠隐窝产生，并在wnt3a、r-spondin-1和含有未分化培养基(udm)的noggin的存在下培养，如在以下中所描述的：zachos,n.c.等人(2016)humanenteroids/colonoidsandintestinalorganoidsfunctionallyrecapitulatenormalintestinalphysiologyandpathophysiology.jbiolchem291,3759-3766；in,j.,等人(2016)enterohemorrhagicescherichiacolireducemucusandintermicrovillarbridgesinhumanstemcell-derivedcolonoids.cellmolgastroenterolhepatol2,48-62。udm培养基中的matrigel培养物用于结肠样体的增殖。为了产生单层培养物，在cultrex类器官收集获取溶液(trevigen,gaithersburg,md)中研磨结肠样体，通过离心收集碎片并重新悬浮在udm中。将结肠样体片段(100μl)接种到0.4μm孔聚酯膜24孔细胞培养池(transwell；corning,tewksbury,ma)上，该池预涂有人胶原iv(34μg/ml；milliporesigma)。单层细胞在udm中于37℃、5％co2下培养。在这些条件下，培养物在7至14天内达到融合，如通过跨上皮电阻所监测的。[0247]实施例3.短路电流测量[0248]t84细胞安装在ussing室中并浸浴在包含(以mm计)：120nacl,5kcl、1mgcl2、1cacl2、10d-葡萄糖、5hepes和25nahco3(ph7.4)的匀称的hco3-缓冲溶液中。溶液用95％o2/5％co2充气并保持在37℃。在一项研究中，为了测量顶端cl-电导，应用了基底外侧到顶端cl-梯度，其中基底外侧半室包含(以mm计)：120nacl、1mgcl2、1cacl2、10d-葡萄糖、5hepes和25nahco3(ph7.4)；在顶端溶液中，120mmnacl被5mmnacl和115mmna-葡萄糖酸盐代替，基底外侧膜用250μg/ml两性霉素b进行透化。短路电流使用evc4000多通道电压钳(worldprecisioninstruments,sarasota,fl)测量。[0249]对于肠短路电流测量，用异氟醚麻醉cd1小鼠。取出结肠，用冰冷的krebs缓冲液冲洗，沿肠系膜边界打开，将全层碎片安装在微型ussing室(面积0.7cm2，worldprecisioninstruments)中。半室充满了氧化的krebs-碳酸氢盐溶液。[0250]人结肠样体培养物中的测量如(18)所描述的进行。顶端和基底外侧半室填充有在37℃下用95％o2/5％co2充气的krebs-ringer碳酸氢盐(kbr)缓冲液。基底外侧半室补充有10mm葡萄糖，顶端半室补充有10mm甘露醇以维持渗透平衡。[0251]实施例4.细胞内ca2 和camp测量[0252]t84细胞接种在96孔黑壁微板中。接种后72小时，将融合的细胞装入fluo-4nw(invitrogen,carlsbad,ca)。对于ca2 测量，用fluostar荧光读板仪(bmglabtechnologies,durham,northcarolina)在485/538nm的激发/发射波长下测量fluo-4荧光。在一些研究中，细胞用bapta-am预处理30分钟。人结肠样体培养物中的ca2 测量是在经荧光ca2 传感器adeno-gcsmp6s转导的单层中进行的。对于camp测定，t84细胞在24孔板中生长，用cdca和/或毛喉素处理30分钟，通过重复冷冻/解冻进行裂解，离心以去除细胞碎片，并根据制造商的说明(r&dsystems,minneapolis,nm)，使用参数camp免疫测定试剂盒测定上清液中的camp。[0253]实施例5.小鼠闭合肠袢中的肠液分泌[0254]在实验前24小时给予cd1小鼠(8至10周龄)5％葡萄糖水，但没有固体食物。在创建闭合肠(中段空肠或远端结肠)袢并注射cdca或pbs载体前60分钟向小鼠腹膜内施用(r)-bpo-27(5mg/kg)或载体(5％dmso，盐水中的10％kolliphorhs)。先前已显示该剂量的(r)-bpo-27在小鼠体内提供治疗性血清水平数小时。参见cil,o.,等人(2017)benzopyrimido-pyrrolo-oxazine-dionecftrinhibitor(r)-bpo-27forantisecretorytherapyofdiarrheascausedbybacterialenterotoxins.fasebj31,751-760。为了创建袢，小鼠用异氟醚麻醉，并在手术期间使用加热垫将体温保持在36℃至38℃。做一个小腹部切口以使肠暴露。对于中段空肠闭合袢模型，通过缝合线创建2cm至3cm的袢。用含有cdca或pbs载体的100μlpbs注射袢。腹部切口用缝合闭合，使小鼠从麻醉中恢复。在结肠闭合袢模型中，小鼠在手术前12小时接受灌肠(500μl矿物油)以清洁结肠的固体，如先前报道的(haggie,p.m.,等人(2018)slc26a3inhibitoridentifiedinsmallmoleculescreenblockscolonicfluidabsorptionandreducesconstipation.jciinsight3,e121370)并且通过缝合线形成1cm至2cm的闭合袢。在指定时间通过外科手术取除肠袢，并测量袢长度和重量以量化液体分泌。在一些实验中，使用了cf小鼠(δf508纯合子，8至10周龄)。[0255]实施例6.胆汁酸性腹泻的大鼠模型[0256]雌性sprague-dawley大鼠(8至10周龄)通过使用柔性塑料管(15号，78mm长，instechlaboratories,plymouthmeeting,pa)的中段结肠输注施用500μlcdca(在pbs中10mm)或pbs载体。在输注前30分钟向大鼠腹膜内施用(r)-bpo-27(10mg/kg)(或载体对照)。(r)-bpo-27溶解在含有5％dmso和10％kolliphorhs的盐水中。输注后，大鼠被单独放置在代谢笼中，并自由获取水和食物。在输注前(用于基线粪便含水量)和输注后4小时内收集粪便样本。粪便在可视时立即称重以确定湿重。为了确定粪便含水量，粪便样品在70℃下干燥24小时，含水量计算为(湿重-干重)/湿重。[0257]实施例7.统计[0258]数据表示为平均值±s.e.m.。使用prism5graphpad软件包(sandiego,ca)进行统计分析。当有两个组时使用学生t-检验进行统计比较，或者当有三个或更多组时使用单因素方差分析进行统计比较。《0.05的p值被认为是统计学上显著的。[0259]cftr抑制阻断t84细胞中胆汁酸诱导的分泌反应[0260]在初步研究中，通过短路电流测量筛选多种胆汁酸，以确定它们在t84结肠上皮细胞系中诱导促分泌反应的能力。参见实施例3。当添加到顶端(粘膜)和基底外侧(浆膜)浸浴溶液二者中时，胆汁酸cdca和dca及其牛磺酸结合物产生稳健的分泌电流，该电流被(r)-bpo-27阻断(图1a)。对于胆酸和熊去氧胆酸未观察到短路电流增加，对于石胆酸仅观察到小的瞬态响应。[0261]cdca应用之后短路电流的增加被选择性和化学无关的抑制剂(r)-bpo-27和cftrinh-172(图1b、图1c)完全阻断。浓度依赖性研究显示该模型中对于(r)-bpo-27抑制的ic50《1μm(数据未显示)。小鼠远端结肠中的短路电流测量显示，在顶端浸浴溶液中添加cdca，电流增加了5.2±1.4μa/cm2(平均值±s.e.m.，n＝3)，这完全被(r)-bpo-27逆转(-5.2±1.7μa/cm2)(图1d)。在基底外侧浸浴溶液中添加cdca后，没有观察到短路电流的增加。[0262]为了研究t84细胞中cdca作用的方向性，将cdca添加到顶端或基底外侧浸浴溶液中。图2a显示了在向顶端溶液添加0.75mm或1mmcdca后的稳健电流响应，而向基底外侧溶液中添加1mmcdca没有影响。观察到向基底外侧溶液添加高达2mmcdca几乎没有影响(图2b)，在研究结束时添加毛喉素作为阳性对照，以证明t84细胞单层的完整性。cdca对顶端cftr的作用和通过(r)-bpo-27的抑制在存在顶端到基底外侧cl-浓度梯度的情况下在基底外侧膜透化的t84细胞单层的短路电流测量中得到证实，其中短路电流提供了顶端cftrcl-电流的直接测量(图2c)。[0263]研究了cdca对t84细胞中camp和ca2 信号通路的可能作用。参见实施例4。高达0.75mm的cdca未显著影响对添加camp激动剂毛喉素的短路响应，但在1mmcdca中观察到毛喉素诱导电流的小幅降低(图3a、图3b)。在每种情况下，增加的电流被(r)-bpo-27完全阻断。细胞内camp测量显示，高达1mm的cdca本身未使camp增加。然而，0.75mm和1mmcdca使camp增加以对最大(10μm)毛喉素响应(图3c)。[0264]在t84细胞中，cdca诱导的短路电流增加在很大程度上通过用ca2 螯合剂bapta-am预处理所阻断(图4a、图4b)。使用荧光传感器fluo-4对细胞内ca2 浓度的测量显示在0.75mm或1mmcdca后ca2 持续升高，其幅度与使用胆碱能激动剂卡巴胆碱或嘌呤能激动剂atp观察到的峰值ca2 升高相当(图4c、图4d)。ca2 升高在很大程度上被bapta-am预处理阻止。这些实验支持ca2 信号参与t84细胞中对cdca的促分泌反应，这是出乎意料的，因为分泌反应似乎完全由cftr(camp激活的cl-通道)介导，而不是由ca2 激活的cl-通道介导。[0265]原代人结肠样体培养物的研究[0266]在原代人结肠样体培养物中研究了使用t84细胞获得的主要发现，包括对顶端cdca的cftrcl-分泌反应和参与ca2 信号传导。参见实施例2。正如在t84细胞中所观察到的，cdca在添加到顶端而不是基底外侧浸浴溶液时产生浓度依赖性的短路电流增加，这被(r)-bpo-27逆转(图5a、图5b)。此外，bapta-am预处理大大降低了短路电流的增加(图5c)，并且cdca使细胞质ca2 浓度升高，峰值幅度与atp产生的峰值幅度相当(图5d)，尽管这比在t84细胞中观察到的更短暂。[0267]bpo-27抑制闭合小鼠肠袢中的液体分泌[0268]在小鼠中建立闭合肠袢模型以研究cdca在体内的促分泌作用。参见实施例5。最初的研究是在中段空肠袢进行的，因为在单个动物中获得多个袢在技术上是容易的，并且它们在研究霍乱和旅行者腹泻模型中的肠液分泌中有广泛的先前用途。图6a显示在中段空肠袢中注射10mmcdca会在1小时内产生液体的大量积聚。使用在2小时测量的用袢液进行的cdca浓度依赖性研究显示，使用5mm和10mmcdca时袢液积聚显著增加(图6b)。闭合远端结肠袢中的类似实验显示，用2.5mmcdca有显著的袢液积聚(图6c)。[0269]为了研究cftr抑制的影响，在创建闭合肠袢和注射cdca(或对照pbs载体)之前60分钟施用(r)-bpo-27(图7a)。在闭合中段空肠袢中，活性bpo-27对映异构体(r)-bpo-27使袢液积聚显著减少55％，而非活性对映异构体(s)-bpo-27没有显著影响(图7b)。在闭合结肠袢中发现用(r)-bpo-27的袢液积聚～70％的更大的减少(图7c)。[0270]由于cftr抑制在很大程度上但不完全阻断袢液积聚，因此研究了cftr依赖性机制是否可能部分是由cdca影响引起的。对于这些实验，在缺乏功能性cftr的囊性纤维化小鼠中进行了闭合袢研究。与注射pbs载体的对照袢相比，注射10mmcdca的中段空肠闭合袢和远端结肠闭合袢显示出少量但显著更大的袢液含量，这表明cftr以外的机制也在cdca诱导的液体积聚中起作用，基于先前的研究其可能包括na /h 和cl-/hco3-交换剂的抑制(促吸收过程)、增加的细胞间渗透性或粘液分泌的刺激。参见alrefai,w.a.,等人(2007)taurodeoxycholatemodulatesapicalcl-/oh-exchangeactivityincaco2cells.digdissci52,1270-1278；pallagi-kunstar,e.,等人(2015)bileacidsinhibitna /h exchangerandcl-/hco3-exchangeractivitiesviacellularenergybreakdownandca2 overloadinhumancoloniccrypts.pflugersarch467,1277-1290；sarathy,j.,等人(2017)theyinandyangofbileacidactionontightjunctionsinamodelcolonicepithelium.physiolrep5,e13294；barcelo,a.,等人(2001)effectofbilesaltsoncolonicmucussecretioninisolatedvascularlyperfusedratcolon.digdissci46,1223-1231。[0271]bpo-27减少胆汁酸性腹泻大鼠模型中的粪便含水量[0272]建立模型以测试(r)-bpo-27影响，其中通过中段结肠输注向大鼠施用cdca(或载体对照)，收集4小时内的粪便以测量粪便重量和含水量(按湿干重量比)(图8a，上图)。参见实施例6。如使用伊文思蓝染料所见，该模型中输注的液体通过结肠腔迅速分布(图8a，下图)。在4小时内从输注cdca的大鼠收集了更大量的粪便，粪便含水量显著增加了～25％(图8b、图8c)。虽然(r)-bpo-27预处理不影响接受中段结肠输注pbs的大鼠的粪便量或含水量，但接受cdca输注的大鼠的粪便含水量的增加被抑制了～55％(图8c)。[0273]不受理论的束缚，本文的数据支持cftr抑制剂(特别是(r)-bpo-27)在胆汁酸相关腹泻的治疗中的cftr抑制效用。t84细胞和人结肠样体培养物中的短路电流测量显示响应于细胞顶端表面暴露于cdca时的促分泌电流，其完全被cftr抑制逆转。(r)-bpo-27对分泌电流的完全抑制也见于暴露于cdca的体外小鼠结肠组织中。全身施用(r)-bpo-27在很大程度上防止小鼠体内闭合结肠袢中的液体积聚，并防止在结肠内输注含有cdca的溶液后粪便水分的增加。这些结果表明cftr是人结肠细胞培养物和啮齿动物中cdca诱导的腹泻中的主要促分泌离子通道。[0274]本技术要求于2019年6月12日提交的美国临时申请第62/860,539号的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文。当前第1页12当前第1页12
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