炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱及其构建方法和用途与流程

1.本发明属于中药分析和检测技术领域。具体地，本发明涉及炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱及其构建方法和用途。


背景技术：

2.九香虫为蝽科昆虫九香虫aspongopus chinensis dallas的干燥体，其始载于《本草纲目》，具有温中助阳、理气止痛的功效，是具有较高药食两用价值的昆虫。九香虫的功能包括理气止痛、温中助阳，主治胃寒胀痛、肝胃气痛、肾虚阳痿和腰膝酸痛。
3.对于九香虫，报道较多的药理作用主要为抗肿瘤和改善生殖损伤作用，另外其还具有抗菌、抗氧化、抗凝血、抗溃疡、抗疲劳等多种药理活性。据文献报道，九香虫的化学成分主要有核苷类成分及其类似物、多巴胺类衍生物以及脂肪酸类化合物等。
4.炒九香虫是九香虫经清炒法制备而来的炮制加工品，其研究文献资料较少，现有的质量标准《中国药典》2020年版仅记载其来源、性状和检查的项目，未记载其含量测定项。除此之外，在九香虫含量测定文献中所报道的检测成分多为黄嘌呤、次黄嘌呤、尿苷、腺苷等核苷类成分，但是经过前期试验研究发现，九香虫配方颗粒中核苷类成分并未检测到。因此，目前在九香虫功能活性成分或指标性化学组分与药材的功能主治尚不能一一对应的情况下，在建立特征图谱及含量测定方法时，尚没有合适的对照品或内标物作为参照物，也没有全面、准确地反映炒九香虫中相关物质含量的检测方法。
5.因此，有必要开发炒九香虫高效液相特征图谱及其构建方法、以及基于该特征图谱的炒九香虫中相关物质含量的全面、准确的检测方法。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种炒九香虫高效液相特征图谱、其构建方法。该方法以犬尿奎啉酸为特征成分，通过高效液相色谱有效地构建了特征图谱，为更全面、更准确地实现炒九香虫中各成分的分析与含量检测提供了高效的保障。
7.本发明的上述第一目的是通过以下技术方案实现的：
8.一方面，本发明提供了一种构建炒九香虫高效液相特征图谱的方法，其包括：
9.(a)制得炒九香虫供试品溶液，并以犬尿喹啉酸作为对照品，制得对照品溶液；
10.(b)对所述炒九香虫供试品溶液和所述对照品溶液进行高效液相色谱检测；
11.其中，所述高效液相色谱检测的条件包括：
12.在254nm的波长下，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，以乙腈为流动相a，以甲酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱的方式洗脱。
13.优选地，在步骤(a)中，制得炒九香虫供试品溶液的方法包括：使炒九香虫供试品溶解于甲醇水溶液中并定量，经超声提取、过滤后制得。
14.优选地，所述炒九香虫供试品溶液的浓度为5mg/ml～20mg/ml。在本发明中，所述
炒九香虫供试品溶液的浓度可以选择例如5mg/ml、6 mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml、 18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。
15.所述炒九香虫供试品可以为炒九香虫或炒九香虫配方颗粒。
16.优选地，所述供试品溶液的浓度为90μg/ml～1mg/ml。
17.优选地，所述超声提取在390w～520w的功率和30khz～50khz的频率下进行20min～40min。在本发明中，所述超声提取例如可以在390w、 400w、410w、420w、430w、440w、450w、470w、490w、500w、 510w、或520w的功率下，并在30khz、35khz、40khz、45khz、或 50khz的频率下进行20min、25min、30min、35min、或40min。
18.优选地，所述甲醇水溶液的体积浓度为0％～70％。在本发明中，所述甲醇水溶液的体积浓度可以选择例如0％、10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。在本发明中，当所述甲醇水溶液的体积浓度选择“0％”时，表示在这种情况下将炒九香虫供试品溶解于水中，以制得炒九香虫供试品溶液。
19.优选地，作为流动相b，所述甲酸水溶液的体积浓度为0.08％～0.15％，更优选为0.1％。
20.优选地，以所述流动相a和所述流动相b的体积分数计，所述梯度洗脱的程序包括：
21.0min～10min，以5％～40％流动相a-95％～60％流动相b洗脱；
22.10min～11min，以40％～5％流动相a-60％～95％流动相b洗脱；
23.11min～13min，以5％流动相a-95％流动相b洗脱。
24.其中，在0min～10min的洗脱时段内，所述流动相a的体积分数可以选择5％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、32％、35％、38％、 40％、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值；所述流动相b 的体积分数则可以根据流动相a的体积分数对应地选择。
25.在10min～11min的洗脱时段内，所述流动相a的体积分数可以选择40％、38％、35％、32％、30％、28％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、 5％、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值；所述流动相b 的体积分数则可以根据流动相a的体积分数对应地选择。
26.优选地，所述流动相的流速为0.2ml/min～0.6ml/min，更优选为0.4 ml/min。
27.优选地，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃，更优选地为30℃。
28.优选地，所述炒九香虫供试品溶液和所述对照品溶液的进样量为0.8 μl～1.2μl，更优选地为1μl。
29.在本发明的构建炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱的方法中，高效液相色谱的系统适用性实验应当使得满足：按犬尿喹啉酸峰计算，理论板数不低于3000。
30.另一方面，本发明提供了根据上述构建炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱的方法获得的炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱。
31.优选地，所述高效液相特征图谱包含5个特征峰，其中相对于特征峰 2(s)的保留时间3.14
±
10％min，各特征峰的保留时间分别在以下规定值的
±
10％范围内：2.15min(特征峰1)、3.45min(特征峰3)、4.56min(特征峰4)、以及7.30min(特征峰5)。
32.本发明的第二目的在于提供一种鉴定炒九香虫或其提取物的方法，其包括：获得
待鉴定的供试品的高效液相色谱谱图，并且将所述供试品的高效液相色谱谱图与上述炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱对照。
33.本发明的第三目的在于提供一种检测炒九香虫或其提取物中有关物质含量的方法。
34.本发明的上述第三目的是通过以下技术方案实现的：
35.一种检测炒九香虫或其提取物中有关物质含量的方法，其包括：
36.(a’)制得供试品溶液，并以犬尿喹啉酸作为对照品，制得对照品溶液；
37.(b’)对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行高效液相色谱检测；
38.其中，所述高效液相色谱检测的条件包括：
39.在240nm的波长下，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，以乙腈为流动相a，以甲酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱的方式洗脱；其他条件同上述构建炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱的方法中所定义的。
40.优选地，所述有关物质包括犬尿奎啉酸、1,2-脱氢-n-乙酰基多巴胺、丝氨酸、苏氨酸、十三烷、2-辛烯酸、棕榈酸、尿嘧啶、黄嘌呤、腺苷和 aspongamide a中的至少一种。
41.优选地，所述犬尿奎啉酸的检测波长为240nm。
42.在本发明检测炒九香虫或其提取物中有关物质的方法中，高效液相色谱的系统适用性实验应当使得满足：按犬尿喹啉酸峰计算，理论板数不低于3000。
43.本发明至少具有如下有益效果：
44.(1)本发明所提供的炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱及其构建方法，以犬尿奎啉酸为特征成分，通过高效液相检测有效地构建了特征图谱，为更全面、更准确地鉴定炒九香虫或其提取物、实现对炒九香虫或其提取物中各成分的分析与含量检测提供了可靠的保障。
45.(2)本发明所提供的检测炒九香虫或其提取物中有关物质的方法，其具有准确度好、精密度高、专属性强、稳定性好的优势，符合中药质量标准研究的技术要求，为分析并测定炒九香虫或其提取物中各成分的准确含量提供了可靠的途径。
附图说明
46.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
47.图1为实施例1中对供试品全波长扫描所获得的谱图(210nm～400 nm)；
48.图2为实施例1中犬尿奎啉酸的光谱图；
49.图3是实施例1中波长筛选考察的hplc色谱图(254nm)；
50.图4是实施例1中波长筛选考察hplc色谱图(240nm)；
51.图5是实施例2中炒九香虫方颗粒254nm色谱图(a)、阴离子总离子流图(b)、阳离子总离子流图(c)；
52.图6是实施例3中供试品溶剂用量考察的hplc色谱图；
53.图7是实施例3中提取方式考察的hplc色谱图；
54.图8是实施例3中提取溶剂浓度考察的hplc色谱图；
55.图9是实施例3中超声功率考察的hplc色谱图；
56.图10是实施例3中提取时间考察的hplc色谱图；
57.图11是实施例4中犬尿喹啉酸含量测定精密度考察的hplc色谱图；
58.图12是实施例4中犬尿喹啉酸含量测定重复性考察的hplc色谱图；
59.图13是实施例4中犬尿喹啉酸加样回收试验的hplc色谱图；
60.图14是实施例4中犬尿喹啉酸的标准曲线；
61.图15是实施例4中犬尿喹啉酸含量测定线性范围考察的hplc色谱图；
62.图16是实施例4中犬尿喹啉酸含量测定专属性考察的hplc色谱图；
63.图17是实施例4中供试品稳定性考察的hplc色谱图；
64.图18是实施例4中犬尿喹啉酸含量测定色谱柱耐用性考察的hplc 色谱图(acquity uplc beh c18)；
65.图19是实施例4中犬尿喹啉酸含量测定色谱柱耐用性考察的hplc 色谱图(acquity uplc beh shield rp18)；
66.图20是实施例4中犬尿喹啉酸含量测定色谱柱耐用性考察的hplc 色谱图(acquity uplc hss t3)；
67.图21是实施例4中acquity h-class plus(pda检测器)考察的hplc色谱图；
68.图22是实施例4中thermo vanquish(dad检测器)考察的hplc色谱图；
69.图23是实施例4中炒九香虫犬尿喹啉酸含量测定三倍洗脱时间考察的hplc图谱；
70.图24是实施例4中炒九香虫特征图谱精密度考察的hplc色谱图；
71.图25是实施例4中炒九香虫特征图谱重复性考察的hplc色谱图峰；
72.图26是实施例4中炒九香虫特征图谱稳定性考察的hplc色谱图峰。
具体实施方式
73.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
74.本发明实施例中所采用的试剂与试药、仪器的信息如下所列。
75.试剂与试药：炒九香虫配方颗粒由北京康仁堂药业有限公司提供；犬尿喹啉酸(批号：9597，纯度≥98％)对照品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；乙腈(天津渤化化学试剂有限公司，20210220，色谱纯)；甲醇(天津渤化化学试剂有限公司，20201208，分析纯)；甲酸(上海市试剂一厂，2019-1-2，色谱纯)；乙腈(fisher，204142，色谱纯)；甲酸(东京化成工业株式会社，3c7on-nj，色谱纯)；蒸馏水(屈臣氏)。
76.仪器：分析天平(赛多利斯，sqp quintix224-1cn，德国)；thermovanquish型超高效液相色谱仪(配有dad检测器、控温型柱温箱、控温型自动进样器，美国)；waters acquity h-class puls型超高效液相色谱仪(配有pda检测器、控温型柱温箱、控温型自动进样器，美国)；高速台式离心机(sigma，1-14，德国)；超纯水仪(cascada，pall，美国)；超声波清洗仪(天津奥特赛恩斯，as20500bt，中国)； uplc-g2xs-tof系统：acquity ultra型高效液相色谱仪(waters，美国)， g2xs-tof型飞行时间质谱，配有电喷雾离子源(waters，美国)。
77.实施例1
78.取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)适量，研细，取约0.5g，精密称定，精密加入70％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声提取(功率390w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，获得供试品溶液。
79.取犬尿喹啉酸对照品适量，精密称定，加入70％甲醇水溶液制成每1 mg/ml的溶液，获得对照品溶液。
80.按照以下色谱条件，对所述供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱检测：
81.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，按以下表1中所列的程序进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；柱温为30℃； pda全波长扫描(210nm～400nm)。
82.表1梯度洗脱程序
83.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)05951040601159513595
84.供试品的全波长扫描图谱和犬尿喹啉酸的光谱图分别参见图1和图2。由实验和图中结果发现，在254nm的检测波长下，色谱图能体现最多的化合物信息；犬尿喹啉酸色谱峰光谱图显示，犬尿喹啉酸在240nm附近存在较好吸收。因此，将构建特征图谱的检测波长确定为254nm(参见图 3)，将犬尿喹啉酸含量测定的检测波长确定为240nm(参见图4)。
85.实施例2
86.采用飞行时间质谱(uplc-q-tof)对特征图谱的特征峰进行识别，具体如下：
87.色谱条件：色谱柱waters acouity uplc beh c18(100mm
×
2.1 mm，1.7μm)；以乙腈为流动相a，0.1％甲酸水溶液为流动相b，按以下表2中所列的程序进行梯度洗脱；检测波长为254nm；流速0.4ml/min；柱温为30℃；进样量为2μl。
88.表2梯度洗脱程序
89.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0955106040
90.质谱条件：采用电喷雾离子化源(esi)mse扫描正负离子模式检测，扫描范围m/z 50～1500，亮氨酸脑啡肽为校正液，进行实时校正；毛细管电压负离子模式2.5kv，正离子模式3kv；锥孔电压20v；雾化气为氮气，体积流量50l/h；碰撞气为氩气；脱溶剂气体流量500l/h，温度350℃；离子源温度120℃；亮氨酸-脑啡肽m/z 566.2771[m h]

，m/z566.2771[m h]

作为lockpray实时校正标准液(200pg/μg)，流速10 μl/min，以物质的量浓度为0.5mm/l的甲酸钠水溶液对质量数进行校正。
[0091]
特征峰识别实验结果：采用uplc-qtof-ms方法对炒九香虫配方颗粒供试品溶液中的化学成分进行分析、正负离子模式下总离子流图及色谱图如图5所示；通过准确分子量、二级质谱离子碎片、参考文献及数据库中化学成分信息共鉴定了其中3个成分；进一步经与对照品通过准确分子量、二级质谱碎片离子的比对确定了2号峰、3号峰、5号峰分别为犬尿喹啉酸、1,2-脱氢-n-乙酰基多巴胺(1,2-dehydro-n-acetyldopamine)、 aspongamide a，1号峰、4号峰为未知峰。
[0092]
2号峰的准分子离子[m h]

为m/z 190.2033，对其进行碰撞诱导解离，在二级质谱图中，可见脱羧基碎片离子m/z 144.2659[m-h-cooh]-。推测该化合物可能为犬尿喹啉酸，
经对照品比对确认2号峰为犬尿喹啉酸。
[0093]
3号峰的准分子离子[m h]

为m/z 194.1387、[m-h]-为m/z 192.1386，对其进行碰撞诱导解离，在二级质谱图中，可见分子离子m/z 152.1895、 m/z 135.1453、m/z 123.1895。推测该化合物可能为1,2-脱氢-n-乙酰基多巴胺(1,2-dehydro-n-acetyldopamine)。
[0094]
5号峰的准分子离子[m h]

为m/z 539.4597、[m-h]-为m/z 537.3631，对其进行碰撞诱导解离，在二级质谱图中，可见分子离子m/z 521.5682、 m/z 473.1963、m/z 385.1953、m/z 149.1895，推测该化合物可能为 aspongamide a。
[0095]
将上述识别和解析结果总结于表3中。
[0096]
表3炒九香虫配方颗粒指认化合物
[0097][0098]
结果显示，在此检测波长下，色谱图中色谱峰较多，信息丰富，故选择254nm作为构建特征图谱的检测波长。通过准确分子量、二级质谱碎片离子解析对照品确定了2号峰、3号峰、5号峰分别为犬尿喹啉酸、1,2
‑ꢀ
脱氢-n-乙酰基多巴胺、aspongamide a。而1号峰～5号峰的峰强度较高，因此选择1号峰～5号峰为炒九香虫的特征峰，其中1号峰、4号峰为未知峰。
[0099]
实施例3
[0100]
本实施例分别考察了供试品溶液的制备过程中溶剂用量、超声提取 (包括提取方式、提取溶剂、提取时间、提取功率)对结果的影响，具体如下：
[0101]
供试品溶剂用量对结果的影响
[0102]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照实施例1的方法，分别采用25ml、50ml、100ml的70％甲醇水溶液作为提取溶剂制备供试品溶液，并进行hplc测定，考察不同体积70％甲醇水溶液对供试品提取结果的影响。其中，以犬尿喹啉酸含量为评价指标。如表4中结果所示，采用25ml、50ml、100ml提取溶剂提取，犬尿喹啉酸含量rsd值均小于5％，以25ml的70％甲醇水溶液能够有效提取供试品，因此，提取溶剂可以选择25ml的70％甲醇水溶液。图6示出了供试品溶剂用量考察的 hplc色谱图结果，其中a、b、c、d分别表示100ml提取溶剂、50ml 提取溶剂、25ml提取溶剂以及犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0103]
表4溶剂体积考察结果
[0104]
溶剂体积/ml含量/％250.58500.56
1000.60rsd/％3.5
[0105]
提取方式对结果的影响
[0106]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照实施例1的方法制备供试品溶液，其中将超声提取改为回流提取，并进行hplc测定，考察回流提取与超声提取对供试品提取结果的影响，以犬尿喹啉酸含量为评价指标，比较两种提取方式。
[0107]
表5提取方式考察结果
[0108]
提取方式含量/％回流提取0.48超声提取0.58rsd/％9.5
[0109]
如表5中结果所示，采用回流提取与超声提取，犬尿喹啉酸含量差异较大，rsd为9.5％，表明两种提取方式差异明显，因此，选择提取效果更好且较为便捷的超声提取方式。图7示出了提取方式考察的hplc色谱图结果，其中a、b、c分别表示超声提取方式、回流提取方式以及犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0110]
提取溶剂对结果的影响
[0111]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照实施例1中供试品制备方法与色谱条件，分别采用纯水、50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液、 100％甲醇水溶液作为提取溶剂制备供试品溶液，考察以纯水、50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液、100％甲醇水溶液作为提取溶剂对供试品提取结果的影响，以犬尿喹啉酸含量为评价指标。如表6中结果所示，不同浓度甲醇对提取效果影响显著，其中以50％甲醇水溶液作为提取溶剂较佳。图8 示出了提取溶剂浓度考察的hplc色谱图结果，其中a、b、c、d、e分别表示纯水提取、50％甲醇提取、70％甲醇提取、100％甲醇提取及犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0112]
表6提取溶剂浓度考察结果
[0113]
提取溶剂含量/％纯水0.5850％甲醇水溶液0.6370％甲醇水溶液0.58100％甲醇水溶液0.50rsd/％9.1
[0114]
提取功率对结果的影响
[0115]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照实施例1中的供试品制备方法与色谱条件，分别采用50％、75％、100％额定功率(520w，40khz) 制备供试品，考察50％、75％、100％额定功率(520w，40khz)对供试品提取结果的影响，选取犬尿喹啉酸含量为评价指标，如表7中结果所示，不同超声功率对犬尿喹啉酸提取效果影响显著，以100％额定功率作为超声功率较佳。图9示出了超声功率考察的hplc色谱图结果，其中a、b、 c、d分别表示100％超声功率提取、75％超声功率提取、50％超声功率提取及犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0116]
表7超声功率考察结果
[0117]
超声功率含量/％50％额定功率0.5375％额定功率0.58100％额定功率0.59rsd/％5.8
[0118]
提取时间对结果的影响
[0119]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照实施例1的方法，在520w、40khz下，分别超声提取20min、30min、40min制备供试品溶液，考察不同超声提取时间对供试品提取结果的影响，选取犬尿喹啉酸含量为评价指标。如表8中结果所示，20min、30min、40min三个提取时间，犬尿喹啉酸含量rsd值均小于5％，无显著性差异。图10示出了提取时间考察的hplc色谱图结果，其中a、b、c、d分别表示提取40min、提取30min、提取20min及犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0120]
表8提取时间考察结果
[0121]
提取时间/min含量/％200.60300.58400.59rsd/％2.3
[0122]
实施例4
[0123]
本实施例考察了本发明的方法和仪器的精密度、重复性、准确度、线性与范围、专属性、稳定性、色谱柱耐用性、仪器重现性、特征图谱精密度、特征图谱重复性以及特征图谱稳定性，具体如下：
[0124]
对照品溶液的制备：取犬尿喹啉酸对照品适量，精密称定，加入甲醇制成90μg/ml的溶液，获得对照品溶液。
[0125]
供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，取约0.5g，精密称定，精密加入50％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率520w，频率40khz)20分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，获得供试品溶液。
[0126]
参照《中国药典》2020年版四部通则0512的规范，色谱条件与系统适用性试验：
[0127]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，按表1中所列的程序进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；柱温为30℃；含量测定检测波长为240nm，特征图谱检测波长为254nm。理论板数按犬尿喹啉酸峰计算应不低于3000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1 μl，注入高效液相色谱仪进行检测。
[0128]
精密度考察
[0129]
取犬尿喹啉酸对照品，采用以上色谱方法，重复进样6针，计算犬尿喹啉酸峰面积相对标准偏差，如图11和表9中结果所示，犬尿喹啉酸6 针进样峰面积rsd值为0.2％，表明仪器精密度良好，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。图 11中a、b、c、d、e、f分别表示犬尿奎啉酸对照品第1次进样至第6 次进样的图谱。
[0130]
表9犬尿喹啉酸含量测定精密度考察结果
[0131]
编号犬尿喹啉酸峰面积(mau*s)精密度11258148精密度21258427精密度31258810精密度41256077精密度51257000精密度61253831峰面积rsd/％0.2
[0132] 重复性考察
[0133]
参照本实施例的前述方法分别制备6份供试品溶液，并采用本实施例前述色谱条件进样，分析供试品中犬尿喹啉酸含量rsd值，以考察本发明方法的重复性。如图12和表10中结果所示，6份供试品溶液中犬尿喹啉酸含量rsd值为1.7％，表明本发明的方法重复性良好，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。图12中a、b、c、d、e、f分别表示炒九香虫第1次至第6次制备供试品所测得的图谱。
[0134]
表10犬尿喹啉酸含量测定重复性试验结果
[0135]
批号犬尿喹啉酸含量/％重复10.21重复20.20重复30.20重复40.20重复50.21重复60.20rsd/％1.7
[0136]
定量计算方法依据《中国药典》2020年版四部通则0512高效液相色谱法中有关规定进行计算，即测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积，按以下等式计算含量：
[0137]
含量(c
x
)＝cr×ax
/ar[0138]
等式中，a
x
为供试品的峰面积；c
x
为供试品的浓度；ar为对照品的峰面积；cr为对照品的浓度。
[0139]
准确度考察
[0140]
准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。
[0141]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)样品，按对照品量与所取供试品中待测定成分量之比为在0.5:1、1:1、1.5:1分别加入对照品进行加样 (n＝9)，制备供试品溶液，并按照本实施例前述的色谱条件进行高效液相色谱分析，分析结果取平均值。如图13和表11中结果所示，加样回收试验中，犬尿喹啉酸的平均回收率为97.2％，rsd为3.6％，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。图13中a、b、c、d、分别表示1.5:1加入对照品、1:1加入对照品、0.5:1 加入对照品依据犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0142]
表11犬尿喹啉酸加样回收试验结果
[0143][0144]
线性与范围考察
[0145]
取犬尿喹啉酸对照品适量，精密称定，加入甲醇制成292.64μg/ml的标准溶液。吸取标准溶液，分别稀释至浓度为混合标准溶液浓度的1％、 10％、25％、50％、75％、100％的犬尿喹啉酸标准溶液，并按照本实施例前述的色谱条件进行高效液相色谱分析。如图14和图15中结果所示，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，拟合犬尿喹啉酸标准曲线为：y＝ 10615x 11132(n＝6)，r2＝0.9995。结果表明，犬尿喹啉酸在2.92 ng～292.64ng范围内线性关系良好。图15中a、b、c、d、e、f分别表示浓度为母液浓度的100％、75％、50％、25％、10％、1％的犬尿奎啉酸对照品溶液图谱。
[0146]
专属性考察
[0147]
取配方颗粒辅料适量，按照本实施例前述的方法制备辅料供试品溶液。取炒九香虫供试品溶液、犬尿喹啉酸标准品溶液和辅料溶液，按照本实施例前述的色谱条件进行高效液相色谱分析。如图16中结果所示，犬尿喹啉酸在缺阴性位置处无干扰峰，表明含量测定专属性良好。图16中a、 b、c分别表示炒九香虫配方颗粒供试品图谱、辅料图谱及犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0148]
稳定性考察
[0149]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照本实施例中前述的方法制备供试品溶液，并按照本实施例前述的色谱条件进行高效液相色谱分析。在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h分别进样测定，将峰面积作为指标，考察样品在24h内的稳定性。如图17(a至j分别对应上述0h～24h内各进样时间点的进样结果)和表12中结果所示，对于犬尿喹啉酸含量测定，供试品24h内峰面积rsd为0.7％，表明稳定性良好。
[0150]
表12供试品的稳定性考察结果
[0151]
时间(h)犬尿喹啉酸峰面积mau*s087426738753406880785
98818621288337615892011188861592188635424888944rsd/％0.7
[0152]
色谱柱耐用性考察
[0153]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照本实施例中前述的方法和色谱条件制备供试品溶液并进行高效液相色谱检测，考察不同厂家色谱柱耐用性，进行系统适应性试验，色谱柱信息如表13中所示。
[0154]
表13犬尿喹啉酸含量测定色谱柱信息
[0155]
色谱柱名称规格厂家批号acquity uplc beh c182.1
×
100mm，1.7μmwaters186002352acquity uplc beh shield rp182.1
×
100mm，1.7μmwaters186002854acquity uplc hss t32.1
×
100mm，1.8μmwaters186003539
[0156]
表14色谱柱耐用性考察结果
[0157]
色谱柱型号保留时间/min分离度acquity uplc beh c183.2513.7acquity uplc beh shield rp185.0819.5acquity uplc hss t34.703.1
[0158]
如图18至图20和表14中结果所示，图中a、b、c分别表示炒九香虫配方颗粒供试品、辅料及犬尿奎啉酸对照品图谱。不同色谱柱对犬尿喹啉酸分离较好，均已达到基线分离，且缺阴性样品显示无干扰峰，表明炒九香虫配方颗粒犬尿喹啉酸含量测定色谱柱耐用性良好。
[0159]
仪器重现性考察
[0160]
在不同仪器上考察炒九香虫含量测定和特征图谱方法系统适用性，仪器信息及考察结果参见表15、表16和图25、图26，图中a、b、c分别表示炒九香虫配方颗粒供试品、辅料及犬尿奎啉酸对照品图谱。结果表明，在不同仪器上，犬尿喹啉酸色谱峰均达到基线分离，且缺阴性样品中无干扰峰，表明本发明的炒九香虫犬尿喹啉酸含量测定方法在不同仪器上重现性良好。
[0161]
表15犬尿喹啉酸含量测定液相色谱仪信息
[0162]
厂家型号检测器类型thermovanquishdadwatersacquity h-class pluspda
[0163] 表16不同仪器考察结果
[0164]
仪器型号保留时间/min分离度acquity h-class plus3.2513.7
vanquish4.234.3
[0165]
三倍洗脱时间考察
[0166]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照本实施例中前述的方法与色谱条件制备供试品溶液并进行高效液相色谱检测。将色谱梯度延长至39min，考察炒九香虫犬尿喹啉酸含量测定三倍洗脱时间图谱。结果如图23中所示，经三倍洗脱，13min之后基本无色谱峰，因此将洗脱时间确定为13min。图23中a、b、c分别表示39min洗脱得到的供试品图谱、13min洗脱得到的供试品图谱及犬尿奎啉酸对照品图谱。
[0167]
特征图谱精密度考察
[0168]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照本实施例中前述的方法和色谱条件制备供试品溶液并进行高效液相色谱检测，重复进样6针，以犬尿喹啉酸为s峰，计算其他特征峰与s峰相对保留时间及相对峰面积 rsd值，结果参见图24和表17、表18。结果显示，特征峰相对保留时间与相对峰面积rsd均小于2％，表明精密度良好。图24中a、b、c、d、 e、f、g分别表示炒九香虫配方颗粒供试品第1次至第6次进样得到的供试品图谱。
[0169]
表17炒九香虫特征图谱精密度考察结果(相对保留时间)
[0170]
色谱峰编号12345精密度10.731.001.251.462.28精密度20.731.001.251.462.28精密度30.731.001.251.462.28精密度40.731.001.251.462.28精密度50.731.001.251.462.29精密度60.731.001.251.462.28rsd/％0.20.00.10.20.2
[0171] 表18炒九香虫特征图谱精密度考察结果(相对峰面积)
[0172]
色谱峰编号12345精密度10.761.000.150.070.06精密度20.751.000.150.070.05精密度30.751.000.150.070.06精密度40.751.000.150.070.06精密度50.751.000.150.070.06精密度60.751.000.150.070.05rsd/％1.00.00.70.91.4
[0173]
特征图谱重复性考察
[0174]
取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照本实施例中前述的方法与色谱条件制备供试品溶液6份并进行液相色谱检测。以犬尿喹啉酸为 s峰，计算其他特征峰与s峰相对保留时间及相对峰面积rsd值，结果参见图25和表19、表20。结果显示，特征峰相对保留时间与相对峰面积 rsd均小于2％，表明特征图谱重复性良好。图25中a、b、c、d、e、 f、g分别表示制备第1份供试品至第6份供试品测得的图谱。
[0175]
表19炒九香虫特征图谱重现性考察结果(相对保留时间)
[0176]
色谱峰编号12345重现性10.721.001.261.472.31重现性20.731.001.261.472.31重现性30.731.001.261.472.31重现性40.731.001.261.472.31重现性50.731.001.261.472.31重现性60.731.001.261.472.31rsd/％0.10.00.10.10.1
[0177] 表20炒九香虫特征图谱精密度考察结果(相对峰面积)
[0178]
色谱峰编号12345重现性10.761.000.160.070.05重现性20.761.000.160.070.05重现性30.751.000.160.070.05重现性40.751.000.160.070.05重现性50.751.000.160.070.05重现性60.751.000.160.070.06rsd/％0.30.00.50.40.5
[0179]
特征图谱稳定性考察
[0180]
特征图谱稳定性考察：取炒九香虫配方颗粒(批号：20022142)，按照本实施例中前述的方法与色谱条件制备供试品溶液并进行高效液相色谱检测。分别在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h时进样测定，记录识别峰保留时间与峰面积。以犬尿喹啉酸为s峰，计算其他特征峰与s峰相对保留时间及相对峰面积rsd值，结果参见图26和表21、表22。结果显示，特征峰相对保留时间与相对峰面积rsd均小于2％，表明供试品的特征图谱在24h内稳定性良好。图26中a、b、c、d、e、f、 g、h、i、j分别对应上述0h至24h内各进样时间点的进样结果。
[0181]
表21炒九香虫特征图谱稳定性考察结果(相对保留时间)
[0182]
色谱峰编号123450h0.731.001.251.462.283h0.731.001.251.472.306h0.731.001.251.472.309h0.731.001.251.462.3012h0.731.001.251.462.2915h0.731.001.251.462.3018h0.731.001.251.462.3021h0.731.001.251.462.2924h0.731.001.251.462.29rsd/％0.20.00.10.20.3
[0183] 表22炒九香虫特征图谱稳定性试验结果(相对峰面积)
[0184]
色谱峰编号12345
0h0.761.000.140.070.053h0.751.000.150.070.056h0.751.000.150.070.059h0.751.000.150.070.0512h0.751.000.150.070.0515h0.751.000.150.070.0518h0.751.000.150.070.0521h0.751.000.150.070.0624h0.771.000.150.070.06rsd/％0.70.01.00.61.0
[0185]
以上所述，仅是本发明的几个示例性实施例，并非对本发明做任何形式的限制。虽然本发明以较佳的实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案范围内。