一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡的制作方法

1.本发明属于抗生素污染以及食品安全免疫检测技术领域，具体涉及一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡。


背景技术：

2.诺氟沙星（nor）是第三代喹诺酮类抗菌药，会阻碍消化道内致病细菌的dna旋转酶的作用，阻碍细菌dna复制，对细菌有抑制作用。诺氟沙星为杀菌剂，通过作用于细菌dna螺旋酶的a亚单位，抑制dna的合成和复制而导致细菌死亡。由于诺氟沙星抗生素在养殖业中的滥用，导致了动物性食品中诺氟沙星抗生素的残留。动物性食品中的诺氟沙星抗生素残留不仅会导致光毒性，也会导致耐药性的产生。同时，动物性食品中诺氟沙星的残留会影响奶制品的质量，随着人食用奶制品会严重威胁人们健康。中国农业部已经明令禁止一些抗生素在养殖业中的使用。此外，在食品安全检测中它可以作为评价食品产品质量的一项重要指标。因此需要高灵敏，高通量的检测技术来实现对于诺氟沙星抗生素的检测显得尤为重要。
3.目前，检测样品中诺氟沙星含量的方法主要包括毛细血管电泳法、电化学免疫传感器、高效液相色谱法等方法。这些方法都利用分析化学的检测手段对样品进行分离鉴定，可以实现诺氟沙星的定量检测。然而，这些方法的操作都需要实验室技术人员的操作以及对样品的预处理，有些还会用到昂贵的实验仪器，因此对样品中诺氟沙星的快速检测带来了一定的困扰。抗原抗体反应具有比例性，可逆性和高度的特异性，因此可以被用作免疫检测以及免疫诊断，目前已经被广泛应用于免疫印迹（wb）、免疫组织化学（ihc）、酶联免疫吸附试验（elisa）和免疫胶体和纳米花金层析技术（gica）。应用纳米花金标免疫检测卡可以对诺氟沙星进行快速大批量的定性和半定量检测，而且不需要对样品进行前处理，从而省去了繁琐的步骤和样品处理时间。与其他化学检测方法相比较而言，该检测卡具有灵敏度高，特异性强，快速，简便等特点，被广泛应用于食品安全检测中。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对上述问题，提供一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡。利用该检测卡检测样品中的诺氟沙星，缓解了现有技术中缺少一种快速检测诺氟沙星的症结，将检测线和控制线划到同一个卡条上，装入包装壳，滴加微量检测样品等待5-10分钟即可完成全部检测，结果肉眼可见，操作简单易行，且能保证检测卡的灵敏度，提高检测的准确性，避免污染环境，实现对诺氟沙星绿色环保的快速检测。
5.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡，所述检测卡包括样品垫、纳米花金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡壳；所述的nc膜上设置有c线和t线，所述的c线上喷有羊抗鼠的igg抗体，所述的t线上包被有bsa-nor交联抗原；所述的金标垫上含有金纳米花标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5b1。
6.上述金标垫中所含有纳米花标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5b1的制备方法为：取10 ml纳米花金溶液，加入300 μl 0.1 m k2co3溶液，混匀后备用；加入500 μl 抗诺氟沙星单克隆抗体5b1，于冰上继续搅拌30 min；称量0.1 g bsa并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min；称量0.1g peg-20000并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min待完全溶解后4℃静置过夜；4℃，1000 r/min离心10 min，收集上清中的纳米花金标抗体5b1，之后于4℃ 3000 r/min离心30 min，收集中间层蓝紫色流动相；向含有蓝紫色流动相中加入原来纳米花金标抗体5b1 1/10体积的纳米花金标稀释液，制得浓度为0.068 mg/ml的纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆抗体5b1溶液；纳米花金标记的抗诺氟沙星单克隆igg抗体溶液以100 mm/s和1.25 μl/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上后干燥；所述纳米花金标稀释液：10 ml pbs 0.1g bsa 0.05 g peg-20000。
7.上述纳米花金溶液的制备方法为：用100 ml ddh2o溶解1 g haucl4制备获得1wt%的氯金酸水溶液，每管1 ml分装于1.5 ml灭菌离心管中并用锡箔纸密封后于-20℃保存备用；取1 ml 1wt%的氯金酸水溶液溶于100 ml ddh2o，混匀后加热煮沸，随后加入1.5 ml 1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸7 min；观察溶液的颜色逐渐稳定成酒红色，放置室温冷却后，用无菌ddh2o定容至100 ml，即得到胶体金溶液，于4℃冰箱冷藏备用；取750 μl1wt%的氯金酸水溶液加入100 ml ddh2o中，加入500 μl上述制备的胶体金溶液混匀，再加入300 μl 1wt%的柠檬酸三钠摇匀，最后加入1 ml 30 mm的对苯二酚溶液, 搅拌2 min即得到纳米花金溶液。所述纳米花金的溶液中纳米花金颗粒的最大吸收峰为570 nm。
8.上述抗诺氟沙星单克隆抗体5b1是由保藏编号为cgmcc no. 21013的抗诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株5b1分泌获得；所述抗诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株5b1已于2020年11月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
9.上述t线上包被的bsa-nor交联抗原，其制备方法为：将 1 mg 诺氟沙星用1 ml二甲基亚枫(dmso)溶解后，加入 13 mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和 38 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edc），37℃条件下避光反应 24 h，4000 r/min离心 5 min后取上清液逐滴加入到 4 ml含 10 mg bsa的pbs缓冲液中，37℃条件下避光振荡反应 24 h，反应完用 pbs透析3 d，即获得bsa-nor交联抗原溶液；将0.05 mg/ml的bsa-nor交联抗原溶液，以100 mm/s和1.25 μl/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在t线上后干燥。
10.所述c线上包被的羊抗鼠igg的抗体是由0.06 mg/ml的羊抗鼠igg的抗体溶液以100 mm/s和1.25 μl/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在c线上后干燥。
11.上述基于金纳米花颗粒的诺氟沙星免疫快速检测卡在诺氟沙星检测中的应用。
12.本发明的显著优点在于：通过竞争法纳米花金标免疫测流层析检测卡方法，对诺氟沙星进行快速检测，其检测灵敏度为39 ng/ml, 所建立的检测方法方便快捷可以直接用于实际样品中诺氟沙星的快速检测。
附图说明
13.图1 单克隆抗体5b1的腹水纯化结果鉴定。m：蛋白marker；1泳道：腹水；2泳道：经过纯化后的单克隆抗体。
14.图2 纯化单克隆抗体5b1特异性测定结果。
15.图3 纯化单克隆抗体5b1亲和力测定结果。
16.图4 纳米花金颗粒的制备结果。
17.图5 纳米花免疫测流层析检测卡的结构示意图。
18.图6 纳米花免疫测流层析检测卡特异性分析。
19.图7 纳米花免疫测流层析检测卡灵敏度分析。
20.图8 纳米花免疫测流层析检测卡牛奶及实际样品检测。
具体实施方式
21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
22.实施例1 本发明单克隆抗体5b1的纯化与鉴定1）抗诺氟沙星的杂交瘤细胞5b1的制备：将0.1 mg 的bsa-nor完全抗原用pbs稀释至终体积为300 μl。将freund’s完全佐剂等体积与完全抗原bsa-nor混合进行，用乳化仪将混合物乳化至油包状态，乳化的结果以滴到水中30 min之内不散开为判断标准，乳化后对balb/c小鼠进行皮下多点注射免疫。后续每间隔14天进行一次加强免疫，将freund’s完全佐剂替换成freund’s不完全佐剂，其他步骤同首次免疫。将血清效价达1:16000的小鼠脾细胞与sp2/0用peg1450按照常规方法进行融合，用含体积分数（v/v）20%胎牛血清的hat rpmi-1640培养基作为基础筛选融合细胞，采用有限稀释法多次进行亚克隆，最终筛选获得能稳定分泌抗诺氟沙星的单克隆抗体杂交瘤细胞株5b1。
23.制备所得抗诺氟沙星的单克隆抗体杂交瘤细胞株5b1于2020年11月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no. 21013，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
24.2）单克隆抗体腹水的制备选取9~10周龄的balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射500 μl液体石蜡致敏。致敏后7~10 d，选取96孔细胞培养板中生长状态良好的抗诺氟沙星的杂交瘤细胞株5b1进行细胞计数后（约105~106个）注射到致敏的小鼠腹腔。10~12 d，小鼠的腹部出现明显的膨胀而且行动缓慢，说明腹腔内杂交瘤细胞已经大量繁殖产生了腹水。待小鼠的腹部继续膨胀变大直到小鼠奄奄一息时；即可采用无菌针头扎入小鼠的下部腹腔收集腹水，腹水收集完毕后于13000 r/min 4℃离心15 min。离心后的腹水分三层，最下层是血细胞层，中间相为单克隆抗体层，最上层是脂肪等结缔组织碎片层。用移液器吸取中间相腹水置于新的离心管中，-80℃超低温冰箱保存。
25.3）单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化采用辛酸硫酸铵法和protein g resin法。
26.辛酸硫酸铵法：从-80℃超低温冰箱中取出中间相腹水融化后吸取1 ml置于离心管中，2500 r/min室温离心5 min。用移液枪吸出上清加入3 ml 60 mm的ch3coona（ph 4.0）缓冲液，用0.1 mol/ml naoh溶液调ph至4.5。在室温下，将33 μl正辛酸逐滴缓慢的加入上述溶液中，继续搅拌30 min，冰上静置反应2 h，然后以10000 r/min 4℃离心20 min收集上清，加入1/10体积的0.1 m pbs，再调ph值至7.4，量取溶液的体积，在冰上逐滴缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，注意一边加一边搅拌，加完以后在冰上静置30 min。然后全部溶液转移至离心管内，10000 r/min 4℃离心20 min收集沉淀，用1/10体积的0.01 m pbs重悬抗
体沉淀，最后用0.01 m pbs透析抗体并用peg-20000浓缩。
27.通过辛酸硫酸铵纯化的单克隆抗体纯度较低，仍需要根据实验要求进一步纯化才能得到高纯度的单克隆抗体5b1。
28.protein g亲和层析法：（1）平衡：用5~10倍层析柱体积的平衡缓冲液（20 mm na2hpo4，0.15 m nacl，ph 7.0）平衡层析柱材料，直到流出液与平衡缓冲液完全一致。
29.（2）上样：辛酸硫酸铵粗纯得到的抗体要用0.45 μm微孔滤膜过滤后才能上柱。把过滤后的溶液与等体积的平衡缓冲液（20 mm na2hpo4，0.15 m nacl，ph 7.0）混合后上柱，用计时器计时按照1 ml/min的速度收集流出液。把收集的流出液再次上柱后按照1 ml/min的速度流出，重复2~3次后于4℃静置2 h。
30.（3）洗涤：用30 ml的平衡缓冲液（20 mm na2hpo4，0.15 m nacl，ph 7.0）洗涤层析柱，用计时器计时按照2 ml/min的速度流出。
31.（4）洗脱：用20 ml的洗脱缓冲液（0.1 m gly，ph 2.5）洗脱结合在层析柱的单克隆抗体，用计时器计时按照1 ml/min的速度收集流出液。
32.（5）收集洗脱下来的抗体溶液，立即加入1/10体积的中和缓冲液（1 m tris，ph 8.5）直至ph值为7.4。用0.01 m pbs透析抗体并用peg-20000浓缩后待用。透析抗体时，需要在4℃用0.01 m pbs缓冲液（ph 7.4）透析，每6 h更换一次透析液，透析3次后即可sds-page电泳分析。
33.4) 单克隆抗体sds-page分析取10 μl纯化后的抗体加入20 μl 5
×
loading buffer混匀；取1.5 μl未纯化的腹水加入20 μl 5
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loading buffer混匀。然后把样品置于1.5 ml离心管中沸水浴10 min使抗体完全变性后各取10 μl点样后sds-page电泳。最后经考马斯亮蓝染色后再脱色观察。如图1所示，腹水中含有大量的免疫球蛋白和其他的杂蛋白（1泳道），经过纯化后的单克隆抗体只有重链（约50 kda）和轻链（约25 kda）（2泳道）。
34.5) 单克隆抗体5b1的特异性和亲和力测定抗原包被在酶标板上，乳铁蛋白的单克隆抗体与抗原特异性结合，之后商品化的山羊抗小鼠-hrp孵育后与一抗结合，最后酶标二抗在tmb显色液中显色。根据酶标二抗在显色液中催化底物的量而显出不同深浅的颜色。本实验中把腹水和纯化后的单克隆抗体分别用作一抗，即可测定抗诺氟沙星单克隆抗体5b1的效价。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长的同时会分泌大量的抗体，经过辛酸硫酸铵和protein g亲和层析后就可以得到高纯度的抗体，之后采用间接elisa的方法测定其特异性和亲和力，特异性结果如图2所示，纯化后的单克隆抗体特异性好，只与诺氟沙星（nor）发生特异性竞争识别，而不与其他相关抗原（硫酸锌霉素（nms）、氨苄青霉素（amp）、氯霉素 (cap)、卡那霉素（kana）、牛血清白蛋白（bsa））结合。亲和力测定结果如图3所示，经计算该单克隆抗体5b1的亲和力为7.66
×
10
8 l/mol，属于高亲和力的抗体，可以用于免疫检测方法的建立和后续的实验。
35.实施例2 本发明纳米花免疫层析检测卡的制备与鉴定1）纳米花金溶液的制备纯化透析后的单克隆抗体5b1溶液（0.01 m pbs）会含有大量的盐离子，这些盐离子浓度会影响胶体金溶液的稳定性甚至使胶体金变性。所以单克隆抗体5b1需要在ddh2o透
析24 h，每6 h更换一次透析液，透析后用peg-20000浓缩备用。用100 ml ddh2o溶解1 g haucl4制备获得1wt%的氯金酸水溶液，每管1 ml分装于1.5 ml灭菌离心管中并用锡箔纸密封后于-20℃保存备用。取1 ml1wt%的氯金酸水溶液溶于100 ml ddh2o，混匀后加热煮沸，随后加入1.5 ml 1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸7 min，观察溶液的颜色逐渐稳定成酒红色，放置室温冷却后，用无菌ddh2o定容至100 ml，即得到胶体金溶液，于4℃冰箱冷藏备用。取750 μl 1wt%的氯金酸水溶液加入100 ml ddh2o中，调ph值至7.5，加入500 μl制备的胶体金溶液，混匀后再加入300 μl的柠檬酸三钠（1wt%）摇匀，最后加入1 ml的对苯二酚溶液（30 mm）, 并搅拌2 min即可得到金纳米花溶液。纳米花金溶液的制备与表征结果如图4所示，制备的纳米花金颗粒在570 nm达到最大吸收值。
36.2）金纳米花标记诺氟沙星单克隆抗体5b1的制备用移液枪取10 ml纳米花金溶液于50 ml小烧杯中，加入300 μl 0.1 m k2co3溶液，混匀后备用。取500 μl 1.2 mg/ml 诺氟沙星单克隆抗体5b1，用移液枪慢慢滴加入锥形瓶中，于冰上继续搅拌30 min。称量0.1 g牛血清白蛋白（bsa）并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min。称量0.1g peg-20000并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min待完全溶解后4℃静置过夜，获得金纳米花标记的诺氟沙星单克隆抗体5b1，即纳米花金标抗体5b1。
37.3）纳米花金标抗体5b的纯化把过夜静置的纳米花金标抗体5b1分装至1.5 ml灭菌离心管中，4℃，1000 r/min离心10 min，用移液枪轻轻吸取上清并转移至新的离心管中，弃沉淀。然后把新的离心管中的纳米花金标抗体5b1，于4℃，3000 r/min离心30 min，用移液器把上清全部吸出，收集中间层蓝紫色流动相。向含有蓝紫色流动相的离心管中加入纳米花金标稀释液（纳米花金标稀释液：10 ml pbs 0.1g bsa 0.05 g peg-20000）制备得0.068 mg/ml纯化的纳米花金标抗体5b1，然后置于4℃保存备用。
38.4）bsa-nor交联抗原得制备方法为：将 1 mg nor用 1 ml二甲基亚枫溶解后，加入 13 mg n-羟基琥珀酰亚胺和 38 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，37℃条件下避光反应 24 h。4000 r/min离心 5 min后取上清液逐滴加入到 4 ml含 10 mg bsa的pbs缓冲液中，37℃条件下避光振荡反应 24 h。反应完用 pbs透析3 d，即获得bsa-nor交联抗原溶液。
39.5）纳米花金标垫与样品垫的处理把金标垫和样品垫裁剪成4 mm宽，20mm长的长条状，放入500 ml玻璃烧杯中，加入封闭液（100 ml pbs 1 g bsa 1 ml tween-20）使纳米花金标垫和样品垫淹没，置于37℃恒温培养箱30 min，然后取出于37℃干燥保存。
40.6）检测卡组装硝酸纤维膜（nc膜）（sartorius cn140，2.5 cm
×
30 cm）固定到卡式底板 db-6（6.0 cm
ꢀ×ꢀ
30 cm），用0.01 m pbs（ph 7.4）稀释nor-bsa交联抗原（1 mg/ml）至0.05 mg/ml后在硝酸纤维膜上按照100 mm/s 和1.25 μl/cm进行划线，得检测线（t线）；用0.01 m pbs（ph 7.4）稀释羊抗小鼠igg（gama，1 mg/ml）至0.06 mg/ml后在硝酸纤维膜上按照100 mm/s 和1.25 μl/cm进行划线，得质控线（c线），置37 ℃恒温箱干燥。取2 μl步骤3）制备的0.068 mg/ml纳米花金标抗体5b1以每100 mm/s 和1.25 μl/cm的喷涂速度通过喷金点膜机
喷涂到金标垫（gold labeled ab pad）上，干燥，组装检测卡。纳米花免疫检测卡的组装的详细步骤如下：将nc膜固定于检测卡底板，把吸水纸叠（absorption pad）放在检测试纸条尾端，同时把金标垫（gold labeled ab pad）叠放于检测试纸条检测区和加样区的中部，在金标垫上叠放样品垫（sample pad），再扣上卡套，检测卡组装完成。 用移液枪加入100 μl 0.01 m pbs，反应时间10 min，通过金标检测卡的显色情况判断金标抗体是否能进行检测使用。纳米花免疫检测卡的检测原理示意图如图5所示。
41.实施例3 本发明纳米花免疫层析检测卡的检测应用1）纳米花免疫层析检测卡特异性测定用0.01 m pbs把6种不同的抗原（诺氟沙星（nor）、硫酸锌霉素（nms）、氨苄青霉素（amp）、氯霉素(cap)、卡那霉素（kana）、二甲基亚枫（dmso））稀释至终浓度为10 μg/ml。然后向实施例2组装好的纳米花金标检测卡样品垫中依次加入100 μl稀释好的不同抗原，反应时间10 min，观察t线的消失情况。结果如图6所示：只有加入诺氟沙星标准品的溶液中纳米花免疫检测卡的t线完全消失，检测结果为阳性。而加入其它5种抗原的检测卡中都显示出c线和t线，检测结果为阴性。这表明：纳米花免疫层析检测卡只与诺氟沙星抗原反应，不和其它无关的抗原发生反应，证明该纳米花免疫层析检测卡方法特异性强，无交叉反应。
42.2）免疫胶体金层析灵敏度测定用0.01 m pbs把诺氟沙星标准品稀释至终浓度为20 μg/ml，10 μg/ml，5 μg/ml，2.5 μg/ml，1.25 μg/ml，0.625 μg/ml，0.3125 μg/ml，0.156 μg/ml，0.078 μg/ml，0.039 μg/ml和0 μg/ml。然后向实施例2组装好的纳米花金标检测卡样品垫中依次加入100 μl稀释好的诺氟沙星标准品，反应时间7 min，观察t线的消失情况。实验结果如下图7所示：随着待测样品中诺氟沙星浓度的提高，t线逐渐的消失，直至抗原浓度达到1.25 μg/ml时，测试区的蓝紫色t线条带完全消失。相反随着诺氟沙星抗原浓度的降低，抗原的竞争越来越弱，t线的颜色越来越深，当诺氟沙星的浓度为0.039 μg/ml时免疫胶体金层析中c线和t线的显色情况与没有加诺氟沙星抗原的显色情况完全一样，此时已经达到了胶体金检测卡的下限。综上所述，本研究制备的纳米花免疫层析检测卡的最低检测限为39 ng/ml。
43.3）纳米花免疫胶体金层析实际样品检测从市场中随机购买2种饮用水、1种诺氟沙星药品和2种不同品牌的牛奶（分别对应图8中的sample 1，sample 2，sample 3，sample 4和sample 5），然后向实施例2组装好的纳米花金标检测卡样品垫中依次加入100 μl牛奶和实际样品，反应时间10 min，观察t线的消失情况。结果如下图8所示：样品3、样品4和样品5中纳米花免疫层析检测卡的t线完全消失，检测结果为阳性。而加入其它样品的检测卡中都显示出c线和t线，检测结果为阴性。这说明只有2种牛奶和1种诺氟沙星药品中含有诺氟沙星，其余样品中均不含诺氟沙星。
44.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。