MAL33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用的制作方法

mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用
技术领域
1.本发明涉及mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用，属于生物工程领域。


背景技术：

2.近年来，利用丰富、廉价的木质纤维素原料（如农业废弃物、林业废弃物等）生产的二代燃料乙醇有望替代不可再生的化石能源，可以缓解当前世界的能源危机，减少环境污染，受到各国的广泛关注。木质纤维素原料经过预处理、酶解等过程释放可被酿酒酵母等微生物利用的六碳糖和五碳糖等糖分，还产生了各种抑制物，包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物。
3.弱酸类主要包括甲酸、乙酸和乙酰丙酸，乙酸是木质纤维素预处理液中的典型抑制物，乙酸含量最高，预处理手段不同，乙酸浓度也不同，大致浓度范围在1-10 g/l之间，乙酸对细胞产生不利影响：（1）引起dna损伤，导致dna和rna合成速率以及代谢活性降低；（2）为维持正常的生长环境，通过水解atp获得足够能量驱动质子泵，从而排出胞内大量积累的h

，这个过程会消耗大量atp，用于细胞代谢的atp就会供应不足，从而导致细胞活性降低，并最终影响微生物的发酵过程；（3）容易引起ros积累，导致细胞程序性死亡；（4）还会影响膜结构，抑制胞内翻译。
4.呋喃类抑制物主要是糠醛和hmf，浓度一般在0-5 g/l之间。hmf对参与糖酵解和三羧酸循环等其他代谢过程中的酶（如乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和丙酮酸脱氢酶等）产生抑制，降低发酵过程中葡萄糖和木糖的转化率；酿酒酵母将呋喃类抑制物转化为相应的醇化合物过程中消耗大量的辅酶，容易造成胞内氧化还原的失衡，导致细胞产生atp的能力降低；糠醛能够诱导酿酒酵母中活性氧ros 的积累，引发细胞程序性死亡，降低乙醇得率。
5.酚类化合物主要由木质素在高温酸解等预处理过程中分解产生，它们通常是含苯环的芳香族化合物。酚类抑制物通过破坏细胞膜的完整性和线粒体膜的电化学梯度，进而影响细胞膜的选择性和通透性。因此，提高酿酒酵母对木质纤维素水解液中的抑制物耐受性对于二代燃料乙醇的发展和应用至关重要。
6.mal33基因参与麦芽糖代谢，是调节麦芽糖通透酶基因mal31和麦芽糖酶基因mal32表达的转录因子，在提高酿酒酵母对乙酸和h2o2耐受性方面的尚无报道，也没有关于该基因提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性的相关报道。


技术实现要素：

7.利用木质纤维素原料生产二代燃料乙醇过程中，存在酿酒酵母对木质纤维素水解液中的抑制物耐受性较低的问题，本发明提供了mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物的耐受性中的应用。
8.本发明的技术方案如下：
mal33-f（5
’‑
tgatatcagatccactagtgtaggaccctcatcacaatgatt-3’）（下划线部分为与loxp-kanmx4-loxp下游同源序列，用于与loxp-kanmx4-loxp融合pcr）和dos-mal33-r（5
’‑
tgaactcagagaaatggaattggggtgcta-3’）分别进行pcr扩增获得500bp左右的带有g418抗性基因loxp-kanmx4-loxp部分序列的mal33基因上游同源臂和mal33基因下游同源臂，pcr扩增条件为95℃预变性10min，95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环，72℃终延伸5min。
35.（2）g418抗性基因loxp-kanmx4-loxp的扩增：以pug6质粒为模板，以kanmx4-f（5
’‑
agctgaagcttcgtacgctg-3’）和kanmx4-r（5
’‑
gcataggccactagtggatctg-3’）为引物进行pcr扩增，获得1500bp左右的带有loxp位点的基因片段loxp-kanmx4-loxp。
36.（3）mal33上下游同源臂与loxp-kanmx4-loxp融合pcr扩增：分别以带有mal33基因的上下游同源臂和loxp-kanmx4-loxp为模板，利用引物ups-mal33-f和dos-mal33-r，进行融合pcr，扩增获得2600bp左右的mal33基因敲除片段，pcr扩增条件为95℃预变性10min，95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸3min50s，30个循环，72℃终延伸5min。
37.3.mal33基因敲除片段转化酿酒酵母：利用醋酸锂转化法将融合pcr扩增得到的mal33基因敲除片段转入酿酒酵母bspx051-3xi中，在含有200μg/mlg418的ypd平板上进行筛选，初步获得mal33基因缺失的转化子。
38.4.转化子的pcr验证：从筛选平板上挑取单菌落，在含有200μg/mlg418的ypd液体培养基中于30
°
c，200rpm培养12~24h，提取转化子基因组dna，以基因组dna为模板，以ups-mal33-f和dos-mal33-r为引物进行pcr验证。pcr扩增条件为95℃预变性10min，95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸3min50s，30个循环，72℃终延伸5min。pcr扩增出大约2600bp左右的条带，说明mal33基因被成功敲除，得到mal33基因缺失菌株bspx051-3xi-mal33
△
。
39.实施例2：mal33基因缺失菌株对乙酸、其他典型抑制物和h2o2的耐受性测试1.mal33基因缺失菌株在含有3g/l乙酸的ypd培养基中的限氧摇瓶发酵情况评估挑取mal33基因缺失菌株bspx051-3xi-mal33
△
和对照菌株bspx051-3xi的单菌落，接种到5mlypd液体培养基，于30℃摇床中200rpm活化培养12h~24h，待菌液浑浊后再转接至5ml新鲜培养基中进行第二次活化，活化时间为12h~24h。将活化的种子液接种至装有30mlypd 3g/l乙酸培养基的限氧瓶中，调整起始od
600
为0.2，在30℃，200rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用紫外可见分光光度计发酵液的od
600
，图5结果显示，bspx051-3xi-mal33δ的生长明显好于bspx051-3xi，说明敲除mal33基因能提高酿酒酵母乙酸耐受性。
40.2.mal33基因缺失菌株在含有木质纤维素水解液其它抑制物和h2o2的ypd平板上的生长情况评估挑取mal33基因缺失菌株bspx051-3xi-mal33
△
和对照菌株bspx051-3xi的单菌落接种到ypd中，30℃中振荡活化培养两次，过夜培养，取对数生长期后期的菌体，离心收集并用无菌水清洗菌体3次后悬浮于1ml无菌水中，置于30℃培养箱中温育9h消耗内源性营养物质以便制备休止细胞。调节菌体休止细胞浓度使其悬液od
600
为1左右，10倍梯度稀释三个
梯度（100，10-1
，10-2
，10-3
），取4 μl点滴于含有3 g/l乙酸的ypd平板，于30℃中培养2~3天观察菌落生长情况，拍照保存结果，图6结果所示，bspx051-3xi-mal33
△
在含有木质纤维素水解液其它典型抑制物（如香草醛、甲酸、hmf和乙酰丙酸）的ypd平板上生长略好于对照菌株bspx051-3xi，说明敲除mal33基因也能提高酵母对木质纤维素水解液其它典型抑制物的耐受性。同时bspx051-3xi-mal33
△
在含有h2o2的平板上生长优于对照菌株，说明敲除mal33基因也能提高酵母对h2o2的耐受性。
41.实施例3：mal33基因缺失菌株在含有3.5 g/l乙酸的混糖培养基和含有混合抑制物的混糖培养基中的限氧摇瓶情况评估1. mal33基因缺失菌株在含有3.5 g/l乙酸的ypdx培养基中的限氧摇瓶发酵情况评估挑取mal33基因缺失菌株bspx051-3xi-mal33
△
和对照菌株bspx051-3xi的单菌落，接种到5 ml ypd液体培养基，于30 ℃摇床中200 rpm活化培养12 h~24 h，待菌液浑浊后再转接至5 ml新鲜培养基中进行第二次活化，活化时间为12h~24 h。将活化的种子液接种至装有30 ml含有3.5 g/l乙酸的ypdx培养基中，调整起始od
600
为0.2，在30 ℃，200 rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用紫外可见分光光度计发酵液的od
600
，利用高效液相色谱（hplc）分析发酵产物中的葡萄糖、木糖消耗情况和乙醇产生情况。图7结果显示，bspx051-3xi-mal33
△
在含有3.5 g/l乙酸的ypdx培养基中发酵延滞期明显缩短，生长明显好于对照菌株bspx051-3xi；hplc分析结果（图8）表明，bspx051-3xi-mal33
△
在28 h内利用完葡萄糖，而bspx051-3xi在48 h才消耗完；bspx051-3xi-mal33
△
的木糖消耗和产乙醇能力也明显高于对照菌株，说明敲除mal33基因可以提高酿酒酵母在含有乙酸的葡萄糖和木糖中的生长，同时能加快酿酒酵母利用葡萄糖和木糖产乙醇。
42.2. mal33基因缺失菌株在含有木质纤维素水解液混合抑制物的ypdx培养基中的限氧摇瓶发酵情况评估挑取mal33基因缺失菌株bspx051-3xi-mal33
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和对照菌株bspx051-3xi的单菌落，接种到5 ml ypd液体培养基，于30 ℃摇床中200 rpm活化培养12 h~24 h，待菌液浑浊后再转接至5 ml新鲜培养基中进行第二次活化，活化时间为12h~24 h。将活化的种子液接种至装有30 ml含有混合抑制物（含有0.68 g/l乙酸、0.23 g/l甲酸、0.58 g/l乙酰丙酸、0.48 g/l糠醛、0.63 g/l hmf和0.76 g/l香草醛）的ypdx培养基中，调整起始od
600
为0.2，在30 ℃，200 rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用紫外可见分光光度计发酵液的od
600
，利用高效液相色谱（hplc）分析发酵产物中的葡萄糖、木糖消耗情况和乙醇产生情况。图9结果显示，bspx051-3xi-mal33
△
在含有混合抑制物的ypdx培养基中生长明显好于对照菌株bspx051-3xi；hplc分析结果（图10）表明，bspx051-3xi-mal33
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在葡萄糖和木糖消耗和产乙醇能力也明显高于对照菌株，说明敲除mal33基因可以提高酿酒酵母在含有木质纤维素水解液混合抑制物中的生长，同时能加快葡萄糖和木糖共发酵产乙醇。