一种用于miRNA检测的逆转录-链置换扩增方法及应用与流程

一种用于mirna检测的逆转录-链置换扩增方法及应用
技术领域
1.本发明涉及核酸检测技术领域，更具体地说，关于一种用于mirna检测的逆转录-链置换扩增方法及应用。


背景技术：

2.microrna(mirna)是一类由内源基因编码的、长度约为22个核苷酸的非编码单链rna，已被证明参与各类生命活动的调控。近年来，研究发现血清、血浆等体液中存在种类丰富的循环mirna分子，通过定量检测受试者循环mirna分子的表达水平，可以实现癌症的早期筛查和预后监测(参见例如单保恩等人，microrna:癌症诊治新靶点，中国肿瘤生物治疗杂志，2014，第21卷第6期：603-609)。
3.rt-qpcr是定量检测mirna的常用方法之一(参见kramer m f,curr.protoc.mol.biol.2011,95(1):chapter 15:unit 15.10)；如专利cn105177132a公开了一种定量检测mirna的rt-pcr方法。然而，pcr是一种变温扩增技术，需要连续的变温和精准的温度控制才能实现目标分子的有效扩增，这对检测设备的性能提出了较高的要求。随着等温扩增技术的快速发展，这种仅在恒定温度下就能高效反应的技术方案被认为是未来分子检测技术的发展趋势。目前已有多项用于mirna快速检测的等温扩增新方法的报道出现(参见sun y,chem.commun.,2017,53(80):11040-11043)，其中多数研究是采用mirna目标分子直接检测的方案。由于mirna属于rna类分子，未经处理的mirna容易受到rnaase的作用而降解，不仅无法长期保存，且会影响样本中mirna表达水平的定量准确性。当前，逆转录(reverse transcription)前处理过程被认为是防止mirna降解、延长mirna样品保存周期最有效的技术手段。然而，目前仅有一项基于环介导等温扩增(lamp)术开发的用于mirna检测的rt-lamp研究报道(参见al-maskri a aa,analytica chimica acta,2020,1126:1-6)。由于lamp方法需要的引物或探针的数量较多，且序列较长，容易产生假阳性结果，检测特异性无法得到保证。因此，发展一种用于mirna定量检测的逆转录-等温扩增新方法具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于解决现有的lamp方法检测mirna技术需要的引物或探针的数量较多，且序列较长，导致检测效率低，及mirna加尾逆转录预处理过程无法适配于等温扩增这种新型分子扩增检测技术的问题。
5.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
6.一种用于mirna检测的逆转录-链置换扩增(rt-sda)方法，包括以下步骤：
7.s1、mirna单链进行poly(a)加尾反应，得到c1链；
8.s2、逆转录反应：c1链在逆转录引物p1作用下，进行逆转录反应，生成与c1链反向互补的c2链，并作为cdna模板，用于sda反应检测mirna目标分子；
9.s3、sda反应上游引物p2以c2链为模板，先后进行链杂交和延伸反应，生成c3链；
10.所述上游引物p2的核苷酸序列如通式(i)所示：
11.p-f(i)
12.其中，p为rt-sda反应上游引物p2的5’端序列，包括切刻内切酶的酶切位点识别序列及其保护碱基；f为rt-sda反应上游引物p2的3’端序列，其核苷酸序列与任意一种mirna目标分子5’端8-14个碱基序列相同，除尿嘧啶残基被胸腺嘧啶残基替换外；
13.s4、c3链与c2链形成互补的dna双链后，在切刻内切酶的催化下，进行酶切反应，将c3链剪开一个切口；
14.s5、c3链切口5’端的序列继续延伸，将c3链切口3’端的序列置换出去，生成c4链；同时，又形成新的c3-c2 dna双链结构，并持续重复步骤s4和s5反应，生成大量的c4链；
15.s6、sda反应下游引物p3或sda反应下游探针p4以c4链为模板，先后进行链杂交和延伸反应，生成c5链；
16.所述下游引物p3的核苷酸序列如通式(ii)所示：
17.p-r(ii)
18.其中，p为rt-sda反应下游引物p3的5’端序列，包括切刻内切酶的酶切位点识别序列及其保护碱基，r为所述rt-sda反应下游引物p3的3’端序列，其核苷酸序列与逆转录引物p1的5’端8-14个碱基序列相同；
19.所述下游探针p4的核苷酸序列如通式(iii)所示：
20.p-b1-b2-r(iii)
21.其中，p-b1-b2为rt-sda反应下游探针p4的5’端序列，包括切刻内切酶的酶切位点识别序列及其保护碱基；碱基b1和b2分别为标记的荧光基团和淬灭基团；r为rt-sda反应下游探针p4的3’端序列，其核苷酸序列与逆转录引物p1的5’端8-14个碱基序列相同；
22.s7、c5链与c4链形成互补的dna双链后，在切刻内切酶的作用下，进行酶切反应，将c5链剪开一个切口；
23.s8、c5链切口5’端的序列继续延伸，将c5链切口3’端的序列置换出去，生成c6链；同时，又形成新的c5-c4 dna双链结构，并持续重复步骤s7和s8反应，生成大量的c6链；
24.s9、c6链与c2链序列完全相同，可持续进行步骤s4-s5反应，生成大量的c4链，进而又持续进行步骤s7-s8反应，并再次生成大量的c6链；扩增反应可循环往复持续进行，使得扩增产物和荧光信号呈指数增长。
25.优选地，所述mirna包括体液循环mirna、新鲜组织或石蜡组织mirna、总rna、人工合成的mirna分子中的一种或多种。
26.优选地，所述切刻内切酶包括nb.bbvci、nb.bsmi、nb.bsrdi、nb.btsi、nt.alwi、nt.bbvci、nt.bsmai、nt.bspqi、nt.bstnbi、nb.bsssi、nt.cvipii中的任意一种。
27.本发明提供的上游引物、下游引物或下游探针之间不存在序列互补关系，可有效降低引物之间，或引物和探针之间相互杂交产生的非特异性扩增，且所用引物和探针的序列较短，在恒温条件下，不会因为形成二聚体结构而降低双链结合效率，进而不会影响扩增反应效率。
28.本发明还提供用于mirna检测的逆转录-链置换扩增染料法试剂盒，所述染料法试剂盒包括包括上述的逆转录引物p1、上游引物p2和下游引物p3。
29.进一步地，所述染料法试剂盒还包括用于mirna加尾逆转录反应的成分：poly(a)
聚合酶、逆转录酶、atp、dntps和和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl ph 8.3、nacl、kcl、mgcl2、dtt；
30.所述染料法试剂盒还包括进行链置换等温扩增反应的成分：dna聚合酶、切刻内切酶、dntps、荧光染料和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl ph 7.9、nacl、mgcl2、bsa。
31.进一步地，所述染料法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 8.3、10-100mm nacl、10-100mm kcl、1-50mm mgcl2、1-100mm dtt、1-50nm逆转录引物、0.1-2.0mm atp、0.1-10u/μl poly(a)聚合酶、1-50u/μl逆转录酶、0.1-2.0mm dntp；
32.所述染料法试剂盒在进行链置换等温扩增时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 7.9、50-200mm nacl、5-50mm mgcl2、50-200μg/ml bsa、0.05-0.5u/μl dna聚合酶、0.05-0.5u/μl切刻内切酶、0.025-0.5mm dntps、0.025-0.5μm上游引物、0.025-0.5μm下游引物、1
×
荧光染料。
33.进一步地，所述染料法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：20-80mm tris-hcl ph 8.3、20-80mm nacl、20-80mm kcl、5-30mm mgcl2、5-50mm dtt、2-20nm逆转录引物、0.2-1.0mm atp、0.2-5.0u/μl poly(a)聚合酶、2-20u/μl逆转录酶、0.2-1.0mm dntp；
34.所述染料法试剂盒在进行链置换等温扩增时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：20-80mm tris-hcl ph 7.9、80-150mm nacl、10-30mm mgcl2、80-150μg/ml bsa、0.1-0.3u/μl dna聚合酶、0.1-0.3u/μl切刻内切酶、0.05-0.4mm dntps、0.05-0.3μm上游引物、0.05-0.3μm下游引物、1
×
荧光染料。
35.进一步地，所述染料法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时的反应条件为：先37-42℃保温15-60min，随后65-95℃加热5-20min；
36.所述染料法试剂盒在进行链置换等温扩增时的反应条件为：先37-65℃保温15-60min，随后70-95℃加热5-20min。
37.本发明还提供用于mirna检测的逆转录-链置换扩增探针法试剂盒，所述探针法试剂盒包括上述的逆转录引物p1、上游引物p2和下游探针p4。
38.更进一步地，所述探针法试剂盒还包括用于mirna加尾逆转录反应的成分：poly(a)聚合酶、逆转录酶、atp、dntps和和反应缓冲液；所述探针法试剂盒还包括用于mirna加尾逆转录反应的成分：poly(a)聚合酶、逆转录酶、atp、dntps和和反应缓冲液；
39.所述探针法试剂盒还包括用于进行链置换等温扩增反应的成分：dna聚合酶、切刻内切酶、dntps和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl ph 7.9、nacl、mgcl2、bsa。
40.更进一步地，所述探针法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 8.3、10-100mm nacl、10-100mm kcl、1-50mm mgcl2、1-100mm dtt、1-50nm逆转录引物、0.1-2.0mm atp、0.1-10u/μl poly(a)聚合酶、1-50u/μl逆转录酶、0.1-2.0mm dntp；
41.所述探针法试剂盒在进行链置换等温扩增时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 7.9、50-200mm nacl、5-50mm mgcl2、50-200μg/ml bsa、0.05-0.5u/μl dna聚合酶、0.05-0.5u/μl切刻内切酶、0.025-0.5mm dntps、0.025-0.5μm上
游引物、0.025-0.5μm下游探针。
42.更进一步地，所述探针法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 8.3、10-100mm nacl、10-100mm kcl、1-50mm mgcl2、1-100mm dtt、1-50nm逆转录引物、0.1-2.0mm atp、0.1-10u/μl poly(a)聚合酶、1-50u/μl逆转录酶、0.1-2.0mm dntp；
43.所述探针法试剂盒在进行链置换等温扩增时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：20-80mm tris-hcl ph 7.9、80-150mm nacl、10-30mm mgcl2、80-150μg/ml bsa、0.1-0.3u/μl dna聚合酶、0.1-0.3u/μl切刻内切酶、0.05-0.4mm dntps、0.05-0.3μm上游引物、0.05-0.3μm下游探针。
44.更进一步地，所述探针法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时的反应条件为：先37-42℃保温15-60min，随后65-95℃加热5-20min；
45.所述探针法试剂盒在进行链置换等温扩增时的反应条件为：先37-65℃保温15-60min，随后70-95℃加热5-20min。
46.本发明具有如下的有益效果：
47.1、本发明提供的上游引物、下游引物或下游探针之间不存在序列互补关系，可有效降低引物之间，或引物和探针之间相互杂交产生的非特异性扩增，且所用引物和探针的序列较短，在恒温条件下，不会因为形成二聚体结构而降低双链结合效率，进而不会影响扩增反应效率。
48.2、本发明提供的rt-sda检测mirna的染料法或探针法反应体系，在检测任意一种mirna目标分子时，只需根据不同的mirna分子序列设计和合成不同的上游引物，无需重复设计和合成不同的下游引物或下游探针，就可实现对任意一种mirna目标分子进行定量检测，既提高了检测效率，又极大地降低了检测成本。
附图说明
49.图1为本发明实施例提供的用于mirna检测的逆转录-链置换扩增(rt-sda)方法反应原理示意图；
50.图2为利用本发明实施例提供的基于rt-sda染料法检测mirna的扩增曲线；
51.图3为利用本发明实施例提供的基于rt-sda探针法检测mirna的扩增曲线。
具体实施方式
52.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合说明书附图和本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
53.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
54.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
55.本发明提供的一种用于mirna检测的逆转录-链置换扩增方法适用于任意类型的mirna，包括人类、动物、植物等所有真核生物的天然mirna分子，例如体液循环mirna、新鲜
组织或石蜡组织mirna、总rna中的一种或多种，还可包括任何人工合成的mirna分子。以下实施例中以人工合成的mir-320分子标准品(aaaagcuggguugagagggcga，seq id no:5)为例来描述本发明的方法。
56.以下实施例中涉及的序列均可使用已有技术合成。
57.实施例1
58.rt-sda检测mirna的染料法检测方法：
59.本实施例利用人工合成的mir-320标准品为样品，根据图1所示的技术原理构建rt-sda检测mirna的染料法检测方案，具体按照以下要求配制20μl反应体系：
60.反应缓冲液2.0μl(终浓度分别为：50mm tris-hcl ph 7.9、100mm nacl、10mm mgcl2、100μg/ml bsa)，0.125μm上游引物p2(seq id no:2)，0.125μm下游引物p3(seq id no:3)，0.1u/μl dna聚合酶，0.2u/μl nt.bstnbi，0.125mm dntps，1
×
green染料，并将10pm mir-320分子标准品经加尾逆转录合成的cdna依次稀释成三个浓度的母液(10-1
、10-2
和10-3
)，并分别取1.0μl母液作为三个反应的模板，最后补水至20μl，在55℃保温40min，随后85℃加热5min终止反应，每个循环间隔1min，每个循环结束后采集一次荧光信号，共计40次，rt-sda扩增检测结果如图2所示。
61.根据图2所示的结果，可见rt-sda染料法检测mirna的三个试验组均出现标准的“s”型扩增曲线，充分表明本发明提供的rt-sda染料法能够实现mirna的有效检测；同时，合成的cdna模板经三次梯度稀释对应的扩增曲线之间的线性相关性较高，表明本发明提供的rt-sda染料法能够高效地实现mirna分子的扩增检测。
62.由于所述rt-sda检测mirna方法，在不改变上、下游引物序列的前提下，仅通过对下游引物碱基进行荧光基团和淬灭基团修饰，获得的探针即可用于探针法检测试验，进而可以使用rt-sda探针法检测方案定量检测mirna，将通过以下实例2验证。
63.实施例2
64.rt-sda检测mirna的探针法检测方法：
65.本实施例利用人工合成的mir-320标准品为样品，根据图1所示的技术原理构建rt-sda检测mirna的探针法检测方案，具体按照以下要求配制20μl反应体系：
66.反应缓冲液2.0μl(终浓度分别为：50mm tris-hcl ph 7.9、100mm nacl、10mm mgcl2、100μg/ml bsa)，0.125μm上游引物p2(seq id no:2)，0.125μm下游探针p4(seq id no:4)，0.1u/μl dna聚合酶，0.2u/μl nt.bstnbi，0.125mm dntps，并将10pm mir-320分子标准品经逆转录引物p1(seq id no:1)加尾逆转录合成的cdna依次稀释成三个浓度的母液(10-1
、10-2
和10-3
)，并分别取1.0μl母液作为三个反应的模板，最后补水至20μl，在55℃保温40min，随后85℃加热5min终止反应，每个循环间隔1min，每个循环结束后采集一次荧光信号，共计40次，rt-sda扩增检测结果如图3所示。
67.根据图3所示的结果，可见rt-sda探针法检测mirna的三个试验组均出现标准的“s”型扩增曲线，充分表明本发明提供的rt-sda探针法能够实现mirna的有效检测；同时，合成的cdna模板经三次梯度稀释对应的扩增曲线之间的线性相关性较高，表明本发明提供的rt-sda探针法能够高效地实现mirna分子的扩增检测。
68.实施例3
69.基于实施例1的结果，本发明还提供可以用于上实施例1中rt-sda检测mirna的染
料法试剂盒。
70.提供的rt-sda检测mirna的染料法试剂盒包括包括实施例1中的逆转录引物p1、上游引物p2和下游引物p3，还包括用于mirna加尾逆转录反应的成分：poly(a)聚合酶、逆转录酶、atp、dntps和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl ph 8.3、nacl、kcl、mgcl2、dtt；染料法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 8.3、10-100mm nacl、10-100mm kcl、1-50mm mgcl2、1-100mm dtt、1-50nm逆转录引物、0.1-2.0mm atp、0.1-10u/μl poly(a)聚合酶、1-50u/μl逆转录酶、0.1-2.0mm dntp；优选为20-80mm tris-hcl ph 8.3、20-80mm nacl、20-80mm kcl、5-30mm mgcl2、5-50mm dtt、2-20nm逆转录引物、0.2-1.0mm atp、0.2-5.0u/μl poly(a)聚合酶、2-20u/μl逆转录酶、0.2-1.0mm dntp；同时，还包括用于进行链置换等温扩增反应的成分：dna聚合酶、切刻内切酶、dntps、荧光染料和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl ph 7.9、nacl、mgcl2、bsa；染料法试剂盒在进行链置换等温扩增时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 7.9、50-200mm nacl、5-50mm mgcl2、50-200μg/ml bsa、0.05-0.5u/μl dna聚合酶、0.05-0.5u/μl切刻内切酶、0.025-0.5mm dntps、0.025-0.5μm上游引物、0.025-0.5μm下游引物、1
×
荧光染料；优选为20-80mm tris-hcl ph 7.9、80-150mm nacl、10-30mm mgcl2、80-150μg/ml bsa、0.1-0.3u/μl dna聚合酶、0.1-0.3u/μl切刻内切酶、0.05-0.4mm dntps、0.05-0.3μm上游引物、0.05-0.3μm下游引物、1
×
荧光染料；
71.本实施例的染料法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时的反应条件为：先37-42℃保温15-60min，随后65-95℃加热5-20min；然后在进行链置换等温扩增时的反应条件为：先37-65℃保温15-60min，随后70-95℃加热5-20min。
72.实施例4
73.基于实施例2的结果，本发明还提供可以用于上实施例2中rt-sda检测mirna的探针法试剂盒。
74.提供的rt-sda检测mirna的探针法试剂盒包括实施例2中的逆转录引物p1、上游引物p2和下游探针p4，还包括用于mirna加尾逆转录反应的成分：poly(a)聚合酶、逆转录酶、atp、dntps和和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl ph 8.3、nacl、kcl、mgcl2、dtt。探针法试剂盒在mirna加尾逆转录时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 8.3、10-100mm nacl、10-100mm kcl、1-50mmmgcl2、1-100mm dtt、1-50nm逆转录引物、0.1-2.0mm atp、0.1-10u/μl poly(a)聚合酶、1-50u/μl逆转录酶、0.1-2.0mm dntp；优选为20-80mm tris-hcl ph 8.3、20-80mm nacl、20-80mm kcl、5-30mm mgcl2、5-50mm dtt、2-20nm逆转录引物、0.2-1.0mm atp、0.2-5.0u/μl poly(a)聚合酶、2-20u/μl逆转录酶、0.2-1.0mm dntp；同时，还包括用于进行链置换等温扩增反应的成分：dna聚合酶、切刻内切酶、dntps和反应缓冲液；所述反应缓冲液包括tris-hcl ph 7.9、nacl、mgcl2、bsa；探针法试剂盒在进行链置换等温扩增时使用的各成分在反应体系中的浓度分别为：10-100mm tris-hcl ph 7.9、50-200mm nacl、5-50mm mgcl2、50-200μg/ml bsa、0.05-0.5u/μl dna聚合酶、0.05-0.5u/μl切刻内切酶、0.025-0.5mm dntps、0.025-0.5μm上游引物、0.025-0.5μm下游探针，优选为20-80mm tris-hcl ph 7.9、80-150mm nacl、10-30mm mgcl2、80-150μg/ml bsa、0.1-0.3u/μl dna聚合酶、0.1-0.3u/μl切刻内切酶、0.05-0.4mm dntps、0.05-0.3μm上游引物、0.05-0.3μm下游探针；
75.本实施例的探针法试剂盒在进行mirna加尾逆转录时的反应条件为：先37-42℃保温15-60min，随后65-95℃加热5-20min；然后在进行链置换等温扩增时的反应条件为：先37-65℃保温15-60min，随后70-95℃加热5-20min。
76.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
77.78.