一种缓解肉鸡热应激的饲料添加剂的制作方法

1.本发明属于动物营养、饲料工业领域，更具体地涉及一种缓解肉鸡热应激的饲料添加剂。


背景技术：

2.热应激严重影响畜牧业发展，给全球养殖业每年造成高达数十亿美元的损失，当前主流的畜禽品种由于其皮肤表面缺乏汗腺而不能有效散热，对环境温度的变化较敏感，温度过高引发的热应激给畜禽生产带来不利影响。热应激状态下，机体电解质平衡、糖脂代谢、抗氧化系统和肠道健康均受到负面影响，进而导致畜禽情绪低落、食欲不振，机体免疫力也随之降低。
3.如何缓解肉鸡热应激一直是困扰养殖行业的一个难题，传统上缓解热应激的途径如提高日粮能量浓度，或应用电解质、矿物质、维生素及中草药制剂等添加剂，在应用及功能等方面存在一些限制性因素。而胆汁酸作为一种新型饲料添加剂，具有绿色、安全、高效、作用持续稳定等特点，近年来引起越来越多关注，但缺乏在畜禽上的应用研究。其作为胆汁的重要成分，可通过非受体介导途径与极性磷脂分子结合乳化脂类以促进脂类和脂溶性物质吸收，作为信号分子及配体在参与调节脂代谢、缓解氧化应激、保护肠道屏障等方面具有重要作用。一些亲水性胆汁酸，如胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸可作为关键的信号分子激活特异受体和细胞信号通路，促进糖和脂肪代谢稳态、保护肠道屏障和抗应激损伤。近年来，外源胆汁酸对缓解热应激导致的负面影响，诸如胰岛素抵抗、脂肪堆积、肠道屏障受损、氧化应激等，均已在体外、小鼠等试验中验证。此外，研究发现热应激会抑制牛磺结合型胆汁酸的合成、结合和摄取，影响肠肝循环，可能对畜禽的抗应激能力造成影响。而日粮中适当添加胆汁酸，有利于维持机体代谢稳态，提高肉鸡的抗应激能力，进而改善热应激肉鸡的生长性能。
4.因此，研究一种高效缓解热应激，且安全、天然、环保的饲料添加剂，对于动物健康养殖和畜禽可持续发展具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对上述问题，克服上述饲料添加剂的缺陷和不足，本发明提供一种具有缓解肉鸡热应激功能的饲料添加剂。所述的饲料添加剂主要活性成分为猪源胆汁酸，并添加氯化钾、碳酸氢钠及膨润土。其中：猪源胆汁酸包含70.67wt％猪去氧胆酸,19.61wt％鹅去氧胆酸,以及9.72wt％猪胆酸，所述的猪源胆汁酸来源于猪胆汁提取物，该饲料添加剂以复配的预混料为载体。
6.例如，所述的猪源胆汁酸为猪胆汁提取物，本发明公开了其在制备动物饲料添加剂中的应用及相应饲料在缓解肉鸡热应激的应用。该物质配合电解质作为复合添加剂具有缓解热应激诱导的电解质平衡紊乱、肝脏脂质堆积、氧化应激等作用，进而改善热应激状态下肉鸡生长性能中的应用。
7.本发明是通过下述技术方案实现的：
8.本发明提供一种缓解肉鸡热应激的饲料添加剂。所述的饲料添加剂成分为猪源胆汁酸、氯化钾、碳酸氢钠以及膨润土。其中：猪源胆汁酸包含70.67wt％猪去氧胆酸，19.61wt％鹅去氧胆酸，以及9.72wt％猪胆酸，所述的猪源胆汁酸来源于猪胆汁提取物。所述的饲料添加剂活性主要活性成分为100g猪源胆汁酸，同时添加300g氯化钾、500g碳酸氢钠及1100g膨润土初步稀释，并以复配的预混料为载体。
9.优选地，所述复配的预混料包含矿物元素和微量元素。所述的矿物元素包括锰、铜、铁、锌、硒和碘中的一种或多种。所述的微量元素包括维生素a、维生素c、维生素d3、维生素e、维生素k3、维生素b1、泛酸钙、烟酰胺、叶酸、生物素和维生素b
12
中的一种或多种。
10.本发明提供一种缓解生长中后期肉鸡热应激的饲料，其包括基础饲料和如上所述的饲料添加剂；以所述缓解生长中后期肉鸡热应激的饲料总质量计，所述的饲料添加剂的含量为0.15wt％～0.25wt％。
11.进一步地，所述缓解生长中后期肉鸡热应激的饲料由99.8wt％的基础饲料和0.2wt％的饲料添加剂组成。
12.优选地，所述的基础饲料包含常规饲料和预混料。以基础饲料总质量计，所述的基础饲料营养水平应满足：粗蛋白质16wt％～19wt％、赖氨酸0.9wt％～1.2wt％、蛋氨酸0.35wt％～0.5wt％、苏氨酸0.62wt％～0.8wt％、粗纤维≤7wt％、粗灰分≤8wt％、钙0.7wt％～1.0wt％、总磷0.4wt％～0.7wt％、氯化钠0.3wt％～0.8wt％。
13.优选地，所述基础饲料中的预混料包含矿物元素和微量元素；所述的矿物元素包括锰、铜、铁、锌、硒和碘中的一种或多种。所述的微量元素包括维生素a、维生素c、维生素d3、维生素e、维生素k3、维生素b1、泛酸钙、烟酰胺、叶酸、生物素和维生素b
12
中的一种或多种。
14.本发明还提供一种如上任一项所述的饲料添加剂在饲料中的应用，所述饲料添加剂在所述饲料中的浓度为0.2wt％。
15.优选地，所述饲料添加剂成分为猪源胆汁酸、氯化钾、碳酸氢钠及膨润土。其中：猪源胆汁酸包含70.67％猪去氧胆酸，19.61％鹅去氧胆酸,以及9.72％猪胆酸，从猪胆汁中提取。所述的饲料添加剂主要活性成分为100g猪源胆汁酸，同时添加300g氯化钾、500g碳酸氢钠和1100g膨润土初步稀释，并以复配的预混料为载体。
16.优选地，所述饲料应用于缓解生长中后期肉鸡热应激的饲料。
17.优选地，按照基础饲料质量计，所述的基础饲料营养水平应满足：粗蛋白质16wt％～19wt％、赖氨酸0.9wt％～1.2wt％、蛋氨酸0.35wt％～0.5wt％、苏氨酸0.62wt％～0.8wt％、粗纤维≤7wt％、粗灰分≤8wt％、钙0.7wt％～1.0wt％、总磷0.4wt％～0.7wt％、氯化钠0.3wt％～0.8wt％。将初步稀释后的胆汁酸添加到所述基础饲料中，所述的饲料添加剂在所述饲料中的浓度为0.15wt％～0.25wt％；优选地，所述的饲料添加剂在所述饲料中的浓度为0.2wt％。
18.进一步地，所述饲料作为养殖动物饲料。所述饲料添加剂成分为猪源胆汁酸、氯化钾、碳酸氢钠以及膨润土。其中：猪源胆汁酸包含70.67％猪去氧胆酸,19.61％鹅去氧胆酸,以及9.72％猪胆酸，所述胆汁酸来源于猪胆汁提取物；所述的饲料添加剂主要活性成分为100g猪源胆汁酸，同时添加300g氯化钾、500g碳酸氢钠及1100g膨润土初步稀释，并以复配
的预混料为载体；所述饲料具有缓解热应激诱导的电解质平衡紊乱、肝脏脂质堆积、氧化应激，进而改善热应激状态下肉鸡生长性能的作用，所述饲料中含有上述复合添加物。上述复合添加物以饲料添加剂的方式添加于饲料中。
19.本发明还提供了上述饲料添加剂及制备的饲料在动物中的应用。所述应用在动物任何阶段中均可使用，具体表现为可在如下1、2中的任意一种：
20.1)在缓解机体电解质平衡紊乱、肝脏脂质堆积、氧化应激，缓解热应激诱导的负面效应的应用；
21.2)在提高动物脂肪吸收效率，改善肉鸡生长性能的应用。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明证明上述复合型添加剂在饲料中应用效果突出，且安全无毒副作用。
24.本发明提供的饲料添加剂在缓解肉鸡热应激中的应用，在缓解机体电解质平衡紊乱、肝脏脂质过度堆积，提高动物机体抗氧化水平(如提高抗氧化酶gsh-px的活性)，维持动物肠道屏障，增加肠道有益菌(如乳酸杆菌)丰度，抑制有害菌增殖等方面效果良好。
25.作为饲料添加剂在动物上使用具有促生长、抗应激的效果。
26.本发明提供饲料添加剂中复合胆汁酸为猪源胆汁酸，具有来源绿色天然、价格便宜、高效稳定、无污染等优点。
附图说明
27.图1肉鸡血清(a)、肝脏(b)、回肠(c)以及盲肠(d)胆汁酸组分；
28.图2日粮中添加胆汁酸对热应激肉鸡肝脏胆固醇含量及脂质沉积的影响；
29.注：(a)-(b)为10％肝脏匀浆中总胆固醇和总甘油三酯含量；(c)-(f)为肝脏油红染色。显示了外源胆汁酸有效抑制热应激诱导的肝脏脂肪过度堆积，*表示p《0.05。tn：常温；hs：热应激；basal：基础日粮；ba：胆汁酸日粮；
30.图3日粮中添加胆汁酸对热应激肉鸡回肠形态、紧密连接蛋白和回肠胆汁酸相关受体的影响；
31.注：(a)回肠he染色(b)回肠紧密连接蛋白zo-1、occludin的表达(c)回肠胆汁酸转运相关fxr、abst的表达。显示了外源性胆汁酸保护动物肠道屏障，将肉鸡回肠组织切片进行h&e染色，通过显微镜观察热应激以及日粮添加胆汁酸对肉鸡回肠组织绒毛形态及完整性的影响，以及回肠组织相关基因表达量的变化，*表示p《0.05。tn：常温；hs：热应激；basal：基础日粮；ba：胆汁酸日粮。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
33.实施例1动物饲料的制备
34.(1)制备饲料添加剂和复配的预混料
35.称取100g猪源胆汁酸(胆汁酸成分：70.67wt％猪去氧胆酸，19.61wt％鹅去氧胆酸，以及9.72wt％猪胆酸)，与300g氯化钾、500g碳酸氢钠及1100g膨润土初步混合，并添加
到10kg预混料中形成复配的预混料，搅拌混合2分钟。其中所述的预混料由矿物质(硫酸铜：4g、硫酸亚铁：40g、硫酸锰：50g、泛酸钙：58.8g、硫酸锌：37.6g、亚硒酸钠：0.2g、碘化钾：0.2g)和微量元素(维生素a：5000*103iu、维生素c：250g、维生素d：3000*103iu、维生素e：375g、维生素k3：18.8g、维生素b1：0.1g、维生素b2：28.8g、维生素b6：19.6g、维生素b12：0.1g、烟酸：196g、叶酸：4.9g、生物素：2.5g)、玉米粉8.91kg组成。
36.(2)制备基础饲料中的常规饲料
37.分别称取玉米638.6kg和豆粕220kg置于粉碎机中粉碎混合，而后将粉碎混合均匀的混合物通过螺旋上料机传送至混合机，然后在混合机中添加预先称取好的玉米蛋白粉：50kg、大豆油40kg、磷酸氢钙18kg、氯化钠3kg、石粉13kg、氯化胆碱1kg、赖氨酸盐酸盐1.8kg、蛋氨酸1.6kg、苏氨酸1kg原料，混合10分钟，制得常规饲料。
38.(3)制备添加饲料添加剂的饲料
39.将步骤(2)制得的基础饲料置于混合机中，然后在混合机中添加步骤(1)所得的含有猪源胆汁酸、氯化钾、碳酸氢钠及膨润土的复配预混料，再混合10分钟；最后用螺旋上料机传至制粒机进行制粒，制粒温度为60℃，制得颗粒的粒径为2mm，制得含有上述饲料添加剂的饲料，营养水平见表1。
40.以下实施例中肉鸡所用饲料为本实施例1制备得到的含有上述胆汁酸添加剂的饲料。
41.表1基础饲料的营养水平
42.指标含量代谢能，mcal/kg3.05粗蛋白，％18.5钙，％0.8有效磷，％0.38赖氨酸，％1.05蛋氨酸，％0.42
43.实施例2日粮添加胆汁酸对热应激肉鸡胆汁酸谱的影响
44.1、试验方法
45.采用lc-ms/ms方法检测肉鸡(实施例3屠宰的肉鸡)血清、肝脏以及回盲肠内容物中胆汁酸组成及含量。
46.本试验测定16种胆汁酸含量，包括初级胆汁酸：胆酸(ca)、猪胆酸(hca)、鹅去氧胆酸(cdca)；次级胆汁酸：去氧胆酸(dca)、猪去氧胆酸(hdca)、熊去氧胆酸(udca)、石胆酸(lca)；牛磺型胆汁酸：牛磺型胆酸(tca)、牛磺型鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺型去氧胆酸(tdca)、牛磺型熊去氧胆酸(tudca)、牛磺型猪去氧胆酸(thdca)、牛磺型石胆酸(tlca)；甘氨型胆汁酸：甘氨型胆酸(gca)、甘氨型鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨型猪胆酸(ghca)。其中hca、hdca标准品购自steraloids公司，ca、cdca、dca、udca、lca、tca、tcdca、tdca、tudca、thdca、tlca、gca、gcdca、ghca标准品均购自sigma公司，且此部分均使用色谱级试剂，购自thermo fisher公司。
47.提取血清胆汁酸前处理，将200μl血清与等体积的预冷乙酸钠缓冲液(50mm，ph5.6)，按血清体积1:3加入色谱级混合。将混合物涡旋2min，4℃静置30min后20,000g离心
20min，取上清液后，加入4倍体积的乙酸钠缓冲液，待过柱；
48.提取肝脏和肠道食糜胆汁酸前处理，取80mg冻干样品(精确至十万分之一)，分别加入500μl预冷乙酸钠缓冲液(50mm，ph 5.6)、色谱级甲醇1.4ml，摇床上孵育1h(40～45℃，180rpm)，4℃20,000g离心15min后取统一体积上清，加入醋酸钠至4倍体积，待过柱；
49.5ml甲醇活化bond elute c18固相层析柱(500mg/6ml；ca，harbour city)上，5ml乙酸钠溶液(50mm，ph 5.6)清洗柱子后统一将样品过柱，5ml 25v/v％乙醇(用上述50mm醋酸钠配置)清洗后抽干柱子，并用5ml甲醇洗脱，收集洗脱液；
50.采用高纯氮气吹干，将残留物重新溶解于1ml色谱级甲醇，过孔径为0.45μm的滤膜(-lg；billerica，ma)以去除固体沉淀，每个样品设置为两个平行，进行上机。
51.2、试验结果
52.图1(a)所示，牛磺结合型胆汁酸如tcdca(86.74wt％)、tca(2.84wt％)及tlca(1.13wt％)是血清中主要胆汁酸，占血清胆酸总量的93.11wt％，而甘氨结合型的胆汁酸(gcba)仅占血清胆酸总量的1wt％。如表2所示，热应激虽对血清pba、sba、tcba和gcba水平没有显著影响(p》0.05)。然而，日粮中添加胆汁酸极显著提高血清中sba水平(p《0.001)，有提高血清中tcba水平的趋势(p＝0.051)。进一步对血清中差异的胆汁酸含量进行分析，结果表明热应激显著降低血清hdca含量(p＝0.008)，有降低血清tca(p＝0.061)和tlca(p＝0.052)含量的趋势。此外，日粮添加胆汁酸可以极显著提高血清tudca含量(p《0.001)，有提高血清tca含量的趋势(p＝0.062)。
53.肉鸡肝脏胆汁酸成分如图1(b)所示，肝脏是胆汁酸合成及肠肝循环的关键部位，tcba(tcdca，59.16wt％；tca，18.23wt％)是肝脏胆汁酸的主要成分，占77％以上。肝脏胆汁酸成分变化如表3所示，热应激显著降低肉鸡肝脏中sba含量(p＝0.0498)，而日粮中添加胆汁酸可极显著提高肝脏中sba含量(p《0.001)。对于单一胆汁酸的变化，热应激显著降低肝脏中tca(p＝0.007)、lca(p＝0.044)和hdca(p＝0.043)的水平，而日粮添加胆汁酸显著降低肝脏中tca含量(p＝0.002)，极显著提高肝脏中tudca和thdca的含量(p《0.001)。
54.与血清和肝中的结果类似，tccda(66.02wt％)，tca(17.08wt％)和cdca(14.34wt％)仍是回肠中主要的胆汁酸。日粮中添加胆汁酸对热应激肉鸡回肠胆汁酸谱的影响如表4所示，热应激显著降低pba(p＝0.039)和tcba(p《0.001)的含量，而日粮中添加胆汁酸极显著提高sba含量(p《0.001)。进一步回肠中差异的胆汁酸含量进行分析，结果表明热应激显著降低回肠中tcdca含量(p＝0.038)，而日粮中添加胆汁酸显著提高回肠中tdca(p＝0.022)、tlca(p＝0.035)、tudca(p＝0.018)、hdca(p＝0.003)和thdca(p《0.001)的含量。图1(c,d)显示肉鸡回肠与盲肠胆汁酸总量以及成分的对比，由于机体在回肠末端对胆汁酸的重吸收作用，盲肠总胆汁酸含量仅占回肠的0.83％，且sba占盲肠胆汁酸总量的70.75％。热应激虽未对盲肠胆汁酸组分造成影响，而日粮中添加胆汁酸可显著提高盲肠sba水平(表5所示)。
55.表2试验结果(血清)
[0056][0057]
表3试验结果(肝脏)
[0058][0059]
表4试验结果(回肠)
[0060][0061]
表5试验结果(盲肠)
[0062][0063]
实施例3饲料中添加上述胆汁酸添加剂对热应激肉鸡生长性能和抗氧化能力的影响
[0064]
1、试验方法
[0065]
试验选用健康、生长发育正常、体重相近的21日龄(arbor acres)280只，随机分成4个组：常温组(tn-basal)、常温胆汁酸组(tn-ba)、热应激组(hs-basal)和热应激胆汁酸组(hs-ba)。常温组及热应激组饲喂不含胆汁酸添加剂的饲料，其他组成比例均一致，热应激期间自由采食及饮水。热应激胆汁酸饲喂由实施例1制得的含有上述饲料添加剂的饲料。本试验于2020年7月5日至2020年9月16日在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平基地进行，试验期21天，肉鸡在16-21日龄其为适应期5天。
[0066]
饲养管理：实验期内按照白羽肉鸡常规饲养管理程序操作，自由采食和饮水，并按照规范化免疫程序对育雏期间肉仔鸡进行免疫。
[0067]
指标测定：试验开始和结束时，分别于当日饲喂前空腹称重作为试验初始重和末重，以重复组为单位详细记录耗料量并计算平均日增重、日均采食量和料重比，并通过aia法测定其脂肪消化率(表6)。日增重＝(末重-初始重)/试验天数；料重比＝平均日采食量/平均日增重。
[0068]
1、试验方法
[0069]
测定饲粮与粪样品粗脂肪和aia含量。使用sox-406脂肪测定仪(hanon)测定粗脂
肪含量；aia含量根据gb/t23743—2009的方法测定，粗脂肪表观消化率计算公式为：
[0070]
粗脂肪消化率(％)＝[1-a/b
×
(c
×
d)]
×
100。
[0071]
式中：a为粪样中含量；b为饲粮中含量；c为饲粮中酸不溶灰含量；d为粪样中酸不溶灰分含量
[0072]
采用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)测定血浆和肝脏组织中丙二醛(mda)含量，以及超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活性。通过硫代巴比妥酸法测定mda水平，酶促谷胱甘肽消耗法测定sod的活性，和使用黄嘌呤氧化酶法测量gsh-px活性。用生理盐水制备10w/v％(w/v＝1：9)的肝组织匀浆，并在4℃2000rpm离心10分钟，收集上清液以测定肝脏中的mda水平，以及sod、gsh-px活性。
[0073]
表6试验结果
[0074][0075]
表7试验结果
[0076][0077]
2、试验结果
[0078]
育雏期后，高温环境严重影响肉鸡的生长性能，而日粮中添加胆汁酸以及电解质
对肉鸡生长性能表现出积极作用，特别是在热应激状态下。如表6所示，热应激极显著降低肉鸡的平均日增重和平均日采食量，分别降低35.88％和26.15％，同时极显著提高料重比。日粮中添加上述胆汁酸添加剂显著提高肉鸡平均日增重(提高9.89％)，提高热应激肉鸡脂肪消化率1.4％以及降低料重比4.19％，虽未达到统计显著水平。
[0079]
如表7所示，热应激虽然对42日龄肉鸡血清中抗氧化酶(超氧化物歧化酶，sod；谷胱甘肽过氧化物酶，gsh-px)以及脂质过氧化终产物丙二醛(mda)含量未造成显著影响。但热应激有提高肝脏中脂质过氧化物终产物mda含量的趋势(p＝0.070)，而在热应激状态下，肉鸡肝脏mda含量在日粮添加胆汁酸组有所下降，但没有达到统计显著水平(p》0.05)。温度和日粮对肝脏中gsh-px活性存在显著交互作用(p＝0.045)，热应激组的肝脏gsh-px活性显著低于其他三组，而日粮中添加胆汁酸可以将热应激状态下肉鸡肝脏的gsh-px活性恢复到正常水平(p《0.05)。这表明热应激降低肝脏抗氧化能力，而热应激条件下添加胆汁酸可以恢复肝脏的抗氧化能力。
[0080]
实施例4日粮添加胆汁酸对热应激肉鸡肝脏脂肪沉积的影响
[0081]
1、试验方法
[0082]
实验所用动物(实施例3屠宰的肉鸡)。于试验结束后，采集肝脏样品，采用自动生化分析仪检测动物肝脏中脂质水平(tc、tg)、肝脏脂合成基因表达以及oil red o染色观察肝脏脂滴附着情况。实验步骤包括：
[0083]
1)用生理盐水制备肝脏组织10w/v％匀浆(w/v＝1：9)以测定tg和tc水平，采用自动tba-120fr生化分析仪(东芝，日本东京)测定肝脏匀浆中总甘油三酸酯(tg)、总胆固醇(tc)含量。
[0084]
2)采用总rna提取试剂盒(gene better，r013-50，中国北京)从肝脏组织中提取总rna，通过primescript
tm rt试剂盒和gdna eraser(takara rr047a，中国大连)进行反转录，并使用sybr green master mix(takara rr420a，中国大连)进行qpcr扩增，通过ct法(2-δδct
)计算mrna相对表达水平，以β-actin作为内参基因。脂合成相关基因的引物列表如下。
[0085][0086]
3)肝脏组织样品制备冷冻切片(8μm)，并固定在50v/v％乙醇中。随后，将切片用油红o溶液(北京索莱宝生物科技有限公司，中国北京)染色8分钟，并用50v/v％乙醇分化，用自来水冲洗，苏木精复染。最后在自来水中冲洗后，将切片用甘油明胶包被的载玻片固定。使用连接数字型ccd相机dm300(leica,wetzlar,germany)的光学显微镜对切片进行拍照。
[0087]
2、试验结果
[0088]
日粮中添加胆汁酸对热应激肉鸡肝脏脂质沉积的影响如图1所示。在常温(tn)状态下，能量摄入不足通常会促进机体脂肪动员，以维持正常代谢所需的能量。然而，研究发现，热应激(hs)反而诱导生长猪和奶牛出现脂肪堆积现象。与上述结果一致，本研究发现热应激有增加肉鸡肝脏脂肪沉积的趋势。热应激显著降低肝脏内胆固醇的含量(p＝0.035)，添加胆汁酸也有降低肝脏中胆固醇含量的趋势(p＝0.087)。然而，肝脏油红染色切片结果显示，日粮中添加胆汁酸可有效减少热应激状态下肉鸡肝脏脂质的沉积。肝脏中总甘油三脂定量的结果显示热应激只是数值上增加肝脏中甘油三脂含量(10w/v％肝脏匀浆为样本测得)，统计并未达到显著水平(p＝0.130)；而日粮中添加胆汁酸显著降低肉鸡肝脏中甘油三脂含量(p＝0.007)。
[0089]
如表8所示，温度和外源胆汁酸对肝脏中脂质代谢和胆汁酸合成相关基因的表达水平没有显著的交互作用(p》0.05)。对于肝脏脂质合成方面，热应激对肝脏fas表达水平没有影响(p》0.05)，但提高了肝脏脂质转运基因apob的表达(p＝0.019)，对脂质合成调控因
子srebp-1c的表达也有上调的趋势(p＝0.080)。日粮中添加胆汁酸可以显著降低肉鸡肝脏脂质合成基因fas(p＝0.007)和srebp-1c(p＝0.002)的表达量，也有降低hmgcr(p＝0.084)基因表达的趋势。此外，热应激显著提高肝脏中胆汁酸受体fxr的表达(p＝0.010)，显著降低能量代谢基因me的表达(p＝0.009)。尽管日粮中添加胆汁酸对fxr和me的表达没有显著影响(p》0.05)。
[0090]
综上数据说明，日粮中添加胆汁酸可有效缓解热应激状态下肝脏脂质的过度沉积，其作用靶点是fas-srebp-1c。
[0091]
表8试验结果
[0092][0093]
实施例5日粮添加胆汁酸对热应激肉鸡回肠肠道屏障的影响
[0094]
1、试验方法
[0095]
实验所用动物(实施例2屠宰的肉鸡)。取动物的回肠组织置于4％的多聚甲醛(以
质量百分比计，将40g多聚甲醛粉末加入60～70℃450ml去离子水中，再加入1mmol/l naoh溶液并不断搅拌(滴加)，调ph至7.0使其呈清亮状，再加入500ml2
×
pbs(磷酸缓冲盐溶液)，充分混匀，最后检测ph值，过滤后定容至1000ml即为4％多聚甲醛溶液)，在配好的4％多聚甲醛中固定过夜，采用石蜡包埋后切片并进行h&e染色，采用显微镜观察结肠组织病理结构并拍照。
[0096]
采用总rna提取试剂盒(gene better，r013-50，中国北京)从肝脏组织中提取总rna，通过primescript
tm rt试剂盒和gdna eraser(takara rr047a，中国大连)进行反转录，并使用sybr green master mix(takara rr420a，中国大连)进行qpcr扩增，通过ct法(2-δδct
)计算mrna相对表达水平，以β-actin作为内参基因。相关基因及引物列表如下。
[0097][0098]
2、试验结果
[0099]
如图2所示，通过肠道形态和qrt-pcr结果表明，外源胆汁酸对于保护肠道健康、促进胆汁酸的信号传导及转运具有促进作用。如图2(a)，热应激状态下，肉鸡回肠绒毛呈现轻微脱落现象，但热应激对肉鸡回肠组织的紧密连接蛋白(zo-1、occludin)以及胆汁酸特异性受体和转运体(fxr、asbt)的表达没有显著影响。而日粮添加胆汁酸有提高紧密连接蛋白occludin的趋势(p＝0.058)，同时显著提高回肠胆汁酸信号受体及转运体fxr和abst表达(p《0.05)。
[0100]
需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
[0101]
以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。