一种消毒用品中苯扎氯铵的检测方法与流程

1.本技术涉及消毒用品检测领域，更具体地说，它涉及一种消毒用品中苯扎氯铵的检测方法。


背景技术：

2.苯扎氯铵是一种通过改变细菌细胞通透性从而起到杀死细菌作用的季铵基类阳离子表面活性剂，是各种偶数烷基链烷基芐氯化物的非匀相混合物；具有广谱、高效的杀菌灭藻能力，主要用于手术前皮肤消毒，黏膜和伤口消毒。
3.《化妆品安全技术要求》4.4项下的苯扎氯铵的检测方法，适用于淋洗类发用产品或液态水基类、膏霜乳液类化妆品中苯扎氯铵的测定，本方法所指苯扎氯铵为十二烷基二甲基苄基氯化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵和十六烷基二甲基苄基氯化铵之和；a、标准溶液：用乙醇为溶剂，十二烷基二甲基苄基氯化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基二甲基苄基氯化铵分别为溶质，配制 1.0mg/ml的苯扎氯铵标准溶液；b、样品溶液：称取样品0.5g于25ml具塞刻度管中，加入20ml乙腈(3.2)，涡旋振荡1min，超声提取30min，取出，冷却至室温后用乙腈(3.2)定容至25ml，混匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液；c、色谱柱条件：色谱柱：cn柱(250mm
×
4.6mm
×
5mm)，或等效色谱柱，流动相：乙腈 0.1mol/l醋酸铵缓冲溶液(冰醋酸调ph至5.0)(70 30)，流速：1.0ml/min，检测波长：260nm，柱温：25℃，进样量：20ml。
4.针对上述中的相关技术，发明人认为存在有上述方法直接挪用在消毒用品中苯扎氯铵含量的检测中不适用，存在有导致检测结果不准确的缺陷。


技术实现要素：

5.为了解决将上述方法直接挪用在消毒用品中苯扎氯铵含量的检测，检测结果不准确的问题，本技术提供一种消毒用品中苯扎氯铵的检测方法。
6.本技术提供的一种消毒用品中苯扎氯铵的检测方法，包括如下步骤：s1：苯扎氯铵消毒用品前处理：a、将苯扎氯铵消毒用品用溶剂溶解，得到苯扎氯铵溶解液；b、将苯扎氯铵溶解液在10000rpm/min，0-4℃的条件下离心 20-30min，得到苯扎氯铵标准液；s2：高效液相检测：取样检测，其中，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈-醋酸盐溶液，其中戊烷磺酸钠、乙腈、醋酸盐溶液的体积比为(5～15)：(50～70)：(20～35)，用醋酸调节流动相的ph为4.5～6。
7.通过采用上述技术方案，本方法中的流动相采用的是戊烷磺酸钠、乙腈、醋酸盐溶液，即本方法提供了一种与《化妆品安全技术要求》中完全不同的流动相，且调整了戊烷磺酸钠、乙腈、醋酸盐溶液的配比；相比于《化妆品安全技术要求》中苯扎氯铵含量的检测方法，此方法以特定色谱柱与特定比例的流动相配合使用，来检测消毒用品中的苯扎氯铵的含量时，检测方法的相对标准偏差小，且检出限低、三种同系物分离度好。
8.高速离心时，利用高速旋转转头产生的强大离心力，使离心管内的悬浮液或乳浊液中沉降系数不同的物质发生沉降，从而使之分离、浓缩和提纯，高速离心不仅可以离心出大颗粒沉淀物，还可以离心出纳米级的不溶物，使其沉淀；冷冻的目的在于聚集离心沉淀物，使得离心沉淀物不易分散，以便于操作人员吸取上层清液，弃除离心沉淀物。
9.可选的，步骤s2中戊烷磺酸钠、乙腈、醋酸盐溶液的体积比为(10～15)： (60～70)：(15～20)。
10.通过采用上述技术方案，由于戊烷磺酸钠为离子对试剂，苯扎氯铵溶液在流动相中与戊烷磺酸钠的反离子生成不带电荷的中性离子对，从而增加苯扎氯铵与固定相的作用，改善分离效果；醋酸盐溶液为离子抑制剂，可有效调节流动相的ph，抑制苯扎氯铵溶液的解离，从而增加苯扎氯铵与固定相的作用；进一步调整戊烷磺酸钠、乙腈、醋酸盐溶液的比例，使得被流动相带动进入色谱柱的苯扎氯铵消毒用品中的三种组分很好的被分离，检测出的峰面积与苯扎氯铵标准峰面积较接近，且多次实验的标准偏差较小，因此最终检测消毒用品中苯扎氯铵含量的检出限更低。
11.可选的，s1中，所述溶剂为水。
12.通过采用上述技术方案，虽然苯扎氯铵在水与乙醇中均易溶，但是由于乙醇易挥发，水难以挥发，因此以水作为溶剂溶解苯扎氯铵后的苯扎氯铵溶液浓度接近标准浓度，因此，以水为溶剂溶解的苯扎氯铵进行检测时的检出限更低；且水作为溶剂后续处理液较方便。
13.可选的，所述s1还包括将苯扎氯铵溶解液超声处理10-30min得到苯扎氯铵预处理液的步骤。
14.通过采用上述技术方案，超声处理苯扎氯铵溶解液的目的在于将苯扎氯铵更好的溶解在水中，进而使得苯扎氯铵在极性流动相与非极性色谱柱中的分离效果更好，则检测的峰形更接近标准峰形，最终测得苯扎氯铵的检出限较低。
15.可选的，所述s1还包括将苯扎氯铵预处理液冷却至室温，用s1中的溶剂重新定容至超声前体积，得到苯扎氯铵后处理液的步骤。
16.通过采用上述技术方案，由于超声操作会导致待超声的苯扎氯铵预处理液的温度上升，从而导致苯扎氯铵预处理液的体积在高温下蒸发而变小，且测量的体积并不是常温下的标准体积，进而影响后期的检测准确性；因此需要将苯扎氯铵预处理液冷却至室温，然后定容至超声前体积，补充超声过程中损失的溶剂，最终使得用溶剂溶解苯扎氯铵的浓度更接近苯扎氯铵预处理液的初始浓度，进而使得通过检测结果得到的检出限也更加准确。且在进行仪器精密度实验时，每次检测的苯扎氯铵浓度不会出现较大偏差，标准偏差较小。
17.可选的，所述s1还包括将苯扎氯铵预处理液、苯扎氯铵后处理液或苯扎氯铵标准液用小于或等于0.45μm的滤膜进行过滤，得到苯扎氯铵进样液的步骤。
18.通过采用上述技术方案，用滤膜对苯扎氯铵溶解液、苯扎氯铵预处理液、苯扎氯铵后处理液或苯扎氯铵标准液进行过滤，进一步过滤掉离心后分散在苯扎氯铵标准液中的离心沉淀物，使得最终检测的苯扎氯铵溶液中杂质含量较少，高效液相色谱峰的峰面积仅包含苯扎氯铵的峰面积，不会有其他杂质影响苯扎氯铵的峰面积，线性关系更标准。
19.可选的，步骤s2中流动相的ph为5～6。
20.通过采用上述技术方案，由于苯扎氯铵中含有极性基团，对于含有极性官能团的
化合物来说，ph会影响化合物的存在状态，进而影响分离选择性及色谱峰的对称性；通过进一步调整流动相的ph，使得苯扎氯铵在合适ph值的流动相中可以更好的分离，有利于降低苯扎氯铵的检出限。
21.可选的，所述醋酸盐溶液为醋酸钠溶液或醋酸铵溶液中的一种。
22.通过采用上述技术方案，醋酸钠溶液或醋酸铵溶液均为两种常用的ph缓冲液，将醋酸钠溶液或醋酸铵溶液分别与乙腈、戊烷磺酸钠以一定的体积比组成流动相，进行消毒用品中的苯扎氯铵的检测，对苯扎氯铵的检测结果均较好。
23.可选的，所述醋酸盐溶液的浓度为0.1mol/l。
24.通过采用上述技术方案，由于合适浓度的醋酸盐溶液，具有合适的缓冲容量，则在进行流动相的ph调节时，可以在ph为5-6的变化范围内进行进一步精细的调节。
25.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、与《化妆品安全技术要求》中苯扎氯铵含量的检测方法相比，本技术的方法采用了价格低、普适性好的c18色谱柱，且使用了由戊烷磺酸钠、乙腈、醋酸盐溶液组成的流动相，通过色谱柱和流动相的配合，使得本技术苯扎氯铵的相对标准偏差小，且检出限低、三种同系物分离度好；2、本方法利用高速冷冻离心，使离心管内的悬浮液或乳浊液中沉降系数不同的物质发生沉降，从而使之分离、浓缩和提纯，高速离心不仅可以离心出大颗粒沉淀物，还可以离心出纳米级的不溶物，使其沉淀；冷冻的目的在于聚集离心沉淀物，使得离心沉淀物不易分散，以便于操作人员吸取上层清液。
附图说明
26.图1是检出限检测中苯扎氯铵浓度为0μg/ml的高效液相色谱图；图2是检出限检测中苯扎氯铵浓度为50μg/ml的高效液相色谱图；图3是检出限检测中苯扎氯铵检测中十二烷基二甲基苄基氯化铵的线性关系曲线。
具体实施方式
27.以下结合实施例及对比例对本技术作进一步详细说明。
28.原料来源：盐酸奥洛他定滴眼液(0.01％苯扎氯铵)，品牌：帕坦洛；苯扎氯铵消毒液(0.1％苯扎氯铵)，品牌：优可适；苯扎氯铵标准样品，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
29.实施例1消毒用品中苯扎氯铵含量的检测方法，其检测步骤为：s1：苯扎氯铵消毒液前处理：a、将0.5g苯扎氯铵消毒液置于50ml容量瓶中，用25ml去离子水溶解，得到苯扎氯铵溶解液；b、将苯扎氯铵溶解液在10000rpm/min，-4℃的条件下离心25min，得到苯扎氯铵标准液；将苯扎氯铵标准液用0.45μm的滤膜进行过滤，得到苯扎氯铵进样液；s2：高效液相检测：取苯扎氯铵进样液10μl，进样检测，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈-0.1mol/l醋酸铵溶液，其中戊烷磺酸钠溶液10ml，乙腈
70ml，醋酸铵溶液20ml(体积比为10：70：20)，醋酸调节流动相ph为5，检测波长为262nm，记录色谱图。
30.实施例2消毒用品中苯扎氯铵含量的检测方法，其检测步骤为：与实施例1的不同之处在于，s2中进行高效液相检测时，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱色谱柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈-0.1mol/l醋酸铵溶液，其中戊烷磺酸钠溶液15ml，乙腈70ml，醋酸铵溶液15ml(体积比为15：70：15)，醋酸调节流动相ph为5，检测波长为262nm。
31.实施例3消毒用品中苯扎氯铵含量的检测方法，其检测步骤为：与实施例1的不同之处在于，s2中进行高效液相检测时，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱色谱柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈-0.1mol/l醋酸铵溶液，其中戊烷磺酸钠溶液5ml，乙腈60ml，醋酸铵溶液35ml(体积比为5：60：35)，醋酸调节流动相ph为5，检测波长为262nm。
32.实施例4消毒用品中苯扎氯铵含量的检测方法，其检测步骤为：s1：苯扎氯铵消毒液前处理：a1、将0.5g苯扎氯铵消毒液置于50ml容量瓶中，用25ml去离子水溶解，得到苯扎氯铵溶解液；a2、将苯扎氯铵溶解液在室温下超声20min，得到苯扎氯铵预处理液；a3、将苯扎氯铵预处理液冷却至室温，用去离子水重新定容至25ml，得到苯扎氯铵后处理液；将苯扎氯铵后处理液用0.45μm的滤膜进行过滤，得到苯扎氯铵进样液；s2：高效液相检测：高效液相检测：取苯扎氯铵进样液10μl，进样检测，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱色谱柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈-0.1mol/l醋酸铵溶液，其中戊烷磺酸钠溶液10ml，乙腈70ml，醋酸铵溶液20ml(体积比为10：70：20)，醋酸调节流动相ph为5，检测波长为262nm，记录色谱图。
33.实施例5消毒用品中苯扎氯铵含量的检测方法，其检测步骤为：与实施例4的不同之处在于：s1中还包括b步骤，b步骤为将苯扎氯铵后处理液在10000rpm/min，-4℃的条件下离心25min，得到苯扎氯铵标准液；再进行将苯扎氯铵标准液用0.45μm的滤膜进行过滤，得到苯扎氯铵进样液的步骤。
34.实施例6与实施例4的不同之处在于，s1：c步骤中苯扎氯铵预处理液超声结束直接进行定容，不用冷却至室温。
35.具体步骤为：c、将苯扎氯铵预处理液用去离子水重新定容至25ml，得苯扎氯铵标准液。
36.实施例7消毒用品中苯扎氯铵含量的检测方法，其检测步骤为：
与实施例5的不同之处在于：溶剂不同；具体步骤为：s1：a、苯扎氯铵消毒液前处理：将0.5g苯扎氯铵消毒液置于50ml容量瓶中，用25ml乙醇溶解，得到苯扎氯铵溶解液；c、将苯扎氯铵预处理液冷却至室温，用乙醇重新定容至25ml，得到苯扎氯铵标准液。
37.对比例1与实施例5的不同之处在于：步骤s2流动相的ph为9。
38.具体步骤为：s2中进行高效液相检测时，取苯扎氯铵进样液10μl，进样检测，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱色谱柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈
ꢀ‑
0.1mol/l醋酸铵溶液，其中戊烷磺酸钠溶液10ml，乙腈70ml，醋酸铵溶液20ml(体积比为10：70：20)，醋酸调节流动相ph为5，检测波长为262nm，记录色谱图。
39.对比例2消毒用品中苯扎氯铵含量的检测方法，其检测步骤为：与实施例5的不同之处在于，s2中进行高效液相检测时，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈-0.1mol/l醋酸铵溶液，其中戊烷磺酸钠溶液2ml，乙腈90ml，醋酸铵溶液8ml(体积比为2：90：8)，醋酸调节流动相ph为5，检测波长为262nm。
40.对比例3采用《化妆品安全技术要求》项下的苯扎氯铵检测方法进行检测。
41.对比例4挪用盐酸奥洛他定滴眼液中苯扎氯铵含量的检测方法，检测消毒用品中苯扎氯铵含量(食品与药品，hplc测定盐酸奥洛他定滴眼液中苯扎氯铵的含量，2010 年第12卷第11期)，其检测步骤为：s1：称取苯扎氯铵消毒剂约25mg，置入25ml量瓶，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；再吸取1ml置入10ml量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。
42.s2：高效液相检测：取样品溶液10μl，进样检测，高效液相检测的色谱柱采用waters spherisorb cnrp(4.6mm
×
150mm，5μm)，流动相采用乙腈-水
‑ꢀ
三乙胺440∶560∶1，用磷酸调ph3.4，检测波长210nm。
43.对比例5挪用新霉素地塞米松滴眼液中苯扎氯铵含量的检测方法，检测消毒用品中的苯扎氯铵含量(安徽医药，高效液相色谱法测定新霉素地塞米松滴眼液中苯扎氯铵的含量，2017aug，21(8))，其检测步骤为：s1：取苯扎氯铵消毒液，摇匀，分别精密移取3ml置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度配制成含苯扎氯铵60mg
·
l
－1
的供试品溶液。
44.s2：高效液相检测：取供试品溶液20μl，进样检测，色谱柱为phenomenexluna c18(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相a：0.02mol
·
l
－1
庚磺酸钠溶液 [含0.1％三乙胺，用磷酸调节ph(3.45
±
0.1)]，流动相b：乙腈，a与b 的比例为20：80；流速：1.0ml
·
min
－1
；柱温：40℃；紫外检测波长：210nm。
[0045]
对比例6
挪用高效液相色谱法同时测定化妆品中的3种苯扎氯铵同系物的方法，检测消毒用品中苯扎氯铵含量(技术与应用，高效液相色谱法同时测定化妆品中的3种苯扎氯铵同系物，vol.29no.5)，其检测步骤为：s1：称取1.0g苯扎氯铵消毒液，精确至0.01g，置于10ml容量瓶中，加入9ml 含0.5％甲酸的甲醇，超声波提取10min，用含0.5％甲酸的甲醇定容至刻度，经滤纸过滤，过0.45μm滤膜，滤液供hplc分析。
[0046]
s2：高效液相检测：取供试品溶液20μl，进样检测，色谱柱：资生堂 capcell pak scx柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；柱温：30℃；进样量：20μl；检测波长：260nm；流动相：(a)乙腈和(b)乙酸铵缓冲溶液(ph4.0)；梯度洗脱程序：0～15min，100％a线性降至75％a；15～20min，75％a；20～26min，100％a。流速：1.0ml/min。
[0047]
性能检测试验a、检出限检测检测步骤为(同实施例1方法)：s1：苯扎氯铵消毒用品前处理：a、分别将不同重量的苯扎氯铵标准样品置于50ml 容量瓶中，用25ml去离子水溶解，得到不同浓度的苯扎氯铵溶解液；b、将苯扎氯铵溶解液在10000rpm/min，-4℃的条件下离心25min，得到苯扎氯铵标准液；将苯扎氯铵标准液用0.45μm的滤膜进行过滤，得到苯扎氯铵进样液；s2：高效液相检测：取苯扎氯铵进样液10μl，进样检测，色谱柱采用c18硅烷键合硅胶柱色谱柱，流动相采用戊烷磺酸钠-乙腈-0.1mol/l醋酸铵溶液，其中戊烷磺酸钠溶液10ml，乙腈70ml，醋酸铵溶液20ml(体积比为10：70：20)，醋酸调节流动相ph为5，检测波长为262nm，记录色谱图。
[0048]
(用表1的苯扎氯铵溶解液进行苯扎氯铵检测，并绘制线性关系图)：表1采用上述方法检测20μg/ml苯扎氯铵溶解液，进行仪器精密度试验，试验结果如表2所示：表2 色谱峰面积平均值rsd/％0.9126,0.8993,0.9151,0.8994,0.9153,0.9089,0.91690.90960.008227
结合表1和表2，可以得到，以苯扎氯铵的质量浓度(x)为横坐标，相应的色谱峰面积(y)为纵坐标绘制标准工作曲线，其中，色谱峰面积(y)为三次检测的平均值，在0～600μg/ml范围内得到的线性关系：十二烷基二甲基苄基氯化铵：y＝0.0193x 0.4133(r＝0.9999)；十四烷基二甲基苄基氯化铵：y＝0.0128x 0.2689(r＝0.9999)；十六烷基二甲基苄基氯化铵：y＝0.0081x 0.1089(r＝0.9999)；同时进行样品添加试验，以信噪比(s/n)为3确定3种苯扎氯铵同系物的检出限，用空白样品提取液进行实验，在信噪比均大于3的条件下，将此添加量定为检出限，得到检出限为1.299μg/ml。
[0049]
本技术的实施例1、5与对比例3、4、5、6的检出限对比结果如表3所示：表3注：实施例4、5与对比例3、4、5、6中检出限的检测方法与计算方法与实施例 1中检出限的检测方法与计算方法相同。
[0050]
由表3可以看出，对比例3、4、5、6中采用不用色谱柱与流动相的结合进行苯扎氯铵的检测时，检出限均比本技术实施例的检出限高；实施例5与实施例4的不同之处在于添加了高速降温离心操作，实施例5的检出限比实施例4 的检出限低。
[0051]
b.实际样品分析按照实施例5的步骤制备不同种类的苯扎氯铵进样液，并进行检测，检测结果如表4所示：表4 样品苯扎氯铵检测值标示量盐酸奥洛他定滴眼液0.00990.01苯扎氯铵消毒液0.10.1将不同的实际样品进行检测，检测结果对照标准曲线，得到的苯扎氯铵检测值符合样品标示量范围内，证明此标准曲线较准确，得到的检出限结果也较准确。
[0052]
c、色谱图分析对实施例1至7和对比例1至6中得到的高效液相谱图进行分析，统计保留时间。统计结果如表5所示：表5
结合实施例1和实施例3，可以看出，一定体积比例的流动相及固定相的配合，使得苯扎氯铵的检测中三种同系物出峰时间间隔较大，难以掺杂其他同系物，检测出三种同系物的峰面积较标准；当戊烷磺酸钠-乙腈-醋酸盐溶液体积比为10： 70：20时，三种同系物出峰时间间隔最大。
[0053]
结合实施例4与实施例5，由于实施例4与实施例5的不同之处在于，实施例5添加了冷冻离心操作，可以看出，冷冻离心操作使得苯扎氯铵中的杂质被尽可能的除去，苯扎氯铵检测的样品纯度较高，三种苯扎氯铵的同系物出峰时间差别较大，分离效果好。
[0054]
结合实施例5和对比例1，可以看出，当流动相的ph变为9时，对苯扎氯铵中三种同系物的分离有较大的影响。
[0055]
结合实施例5和对比例2，可以看出，当戊烷磺酸钠-乙腈-醋酸盐溶液的比例范围超出本技术的比例范围时，对苯扎氯铵中三种同系物出峰逐渐接近，不能进行很好的分离。
[0056]
结合实施例5与对比例3、4、5、6，可以看出，四种检测方法中苯扎氯铵的三种同系物相比于本技术的保留时间间隔较小，导致检测苯扎氯铵三种同系物的峰不能很好的分离，以至于最终导致检测结果不准确，检出限变大。
[0057]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。