用于自乳化的油/表面活性剂混合物的制作方法

1.本发明涉及制备具有小油滴粒度的含α-生育酚的水包油乳剂的改进的方法。这样的乳剂可用作疫苗佐剂。本发明还涉及可通过改进的方法制备的乳剂和用于所述改进的方法的组合物。


背景技术：

2.被称为'mf59'的疫苗佐剂（wo90/14837；podda, 2003；podda, 2001）是角鲨烯、聚山梨酯80（也称为tween 80
™
）和失水山梨糖醇三油酸酯（也称为span 85
™
）的亚微米水包油乳剂。其也可包括柠檬酸根离子，例如10mm柠檬酸钠缓冲液。该乳剂的体积组成可以是大约5%角鲨烯、大约0.5%聚山梨酯80和大约0.5%失水山梨糖醇三油酸酯。佐剂及其生产更详细描述在vaccine design: the subunit and adjuvant approach（第10章）、vaccine adjuvants: preparation methods and research protocols（第12章）和new generation vaccines（第19章）。如o’hagan, 2007中描述，在商业规模下通过将失水山梨糖醇三油酸酯分散在角鲨烯中、将聚山梨酯80分散在水相（例如柠檬酸盐缓冲液）中、然后混合这两个相以形成粗乳剂（coarse emulsion），然后将其微流化而制备mf59。该乳剂通常以双倍浓度制备（4.3% v/v角鲨烯、0.5% v/v聚山梨酯80和0.5% v/v失水山梨糖醇三油酸酯）并用含抗原的组合物1:1（按体积计）稀释以提供最终含佐剂的疫苗组合物。mf59的成人剂量含有9.75 mg角鲨烯、1.17 mg聚山梨酯80和1.17 mg失水山梨糖醇三油酸酯（o’hagan, 2013）。
3.被称为'as03'的乳剂佐剂（gar
ç
on, 2012）通过混合油混合物（由角鲨烯和α-生育酚组成）与水相（聚山梨酯80和缓冲液），然后微流化制备 (wo2006/100109)。as03也通常以双倍浓度制备，期望通过水性含抗原组合物稀释。as03的成人剂量含有11.86 mg α-生育酚、10.69 mg角鲨烯和4.86 mg聚山梨酯80（morel, 2011；fox, 2009）。
4.被称为'af03'的乳剂佐剂通过冷却预热的油包水乳剂直至其经过其乳剂相转变温度（此时其热可逆转化成水包油乳剂）来制备（us20070014805）。'af03'乳剂包括角鲨烯、失水山梨糖醇油酸酯、聚氧乙烯十六十八烷基醚和甘露醇。甘露醇、十六十八烷基醚和磷酸盐缓冲液在一个容器中混合以形成水相，而失水山梨糖醇酯和角鲨烯在另一容器中混合以形成油性组分。将水相添加到油性组分中，然后将混合物加热到~60℃并冷却以提供最终乳剂。该乳剂最初以32.5%角鲨烯、4.8%失水山梨糖醇油酸酯、6.2%聚氧乙烯十六十八烷基醚和6%甘露醇的组成制备，其为最终浓度的至少4x。
5.as03和mf59佐剂已表明增强对2剂灭活h7n9流感疫苗的免疫应答，含as03佐剂的制剂引发最高滴度（jackson, 2015）。
6.α-生育酚在as03中的存在已表明在小鼠模型中增强hbsag抗原特异性适应性反应的量级（morel, 2011）。
7.如上文论述，本领域中已知用于生产适合用作佐剂的乳剂的传统方法需要剧烈机械过程（如匀浆和微流化）或相对较高的温度（例如在相转变温度法中）以实现佐剂活性所需的小油滴尺寸。这些方法的使用与几个缺点相关联，例如高制备成本。
8.wo2015/140138和wo2016/135154描述了油/表面活性剂组合物的制备，其在用水相稀释时自发形成具有小液滴粒度的水包油乳剂，这样的乳剂可用作免疫佐剂。sea160乳剂的成人剂量包括7.62 mg角鲨烯、2.01 mg聚山梨酯80和2.01 mg失水山梨糖醇三油酸酯。wo2015/140138例示基于角鲨烯和聚山梨酯80的组合物的用途。尝试用葵花油或大豆油替代角鲨烯和用聚山梨酯20、十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯10十二烷基醚替代聚山梨酯80得出的结论是，测试的这些替代油无一适合替代角鲨烯，并且测试的替代性表面活性剂组分无一有用。
9.用于自乳化水包油乳剂佐剂的液滴尺寸已表明与免疫应答相关联（shah, 2014；shah, 2015），160 nm直径的液滴产生比20 nm或90 nm的那些强的免疫应答。
10.julianto, 2000描述了包含棕榈油的自乳化维生素e制剂。
11.在兽用疫苗领域中已经研究了包含α-生育酚的基于矿物油的乳剂（franchini, 1991；franchini, 1994）。
12.仍然需要新型自乳化油/表面活性剂组合物，其能在商业可行的规模下安全、方便和成本有效地生产佐剂，所述佐剂与来自常规制备法的佐剂相比表现出良好的免疫性能。
13.相应地，本发明的一个目的是提供用于生产具有新型组成和改进的免疫活性的亚微米水包油乳剂的另外的和改进的（例如更简单的）方法。特别地，本发明的一个目的是提供适合在商业规模下使用并且不要求使用涉及剧烈机械处理或显著提高的温度的工艺的方法。
14.发明概述本发明人已经令人惊讶地发现，不需要微流化或加热以造成相转变，而是通过油和表面活性剂的合适预混组合物与水性材料的简单混合，可形成具有小液滴尺寸和低多分散指数值（pdi）的某些含α-生育酚的水包油乳剂。本发明的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物可与过量体积的水性材料混合以自发形成具有亚微米油滴（和甚至具有适合无菌过滤的直径为200 nm或更小且pdi为0.3或更小的液滴）的水包油乳剂，其表现出良好的佐剂活性，在一些情况下好于自发形成的无α-生育酚的乳剂，尤其比得上已知的含α-生育酚的乳剂as03。
15.本发明提供一种包含角鲨烯、生育酚和生物相容的可代谢表面活性剂的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的40% v/v或更多，生育酚为所述组合物的25% v/v或更少，表面活性剂为所述组合物的60% v/v或更少，其在与过量体积的基本无表面活性剂的水性材料混合时形成具有200 nm或更小的平均油粒直径的佐剂。
16.还提供一种包含角鲨烯、生育酚和生物相容的可代谢表面活性剂的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的50至70% v/v，生育酚为所述组合物的10至20% v/v且表面活性剂为所述组合物的10至40% v/v。
17.另外提供一种制备包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂的方法，所述方法包括将根据本发明的角鲨烯、生育酚和表面活性剂组合物与过量体积的水性组分混合。
18.进一步提供一种包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的40% v/v或更多，生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的25% v/v或更少，表面活性剂为角鲨
烯、生育酚和表面活性剂的总量的60% v/v或更少，并且其中所述佐剂具有200 nm或更小的平均油粒直径。
19.还提供一种包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的50至70% v/v，生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10至20% v/v且表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10至40% v/v。
20.本发明还提供包含本发明的水包油乳剂佐剂和抗原或抗原组分的疫苗组合物，和用于制备这样的疫苗组合物的成套试剂盒（kits of parts）。
21.本发明还提供一种干燥材料（例如冻干产物），其在用水性组分重构时提供根据本发明的水包油乳剂或包含根据本发明的水包油乳剂和抗原或抗原组分的疫苗。
22.附图简述图1
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实施例1中制备的角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80乳剂的三元图，其显示所得粒子直径的等值线图2
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实施例1中制备的角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80乳剂的三元图，其显示所得粒子多分散指数的等值线图3
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如实施例3中所述用四价流感疫苗首次免疫后3周的hai滴度图4
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如实施例3中所述用四价流感疫苗二次免疫后3周的hai滴度图5
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如实施例3中所述用四价流感疫苗免疫后的igg1亚型滴度图6
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如实施例3中所述用四价流感疫苗免疫后的igg2a亚型滴度图7
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如实施例3中所述用四价流感疫苗免疫后的igg2b亚型滴度图8
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如实施例3中所述用四价流感疫苗免疫后的cd4 应答频率图9
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如实施例3中所述用四价流感疫苗免疫后的cd4 t细胞应答，其显示为来自5只动物的频率的平均值并分类为th0、th1、th2和th17型cd4 t细胞图10
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如实施例4中所述经0.22 um聚醚砜过滤器过滤乳剂之前和之后制剂36和22的粒度分布图11
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如实施例4中所述经0.22 um聚醚砜过滤器过滤乳剂之前和之后制剂44的粒度分布图12
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如实施例5中所述在4℃、25℃或50℃下储存10周的制剂36、22和44乳剂的ph和重量摩尔渗透压浓度（osmolality）图13
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如实施例5中所述在4℃、25℃或50℃下储存10周的制剂36、22和44乳剂的颗粒直径和多分散指数（polydispersity index）图14
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如实施例6中所述用cmv疫苗首次免疫后3周的中和抗体滴度图15
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如实施例6中所述用cmv疫苗二次免疫后3周的中和抗体滴度图16
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如实施例6中所述用cmv疫苗三次免疫后3周的中和抗体滴度图17
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如实施例7中所述的制剂44b的粒度分布图18
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如实施例7中所述冻干后的蛋白质完整性图19
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如实施例8中所述用cmv疫苗免疫后的中和抗体滴度。各条代表具有95%置信区间（ci）的几何平均滴度（gmt）。在图上标记显著差异。与单独cmv的比较显示在底部，与as03的比较在中间，与冻干单瓶的比较在顶部；其中ns = 不显著，*= p＜0.05，**= p＜
0.005，***= p＜0.0005和****= p＜0.00005。
23.图20
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如实施例8中所述用cmv疫苗二次和三次免疫后3周获得的血清中的抗-cmv penta igg抗体滴度。各条代表具有95%置信区间（ci）的几何平均滴度（gmt）。在图上标记显著差异。与单独cmv的比较显示在底部，与as03的比较在中间，与冻干单瓶的比较在顶部；其中ns = 不显著，*= p＜0.05，**= p＜0.005，***= p＜0.0005和****= p＜0.00005。
24.图21
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如实施例8中所述用cmv疫苗三次免疫后4周使用ics检测法的抗原特异性cd4 t细胞。各条代表具有95%置信区间（ci）的几何平均滴度（gmt）。
25.发明详述如上文提到，本发明人已经令人惊讶地发现，通过油和表面活性剂的合适预混组合物与水性材料的简单混合，可形成具有小液滴尺寸和低多分散指数值（pdi）的含α-生育酚的水包油乳剂。本发明的预混组合物可与过量体积的水性材料混合以自发形成具有亚微米油滴（和甚至具有适合无菌过滤的直径为200 nm或更小且pdi为0.3或更小的液滴）的水包油乳剂，其表现出良好的佐剂活性。
26.本发明提供一种包含角鲨烯、生育酚和生物相容的可代谢表面活性剂的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的40% v/v或更多，生育酚为所述组合物的25% v/v或更少，表面活性剂为所述组合物的60% v/v或更少，其在与过量体积的基本无表面活性剂的水性材料混合时，形成具有200 nm或更小的平均油粒直径的佐剂。
27.还提供一种包含角鲨烯、生育酚和生物相容的可代谢表面活性剂的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的50至70% v/v，生育酚为所述组合物的10至20% v/v且表面活性剂为所述组合物的10至40% v/v。
28.另外提供一种制备包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂的方法，所述方法包括将根据本发明的角鲨烯、生育酚和表面活性剂组合物与过量体积的水性组分混合。
29.进一步提供一种包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的40% v/v或更多，生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的25% v/v或更少，表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的60% v/v或更少，并且其中所述佐剂具有200 nm或更小的平均油粒直径。
30.还提供一种包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的50至70% v/v，生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10至20% v/v且表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10至40% v/v。
31.本发明还提供包含本发明的水包油乳剂佐剂和抗原或抗原组分的疫苗组合物，和用于制备这样的疫苗组合物的成套试剂盒。
32.本发明还提供一种干燥材料（例如冻干产物），其在用水性组分重构时提供根据本发明的水包油乳剂或包含根据本发明的水包油乳剂和抗原或抗原组分的疫苗。
33.lodaya, 2019描述了在本技术的实施例中提供的一些实验数据。
34.角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物根据本发明，制备水包油乳剂的方法利用角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物。这
种组合物是角鲨烯、生育酚和表面活性剂组分的混合物，下面更详细论述其实例。这些组分中的角鲨烯、生育酚和表面活性剂理想地在该组合物中彼此混溶。该组合物可以是角鲨烯/生育酚/表面活性剂分散体，并且如果角鲨烯、生育酚和表面活性剂相彼此完全混溶，该组合物将是角鲨烯/生育酚/表面活性剂溶液的形式。
35.由于本发明的乳剂意图用于制药用途，该组合物中的表面活性剂通常可代谢（可生物降解）和生物相容。该组合物和其中的所有组分通常适合用作药物。
36.该组合物理想地基本由角鲨烯组分、生育酚组分和表面活性剂组分组成。但是，在一些实施方案中，该组合物可包括除角鲨烯、生育酚和表面活性剂组分外的组分。当包括另外的组分时，它们通常应该构成该组合物的（按重量计）小于15%，更合适地小于10%。例如，在一些实施方案中，该组合物可包括一种或多种赋形剂或药理活性剂。
37.本发明的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物应该基本不含水性组分，并且它们可以是无水的。低水含量通常有益于稳定性。合适地，角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物，无论直接配制还是通过乳剂的干燥制备，将含有1% v/v水或更少，如0.1% v/v或更少，特别是0.01% v/v或更少，尤其是0.001% v/v或更少。
38.角鲨烯组分、生育酚组分和表面活性剂组分的比例可变。角鲨烯组分为该组合物的40% v/v或更多，如50%或更多，特别是55%或更多。角鲨烯组分理想地为该组合物的90% v/v或更少，如80%或更少，特别是70%或更少，尤其是65%或更少。合适地，角鲨烯组分为该组合物的50至70% v/v，如55至65%，特别是57至63%，尤其是大约60%（如60%）。
39.为了确保自发形成小液滴尺寸，通常需要低生育酚含量。生育酚组分为该组合物的25% v/v或更少，如20%或更少。生育酚组分理想地为该组合物的5% v/v或更多，如10%或更多。合适地，生育酚组分为该组合物的5至25% v/v，如10至20%，特别是12至18%，尤其是大约15%（如15%）。
40.表面活性剂组分为该组合物的60% v/v或更少，如50%或更少，特别是40%或更少，尤其是30%或更少。表面活性剂组分可为该组合物的10% v/v或更多，如20%或更多。合适地，表面活性剂组分为该组合物的15至35% v/v，如20至30%，特别是22至28%，尤其是大约25%（如25%）。
41.理想的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物包含角鲨烯、α-生育酚和表面活性剂，如包含角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80。更特别理想的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物基本由角鲨烯、α-生育酚和表面活性剂组成，如基本由角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80组成。
42.角鲨烯大多数鱼含有可容易回收的可代谢油。在5-碳异戊二烯单元中生物化学合成许多支链油并通常被称为萜类化合物。角鲨烯是一种支化的不饱和萜类化合物（[(ch3)2c[=chch2ch2c(ch3)]2=chch
2-]2；c
30h50
；2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯；cas登录号7683-64-9）。角鲨烯易获自商业来源或可通过本领域中已知的方法获得。
[0043]
生育酚α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚的任一种可用于本发明，但通常使用α-生育酚（在本文中也称为alpha-生育酚）。d-α-生育酚和dl-α-生育酚都可使用。理想的α-生育酚是dl-α-生育酚。生育酚易获自商业来源或可通过本领域中已知的方法获得。
[0044]
表面活性剂组分该组合物包括由一种或多种表面活性剂形成的表面活性剂组分。其通常由一种表面活性剂组成。在一些实施方案中，该表面活性剂组分由多于一种表面活性剂组成，如基本由三种表面活性剂组成（如由三种表面活性剂组成）的混合物，尤其是基本由两种表面活性剂组成（如由两种表面活性剂组成）的混合物。
[0045]
表面活性剂组分可包括各种表面活性剂，包括离子型（阳离子、阴离子或两性离子）和/或非离子型表面活性剂。使用仅非离子型表面活性剂通常是理想的，例如由于它们的ph独立性。本发明因此可使用表面活性剂，包括但不限于：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂（常被称为tween或聚山梨酯），如聚山梨酯20和聚山梨酯80，尤其是聚山梨酯80；环氧乙烷(eo)、环氧丙烷(po)和/或环氧丁烷(bo)的共聚物，以dowfax
™
、pluronic
™
或synperonic
™
商品名出售，如线性eo/po嵌段共聚物，例如泊洛沙姆407和泊洛沙姆188；重复乙氧基（氧基-1,2-乙二基）基团数可变的octoxynol，其中octoxynol-9（triton x-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）特别有意义；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇（igepal ca-630/np-40）；磷脂，如磷脂酰胆碱（卵磷脂）；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（被称为brij表面活性剂），如聚氧乙烯4月桂醚（brij 30）；聚氧乙烯-9-月桂醚；失水山梨糖醇酯（常被称为span），如失水山梨糖醇三油酸酯（span 85）、失水山梨糖醇单油酸酯（span 80）和失水山梨糖醇单月桂酸酯（span 20）；聚氧乙烯月桂醚（emulgen 104p）或生育酚衍生物表面活性剂，如α-生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯（tpgs）。可药用表面活性剂的许多实例在本领域中已知用于该组合物和因此用于最终乳剂，例如参见
‘
handbook of pharmaceutical excipients’（eds. rowe, sheskey, & quinn；第6版, 2009）。
[0046]
该组合物的表面活性剂组分中的表面活性剂合适地生物相容和可生物降解。因此，表面活性剂组分在正常使用下在给药时不危害哺乳动物受体，并可代谢以使其不存留。
[0047]
特别有意义的表面活性剂包括聚山梨酯（例如聚山梨酯20或80）、失水山梨糖醇酯（例如失水山梨糖醇三油酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯和失水山梨糖醇单月桂酸酯）、泊洛沙姆（例如泊洛沙姆407和泊洛沙姆188）和α-生育酚peg糖酯（例如tpgs），它们可独立地、互相组合地或与其它表面活性剂组合地使用。
[0048]
在一些情况下，聚山梨酯，如聚山梨酯80，可与第二表面活性剂如泊洛沙姆（例如泊洛沙姆407和泊洛沙姆188）或α-生育酚peg糖酯（例如tpgs）联合使用。
[0049]
在一些情况下，聚山梨酯80独立地用作表面活性剂组分。
[0050]
表面活性剂可通过它们的“hlb”（griffin’s亲水/亲油平衡）分类，其中在1-10范围内的hlb通常是指该表面活性剂在油中比在水中更可溶，而在10-20范围内的hlb是指该表面活性剂在水中比在油中更可溶。相关表面活性剂的hlb值易得，例如聚山梨酯80具有15.0的hlb，且tpgs具有13-13.2的hlb。失水山梨糖醇三油酸酯具有1.8的hlb。
[0051]
当掺合两种或更多种表面活性剂时，该掺合物的所得hlb通常通过加权平均值计算，例如聚山梨酯80和tpgs的70/30重量%混合物具有(15.0 x 0.70) (13 x 0.30)，即14.4的hlb。聚山梨酯80和失水山梨糖醇三油酸酯的70/30重量%混合物具有(15.0 x 0.70) (1.8 x 0.30)，即11.04的hlb。
[0052]
一般而言，表面活性剂组分具有在10至18之间，如在12至17之间，特别是13至16的hlb。这通常可使用单一表面活性剂或在一些实施方案中使用表面活性剂的混合物（例如两
种表面活性剂的混合物，如聚山梨酯80和第二表面活性剂，如tpgs）实现。
[0053]
如果表面活性剂组分包括多于一种表面活性剂，则其中至少一种通常具有至少10（例如在12至17或13至16的范围内）的hlb，且另一种可具有高于10的hlb或低于10的hlb（例如在1至9或1至4的范围内）。在一些实施方案中，表面活性剂组分包含具有1至5的hlb值的第一表面活性剂和具有13至17的hlb值的第二表面活性剂。
[0054]
水性组分根据本发明，制备乳剂的方法利用水性组分，将其与本发明的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物混合。这种水性组分可以是淡水（例如注射用水）或可包括另外的组分，例如溶质。例如，水性组分可包括盐，其可用于影响张度和/或控制ph。例如，该盐可形成ph缓冲液，例如柠檬酸盐或磷酸盐，如钠盐。典型缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸盐缓冲液。当使用缓冲的水性组分时，通常在1-20mm范围内包括缓冲液。
[0055]
水性组分可包括用于影响张度和/或重量摩尔渗透压浓度的溶质（其可以是离子型或非离子型的）。张度可选择为与人体组织大致等张。为了控制张度，该乳剂可包含生理盐，如钠盐。氯化钠（nacl）例如可以大约0.9% (w/v)使用（生理盐水）。可能存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。非离子型张度剂也可用于控制张度。归类为醛糖的单糖，如葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和核糖，以及归类为酮糖的那些，如果糖、山梨糖和木酮糖，可用作本发明中的非离子型张度剂。也可使用二糖，如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖。此外，醛糖醇（无环多羟基醇，也被称为糖醇)，如甘油、甘露醇、木糖醇和山梨糖醇是可用于本发明的非离子型张度剂。非离子型张度改性剂可以以水性组分的大约0.1%至大约10% w/v或大约1%至大约10% w/v的浓度存在，取决于所用试剂。
[0056]
用于给药的组合物通常具有在250至750 mosm/kg的范围内的重量摩尔渗透压浓度，例如，重量摩尔渗透压浓度可在250至550 mosm/kg的范围内，如在280至500 mosm/kg的范围内。在一个特定实施方案中，重量摩尔渗透压浓度可在280至310 mosm/kg的范围内。重量摩尔渗透压浓度可根据本领域中已知的技术，如通过使用市售渗透压计，例如可获自advanced instruments inc. (usa)的advanced
tm model 2020测量。
[0057]
不直接用于给药的乳剂（例如其旨在首先与另外的含抗原或抗原组分的液体或干燥组合物混合）可能本身是低渗或高渗的，取决于影响张度和/或重量摩尔渗透压浓度的组分在所述液体或干燥组合物中的存在。
[0058]
水性组分可包含pickering试剂s如甘露醇以降低表面张力。
[0059]
水性组分理想地具有在6至9之间，例如在6.5至8.5之间，或在6.0至7.5之间或在7.0至8.5之间的ph。这一ph范围保持与正常生理条件的相容性并在某些情况下，可能是为了确保该乳剂的某些组分的稳定性而要求的。
[0060]
优选地，水性组分基本不含油。因此，在与角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物混合以形成乳剂时，乳剂中的基本所有的油应该源自角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物（例如至少95% v/v，合适地至少98%，如至少99%）。优选地，水性组分也基本不含表面活性剂。因此，在与角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物混合以形成乳剂时，乳剂中的基本所有的表面活性剂应该源自角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物（例如至少95% w/w，合适地至少98%，如至少99%）。最优选地，水性组分基本不含油和表面活性剂。
[0061]
在一些实施方案中，水相可包含抗原或抗原组分。
[0062]
混合不同于mf59和as03，不需要使用匀浆器或微流化器就可制备本发明的乳剂。不同于af03，不需要加热到》50℃就可制备本发明的乳剂。取而代之地，油/表面活性剂组合物与水相的混合可导致自发形成亚微米乳剂，即使仅温和搅动/混合（例如用手，如通过简单手动倒转）。
[0063]
因此本发明提供一种制备具有200 nm或更小的平均油粒直径并包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂的方法，所述方法包括：(i) 提供根据本发明的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物；(ii) 提供水性组分；(iii) 将所述组合物与过量体积的水性组分合并以形成稀释组合物；和(iv) 混合所述稀释组合物以形成具有200 nm或更小的平均油粒直径的水包油乳剂。
[0064]
还提供一种制备具有200 nm或更小的平均油粒直径并包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂的方法，所述方法包括：(iii) 将根据本发明的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物与过量体积的水性组分合并以形成稀释组合物；和(iv) 混合所述稀释组合物以形成具有200 nm或更小的平均油粒直径的水包油乳剂。
[0065]
步骤(iii)可通过角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物与水性组分的简单混合进行。其优选通过将角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物添加到水性组分中实现。步骤(iii)有时可包括两个分开的步骤：(a) 最初混合一定体积的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物和水性组分；和(b) 用另一体积的水性组分稀释角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物和水性组分的混合物以形成稀释组合物。步骤(a)和(b)优选各自通过将含角鲨烯/生育酚/表面活性剂的材料添加到水性组分中实现。
[0066]
步骤(iv)中的混合的进行可以不需要任何剪切压力、不使用转子/定子混合、在常压下并且不经过泵循环组分。其可在不存在机械搅动的情况下进行。其可在不存在热转化的情况下进行。
[0067]
可温和搅动/混合该组合物和水性组分的混合物以形成水包油乳剂。通过不同于匀浆、微滤、微流化、声处理（或其它高剪切或高能量法）或相转变温度法（其中提高乳剂的温度直至其反转）的手段提供温和混合。合适地，温和搅动可包括手动倒转该混合物，或其可包括搅拌，或其可包括经过注射器混合，或其可包括任何类似的方法。总体上，通过施加受控的最小分散力实现混合。理想地避免包含机械混合组件（例如磁搅拌棒）。
[0068]
合并角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物和水性组分的步骤可在低于55℃，例如在5-50℃的范围内任一处，例如在10-20℃之间、在20-30℃之间、在30-50℃之间或在40-50℃之间进行。该过程可有用地在室温，即大约20-25℃下进行。这一步骤理想地在低于30℃，例如在15-29℃的范围内进行。该组合物和/或水相优选在混合前平衡到所需温度。例如，可将这两种组分平衡到40℃，然后混合。在混合后，在乳剂形成的同时，可将混合物保持在低于55℃的温度。优选地，角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物和/或水性组分在混合前加热并保
average），即通过dls测量的整组液滴的强度加权平均流体动力学尺寸。z均来源于实测相关曲线的累积量分析，其中假设单粒子尺寸（液滴直径）并对自相关函数施加单指数拟合。因此，在本文中提到平均直径应被认为是强度加权平均，并理想地为z均。
[0078]
本发明的乳剂内的液滴优选具有0.5或更小的多分散指数。多分散性是粒子的粒度分布的宽度的量度并常规表示为多分散指数（pdi）。大于0.7的多分散指数意味着样品具有极宽粒度分布，0的报告值意味着不存在粒度变化，尽管很少见到小于0.05的值。本发明的乳剂内的油滴优选具有相对均匀的尺寸。因此乳剂中的油滴优选具有0.5或更小，例如0.4或更小，如0.3或更小，特别是0.2或更小的pdi。pdi值容易由测量平均直径的相同仪器提供。
[0079]
下游加工本发明的水包油乳剂可过滤。这种过滤从乳剂中除去任何大油滴。尽管数量小，但这些油滴在体积方面可相对较大并且它们可充当聚集的成核点，以造成储存过程中的乳剂劣化（emulsion degradation）。此外，这种过滤步骤可实现过滤灭菌。
[0080]
适用于过滤灭菌的特定过滤膜取决于水包油乳剂的流体特性和所需过滤程度。过滤器的特性可影响其用于过滤乳剂的适用性。例如，其孔径和表面特性可能是重要的，特别是当过滤基于角鲨烯的乳剂时。合适的过滤技术的细节可见于例如wo2011/067669。
[0081]
用于本发明的膜的孔径应该允许所需液滴通过，同时截留不想要的液滴。例如，其应该截留尺寸》1um的液滴，同时允许《200nm的液滴通过。0.2um或0.22um过滤器通常是理想的，并且也可实现过滤灭菌。
[0082]
该乳剂可例如经由0.45 um过滤器预过滤。可使用已知双层过滤器在一个步骤中实现预过滤和过滤，所述双层过滤器包括具有较大孔隙的第一膜层和具有较小孔隙的第二膜层。双层过滤器特别可用于本发明。第一层理想地具有》0.3 um，如在0.3-2 um之间或在0.3-1 um之间或在0.4-0.8 um之间或在0.5-0.7 um之间的孔径。在第一层中《0.75 um的孔径是优选的。因此第一层可具有例如0.6 um或0.45 um的孔径。第二层理想地具有小于第一层的孔径的75%（和理想地小于第一层的孔径的一半）的孔径，如在第一层的孔径的25-70%之间或在25-49%之间，例如在第一层的孔径的30-45%之间，如1/3或4/9。因此第二层可具有《0.3um，如在0.15-0.28 um之间或在0.18-0.24 um之间的孔径，例如0.2 um或0.22 um孔径的第二层。在一个实例中，具有较大孔隙的第一膜层提供0.45 um过滤器，而具有较小孔隙的第二膜层提供0.22 um过滤器。
[0083]
过滤膜和/或预过滤膜可以是不对称的。不对称膜是其中孔径从膜的一侧向另一侧变化，例如其中孔径在入口面大于在出口面的膜。不对称膜的一侧可能被称为“粗孔表面”，而不对称膜的另一侧可能被称为“细孔表面”。在双层过滤器中，一个层或（理想地）两个层可以是不对称的。
[0084]
过滤膜可以是多孔的或均质的。均质膜通常是10至200 um的致密膜。多孔膜具有多孔结构。在一个实施方案中，过滤膜是多孔的。在双层过滤器中，两个层都可以是多孔的，两个层都可以是均质的，或可能有一个多孔层和一个均质层。优选的双层过滤器是其中两个层都是多孔的过滤器。
[0085]
在一个实施方案中，本发明的水包油乳剂经由不对称的亲水多孔膜预过滤，然后经由具有比预过滤膜小的孔隙的另一不对称的亲水多孔膜过滤。这可使用双层过滤器。
[0086]
过滤膜可在使用前灭菌（例如高压灭菌）以确保其无菌。
[0087]
过滤膜通常由聚合物载体材料，如ptfe（聚-四氟乙烯）、pes（聚醚砜）、pvp（聚乙烯基吡咯烷酮）、pvdf（聚偏二氟乙烯）、尼龙（聚酰胺）、pp（聚丙烯）、纤维素（包括纤维素酯）、peek（聚醚醚酮）、硝化纤维素等制成。这些具有不同特性，一些载体固有疏水（例如ptfe），另一些固有亲水（例如乙酸纤维素）。但是，可通过处理膜表面改变这些固有特性。例如，已知通过用其它材料（如其它聚合物、石墨、硅酮等）处理它们以涂布膜表面来制备亲水化或疏水化膜，例如参见wo90/04609的章节2.1。在双层过滤器中，两个膜可由不同材料或（理想地）由相同材料制成。
[0088]
在过滤过程中，可使乳剂保持在40℃或更低，例如30℃或更低的温度下，以促进成功的无菌过滤。一些乳剂在其处于大于40℃的温度下时可能无法通过无菌过滤器。
[0089]
有利的是在制成乳剂的24小时内，例如在18小时内、在12小时内、在6小时内、在2小时内、在30分钟内进行过滤步骤，因为如lidgate, 1992中论述，在这一时间后乳剂有可能无法在不堵塞过滤器的情况下通过无菌过滤器。
[0090]
本发明的方法可大规模使用。因此方法可能涉及过滤大于1升的体积，例如》5升、》10升、》20升、》50升、》100升、》250升等。
[0091]
在一些实施方案中，可对已根据本发明制备的乳剂施以微流化。因此，例如，本发明可在微流化之前使用以减小产生所需结果所需的微流化程度。因此，如果需要，可使用微流化，但可减少施加在乳剂上的总剪切力。
[0092]
可将本发明的水包油乳剂干燥（任选在过滤后，如上文论述）。干燥可方便地通过冻干实现，但也可使用其它技术，例如喷雾干燥。这些干燥乳剂可与水性组分混合以再次提供本发明的乳剂。因此本发明提供干燥材料（例如冻干产物），其在用水性组分重构时提供本发明的水包油乳剂。
[0093]
如本文所用，冻干是指在真空下通过升华和解吸从冷冻样品中除去水的方法。冻干能使疫苗的储存和使用不依赖于冷链。由于冻干改进疫苗的热稳定性，其能使疫苗高效分配。储存和运输变得相对容易，因为将大体积的液体疫苗制剂转化成干燥的饼状形式。蛋白质、减毒活病毒或灭活病毒或含菌疫苗的冻干是用于延长贮存寿命和提高热应力抗性的常规做法。佐剂疫苗已添加了可能对成功的冻干造成技术问题的组分。因此冷链储存对保持不同组分
ꢀ–ꢀ
抗原和佐剂（因为在一些情况下抗原和佐剂在临给药前混合）的稳定性变得至关重要。如果抗原和佐剂可在单瓶中冻干，可避免冷链维护并且给药前的佐剂和抗原混合可被更简单的方法替代——用稀释剂重构冻干疫苗。
[0094]
本文所用的“干材料”和“干燥材料”是指基本不含水或基本不含水相的材料（例如其基本无水）。干材料通常为粉末或饼的形式。
[0095]
本发明还提供通过制备根据本发明的水包油乳剂和对其施以干燥过程而制备所述干材料的方法。合适地，在冻干前将该乳剂与一种或多种冻干稳定剂合并（或该乳剂已包括一种或多种冻干稳定剂）。也可在干燥前将该乳剂与至少一种抗原或抗原组分合并，任选除一种或多种冻干稳定剂外。
[0096]
可为干乳剂提供其它液体形式的组分（例如抗原或抗原组分和/或水性组分）。可以混合这些组分以重构干燥组分并产生给药于患者的液体组合物。干燥组分通常位于小瓶而非注射器内。
[0097]
冻干组分（例如乳剂）可包括冻干稳定剂。这些稳定剂包括如糖醇（例如甘露醇等）或简单糖类，如二糖和三糖之类的物质。冻干稳定剂优选是小糖类，如二糖。它们优选包括选自葡萄糖、果糖和半乳糖的糖单体，且含葡萄糖的二糖和含果糖的二糖特别优选。优选二糖的实例包括蔗糖（含有葡萄糖和果糖）、海藻糖（含有两个葡萄糖单糖）和麦芽酮糖（含有葡萄糖和果糖），更优选蔗糖，如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。
[0098]
本发明的水包油乳剂和根据本发明制备它们的方法的一个优点在于当它们在干燥后用水性组分重构时，所得水包油乳剂可保留其在干燥前的原始性质（例如其平均油粒直径）。
[0099]
抗原或抗原组分尽管有可能将水包油乳剂佐剂独自给药于对象（例如为已单独给药于患者的抗原或抗原组分提供佐剂效应），但更通常在给药前将佐剂与抗原或抗原组分混合以形成含抗原或抗原组分的组合物，例如疫苗。乳剂和抗原或抗原组分的混合可在使用时即时进行，或可在疫苗制备过程中在灌装前进行。本发明的乳剂可用于任一情况。
[0100]
各种抗原或抗原组分可与水包油乳剂一起使用，包括但不限于：病毒抗原，如病毒表面蛋白；细菌抗原，如蛋白质和/或糖类抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。
[0101]
合适地，抗原包含至少一种b或t细胞表位。引发的免疫应答可能是抗原特异性b细胞应答，其产生中和抗体。引发的免疫应答可能是抗原特异性t细胞应答，其可能是全身反应和/或局部反应。抗原特异性t细胞应答可包含cd4 t细胞应答，如涉及表达许多细胞因子，例如ifnγ、tnfα和/或il2的cd4 t细胞的应答。替代性地或另外地，抗原特异性t细胞应答包含cd8 t细胞应答，如涉及表达许多细胞因子，例如ifnγ、tnfα和/或il2的cd8 t细胞的应答。
[0102]
抗原可衍生自（如获自）人类或非人类病原体，包括例如感染人类和非人类脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或衍生自（如获自）癌细胞或肿瘤细胞。
[0103]
在一个实施方案中，抗原是重组蛋白，如重组原核蛋白。
[0104]
在本发明的某些实施方案中，抗原或抗原组分衍生自一种或多种流感菌株（即一价或多价，如三价或四价流感疫苗，其可以是完全的、裂解的、纯化的或重组的）。
[0105]
在本发明的某些实施方案中，抗原或抗原组分衍生自巨细胞病毒（cmv），例如penta抗原（chandramouli, 2017）。
[0106]
抗原或抗原组分的溶液通常例如以1:1体积比与乳剂混合。这种混合可在灌装前由疫苗生产商进行，或可在使用时由医疗保健工作者进行。替代性的制剂包括用于重构的在单一容器中的干燥形式的抗原或抗原组分和乳剂。
[0107]
本发明的水包油乳剂的用途本发明的水包油乳剂适合用作抗原或抗原组分的佐剂。合适地，这些佐剂作为疫苗的一部分给药。因此本发明提供一种抗原或抗原性组合物，如疫苗，其包含(i) 本发明的水包油乳剂，和(ii) 抗原或抗原组分。这些可通过将本发明的水包油乳剂与抗原或抗原组分混合制备。
[0108]
本发明还提供试剂盒，其包含：本发明的水包油乳剂；和抗原或抗原组分。本发明还提供试剂盒，其包含：角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物；水性组分；和抗原或抗原组分。
试剂盒组分的混合提供本发明的疫苗制剂。
[0109]
本发明还提供试剂盒，其包含本发明的角鲨烯/生育酚/表面活性剂组合物和水性组分，两者的任一个或两者都包括抗原或抗原组分。试剂盒组分的混合提供本发明的疫苗制剂。
[0110]
尽管有可能将水包油乳剂佐剂独自给药于患者（例如为已单独给药的免疫原提供佐剂效应），但更通常在给药前将佐剂与抗原或抗原组分混合以形成抗原或抗原性组合物，例如疫苗。乳剂和抗原或抗原组分的混合可在使用时即时进行，或可在疫苗制备过程中在灌装前进行。
[0111]
总之，因此，本发明可在制备混合疫苗时或在制备如上文论述用于混合的试剂盒时使用。如果在制备过程中进行混合，则混合的散装抗原或抗原组分和乳剂的体积通常大于1升，例如》5升、》10升、》20升、》50升、》100升、》250升等。如果在使用时进行混合，则混合的体积通常小于1毫升，例如《0.6ml、《0.5ml、《0.4ml、《0.3ml、《0.2ml等。在这两种情况下，通常混合基本等体积的乳剂和抗原或抗原溶液，即基本1:1（例如在1.1:1至1:1.1之间，优选在1.05:1至1:1.05之间，更优选在1.025:1至1:1.025之间）。但是，在一些实施方案中，可使用过量的乳剂或过量的抗原或抗原组分（wo2007/052155）。如果使用过量体积的一种组分，该过量通常为至少1.5:1，例如》2:1、》2.5:1、》3:1、》4:1、》5:1等。
[0112]
如果抗原或抗原组分和佐剂在试剂盒内作为分开的组分呈递，它们在试剂盒内彼此物理分隔，并且这种分隔可以以各种方式实现。例如，组分可在分开的容器，如小瓶中。然后可在需要时混合两个小瓶的内容物，例如通过取出一个小瓶的内容物并将它们添加到另一个小瓶中，或通过分别取出两个小瓶的内容物并在第三个容器中混合它们。
[0113]
在另一种布置中，试剂盒组分之一在注射器中，另一组分在容器，如小瓶中。该注射器可（例如与针头一起）用于将其内容物注入小瓶以供混合，然后可将混合物抽出到注射器中。然后可将注射器的混合内容物给药于患者，通常经由新的无菌针头。将一种组分包装在注射器中使得不需要使用单独注射器向患者给药。
[0114]
在另一种有用的布置中，两种试剂盒组分一起但分开容纳在相同注射器，例如双室注射器中。当推动注射器时（例如在给药于患者的过程中），两个室的内容物混合。这种布置避免了对使用时的单独混合步骤的需要。
[0115]
各种试剂盒组分的内容物可都为液体形式，但在一些实施方案中可能包括干乳剂。
[0116]
疫苗通常通过注射，特别是肌内注射给药。本发明的组合物通常在使用时作为水性乳剂呈递并理想地适用于肌内注射。在本发明的一些实施方案中，该组合物从包装阶段到给药阶段为水性形式。在另一些实施方案中，该组合物的一种或多种组分可以以干燥（例如冻干）形式包装，并可在必要时重构用于实际给药的佐剂。该乳剂因此可如上所述作为冻干饼分配。
[0117]
根据本发明的一个优选方面的一种可能的布置包含在小瓶中的干燥乳剂组分和在预灌装注射器中的抗原或抗原组分和/或水性组分。
[0118]
本发明还提供包含本发明的干燥乳剂和单独的液体抗原或抗原组分的布置。
[0119]
本发明还提供由本发明的乳剂形成的干燥饼。该饼可与单独水相组合提供。该布置可进一步包含抗原或抗原组分，其可为液体或干燥形式。
[0120]
本发明还提供一种干燥混合物，其中所述混合物包含与抗原或抗原组分组合的本发明的乳剂。该混合物优选是冻干混合物。用水性组分重构这种混合物提供本发明的抗原或抗原性组合物。
[0121]
本发明还提供一种用于制备本发明的水包油乳剂的试剂盒，其中所述试剂盒包含干燥形式的本发明的水包油乳剂和液体形式的水相。该试剂盒可包含两个小瓶（一个含有干乳剂，一个含有水相）或其可包含一个已灌装的注射器和一个小瓶，例如注射器的内容物（水性组分）用于在给药于对象前重构小瓶的内容物（干乳剂）。在本发明的另一些实施方案中，将干燥形式的水包油乳剂与也为干燥形式的抗原或抗原组分合并。
[0122]
如果疫苗含有除乳剂和抗原或抗原组分外的组分，则这些另外的组分可根据本发明的实施方案包括在这两个试剂盒组分之一中，或可以是第三个试剂盒组分的一部分。
[0123]
用于本发明的混合疫苗或用于独立的试剂盒组分的合适容器包括小瓶和一次性注射器。这些容器应该无菌。
[0124]
如果组合物/组分位于小瓶中，则小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。优选在将组合物添加到其中之前将小瓶灭菌。为避免对乳胶敏感患者的问题，小瓶优选用无乳胶塞子密封，并且优选在所有包装材料中都不存在乳胶。在一个实施方案中，小瓶具有丁基橡胶塞子。小瓶可包括单剂量的疫苗/组分，或其可包括多于一个剂量（“多剂量”小瓶），例如10剂。在一个实施方案中，小瓶包括10 x 0.25 ml剂量的乳剂。优选小瓶由无色玻璃制成。
[0125]
小瓶可具有盖子（例如luer lock），其适于将预灌装注射器插入该盖子，可将注射器的内容物推入小瓶（例如以重构其中的干燥材料），并可将小瓶的内容物抽回注射器。在将注射器从小瓶中取出后，可随后连接针头并可将组合物给药于患者。盖子优选位于密封材料或覆盖物内，以致必须除去密封材料或覆盖物才能触及盖子。
[0126]
如果将组合物/组分包装到注射器中，该注射器通常不带有附着于其上的针头，尽管可为注射器提供分开的针头以便组装和使用。安全针头是优选的。1英寸23-gauge、1英寸25-gauge和5/8英寸25-gauge针头是典型的。注射器可带有剥离标签，在其上可印刷批号、流感季和内容物的有效日期，以利于保存记录。注射器中的推杆优选具有止挡器以防止推杆在抽吸过程中意外脱出。注射器可具有胶乳橡胶帽和/或推杆。一次性注射器含有单剂量的佐剂或疫苗。注射器通常具有尖帽以在连接针头前密封尖端，并且尖帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选配有丁基橡胶罩。
[0127]
乳剂可在包装到小瓶或注射器中之前用缓冲液稀释。典型缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸盐缓冲液。稀释可在保持它们的相对比例的同时降低佐剂组分的浓度，例如提供“半强度（half-strength）”佐剂。
[0128]
可标记容器以显示半剂量体积，例如以利于递送于儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。
[0129]
如果使用玻璃容器（例如注射器或小瓶），则优选使用由硼硅酸盐玻璃而非由钠钙玻璃制成的容器。
[0130]
使用本发明的方法制成的组合物可药用。它们可包括除乳剂和任选的抗原或抗原组分外的组分。
[0131]
该组合物可包括防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。但是，优选的是，佐剂或疫苗
应该基本不含（即小于5ug/ml）汞制材料，例如不含硫柳汞（banzhoff, 2000；wo02/097072）。不含汞的疫苗和组分更优选。
[0132]
水性抗原或抗原性组合物的ph通常在6.0至9.0之间，更通常在6.0至8.0之间，例如在6.5至7.5之间。本发明的方法因此可包括在包装或干燥前调节佐剂或疫苗的ph的步骤。
[0133]
该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，例如含有每剂《1 eu（内毒素单位，标准量度），优选每剂《0.1 eu。该组合物优选无麸质。
[0134]
该组合物可包括用于单次免疫的材料，或可包括用于多次免疫的材料（即“多剂量”试剂盒）。在多剂量布置中优选包括防腐剂。
[0135]
该组合物可以以各种方式给药。最优选的免疫途径是通过肌内注射（例如注射到手臂或腿中），但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内、口服、皮内、经皮、透皮等。适合肌内注射的组合物最优选。
[0136]
根据本发明制备的佐剂或疫苗可用于治疗儿童和成年人。患者可小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。患者可能是老年人（例如》50岁，优选》65岁）、青少年（例如《5岁）、住院患者、医疗保健工作者、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病患者、免疫缺陷患者和出国旅行的人。疫苗不仅适用于这些群体，也可能在人群中更普遍地使用。
[0137]
本发明的佐剂或疫苗可与其它疫苗基本同时给药于患者（例如在同一次医疗咨询或探访医疗保健专业人员期间）。
[0138]
合适地，本发明的佐剂和疫苗旨在给药于人类。通过肌内之类的途径给药的典型成人剂量为250 ul至1 ml，如400至600 ul，特别是大约500 ul。
[0139]
通则在本说明书通篇，包括权利要求书中，如果上下文允许，术语“包含（comprising）”及其变型如“包含（comprises）”应被解释为包括所述一个要素（例如整数）或多个要素（例如整数）而不一定排除任何其它要素（例如整数）。因此“包含”x的组合物可能仅由x组成或可能包括另外的东西，例如x y。
[0140]
词语“基本”不排除“完全”，例如“基本不含”y的组合物可能完全不含y。如果必要，词语“基本”可从本发明的定义中省略。
[0141]
关于数值x的术语“大约”是任选的并且是指例如x 给定数值的10%，如x 给定数值的5%。
[0142]
除非文中清楚地另行规定，本文所用的单数形式“一”和“该”包括复数对象。
[0143]
除非具体说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求任何具体混合顺序。因此组分可以以任何顺序混合。如果存在三种组分，则两种组分可互相合并，然后可将合并物与第三种组分合并，等等。
[0144]
如果在细胞培养中使用动物材料（特别是牛源性材料），它们应该获自无传染性海绵状脑病（tse），特别是无牛海绵状脑病（bse）的来源。总之，优选在完全不存在动物源性材料的情况下培养细胞。
[0145]
参考下列条款例示本发明：条款1. 包含角鲨烯、生育酚和生物相容的可代谢表面活性剂的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的40% v/v或更多，生育酚为所述组合物的25% v/v或更少，表面活性剂为
所述组合物的60% v/v或更少，所述组合物在与过量体积的基本无表面活性剂的水性材料混合时形成具有200 nm或更小的平均油粒直径的佐剂。
[0146]
条款2. 根据条款1的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的80% v/v或更少。
[0147]
条款3. 根据条款2的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的70% v/v或更少。
[0148]
条款4. 根据条款1至3之一的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的50% v/v或更多。
[0149]
条款5. 根据条款1至4之一的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的55至65% v/v。
[0150]
条款6. 根据条款1至5任一项的组合物，其中生育酚为所述组合物的20% v/v或更少。
[0151]
条款7. 根据条款1至6任一项的组合物，其中生育酚为所述组合物的10% v/v或更多。
[0152]
条款8. 根据条款1至7任一项的组合物，其中表面活性剂为所述组合物的50% v/v或更少。
[0153]
条款9. 根据条款8的组合物，其中表面活性剂为所述组合物的40% v/v或更少。
[0154]
条款10.根据条款9的组合物，其中表面活性剂为所述组合物的30% v/v或更少。
[0155]
条款11.根据条款1至10任一项的组合物，其中表面活性剂为所述组合物的10% v/v或更多。
[0156]
条款12. 根据条款11的组合物，其中表面活性剂为所述组合物的20% v/v或更多。
[0157]
条款13.包含角鲨烯、生育酚和生物相容的可代谢表面活性剂的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的50至70% v/v，生育酚为所述组合物的10至20% v/v且表面活性剂为所述组合物的10至40% v/v。
[0158]
条款14.根据条款13的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的55至65% v/v，生育酚为所述组合物的10至20% v/v且表面活性剂为所述组合物的20至30% v/v。
[0159]
条款15.根据条款13或14的组合物，所述组合物在与过量体积的基本无表面活性剂的水性材料混合时形成具有200 nm或更小的平均油粒直径的佐剂。
[0160]
条款16.制备具有200 nm或更小的平均油粒直径并包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂的方法，所述方法包括：(i) 提供根据条款1至12或15任一项的组合物；(ii) 提供水性组分；(iii) 将所述组合物与过量体积的水性组分合并以形成稀释组合物；和(iv) 混合所述稀释组合物以形成具有200 nm或更小的平均油粒直径的水包油乳剂。
[0161]
条款17.制备包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和水性组分的水包油乳剂佐剂的方法，所述方法包括将根据条款1至15任一项的组合物与过量体积的水性组分混合。
[0162]
条款18.条款16或17的方法，其中所述水性组分包括ph缓冲液。
[0163]
条款19.条款18的方法，其中所述水性组分用6至8的ph缓冲。
[0164]
条款20.条款16至19任一项的方法，其中所述水性组分包含抗原或抗原组分。
[0165]
条款21. 条款16至20任一项的方法，其中所述水性组分包含冻干稳定剂，如多元
醇，例如蔗糖。
[0166]
条款22.条款16至21任一项的方法，其进一步包括将所述水包油乳剂灭菌的步骤，如通过无菌过滤。
[0167]
条款23. 条款16至22任一项的方法，其进一步包括干燥所述水包油乳剂的步骤。
[0168]
条款24. 条款23的方法，其中所述干燥是通过冻干。
[0169]
条款25.通过条款16至22任一项的方法可获得的水包油乳剂佐剂组合物。
[0170]
条款26.通过条款23或24的方法可获得的干燥组合物。
[0171]
条款27.水包油乳剂佐剂组合物，其包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和过量体积的水性组分，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的40% v/v或更多，生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的25% v/v或更少，表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的60% v/v或更少，并且其中所述佐剂具有200 nm或更小的平均油粒直径。
[0172]
条款28. 根据条款27的组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的80% v/v或更少。
[0173]
条款29. 根据条款28的组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的70% v/v或更少。
[0174]
条款30. 根据条款27至29之一的组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的50% v/v或更多。
[0175]
条款31.根据条款27至30之一的组合物，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的55至65% v/v。
[0176]
条款32. 根据条款27至31任一项的组合物，其中生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的20% v/v或更少。
[0177]
条款33. 根据条款27至32任一项的组合物，其中生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10% v/v或更多。
[0178]
条款34.根据条款27至33任一项的组合物，其中表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的50% v/v或更少。
[0179]
条款35. 根据条款34的组合物，其中表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的40% v/v或更少。
[0180]
条款36. 根据条款35的组合物，其中表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的30% v/v或更少。
[0181]
条款37.根据条款27至35任一项的组合物，其中表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10% v/v或更多。
[0182]
条款38. 根据条款37的组合物，其中表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的20% v/v或更多。
[0183]
条款39.水包油乳剂佐剂组合物，其包含角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和过量体积的水性组分，其中角鲨烯为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的50至70% v/v，生育酚为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10至20% v/v，表面活性剂为角鲨烯、生育酚和表面活性剂的总量的10至40% v/v。
[0184]
条款40.根据条款39的组合物，其中角鲨烯为所述组合物的55至65% v/v，生育酚
为所述组合物的10至20% v/v且表面活性剂为所述组合物的20至30% v/v。
[0185]
条款41.根据条款39或40的组合物，其具有200 nm或更小的平均油粒直径。
[0186]
条款42.根据条款27至41任一项的组合物，其包含至少80% v/v的水，如至少85%或至少90%。
[0187]
条款43. 根据条款27至42任一项的组合物，其包含99% v/v或更少的水，如98% v/v或更少的水。
[0188]
条款44.通过条款20或21的方法可获得的疫苗组合物。
[0189]
条款45.疫苗组合物，其包含根据条款27至43任一项的水包油乳剂和抗原或抗原组分。
[0190]
条款46.根据条款1至45任一项的组合物或方法，其中所述佐剂的平均油粒直径为50 nm或更大。
[0191]
条款47. 根据条款46的组合物或方法，其中所述佐剂的平均油粒直径为100 nm或更大。
[0192]
条款48.根据条款47的组合物或方法，其中所述佐剂的平均油粒直径为125 nm或更大。
[0193]
条款49.根据条款1至48任一项的组合物或方法，其中所述佐剂的平均油粒直径为175 nm或更小。
[0194]
条款50.根据条款1至49任一项的组合物或方法，其中所述佐剂的多分散指数为0.5或更小。
[0195]
条款51.根据条款50的组合物或方法，其中所述佐剂的多分散指数为0.3或更小。
[0196]
条款52.根据条款51的组合物或方法，其中所述佐剂的多分散指数为0.2或更小。
[0197]
条款53.根据条款1至52任一项的组合物或方法，其中所述生育酚是α-生育酚。
[0198]
条款54.根据条款1至53任一项的组合物或方法，其中所述表面活性剂组分包含两种或更多种表面活性剂。
[0199]
条款55.根据条款1至54任一项的组合物或方法，其中所述表面活性剂组分基本由两种表面活性剂组成（如由两种表面活性剂组成）。
[0200]
条款56. 根据条款1至54任一项的组合物或方法，其中所述表面活性剂组分基本由一种表面活性剂组成（如由一种表面活性剂组成）。
[0201]
条款57.根据条款1至56任一项的组合物或方法，其中所述表面活性剂组分具有10至18，如12至17，尤其是13至16的hlb。
[0202]
条款58. 根据条款1至57任一项的组合物或方法，其中所述表面活性剂包含聚山梨酯、失水山梨糖醇酯、泊洛沙姆和/或α-生育酚peg糖酯。
[0203]
条款59.根据条款58的组合物或方法，其中所述表面活性剂包含聚山梨酯20、聚山梨酯80、失水山梨糖醇三油酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和/或tpgs。
[0204]
条款60.根据条款59的组合物或方法，其中所述表面活性剂包含聚山梨酯80。
[0205]
条款61.根据条款1至15、26或46至60任一项的组合物，其基本由角鲨烯、生育酚和生物相容的可代谢表面活性剂组成。
[0206]
条款62.根据条款25、27至43或46至60任一项的组合物，其基本由角鲨烯、生育酚、
生物相容的可代谢表面活性剂和水组成。
[0207]
条款63.根据条款44至60任一项的疫苗组合物，其基本由角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂、水和抗原或抗原组分组成。
[0208]
条款64. 根据条款26的干燥疫苗组合物，其基本由角鲨烯、生育酚、生物相容的可代谢表面活性剂和抗原或抗原组分组成。
[0209]
条款65.疫苗试剂盒，其包含：(i) 抗原或抗原组分；水性组分和根据条款1至15、26、46至61任一项的组合物；(ii) 抗原或抗原组分；和根据条款25、27至43、46至60或62任一项的水包油乳剂佐剂组合物；(iii) 水性组分和根据条款1至15、26、46至61任一项的组合物，其中所述水性组分和所述组合物的任一个或两者包含抗原或抗原组分；或(iv) 水性组分和根据条款26或64的干燥疫苗组合物。
[0210]
条款66. 根据条款1至65任一项的组合物、方法或试剂盒，其中所述抗原或抗原组分衍生自（如获自）人类或非人类病原体，包括例如感染人类和非人类脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或衍生自（如获自）癌细胞或肿瘤细胞。
[0211]
条款67.根据条款66的组合物、方法或试剂盒，其中所述抗原或抗原组分衍生自流感。
[0212]
条款68. 根据条款66的组合物、方法或试剂盒，其中所述抗原或抗原组分衍生自cmv。
实施例
[0213]
实施例1
ꢀ‑ꢀ
水包油乳剂的形成和平均粒度的测量研究角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的各种比例的混合物在与水混合时自发形成小液滴乳剂的能力。
[0214]
方法乳剂制备将具有表1中列出的百分比组成的适当比例的角鲨烯、d/l-α-生育酚和聚山梨酯80在室温下搅拌整夜。
[0215]
将dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（dpbs）调节到ph 6.65-6.95。然后将dpbs升温到大约35-40℃，之后加入油相（dpbs:油9:1 v/v比率）。混合物在大约40℃保持大约1小时，定期倒转容器。
[0216]
粒度测量乳剂通常稀释100x（990ul水 10ul乳剂），然后进一步稀释5倍（400ul水 100x稀释乳剂）以获得500x稀释。使用malvern zetasizer测量粒度。如果每秒观察到的kilo counts太低，可视需要调整稀释。
[0217]
结果结果显示在表1中。初始混合物中较低量的生育酚（10-15% v/v）导致小于200 nm或更小的乳剂液滴粒度和0.3或更小的pdi。通常，具有较高生育酚含量的乳剂和具有类似于as03的组成的乳剂表现出高液滴粒度和pdi值。
[0218]
具有提高的表面活性剂含量的乳剂组合物表现出降低的粒度和较低的pdi。可通过提高角鲨烯浓度和降低表面活性剂浓度来实现提高的粒度和较低pdi。
[0219]
多次制备许多制剂，在批次之间没有观察到粒度或pdi的显著差异，证实这种方法的稳健性（robustness）。
[0220]
数据与粒度和多分散指数（pdi）的等值线图一起绘制在图1和2中。使用jmp12软件使用拟合模型制备等值线图。
[0221]
表1
ꢀ–ꢀ
含生育酚的水包油乳剂组合物和粒度/pdi
[0222]
实施例2
ꢀ–
其它表面活性剂的测试研究替代性的表面活性剂的使用以确定对粒度和pdi的影响。
[0223]
方法通过与实施例1中的那些类似的方法制备包含替代性表面活性剂组分的另外的制剂。提出一系列表面活性剂，具有不同hlb值（表2）。
[0224]
表2
ꢀ–ꢀ
所用表面活性剂和相关hlb值表面活性剂hlbtween80/聚山梨酯8015
tween20/聚山梨酯2016.7span851.8span804.3span208.6tpgs13-13.2泊洛沙姆18829泊洛沙姆40722
[0225]
结果表3
ꢀ–ꢀ
另外的含生育酚的水包油乳剂组合物和粒度/pdi
*对于制剂36和所有制剂a-c，%表面活性剂b是除了100%的角鲨烯、生育酚和表面活性剂a之外的。对于制剂d-f，表面活性剂b包括在总共100%的角鲨烯、生育酚、表面活性剂a和表面活性剂b中。
[0226]
表3中的结果证实可使用一系列表面活性剂，同时仍保持自发形成具有小粒度和良好多分散性的乳剂的能力。
[0227]
实施例3
ꢀ‑ꢀ
体内测试水包油乳剂作为佐剂的潜在用途在小鼠体内测试来自实施例1和2的水包油乳剂，以证实它们作为疫苗佐剂的用途。用四价h1n1 a/singapore、a/hong kong (h3n2)、b/phuket和b/brisbane流感疫苗（qiv）以0.01 ug（总共0.04 ug）和0.1 ug（总共0.4 ug）剂量进行两个研究（表4）。也用无佐剂给药的抗原或与已知乳剂佐剂as03或sea160一起给药的抗原进行对照实验。
[0228]
进行igg亚型elisa以评价总体体液应答。分析t细胞活化、t细胞分化成cd4 和cd8
群体和由活化的t细胞生成细胞因子以测定细胞应答。
[0229]
方法对于体内研究，来自实施例1和2的浓缩乳剂使用0.22um pes膜无菌过滤。
[0230]
浓缩乳剂用等体积的水性抗原稀释以提供最终含乳剂佐剂的疫苗制剂。通过浓缩乳剂的初始10倍稀释制备分数乳剂剂量（fractional emulsion doses），然后用等体积的水性抗原稀释以提供最终分数含乳剂佐剂的疫苗制剂（final fractional emulsion adjuvanted vaccine formulations）。
[0231]
表4
ꢀ–ꢀ
用qiv抗原在0.01 ug剂量下的研究设计组处理a0.01qivb0.01ugqiv 制剂36c0.01ugqiv 制剂22d0.01ugqiv 1/10
th
制剂36e0.01ugqiv 1/10
th
制剂22f0.01ugqiv as03g0.01ugqiv 1/10
th
as03h0.1ugqiv sea160i0.1qivj0.1ugqiv 制剂36k0.1ugqiv 制剂22l0.1qivug 1/10
th
制剂36m0.1qivug 1/10
th
制剂22n0.1ugqiv as03o0.1ugqiv 1/10
th
as03p0.1ugqiv sea160
[0232]
表5
ꢀ–ꢀ
佐剂的研究时间轴
天程序1首次免疫223pw1采血ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二次免疫362wp2尾部采血和从每组5只动物获取脾脏433wp2尾部采血和从其余动物获取脾脏
[0233]
每条腿肌内给予制剂25ul（每只动物总共50 ul）。在各试验组中使用8只雌性6-8周龄balb/c小鼠。
[0234]
hai检测法当获自用分裂抗原（split antigen）免疫的小鼠的血清中的抗体结合到病毒/病毒粒子上以抑制红细胞凝集时，发生血凝抑制（hi或hai）。将获自小鼠的连续稀释液铺板，并用等于8ha单位（获自进行的ha滴度）的固定量的分裂抗原孵育。在孵育后，加入来自鸡的红血球并将样品孵育另外30分钟以读板。防止血细胞凝集的血清最高稀释度被称为血清的hi滴度。如果血清不含反应的抗体，则在所有孔中观察到血细胞凝集。同样地，如果存在对病毒的抗体，直到抗体充分稀释才观察到血细胞凝集。ha滴度被定义为其中病毒/病毒粒子造成红细胞凝集的最后一个孔的稀释度的倒数。
[0235]
igg亚型elisa来自qiv中的所有菌株的分裂抗原与4个不同批次的magplex微球（浓度为1*106个珠粒/ml）偶联。使用每个反应5 ug抗原以与magplex珠粒偶联并在旋转混匀仪（nutator）上摇动1小时并储存在4℃直至使用。血清在96孔平底板中在检测缓冲液中5倍连续稀释。进行初步检测以测定对不同抗原的稀释度范围和起始稀释度。对于无佐剂组和稀释佐剂组，起始稀释度为1:20，而对于其它组，起始稀释度为1:50。从4℃取出抗原偶联微球并在旋转混匀仪（nutator）上在室温下平衡并在检测缓冲液中稀释，然后将50 ul添加到板中。在摇床上孵育板1小时并用检测缓冲液洗涤后加入二抗。板在室温下孵育另外1小时，洗涤，将珠粒再悬浮在检测缓冲液中，然后在flexmap 3d机器上分析。
[0236]
终点滴度以5000的值计算。外推与5000的终点滴度对应的稀释因数，并由此计算对该组中的每只动物的滴度。在graphpad prism中使用单因素方差分析（one-way anova）进一步分析终点滴度并使用多重比较的tukey氏检验将各列的平均值与其它各列的平均值比较。
[0237]
ics染色每组动物获取5个脾脏以在含有10% fbs的rpmi培养基中进行ics检测。获取来自各只动物的脾脏并经70um过滤器过滤。一经匀浆，加入rbc裂解缓冲液以滤出脾细胞悬液中的任何rbcs。这些细胞悬液经70微米细胞过滤器（bd biosciences，目录号#352350）过滤。细胞在1200 rpm下离心5分钟。将团块（pellet）再悬浮到rpmi中并再离心。将新团块再悬浮在rpmi中。这些细胞悬液使用chemometec的nucleocounter nc-3000计数。在各管中适当稀释脾细胞后，在圆底96孔板中铺板每孔大约2,000,000个细胞。所有孔接收anti cd28单克隆抗体(mab)（bd biosciences #553294）以提供t细胞活化所需的共刺激信号。对各组施加6种不同类型的处理：
·
无刺激（使用pbs）: 阴性对照以确定基线应答
·
用anti-cd3 mab（bd biosciences #553057）刺激: 理想地表现出最大应答的阳性组
·
a/singapore分裂抗原2.5
ꢀµ
g/ml蛋白质（用于免疫的蛋白质）
·
来自protein biosciences的用于a/hongkong的重组ha蛋白质（rha） @2.5
ꢀµ
g/ml
·
用于b/brisbane的rha @2.5
ꢀµ
g/ml
·
用于b/phuket的rha @2.5
ꢀµ
g/ml细胞在37℃下用bfa孵育整夜并在第二天使用cytofix/cytoperm固定，然后利用染色以确定cd4 t细胞应答。在各孔中的这种混合物（cocktail）中加入cd 107a以将造粒t细胞染色。使用补偿控制以补偿来自与上述表面和细胞内抗体结合的荧光染料的信号重叠。
[0238]
使用flowjo软件分析由lsrii获得的数据并应用特异性设门策略（specific gating strategy）以获得特异性cd4 、cd8 t细胞应答和细胞因子阳性t细胞应答。
[0239]
以下细胞因子组合用于boolean设门（gating）：th1: 仅产生ifnγ的t细胞th2: 仅产生il4 il13 的t细胞
th17: 仅产生il17a和/或il17f的t细胞th0: 对所有其它细胞因子为阴性的产生tnfα和/或il-2的t细胞。
[0240]
统计分析单因素方差分析，接着tukey氏检验。
[0241]
结果结果呈现在图3（在首次免疫后3周）和图4（在二次免疫后3周）中。
[0242]
所有佐剂小鼠表现出比无佐剂组高的hai滴度，证实该新型乳剂佐剂的佐剂活性。通常，在所有四种抗原中，as03、制剂22和制剂36表现出显著非劣质应答。其例外是b/brisbane，其中as03表现出明显高于制剂36和sea160的滴度。1/10
th
稀释佐剂组表现出比全剂量佐剂低的应答，但差异不显著。另外，制剂22和36表现出与sea160（不含生育酚的制剂）类似的应答。在2wp2后，无佐剂剂量组保持与全剂量佐剂组相比明显较低的应答。其它佐剂组内的趋势保持类似。
[0243]
igg亚型elisa对于igg1和igg2a亚型滴度，所有佐剂组表现出比无佐剂组高的滴度（图5和6）。在所有四种抗原中，制剂36、22和as03表现出显著非劣质应答。对igg2a和igg2b滴度在组之间没有观察到明显趋势。对于igg2b亚型滴度（图7），结果类似于对hai滴度观察到的那些（参见实施例3和图2和4）。这表明hai抗体可能具有igg2b亚型。
[0244]
ics染色结果呈现在图8和9中。用a/singapore的分裂抗原再刺激的脾细胞表现出总体上比使用rha的其它菌株更高的t细胞应答。cd8 t细胞频率在所有抗原中整体低（数据未显示）。总体上，cd4 t细胞频率在两个qiv剂量下都在佐剂组中保持比无佐剂组高。th0和th2应答高于th1和th17。观察到的结果与上文之前呈现的ha数据互相印证。
[0245]
实施例4
ꢀ–
无菌过滤性制备制剂22、36、44和45并经0.22 um聚醚磺酸盐（pes）过滤器过滤。在3ml注射器中抽取1 ml乳剂并经33mm、0.22um pes注射器式过滤器过滤到小瓶中。使用uplc-pda测试乳剂的粒度、pdi和角鲨烯和生育酚的含量百分比。
[0246]
方法如实施例1和2中所述制备制剂22、36、44和45。使用超高压液相色谱法（uplc）测定乳化后的乳剂中的角鲨烯和生育酚的含量百分比。使用来自waters
®
的xterra c18柱。流动相是95:5甲醇: 乙腈。运行时间为在1ml/min流速下15分钟。柱在洗脱过程中在37℃下加热并使用pda检测器记录洗脱峰。生育酚的保留时间为4.4分钟且角鲨烯的保留时间为7.5分钟。在每次运行前用600 ug/ml至2.34 ug/ml的浓度运行角鲨烯和生育酚混合物的标准曲线。使用来自这一标准曲线的斜率和截距，测定乳剂样品中的角鲨烯和生育酚的浓度。
[0247]
结果结果显示在表6和图10和11中。制剂22和36的多分散性在过滤后提高，表现出双峰粒度分布，伴随着过滤后的油含量的显著损失。这些乳剂的无菌过滤导致提高到所需阈值外的粒度和pdi。制剂44在过滤后保持其粒度和pdi；制剂45表现出粒度和pdi的提高。uplc-pda显示与制剂22和36相比含量的最小损失（表6）。制剂44在过滤后保持其粒度和pdi，同时表现出油含量的最小损失。
[0248]
表6
ꢀ–ꢀ
在过滤前和过滤后的粒度和pdi和在过滤后的含量损失
[0249]
实施例5
ꢀ–
在升高的温度下的制剂乳剂稳定性的比较经4周的时段评价制剂22、36和44在三个温度点（5℃、25℃和50℃）的稳定性。测量乳剂的ph、重量摩尔渗透压浓度、粒度和pdi。
[0250]
方法使用thermo's orion ph计测量ph。使用model 2020渗透压计测量重量摩尔渗透压浓度，使用malvern's zetasizer测量粒度并使用uplc-pda测量%含量。
[0251]
测量ph、重量摩尔渗透压浓度、粒度和pdi最多10周。
[0252]
结果结果呈现在图12和13中。所有三种乳剂的ph和重量摩尔渗透压浓度的变化通常有限。在50℃下对所有乳剂观察到ph的降低。制剂44的液滴尺寸和pdi在所有温度点保持一致，而制剂22和36的pdi随时间波动。结果表明制剂44是可无菌过滤而不显著改变乳剂的任何物理化学性质的稳定的自乳化制剂。
[0253]
实施例6
ꢀ–
使用cmv抗原体内评估制剂44 与mf59、as03和sea160相比的效能在体内研究中用巨细胞病毒（cmv）五聚体抗原（
‘
penta’）测试制剂44。
[0254]
方法研究设计如表7和8中所示。以三周为间隔进行三次肌内免疫接种。动物在3wp1、3wp2和3wp3采血。一半的动物在3wp3处死，其余在4wp3处死。对于这两个时间点，都获取脾脏并进行cmv中和抗体滴度检测。
[0255]
浓缩乳剂用等体积的水性抗原稀释以提供最终含乳剂佐剂的疫苗制剂。通过浓缩乳剂的初始10倍稀释制备分数乳剂剂量（fractional emulsion doses），然后用等体积的水性抗原稀释以提供最终分数含佐剂的疫苗制剂（final fractional adjuvanted vaccine formulations）。
[0256]
表7
ꢀ–ꢀ
penta抗原在0.05ug剂量下的研究设计组处理动物数a生理盐水(阴性对照)10b无佐剂penta10c0.05ugpenta 制剂4410d0.05ugpenta as0310
scientific lyostar3上冻干。
[0264]
实施例7a
ꢀ–ꢀ
冻干组合物的初始优化将100 ul制剂44、200 ul稀释剂（10% w/v蔗糖溶液）和100 ul抗原（如果存在，ova在dpbs中）或仅dpbs缓冲液（如果不存在抗原）灌装在3ml小瓶中，以使各自含有400ul灌装体积，含或不含抗原。
[0265]
小瓶在周期开始时在5℃下平衡，然后在托盘中冷冻至-5℃以确保标准冻结饼。然后将小瓶在低于崩塌温度（collapse temperature）和tg’下进一步冷冻至-45℃并保持2小时，然后抽真空并在-35℃下（低于tg’和崩塌温度）干燥制剂直至完成冰从制剂中升华。此后，开始二次干燥，其涉及通过除去该饼中的所有残留冰/水来干燥产物。
[0266]
所用冻干周期概括在表11中。
[0267]
表11
ꢀ–ꢀ
冻干周期
[0268]
冻干饼（lyo cake）用200 ul水重构，以获得抗原和佐剂的1:1当量混合物，或在仅佐剂的情况下，稀释到最终佐剂浓度。在重构后测量ph、重量摩尔渗透压浓度、粒度和pdi以测定稳定性。运行protein bis-tris gels以确保抗原完整性。
[0269]
表12
ꢀ–ꢀ
冻干制剂组分抗原或缓冲液浓缩佐剂冻干保护剂总灌装体积重构体积100ul100ul200ul400ul200ul
[0270]
由于稀释剂中的蔗糖以及其它组分中的缓冲液的存在，观察到这些重构制剂的重量摩尔渗透压浓度极高（表13）。
[0271]
表13
ꢀ–ꢀ
se-as 44的初始冻干
通过dls (orr, 2014)观察到轻微的粒度（20-25 nm）和pdi（0.025-0.05单位）提高。
[0272]
实施例7b
ꢀ–ꢀ
与cmy penta抗原一起冻干制剂44然后与作为模型抗原的cmv五聚体（2ug/ml储备抗原溶液）一起在单瓶中使用lyostar3冻干机冻干。通过用10mm磷酸钾缓冲液（代替dpbs）配制抗原和乳剂以除去盐组分并在重构时获得适当的等张性，优化用于冻干的组合物。将二次干燥温度降低到25℃以使该周期对热敏抗原更稳键。
[0273]
制剂44在10mm磷酸钾缓冲液中（被称为制剂44b）的冻干结果显示在表14和图17中。
[0274]
表14
ꢀ–ꢀ
优化的se-as 44冻干在冻干之前和之后，重量摩尔渗透压浓度保持大致相同。结果表明在冻干后的重构后，乳剂粒度和多分散性少量提高。
[0275]
由于在冻干过程中ph没有降低，蛋白质受到保护并且没有发生剪切（clipping）。配制的cmv五聚体在冻干后保持其完整性（图18）。作为比较，显示储备cmv五聚体溶液
100ug/ml、2ug/ml和1ug/ml。
[0276]
实施例8
ꢀ–
冻干制剂44的效能的体内评估在体内研究中用巨细胞病毒（cmv）五聚体抗原（
‘
penta’）测试根据实施例7b制备的冻干制剂44。
[0277]
方法研究设计如表15和16中所示。以三周为间隔进行三次肌内免疫接种。动物在3wp1、3wp2和3wp3采血。一半的动物在3wp3处死，其余在4wp3处死。
[0278]
浓缩乳剂用等体积的水性抗原稀释以提供最终含乳剂佐剂的疫苗制剂。
[0279]
表15
ꢀ–ꢀ
penta抗原在0.05ug剂量下的研究设计组处理动物数a无佐剂penta13b0.05ugpenta 制剂4413c0.05ugpenta as0313d0.05ugpenta 制剂44（冻干的）13
[0280]
表16
ꢀ–ꢀ
研究的时间轴
天程序1首次免疫223pw1采血ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ二次免疫433pw2采血ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ三次免疫643wp3采血ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ尾部采血和从每组7只动物获取脾脏71尾部采血和从其余动物获取脾脏
[0281]
肌内给予制剂（每次免疫接种50 ul，交替四头肌）。在各试验组中使用13只雌性6-8周龄c57bl/6小鼠。
[0282]
基本如实施例6中所述进行cmv中和抗体检测。
[0283]
cmv igg检测在3wp2和3wp3获自各动物的血清中测定抗体滴度。为了测定cmv五聚体特异性结合igg抗体滴度，使用夹心elisa。使用96孔nunc-immuno maxisorp f96板在4℃下涂布每孔100 ul 1 ug/ml cmv五聚体抗原整夜。抗原涂布板用1x磷酸盐缓冲盐水(pbs) & 0.05% w/v tween20洗涤并用在pbs中的1% w/v牛血清白蛋白（bsa）溶液封闭。在板的第一行中加入来自免疫动物的血清以使孔a1接收阳性对照，孔a12接收样品缓冲液作为阴性对照。将血清预稀释，然后将10 ul添加到第1行中。从第a行至第h行沿板向下进行连续稀释。将血清孵育1小时，然后洗板并加入来自jackson immunoresearch（west grove, pa）的辣根过氧化物酶（hrp）缀合的山羊抗小鼠igg以在室温下另外孵育1小时。在再次洗板后快速加入底物，持续15分钟，然后立即加入终止液。使用来自perkin elmer (waltham, ma)的envision 2105 multimode读板器读板。在获自读板器的50%插值光学密度（od）值下计算滴度。
[0284]
ics4wp3通过体外抗原刺激脾细胞的胞内细胞因子染色分析t细胞应答。将来自各动物的脾脏加工成单细胞悬液，然后用rbc裂解缓冲液（ebioscience, thermo fisher waltham, ma）处理。来自genescript的cmv五聚体肽gh、gl、ul128、ul130和ul131用于刺激脾细胞。这些脾细胞以每孔1百万个细胞的密度用来自bd biosciences (san jose ca)的用作阳性对照的anti-cd3刺激，使用培养基作为阴性对照，并为抗原刺激条件准备肽池。将
来自bd biosciences的抗cd28抗体作为共刺激剂（co-stimulant）添加到各孔中并在刺激后2小时以1 ug/ml浓度加入来自bd biosciences的布雷菲德菌素a (brefeldin a，bfa)以阻断细胞因子分泌。将细胞刺激整夜并用live/dead试剂（near ir, ex 633/em 750）染色。在使用cytofix/cytoperm试剂固定和渗透细胞之前，加入fc block以避免细胞外非特异性结合，然后使用来自bd biosciences的与bv510缀合的cd62l和与bv421缀合的cd127进行记忆标记染色（memory marker staining）。再次加入fc block以避免细胞内非特异性结合，然后用来自biolegend (san diego, ca)的与bv711缀合的cd3、与af647缀合的il-17f，来自bd biosciences的与buv395缀合的cd4、与bb700缀合的cd8、与pefc594缀合的cd44、与apcr700缀合的白细胞介素2 (il-2)、与bv786缀合的干扰素γ (ifn-γ)、与bv650缀合的组织坏死因子α (tnf-α)、与bv421缀合的il-17a和获自thermo fisher scientific (waltham, ma)的与af488缀合的il-13和il-4单步染色。由于所用的大多数抗小鼠抗体源自大鼠或仓鼠的抗大鼠抗仓鼠ig，来自bd biosciences的κ/阴性对照补偿粒子用所有上述荧光染料缀合的抗体染色，包括未染色的对照物，以制备补偿对照（compensation controls）。在来自bd biosciences (san jose, ca)的bd fortessax20 sorp流式细胞仪上获取样品，然后用flowjo软件（ashland, or）分析。
[0285]
统计学使用graphpad prism软件（san diego, ca）分析和绘制来自体内免疫应答的数据。对于体液应答，使用单因素方差分析，接着多重比较的tukey氏检验进行分析。通过在单因素方差分析后运行dunnett氏检验，测试与as03相比hai滴度的非劣效性。对于ics，运行非参数kruskal-wallis检验，接着dunn氏多重比较检验以在不同给药组内进行比较。
[0286]
结果结果呈现在图19、20和21中。
[0287]
在制剂44的液体或冻干制品和重构制品的中和抗体滴度或igg抗体滴度之间没有观察到显著差异。另外，这两种制剂都比得上as03。
[0288]
ics显示优势th0/th2应答。冻干疫苗没有表现出与液体疫苗或与as03的显著差异。
[0289]
参考文献banzhoff immunology letters 2000 71:91-96chandramouli等人sci. immunol. 2017 2 eaan1457fox molecules 2009 14:3286-3312franchini等人poult sci. 1991 70(8):1709-1715franchini等人poult sci. 1995 74(4):666-671gar
ç
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