食品生产和加工的污水以及废弃物的修复
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年3月27日提交的美国临时专利申请第62/824,382号的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
背景技术：
3.以工业规模生产和加工食品会产生数百万吨废弃物，废弃物如果未经处理就分散到环境中，那么其可能会是危害人类健康以及污染空气和水的源头。脂肪、油和油脂(fog)、动物尸体边角料、植物纤维和其它固体或形成固体的物质只是肉类、家禽、海鲜、乳品和一些植物基食品加工过程中留下来的废弃物类型中的一些。许多这些废料储存于会散发臭味和污染性温室气体的污水贮留池或大型池塘中。一些食品废弃物被释放到下水道和排水管中，食品废弃物在下水道和排水管里积聚并造成堵塞，以及被释放到水道中，食品废弃物在水道里耗尽水中的含氧量并促使藻类大量繁殖。
4.已经尝试使用与市政废水处理中使用的废水处理方法类似的废水处理方法来处理食品加工废料。一般来说，“废水”是来自家庭、市政、工业、商业或农业活动、地表径流或暴雨雨水以及任何下水道流入物或下水道渗透物的任何组合的使用过的水。废水处理涉及从废水中去除固体材料、杂质和污染物的多个过程，包括机械、化学和/或生物过程；然而，许多这些过程效率低下，从而难以跟上食品废料生产的高速率。
5.包括例如牛肉、家禽、猪肉和其它牲畜加工的肉类加工以及难以修复的废污水可能是特别大的污染源。在加工之前，在畜栏或箱中饲养活动物，活动物在那里会释放自己的代谢废料和粪便。除了在清洁期间从动物身上洗掉的任何油、头发、羽毛和污垢之外，这些废料最终会作为径流进入废水和地下水。
6.一旦动物被屠宰，它们就可能会被脱毛/脱羽毛、放血、剖腹和清洗，从而进一步将这些材料添加到废水流中。尸体可能会被切割、修剪和去骨，其中组织和骨头的碎片会掉到地板上被冲走。毛皮的进一步固化和清洗会将盐分添加到废水中。
7.海鲜加工还会产生大量污染性污水，污染性污水包含大量油脂fog，部分原因在于某些海鲜的脂肪含量天然地较高。鱼可能会被清洗、灭菌、切除内脏、去头、去鳍、去骨、去鳞、去皮或以其它方式加工，从而导致废水中有固体颗粒和脂肪。鱼例如金枪鱼可能会被进一步烹煮(例如，通过蒸)和罐装，从而产生来自蒸冷凝物以及罐头填充过程中使用的酱汁、盐水和油的油性废料。
8.乳品加工连同肉类和海鲜加工是污染性污水的主要来源。在乳品的情况下，生奶被转化为巴氏杀菌奶和酸腐牛奶、酸奶、硬奶酪、软奶酪和茅屋奶酪、奶油和黄油产品、冰淇淋、奶粉、乳糖、炼乳、开菲尔(keifer)和甜点产品。在生产奶酪和酸奶的情况下，例如乳清副产品(包括酸乳清)可能会对水生生态系统特别不利。当主要含有蛋白质和肽的酸乳清进入溪流或其它水道时，其会耗尽水中溶解的氧气含量，并且其高营养物含量会导致藻类大量繁殖。这些条件使本地鱼类几乎不可能存活。
9.动物基食品的生产和加工并不是食品废料污染和废水的唯一来源。植物基油例如
棕榈油的生产是水污染的主要来源。棕榈油厂污水(pome)或碾磨棕榈油过程中的灭菌和澄清过程产生的液体废料含有90％-95％水，并且剩余部分包含残油、土壤颗粒和悬浮固体。由于pome有高生物需氧量(bod)、低ph和胶体性质，所以其可能会具有高度污染性并且难以修复。
10.此外，萃取后的棕榈果实被保存在大型污水贮留池中，大型污水贮留池由于生活在地表以下的产甲烷微生物的活动而冒泡并散发出强烈气味。污水贮留池通常被用作用于分解大量有机物的低成本方法；然而，与棕榈油的情况一样，有机物通常会被转化为温室气体，温室气体包括二氧化碳和甲烷。
11.除了污水贮留池以外，其它形式的食品废料处理利用厌氧微生物。举例来说，在机械筛选出较大的固体材料之后，通常使用厌氧消化池来消化剩余的固体物质(污泥)并分离出液体(水)。在厌氧消化池中，一群微生物体在缺氧的情况下共同代谢或分解可生物降解的材料—可能花费长达45天的过程。由于微生物体利用废水组分来满足其对应的营养需求，因此其会在所述过程中产生有益于废水处理以及其它有益微生物体的代谢需求的其它化学物质。目标在于让这些生物体共同作用以分解化学和生物污水。
12.所述过程从废水的污泥部分的细菌水解开始，所述污泥部分通常含有不溶性复杂有机物质例如fog。不溶性物质被转化为可溶性分子例如脂肪酸、氨基酸和糖。然后，产酸细菌将这些化合物转化为二氧化碳、氢气、氨和有机酸例如乙酸、丁酸、丙酸以及乙醇。接着，产甲烷菌将例如乙酸转化为甲烷和二氧化碳。然后，剩余的难消化组分例如木质素和非有机成分被转移用于进一步处理或以其它方式重新使用。
13.酶和表面活性剂也可以用于修复食品加工废料。酶主要用于攻击或降解有机化合物，而表面活性剂用于将降解的颗粒分散于水相中。然而，已经发现这些组合物中的一些是不稳定的并且产生在一种类型的废料到另一种类型的废料之间不同的结果，从而未能解决含有大量各种其它fog或结垢物质的废料所呈现的问题。
14.微生物与废水和其它微生物体的相互作用可以非常有效地处理废水。因此，需要更通用、更有力并且对环境友好的微生物基方法来处理食品生产和加工废弃物例如肉类、海鲜、乳品和植物油加工厂排放的废弃物。
技术实现要素：
15.在一个实施例中，本发明提供了用于修复食品生产和加工污水和废弃物的改良方法。更具体地，本发明提供了从废水或其它水体中去除因食品加工产生的杂质、污染物或废料物质的方法。本发明还提供了生产微生物体和/或其生长副产物以用于处理食品加工废料的系统和方法。有利地，本发明的方法是对环境友好的、操作友好的和成本高效的。
16.本发明提供了用于改进食品加工废料处理的方法，特别地，用于生物强化生物废水处理方法。
17.食品加工废弃物的处理或修复可以包含从废水中消化、纯化、净化和/或去除废料物质。废水可以来自例如肉类、家禽或海鲜加工厂、乳品场或用于碾磨、处理、萃取和/或精炼植物基油的场所。举例来说，废水可以含有有机废料物质例如动物粪便、血液、尿液和/或胃内容物、尸体残余物、烹饪残留物、脂肪、油和油脂(fog)、乳清、不溶性多糖和其它杂质例如来自加工厂清洁的悬浮固体、病原体和残留物。
18.在一个实施例中，所述方法包含从存在于厌氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料物质的另一种水体中的废水采取样品，其中所述样品包含食品加工废料物质。在一些实施例中，废水已经被预处理以去除大固体，例如通过使其穿过筛子、筛网或过滤器来去除。
19.所述方法可以进一步包含分析样品以鉴别所存在的废料物质的类型。基于所鉴别的废料物质的类型，生产定制微生物混合物，其中混合物包含最适用于消化、纯化、净化和/或去除所鉴别的废料物质的有益微生物体的混合物。
20.在一些实施例中，本发明的方法可以利用存在于厌氧消化池、污水贮留池或水体中的本地微生物体。在一些实施例中，所述方法可以利用起初不存在于消化池、污水贮留池或水体中的补充性微生物体。
21.在某些优选实施例中，所述方法利用兼性厌氧细菌。微生物混合物可以包含例如不同的芽孢杆菌属(bacillus spp.)微生物，例如芽孢杆菌属细菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、侧孢芽孢杆菌(bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。在一些实施例中，微生物可以是假单胞菌属(pseudomonas spp.)细菌，例如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、鼻疽假单胞菌(pseudomonas mallei)、类鼻疽假单胞菌(pseudomonas pseudomallei)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、产碱假单胞菌(pseudomonas alcaligenes)、门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina)和斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)。有利地，在存在有机废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于有机物分解的其它生长副产物。
22.根据本发明的方法的微生物混合物可以包含微生物体本身以及微生物生长副产物和微生物培养产生的任何残留生长培养基。混合物可以进一步包含用于微生物生长的附加营养物。
23.微生物可以呈营养细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或其组合的形式。在某些实施例中，微生物是使用深层发酵、固态发酵(ssf)或其组合和/或改良型式产生的。在优选实施例中，发酵是使用改良的固态发酵系统执行的。
24.在某些实施例中，将微生物生物强化混合物引入废水中，例如通过将混合物倒入废水中并在其中将其混合。此后，混合物中的微生物在废水内生长和/或萌发，产生代谢物以从其中去除杂质、污染物和/或废料物质。在一些实施例中，萌发增强剂可以与微生物混合物一起施用，特别是在微生物以孢子形式施用的情况下。在一些实施例中，所述过程被加热以更进一步提高去除速率。
25.在某些实施例中，废水样品进一步包含微生物群落。在一个实施例中，样品包含厌氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料的其它水体内的整个微生物群落的代表。
26.在一些实施例中，分析微生物群落以确定存在于微生物群落内的微生物物种的身份，并确定每个物种相对于微生物群落的其它物种的群体百分比。分析可以包含所属领域中的标准方法，例如dna测序、dna指纹鉴定、elisa和细胞涂铺。
27.然后，可以将存在于微生物群落中的微生物物种分类为对废料处理过程有益的、与其共生的或对其有害的。在一些实施例中，分析样品的目的在于判定微生物群落是否处于“失调”。根据本发明，“失调”意思指共生和/或有害微生物体、或包含相对于有益微生物体数量而言更高百分比的共生和/或有害微生物体的微生物群落的过度生长。
28.处于失调的废水处理场所的效率低于包含较少共生和/或有害微生物体的废水处理场所，这意味着处理速率较慢。
29.共生和/或有害微生物体百分比是总群体的至少25％被认为是失调的。在一些实施例中，与有益微生物体相比，失调微生物群落可以具有更多或大于50％的群体百分比的共生和/或有害微生物体。
30.在确定样品内的微生物群落失调之后，可以定制微生物混合物以改善微生物群落(即，使微生物群落摆脱失调)。因此，微生物混合物将生物强化废水处理过程的速度(即，使用生物手段提高所述过程的效率)。在某些实施例中，这还可以通过减少产生这些化合物的共生和/或有害微生物的数量来帮助减少废水处理厂产生的一氧化二氮和甲烷的量。
31.在一个实施例中，所述方法进一步包含引入可以进一步增强废料处理过程的微生物生长副产物。生长副产物可以包括由微生物混合物中的微生物产生的生长副产物，或者它们可以作为单独组分添加。
32.在一个实施例中，生长副产物是生物表面活性剂、酶、生物聚合物、溶剂、酸、蛋白质、氨基酸或可用于修复食品加工废料物质的其它代谢物。在一个具体实施例中，生长副产物是选自例如以下的生物表面活性剂：低分子量糖脂(例如槐糖脂、鼠李糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节杆菌脂肽和地衣素)、纤维二糖脂、黄酮哌脂(flavolipid)、磷脂(例如心磷脂)和高分子量聚合物(例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。
33.一种或多种生物表面活性剂可以进一步包含以下中的任一种或组合：生物表面活性剂的改良形式、衍生物、级分、同种型、异构体或亚型，包括以生物方式或以合成方式改良的形式。在某些实施例中，一种或多种生物表面活性剂以纯形式施用。
34.有利地，生物表面活性剂可以液化某种废料物质例如固化fog，以便疏通堵塞管道，以及增加那些化合物的流动和排水，并使它们更容易被微生物降解。另外，生物表面活性剂可以与酶协同作用和/或协同不同的酶，这些酶由微生物混合物产生以增强废料处理。此外，生物表面活性剂是可生物降解的。
35.有利地，本发明的方法通过增加处理环境中有益微生物体的比例来改进食品生产和加工废料物质。另外，特定废水处理系统的微生物群体可能基于系统位置和废料物质含量而有很大不同；因此，所述方法可以通过利用定制生物体群来加速厌氧过程，所述定制生物体群被选择性地添加到所述群体中以完成窄范围的首选任务。
具体实施方式
36.本发明提供了用于改进在食品加工和生产期间产生的污水和废料物质的处理的方法。特别地，本发明提供了用于修复从加工例如肉类、家禽、海鲜、乳品和植物基油的工厂排放的脂肪、油和油脂(fog)、悬浮固体、蛋白质和其它有机物质的方法。
37.本发明的方法利用定制微生物混合物以及一种或多种微生物生长副产物例如酶
和/或生物表面活性剂，以消化和/或液化动物和/或植物基食品加工废料物质。有利地，本发明的方法提高了在需氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料物质的其它水体中进行废料物质消化、纯化、净化和/或去除的速率。
38.选择的定义
39.本发明利用“微生物基组合物”，“微生物基组合物”意思指包含因微生物体或其它细胞培养物生长而产生的组分的组合物。因此，基于微生物的组合物可以包含微生物本身和/或微生物生长副产物。微生物可以是营养状态、孢子形式、菌丝形式、任何其它形式的微生物繁殖体或它们的混合物。微生物可以是浮游生物或生物膜形式，或两者的混合物。生长的副产物可以是例如代谢产物(例如生物表面活性剂)、细胞膜成分、表达的蛋白质和/或其它细胞组分。微生物可以是完整的或裂解的。细胞可以总体不存在，或以例如至少1
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或更高cfu/毫升所述组合物的浓度存在。
40.本发明进一步提供了“微生物基产物”，所述“微生物基产物”是在实践中将被应用以实现期望结果的产物。微生物基产物可以简单地是从微生物培养过程中收获的微生物基组合物。或者，微生物基产物可以包含已经添加的其它成分。这些附加成分可以包括例如稳定剂、缓冲剂、载体(如，水或盐溶液)、支持进一步的微生物生长的附加营养物、非营养生长增强剂和/或有助于在其应用环境中追踪微生物和/或组合物的试剂。微生物基产物还可以包含微生物基组合物的混合物。微生物基产物还可以包含已经以某种方式诸如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等加工过的微生物基组合物的一种或多种组分。
41.如本文所用，“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质、有机化合物例如小分子(例如下文所述的小分子)或其它化合物大体上不含与其在性质上相关的其它化合物例如细胞物质。举例来说，纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna))在其天然存在状态时不含侧接其的基因或序列。纯化或分离的多肽在其天然存在状态时不含侧接其的氨基酸或序列。将纯化或分离的微生物菌株从其在自然界中存在的环境中移除。因此，分离的菌株可以以例如生物学上纯的培养物或与载体结合的孢子(或菌株的其它形式)形式存在。
42.在某些实施例中，纯化的化合物是感兴趣的化合物的至少60重量％。优选地，制剂是感兴趣的化合物的至少75重量％、更优选地至少90重量％并且最优选地至少99重量％。举例来说，纯化的化合物是作为期望化合物的至少90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％或100重量％(w/w)的纯化的化合物。通过任何适当的标准方法，例如通过柱色谱、薄层色谱或高效液相色谱(hplc)分析来测量纯度。
[0043]“代谢物”是指由代谢产生的任何物质(例如，生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是有机化合物，所述有机化合物是代谢的起始材料、中间物或最终产物。代谢物的实例可以包括但不限于酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、生物聚合物和生物表面活性剂。
[0044]
如本文所用，术语“多个”是指大于一个的任何数量或量。
[0045]“减少”是指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的负变化。
[0046]“表面活性剂”是指降低两种液体之间、液体与气体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的表面活性化合物。表面活性剂用作例如清洁剂、湿润剂、乳化剂、发泡
剂和分散剂。“生物表面活性剂”是由活细胞产生的表面活性物质。
[0047]
本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。举例来说，1到20的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20组成的群组的任何数值、数值组合或子范围以及前述整数之间的所有中间十进制值例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别地考虑了从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。举例来说，1到50示范性范围的嵌套子范围可以在一个方向上包含1到10、1到20、1到30和1到40，或者在另一个方向上包含50到40、50到30、50到20和50到10。
[0048]
与“包含”或“具有”同义的过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。相反，过渡短语“由
……
组成”不包括权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由
……
组成”将权利要求书的范围限制为指定的材料或步骤“以及实质上不影响要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征的材料或步骤”。术语“包含”的使用涵盖了“由一种或多种所叙述的组分组成”或“基本上由一种或多种所叙述的组分组成”的其它实施例。
[0049]
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“一个(a/an)”和“所述”应理解为单数或复数。
[0050]
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所使用的，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差之内。约可以理解为在所陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。
[0051]
在本文对变量的任何定义中列举化学基团的列举包括将该变量定义为所列基团的任何单个基团或组合。本文中对变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例的所述实施例、或所述实施例与任何其它实施例或其部分的组合。
[0052]
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种组合。
[0053]
本发明的其它特点和优点将从其优选实施例的以下描述以及从权利要求书中显而易见。本文引用的所有参考文献都特此通过引用的方式并入。
[0054]
处理食品加工废料的方法
[0055]
在一个实施例中，本发明提供了用于修复食品生产和加工污水和废弃物的改良方法。更具体地，本发明提供了从废水或其它水体中去除因食品加工产生的杂质、污染物或废料物质的方法。本发明还提供了生产微生物体和/或其生长副产物以用于处理食品加工废料的系统和方法。有利地，本发明的方法是对环境友好的、操作友好的和成本高效的。
[0056]
本发明提供了用于改进食品加工废料处理的方法，特别地，用于生物强化生物废水处理方法。优选地，在一些实施例中，所述方法利用有益微生物体，所述有益微生物体在存在于废水中的有机物和其它废料物质存在的情况下产生酶和其它生长副产物。在某些实施例中，微生物是兼性厌氧菌。在某些实施例中，微生物生长副产物是作为单独的处理组分和/或与有益微生物体组合的处理组分被引入废水中。
[0057]
食品加工废弃物的处理或修复可以包含消化、纯化、净化和/或去除存在于废水中的食品加工废料物质。处理可以是部分的和/或其可以是完整的。
[0058]
如本文所用，“食品加工废弃物”是源自用于生产、加工、碾磨、处理、萃取、精炼和/
或包装人类或动物食品商品的任何类型的场所的废弃物。这些场所可以包括但不限于屠宰场，例如用于牛肉、猪肉、羊羔肉、山羊、马、家禽和其它肉类牲畜的屠宰场；肉类包装厂；海鲜加工厂，例如用于养殖或野生捕捞的鱼、虾、螯虾、螃蟹、龙虾、扇贝、蛤蜊、贻贝、章鱼、鱿鱼和鳗鱼的海鲜加工厂；海鲜罐头厂，例如用于金枪鱼罐头或鲑鱼罐头的海鲜罐头厂；牛奶乳品场；用于生产乳品例如牛奶、奶酪、酸奶、开菲尔(kiefer)和冰淇淋的工厂；食用油厂，例如用于萃取和精炼棕榈油、橄榄油和其它植物油或果实油的食用油厂；以及生产加工食品例如零食、新奇食品、糖果、烘焙食品和饮料的工厂。
[0059]
食品加工废弃物可以包括例如有机废料物质，例如动物粪便、血液、尿液和/或胃(肚)内容物、尸体残余物(例如骨头、皮肤、毛皮、羽毛、鳍、指甲、牙齿、组织和器官)、烹饪残留物、脂肪、油和油脂(fog)、乳清、酸乳清、不溶性多糖(例如纤维素、木质素)和其它杂质例如悬浮固体、有害和/或病原性微生物体以及来自加工厂清洁过程中的残留物。废料物质可以进一步包含来自某些加工食品清洁、灭菌、调味、染色或保存过程中的化学物质和/或冷凝物。
[0060]
在一个具体实施例中，食品加工废弃物包含乳清，所述乳清是通过乳品加工产生的。在一个实施例中，乳清是酸乳清，所述酸乳清是在生产茅屋奶酪、奶油奶酪以及希腊酸奶和其它脱乳清酸奶期间产生的。酸乳清包含乳糖、水和多种蛋白质、肽和脂质。
[0061]
在一个具体实施例中，食品加工废弃物包含棕榈油厂污水(pome)，pome是由棕榈油加工厂产生的并包含悬浮组分，所述悬浮组分包括油、压榨棕榈果实过程中剩下的含油纤维素材料以及糖例如阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
[0062]
在一个实施例中，所述方法包含从存在于厌氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料物质的另一种水体(例如，池塘、溪流、湖泊或河流)中的废水采取样品，其中所述样品包含食品加工废料物质。在一些实施例中，废水已经被预处理以去除大固体例如骨头和头发，例如通过使其穿过筛子、筛网或过滤器来去除。
[0063]
所述方法可以进一步包含分析样品以鉴别所存在的废料物质的类型。基于样品中所鉴别的废料物质的类型，生产定制微生物混合物，其中混合物包含最适用于消化、纯化、净化和/或去除所鉴别的废料物质的有益微生物体的混合物。
[0064]
在一些实施例中，本发明的方法可以利用存在于厌氧消化池、污水贮留池或水体中的本地微生物体。在一些实施例中，所述方法可以利用起初不存在于消化池、污水贮留池或水体中的补充性微生物体。
[0065]
微生物混合物可以包含例如不同的芽孢杆菌属(bacillus spp.)微生物，例如芽孢杆菌属细菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、侧孢芽孢杆菌(bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。在一个具体示范性实施例中，利用解淀粉芽孢杆菌nrrl b-67928。
[0066]
在一些实施例中，微生物可以是假单胞菌属(pseudomonas spp.)细菌，例如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、鼻疽假单胞菌(pseudomonas mallei)、类鼻疽假单胞菌(pseudomonas pseudomallei)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、产碱假单胞菌(pseudomonas alcaligenes)、门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina)和斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)。
[0067]
这些微生物可以以定制比例存在。有利地，在存在有机废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于有机物分解的其它生长副产物。
[0068]
有利地，在存在废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于食品加工废料物质分解的其它生长副产物。
[0069]
在一些实施例中，本发明的方法可用于废水反硝化和/或从废水和/或活性污泥中去除硝酸盐和/或铵，其中高浓度微生物培养物包含硝酸盐还原菌(nrb)，例如脱氮硫杆菌(thiobacillus denitrificans)、微球菌属(micrococcus spp.)(例如，脱氮微球菌(micrococcus denitrificans)、玫瑰色微球菌(micrococcus roseus))、沙雷氏菌属(serratia spp.)、假单胞菌属和无色杆菌属(achromobacter spp.)。
[0070]
根据本发明的方法的微生物混合物可以包含微生物体本身以及微生物生长副产物和微生物培养产生的任何残留生长培养基。混合物可以进一步包含用于微生物生长的附加营养物。
[0071]
优选地，单独培养微生物混合物中的微生物，并且在将混合物引入废水中之前或之时将所得高浓度微生物产物组合。
[0072]
微生物可以呈营养细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或其组合的形式。在某些实施例中，微生物是使用深层发酵、固态发酵(ssf)或其组合和/或改良型式产生的。在优选实施例中，发酵是使用改良的固态发酵系统进行的。
[0073]
在某些实施例中，废水样品进一步包含微生物群落。在一个实施例中，样品包含厌氧消化池、污水贮留池或另一种水体内的整个微生物群落的代表。
[0074]
可以分析来自废水样品的微生物群落以确定存在于微生物群落内的微生物物种的身份，并确定每个物种相对于微生物群落的其它物种的群体百分比。分析可以包含所属领域中的标准方法，例如dna测序、dna指纹鉴定、elisa和细胞涂铺。
[0075]
可以将存在于微生物群落中的微生物物种分类为对水处理过程有益的、与其共生的或对其有害的。在一些实施例中，分析样品的目的在于判定微生物群落是否处于“失调”。根据本发明，“失调”是指共生和/或有害微生物体、或包含量、百分比或数量大于有益微生物体的量、百分比或数量的共生和/或有害微生物体的微生物群落的过度生长。
[0076]
如本文所用，“有益”微生物是赋予废水处理过程益处的微生物，而不是仅仅共生的微生物或有害的微生物。益处可以包括例如直接消化废水中的废料物质和/或生产有助于此举的代谢物。
[0077]“共生”微生物体是以非有益方式存在于微生物群落内，但不一定对其造成任何直接危害的微生物体。然而，共生微生物体可能会在废水处理过程中在与有益微生物体的空间和资源竞争中胜出，从而导致效率降低。废水处理中的共生微生物体的实例可以包括例如乳杆菌属(lactobacillus spp.)和双歧杆菌属(bifidus spp.)。
[0078]“有害”微生物体是例如通过杀死和/或寄生有益微生物体或产生有害的生长副产物(包括温室气体，例如一氧化二氮和甲烷)对废水处理过程造成直接或间接危害的微生物体。有害微生物体还可以包括病原性生物体，所述病原性生物体如果不从废水中去除，就可能会对其它活生物体或环境造成危害。
[0079]
共生和/或有害微生物体百分比是总群体的至少25％、30％、35％、40％、45％或更
高被认为是失调的。在一些实施例中，与有益微生物体相比，失调微生物群落可以存在有更多或大于50％的群体百分比的共生和/或有害微生物体。
[0080]
处于失调的废水处理场所的效率低于包含较少共生和/或有害微生物体的废水处理场所。因此，本发明优选用于将失调废水处理系统恢复为具有平衡微生物群落的废水处理系统。平衡微生物群落是包含多种微生物物种的微生物群落，多种微生物物种中的大多数对废水处理过程有益。举例来说，在优选实施例中，微生物群落群体的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多包含有益微生物物种。
[0081]
在确定样品内的微生物群落失调之后，所述方法可以进一步包含生产定制“微生物混合物”以添加到微生物群落中，从而使微生物群落摆脱失调。因此，微生物混合物将生物强化废水处理过程的速度(即，使用生物手段提高所述过程的效率)。
[0082]
在某些实施例中，这还可以通过减少产生这些化合物的微生物的数量来帮助减少厌氧消化池、污水贮留池和其它排水场所产生的一氧化二氮和甲烷(都是温室气体)的量。在一些实施例中，所述方法可用于减少废水中的有害和/或病原性微生物体的数量。在一些实施例中，有害微生物体是能够产生有害硫化氢气体的硫酸盐还原菌(srb)。
[0083]
在某些实施例中，将微生物生物强化混合物引入废水中，例如通过将混合物倒入废水中并在其中将其混合。此后，混合物中的微生物在废水内生长和/或萌发，产生必需代谢物以从其中去除杂质、污染物和/或废料物质。在一些实施例中，萌发增强剂可以与微生物混合物一起施用，特别是在微生物以孢子形式施用的情况下。在一些实施例中，所述过程被加热以更进一步提高效率。
[0084]
在一个实施例中，所述方法进一步包含引入可以进一步增强混合物处理能力的微生物生长副产物。生长副产物可以包括由混合物中的微生物产生的生长副产物，或者它们可以作为单独组分添加。
[0085]
在一个实施例中，生长副产物是生物表面活性剂、酶、生物聚合物、溶剂、酸、蛋白质、氨基酸或可用于处理废水的其它代谢物。在一个具体实施例中，生长副产物是生物表面活性剂。
[0086]
生物表面活性剂是由微生物体产生的一组结构多样的表面活性物质。生物表面活性剂是可生物降解的，并且可以在可再生衬底上使用选定的生物体产生。大多数产生生物表面活性剂的生物体响应于生长培养基中烃源(例如油、糖、甘油等)的存在而产生生物表面活性剂。其它培养基组分例如铁浓缩物也可能会显著地影响生物表面活性剂生产。微生物生物表面活性剂由多种微生物体产生，所述微生物体例如是假单胞菌属(绿脓杆菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、莓实假单胞菌、丁香假单胞菌)；黄杆菌属；芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、蜡样芽孢杆菌)；威克汉姆酵母菌属(例如异常威克汉姆酵母菌)、假丝酵母菌属(例如白假丝酵母菌、皱褶假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、解脂假丝酵母、球拟假丝酵母)；红球菌属；节杆菌属；弯曲菌属；棒杆菌属；毕赤酵母属(例如异常毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、西方毕赤酵母)；斯塔莫酵母(例如熊蜂生斯塔莫酵母)等等。
[0087]
所有生物表面活性剂均为两亲分子。它们由两部分组成：极性(亲水)部分和非极性(疏水)部分。脂肪酸的烃链充当生物表面活性剂分子的常见亲脂部分，而亲水部分由中性脂质的酯或醇基团、脂肪酸或氨基酸(或肽)的羧酸酯基团、在黄酮哌脂情况下的有机酸
或在糖脂情况下的碳水化合物形成。由于其两亲结构，生物表面活性剂增加了疏水性水不溶性物质的表面积，增加了此类物质的水生物利用度，并改变了细菌细胞表面的特性。
[0088]
生物表面活性剂在界面处积聚，从而降低了界面张力并导致溶液中聚集胶束结构的形成。生物表面活性剂形成孔并破坏生物膜稳定性的能力允许其用作抗菌剂、抗真菌剂和溶血剂。结合低毒性和可生物降解性的特征，生物表面活性剂有利于用于包括废水处理的多种应用中。
[0089]
根据本发明的方法的生物表面活性剂可以选自例如糖脂(例如槐糖脂、鼠李糖脂、纤维二糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节杆菌脂肽和地衣素)、黄酮哌脂、脂肪酸酯、磷脂(例如心磷脂)和高分子量聚合物(例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。
[0090]
一种或多种生物表面活性剂可以进一步包含以下中的任一种或组合：生物表面活性剂的改良形式、衍生物、级分、同种型、异构体或亚型，包括以生物方式或以合成方式改良的形式。在某些实施例中，一种或多种生物表面活性剂以纯形式施用。
[0091]
有利地，生物表面活性剂可以液化某种废料物质例如固化fog，以便疏通堵塞管道，以及增加那些化合物的流动和排水。另外，生物表面活性剂可以与酶协同作用和/或协同不同的酶，这些酶由微生物混合物产生以增强废料处理。此外，生物表面活性剂是可生物降解的。
[0092]
有利地，本发明的方法通过增加处理环境中有益微生物体的比例来提高废水处理效率。另外，特定废水处理系统的微生物群体可能基于系统位置和废水含量而有很大不同；因此，所述方法可以通过利用定制生物体群来加速厌氧过程，所述定制生物体群被选择性地添加到所述群体中以完成窄范围的首选任务。通过优化微生物群体，处理厂可以极大地降低其能源消耗和成本。此外，废水处理不需要停止，这意味着根据处理厂的标准操作程序的处理可以在取样、测试、培养期间以及在根据本发明的方法引入微生物混合物之后不间断地继续进行。
[0093]
根据本发明的微生物的生长
[0094]
本发明提供了使用新型固态发酵或表面发酵来培养微生物体和生产微生物代谢物和/或其它微生物生长副产物的方法。也可以使用混合系统。如本文所用，“发酵”是指细胞在受控条件下的生长。生长可以是好氧的或厌氧的。
[0095]
在一个实施例中，本发明提供了用于生产生物质(例如，活细胞物质)、细胞外代谢物(例如，小分子、聚合物和分泌的蛋白质)、残留营养物和/或细胞内组分(例如，酶和其它蛋白质)的物质和方法。
[0096]
根据本发明使用的微生物生长容器可以是用于工业用途的任何封闭式发酵罐或培养反应器。在一个实施例中，反应器是发酵(proofing)烤箱，例如在商业烘焙中用于例如发酵面团的标准烤箱。在一个实施例中，反应器呈放大外壳的形式，例如拖车或房间，其配备必需组件以例如在基质上提供要被同时培育的数十或数百个培养物生长盘。在一个实施例中，反应器可以任选地配备用于连续生产的自动传送系统或滑轮系统。
[0097]
在一个实施例中，容器可以任选地具有功能控制器/传感器或可以连接到功能控制器/传感器以测量培养过程中的重要因素，例如ph、氧气、压力、温度、搅动器轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。然而，优选地，不需要所述控制。
[0098]
在另一个实施例中，容器还能够监测容器内微生物体的生长(例如，细胞数量和生长阶段的测量)。或者，可以从容器中采取每日样品，并通过所属领域中已知的技术例如稀释涂铺技术对所述样品进行计数。稀释涂铺是用于估计样品中的微生物数量的简单技术。所述技术还可以提供一个指标，通过所述指标可以比较不同的环境或处理。
[0099]
在一个实施例中，所述方法包括用氮源补充培养物。氮源可以是例如硝酸钾、硝酸铵硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用或者以两种或更多种氮源组合的形式使用。
[0100]
所述方法可以为培养物生长提供氧合。一个实施例利用了慢速空气运动来去除含低氧的空气并引入含氧空气。含氧空气可以是每天通过例如气泵补充的环境空气。
[0101]
所述方法可以进一步包含用碳源补充培养物。碳源通常是碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和/或麦芽糖；有机酸，诸如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇，诸如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；脂肪和油诸如大豆油、低芥酸菜子油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和/或亚麻子油；等等。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种碳源组合的形式使用。
[0102]
在一个实施例中，培养基中包括用于微生物体的生长因子、痕量营养物和/或生物刺激物。这在无法产生其所需的所有维生素的微生物生长时是特别优选的。培养基中还可以包括无机营养物，所述无机营养物包括痕量元素例如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴。此外，可以包括维生素、基础氨基酸和微量元素的来源，例如呈面粉或谷物粗粉例如玉米粉的形式，或呈萃取物例如马铃薯萃取物、牛肉萃取物、大豆萃取物、香蕉皮萃取物等的形式，或呈纯化形式。也可以包括氨基酸，例如适用于蛋白质的生物合成的氨基酸。
[0103]
在一个实施例中，还可以包括无机盐。可用的无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁(例如七水合硫酸亚铁)、氯化铁、硫酸锰、单水合硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或者以两种或更多种无机盐组合的形式使用。
[0104]
在一些实施例中，例如，当用于接种底物的微生物呈孢子(例如，细菌内生孢子)形式时，可以将萌发增强剂添加到底物中。根据本发明的萌发增强剂的实例包括但不限于l-丙氨酸、锰、l-缬氨酸和l-天冬酰胺或任何其它已知的萌发增强剂。
[0105]
在一些实施例中，培养方法可以任选地包含在培养过程之前和/或期间向底物中添加附加的酸和/或抗微生物剂。然而，有利地，本发明的方法减少或消除了在培养期间对防止污染的需要，此部分归因于较慢的微生物生长速率。
[0106]
混合物的ph应该适合于感兴趣的微生物体，但有利的是，当使用本发明的培养方法时，不需要使用缓冲剂或ph调节剂来稳定ph。
[0107]
用于培养微生物体和生产微生物副产物的方法和设备可以在分批工艺或准连续工艺中执行。
[0108]
在一个实施例中，用于培养微生物体的方法是在约15℃至60℃、优选地25℃至40℃并且在具体实施例中25℃至35℃或32℃至37℃下进行。在一个实施例中，培养可以在恒温下连续进行。在另一个实施例中，培养可以经受温度变化。可以通过将环境空气泵入反应器中并使其在整个过程中循环来将温度保持在优选范围内。
[0109]
在一个实施例中，不需要对本发明的培养方法中使用的设备和衬底进行完全灭
菌。然而，设备和衬底可以任选地被灭菌。可以在用营养培养基铺展之前和/或之后例如使用高压釜来对托盘进行灭菌。另外，在接种固体底物之前，可以例如通过高压釜处理来对蒸汽锅盖和锅带进行灭菌。
[0110]
培养设备例如反应器/容器可以与灭菌单元例如高压釜是间隔开但连接的。培养设备还可以具有在开始接种之前原位灭菌的灭菌单元。可以通过所属领域中已知的方法对空气进行灭菌。举例来说，环境空气在被引入到容器中之前可以穿过至少一个过滤器。在其它实施例中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或任选地，完全不加热，其中，可以利用低水分活度和低ph来控制细菌生长。
[0111]
在一个实施例中，本发明进一步提供了通过在适合生长和代谢物生产的条件下培养微生物菌株来产生微生物代谢物的方法。任选地，所述方法可以包含纯化代谢物。本发明提供了生产代谢物的方法，所述代谢物例如是生物表面活性剂、生物聚合物、乙醇、乳酸、β-葡聚糖、蛋白质、肽、代谢中间物、多不饱和脂肪酸、脂质和酶。
[0112]
感兴趣的微生物体所产生的微生物生长副产物可以被保留在微生物体中或被分泌到底物中。代谢物含量可以是例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0113]
在另一个实施例中，用于生产微生物生长副产物的方法可以进一步包含浓缩和纯化感兴趣的微生物生长副产物的步骤。在另一个实施例中，底物可以含有稳定微生物生长副产物活性的化合物。
[0114]
在一个实施例中，在培养完成时(例如，在例如实现期望的孢子密度或规定代谢物密度时)去除所有微生物培养组合物。在这一分批程序中，在收获第一批后启动全新的批次。
[0115]
在另一个实施例中，在任何一个时间仅去除一部分发酵产物。在这个实施例中，具有活细胞的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。被去除的组合物可以是无细胞底物或含有细胞。以这种方式创建了准连续系统。
[0116]
基质发酵
[0117]
在优选实施例中，本发明提供了使用用于固态发酵或表面发酵的新程序和系统来培养微生物基产物的方法。有利地，本发明不需要具有用于测量和/或稳定do、ph和其它发酵参数的复杂曝气系统、混合器或探针的发酵系统。
[0118]
在优选实施例中，培养微生物体和/或生产微生物生长副产物的方法包含：将一层与水和任选的微生物生长增强营养物混合的固体底物铺展在托盘上以形成基质；将期望种类的接种剂施用到基质表面上；将接种过的托盘放入发酵反应器中；使空气通过反应器以将温度稳定在25℃-40℃之间；并允许微生物体在整个基质中繁殖。
[0119]
在优选实施例中，根据本发明的方法的基质底物包含食料。食料可以包括例如大米、大豆或豆科植物、玉米和其它谷物、面食、麦麸、面粉或谷物粗粉(例如，玉米粉、碱法烹制的玉米粉、部分水解的玉米粗粉)和/或其它类似食料来为微生物培养物的生长和/或取食提供表面区域。
[0120]
在一个实施例中，其中基质底物包含预制面食，所述面食可以由例如玉米粉、小麦粉、粗面粉、米粉、藜麦粉、马铃薯粉、大豆粉、鹰嘴豆粉和/或其组合制成。在一些实施例中，面食由强化面粉制成。
[0121]
在一些实施例中，面食可以呈长绳或带的形状，例如意大利细面或意大利宽面。在
一些实施例中，面食可以呈例如片状、壳状、螺旋状、螺旋形开瓶器状、轮状、中空管状、弓状或其任何变异形状。有利地，微生物可以在面食内部和/或面食外表面上生长。这增加了微生物体可以在其上生长的表面区域，增加了底物内微生物生长的深度，并在培养物内提供了增强的氧气渗透。
[0122]
在一个实施例中，其中基质底物包含米粒，基质底物可以通过将米粒与水和取决于正在培养的微生物，附加的营养培养基混合来制备。
[0123]
在一个实施例中，培养方法包含准备托盘，所述托盘可以是例如适于标准发酵烤箱的金属板平锅或蒸汽平锅。在一些实施例中，“托盘”可以是由例如塑料、金属或玻璃制成的能够容纳底物和培养物的任何器皿或容器，例如烧瓶、杯、桶、板、平锅、槽、筒、盘或柱。
[0124]
制备可以包含用例如箔覆盖托盘的内表面。制备还可以包含通过例如对托盘进行高压釜处理来对托盘进行灭菌。
[0125]
接下来，通过混合食料、水和任选的附加盐和/或营养物以支持微生物生长来制备基质底物。在一个具体实施例中，营养培养基可以包含例如麦芽糖、酵母萃取物或另一种蛋白质源以及矿物质、钾、钠、磷和/或镁源。
[0126]
然后，将混合物铺展到托盘上并分层以形成厚度为约1英寸到12英寸、优选地1英寸到6英寸的基质。基质的厚度可以取决于托盘或在其中准备托盘的其它容器的体积而变化。
[0127]
在优选实施例中，基质底物提供了微生物可以在其上生长的充足的表面区域以及增强的获得氧气供应的途径。因此，微生物在其上生长和繁殖的底物也可以用作微生物的营养培养基。
[0128]
在一些实施例中，可以在基质中形成凹槽、脊、通道和/或孔以增加微生物可在其上生长的表面区域。这也增加了底物内微生物生长的深度，并在整个培养物中提供增强的氧气渗透。
[0129]
为了增加整个底物中的微生物运动性，所述方法可以进一步包含将生物刺激物、马铃薯萃取物和/或香蕉皮萃取物施用到底物上。这允许提高培养物在整个底物表面的分布速度。
[0130]
在一些实施例中，例如，当用于接种底物的微生物呈孢子形式时，可以将萌发增强剂施用到底物。根据本发明的萌发增强剂的实例包括但不限于l-丙氨酸、锰、l-缬氨酸和l-天冬酰胺或任何其它已知的萌发增强剂。
[0131]
然后，可以在将基质铺展到托盘上之后对托盘和基质执行灭菌。灭菌可以通过高压釜或所属领域中已知的任何其它手段来执行。在一些实施例中，这一方法还将有效地烹煮底物。
[0132]
如果期望的话，可以提供盖子和硅锅带用于密封托盘。为了创建完全无菌的系统，也可以对盖子和锅带进行灭菌。
[0133]
在托盘中制备基质底物之后，可以向托盘接种期望微生物体，所述微生物体任选地与无菌营养培养基预混合。任选地，取决于所培养的微生物体和/或所生产的生长副产物，随后可以用盖子和锅带密封托盘。在一个实施例中，例如，当微生物体是芽孢杆菌属细菌时，托盘优选地不被密封。
[0134]
接种物可以包含营养细胞、孢子或其它形式的微生物体。在一个实施例中，通过将
接种物均匀地施用到底物层的表面上来执行接种。接种物可以通过例如喷洒、撒布、倾倒、注射或铺展来施用。在一个实施例中，接种是使用移液管进行的。
[0135]
然后，可以将接种过的托盘放置在发酵反应器内。在一个实施例中，托盘被放置在发酵烤箱内。发酵烤箱可以是例如商业烘焙中使用的标准发酵烤箱。任选地，反应器可以配备传送系统，其中使用例如传送带或滑轮系统使托盘连续移动通过反应器。
[0136]
在一个实施例中，可以使用多个反应器，例如多个发酵烤箱。在一个实施例中，反应器是可分布的和便携的。在其中使用多个反应器的另一个实施例中，多个反应器可以被组装到单个平台上以便于运输。
[0137]
发酵参数可以基于要被生产的期望产品(例如，期望的微生物生物表面活性剂)和所培养的微生物体进行调整。
[0138]
反应器内的温度取决于所培养的微生物体，但一般来说，使用泵送通过反应器的环境空气将温度保持在约25℃-40℃之间。循环空气还可以为培养物提供持续的氧合。空气循环还可以帮助将do保持在期望水平下，例如环境空气的约90％。
[0139]
在一个实施例中，不需要监测或稳定培养物的ph。可以在整个发酵过程中定期向托盘喷洒无菌营养培养基(例如，每天一次、每隔一天一次、每周一次)以实现最大微生物浓度。
[0140]
培养物可以被培育持续使得微生物体达到期望浓度或达到50％-100％孢子形成的时间量，优选地1天到14天、更优选地2天到10天。
[0141]
在一些实施例中，微生物体将在整个发酵过程中消耗基质底物的一部分或全部。
[0142]
一旦培养物形成孢子，就可以从托盘中收获培养物和剩余的底物，然后将其混合在一起以产生微生物浆料。根据这种方法生长的微生物的浓度可以在溶于水中时达到例如1
×
106到1
×
10
13
个繁殖体(或cfu)/克，优选地1
×
108到1
×
10
13
cfu/g、或至少5
×
109到5
×
10
10
cfu/ml。
[0143]
在一个实施例中，微生物浆料被碾磨、微粉化和/或干燥以产生含有微生物体、其生长副产物和基质底物的干燥微生物基产物。微生物浆料可以使用所属领域中已知的任何干燥方法来干燥。在一个实施例中，干燥产物具有约3％至6％保水度。
[0144]
在一个实施例中，使用水将含有溶解的培养物的溶液稀释到1
×
106到1
×
107cfu/ml的浓度以形成液体微生物基产物，所述产物可用于广泛多种的环境和应用中。任选地，可以向水中添加营养物，所述营养物包括例如钾、磷、镁、碳、蛋白质、氨基酸源等等以增强微生物生长。
[0145]
可以在培养期间或在应用微生物基产物时通过添加低(微摩尔)浓度的l-丙氨酸、锰或任何其它已知的萌发增强剂来增强形成孢子的微生物的活化和/或萌发。
[0146]
在一个实施例中，本发明的系统和方法可用于生产微生物代谢物，其中不干燥微生物浆料，而是过滤微生物浆料以将液体与固体分离。随后，如果期望的话，可以使用例如离心、旋转蒸发、微滤、超滤和/或色谱进一步纯化所萃取的包含微生物代谢物的液体。
[0147]
代谢物和/或生长副产物可以是例如生物表面活性剂、酶、生物聚合物、酸、溶剂、氨基酸、核酸、肽、蛋白质、脂质和/或碳水化合物。具体地，在一个实施例中，所述方法可用于生产生物表面活性剂。有利地，所述方法不需要复杂的设备或高能耗。感兴趣的微生物体可以就地小规模或大规模培养并利用，甚至仍与它们的培养基混合。类似地，微生物代谢物
也可以在有需要的位置处被大量生产。
[0148]
有利地，微生物基产物可以在偏远位置中被生产。微生物生长场所可以通过利用例如太阳能、风能和/或水电力而脱离电网运行。
[0149]
发酵室系统
[0150]
在一个实施例中，本发明的方法中利用的发酵反应器可以包含具有四个竖直墙壁、一个地板和一个天花板的大型、防潮、封闭的空间。墙壁可以任选地包含一个或多个窗户和/或门。这个“发酵室”可以复制存在于例如发酵烤箱、发酵反应器中的环境，但规模要大得多。
[0151]
在一个实施例中，发酵室被固定到便携式平台例如带有轮子的拖车上。
[0152]
在一个实施例中，发酵室的内壁具有多个水平表面，用于容纳接种过的底物的容器可以被放置在所述水平表面上。
[0153]
在一个实施例中，表面呈搁板形式。搁板可以被固定到外壳的墙壁上。搁板单元可以被悬挂在天花板上和/或固定到地板上。
[0154]
在一个实施例中，发酵室包含多个金属片盘架。所述片盘架优选地包含多个用于容纳托盘的载玻片，固体底物和微生物培养物被铺展在托盘中。在一个实施例中，架子是便携式的，这意味着可以用轮子将其固定。
[0155]
在一个实施例中，盘架可以容纳10到50个托盘。优选地，载玻片彼此间隔至少3英寸以允许每个托盘之间有最佳的空气循环。
[0156]
在一个实施例中，房间的天花板可以任选地被容纳以允许空气流动，例如具有天花板通风口和/或空气过滤器。此外，天花板和墙壁可以安装uv灯以帮助对系统内的空气和其它表面进行灭菌。有利地，金属托盘和金属盘架的使用增强了uv灯的反射以加强uv灭菌。
[0157]
房间可以配备温度控制器，但优选地，整个房间的空气循环提供期望的发酵温度。
[0158]
发酵室的尺寸可以基于各种因素来定制，所述因素例如是房间的位置和放置在其中的托盘的数量。在一个实施例中，天花板的高度是至少8英尺，而地板的面积是至少80平方英尺。
[0159]
微生物生物强化混合物
[0160]
在某些实施例中，本发明提供了包含一种或多种微生物体和/或一种或多种微生物生长副产物的微生物基产物以用于处理食品加工废料物质，其中产物中的细胞浓度是约1
×
106到1
×
10
13
个细胞(或cfu)/克或更高。在一个实施例中，组合物包含含有微生物体和/或微生物体产生的代谢物和/或任何残留营养物的基质底物。
[0161]
发酵产物无需萃取或纯化即可直接使用。如果期望的话，可以使用所属领域中的技术人员已知的标准萃取方法或技术来实现萃取和纯化。
[0162]
在收获基质底物、微生物和/或副产物后，可以将产物溶解于水中以形成液体产物。
[0163]
或者，在收获基质、微生物和/或副产物后，可以将产物掺合、碾磨和/或微粉化，然后干燥以形成干燥产物。可以将这种干燥产物溶解于水中并根据需要进行稀释。
[0164]
微生物基产物中的微体生物体可以呈活性或非活性形式。在一些实施例中，微生物呈营养体、孢子、菌丝体、菌丝、分生孢子形式和/或它们的混合物的形式。微生物基产物无需进一步稳定、保存和储存即可使用。
[0165]
干燥产物和/或液体产物可以通过例如罐车转移到应用位置以立即使用。
[0166]
在其它实施例中，考虑到例如预期用途、预期应用方法、发酵容器尺寸以及从微生物生长场所到使用位置的任何运输模式，可以将组合物置于合适尺寸的容器中。因此，其中放置微生物基组合物的容器可以是例如1加仑到1,000加仑或更大。在某些实施例中，容器是2加仑、5加仑、25加仑或更大。
[0167]
在从反应器收获微生物基组合物后，可以在收获的产物被加工和/或置入容器中(或以其它方式运输以供使用)时添加其它组分。添加剂可以是例如缓冲剂、载体、在相同或不同场所处生产的其它微生物基组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物、示踪剂、杀虫剂和其它特定于预期用途的成分。
[0168]
有利地，根据本发明，微生物基产物可以包含微生物在其中生长的底物。所述产物中的生物质的量(按重量计)可以是例如0％至100％之间的任何值，包括其间的所有百分比。
[0169]
任选地，产物可以在使用之前被储存。优选地，储存时间短。因此，储存时间可以少于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选实施例中，如果产物中存在活细胞，则将产物储存在冷温度例如低于20℃、15℃、10℃或5℃下。另一方面，生物表面活性剂组合物通常可以被储存在环境温度下。
[0170]
可以根据本发明培养的生物体可以包括例如从活性污泥槽中取样和鉴别的酵母、真菌、细菌、古生菌、原生动物、后生动物和藻类。
[0171]
微生物混合物可以包含例如不同比例的芽孢杆菌属微生物，例如芽孢杆菌属细菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在一个具体示范性实施例中，使用解淀粉芽孢杆菌nrrl b-67928。
[0172]
在一些实施例中，微生物可以是假单胞菌属细菌，例如铜绿假单胞菌、绿针假单胞菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱假单胞菌、门多萨假单胞菌和斯氏假单胞菌。有利地，在存在有机废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于有机物分解的其它生长副产物。
[0173]
有利地，在存在废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于食品加工废料物质分解的其它生长副产物。
[0174]
在一个实施例中，细菌是反硝化细菌或硝酸盐还原菌，例如脱氮硫杆菌、微球菌属(例如，脱氮微球菌、玫瑰色微球菌)、沙雷氏菌属、假单胞菌属和/或无色杆菌属。
[0175]
在一些实施例中，微生物体是原生动物和/或后生动物，例如变形虫、鞭毛虫、纤毛虫、轮虫、线虫和水熊虫。在一些实施例中，微生物体是酵母、真菌或藻类。
[0176]
在一个实施例中，微生物混合物包含微生物生长副产物。这些微生物生长副产物可以由培养物中的微生物体产生，和/或可以将它们添加到培养物中，之后将培养物引入废水中。生长副产物可以包括例如生物表面活性剂、酶、生物聚合物、溶剂、酸、蛋白质、氨基酸、碳水化合物和/或可用于处理废水的其它代谢物。在一个实施例中，生长副产物是生物表面活性剂。
[0177]
在某些其它实施例中，组合物包含一种或多种微生物生长副产物，其中生长副产物已经被从微生物培养物中萃取并且任选地被纯化。举例来说，在一个实施例中，可以掺合本发明的方法的基质底物以形成浓浆料，可以将所述浓浆料过滤或离心以将液体部分与固
体部分分离。然后，包含微生物生长副产物的液体部分可以原样使用或使用已知方法来纯化。
[0178]
微生物基产物的本地生产
[0179]
在本发明的某些实施例中，微生物生长场所以期望规模生产感兴趣的新鲜、高密度的微生物体和/或微生物生长副产物。微生物生长场所可以位于应用位置(例如，在食品加工厂)处或附近。所述场所在分批培养、准连续培养或连续培养中生产高密度微生物基组合物。
[0180]
本发明的微生物生长场所可以位于将使用微生物基产物的位置处。举例来说，微生物生长场所可以距使用位置小于300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。
[0181]
本发明的微生物生长场所产生新鲜的微生物基组合物，所述组合物包含微生物本身、微生物代谢物和/或微生物在其中生长的培养基的其它组分。如果期望的话，组合物可以具有高密度的营养细胞或繁殖体、或营养细胞与繁殖体的混合物。
[0182]
由于微生物基产物可以无需借助常规微生物生产的微生物体稳定、保存、储存和运输过程而在本地生产，所以可以产生密度高得多的微生物体，从而需要更小体积的微生物基产物以用于现场应用，或允许需要实现期望功效的密度高得多的微生物应用。系统是高效的并且可以消除使细胞稳定或将细胞从其培养基中分离出来的需要。微生物基产物的本地生产也有助于在产物中包括生长培养基。培养基可以含有在发酵期间产生的特别充分适用于本地使用的试剂。
[0183]
本地生产的高密度、稳健的微生物培养物在现场比留在供应链中一段时间的微生物培养物更有效。与传统产物(其中，细胞已与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物分离)相比，本发明的微生物基产物是特别有利的。减少的运输时间允许根据本地需求以一定的时间和体积生产和递送新鲜批次的微生物和/或其代谢物。
[0184]
在一个实施例中，微生物生长场所位于将使用微生物基产物的位置上或附近，例如在300英里、200英里或甚至100英里内。有利地，这允许组合物被订做以在指定位置处使用。微生物基组合物的配方和效力可以针对特定应用并根据应用时的当地条件来进行定制。
[0185]
有利地，分布式微生物生长场所提供了依赖分布广的工业规模的生产商的针对当前问题的解决方案，这些生产商由于上游加工延迟、供应链瓶颈、存储不当和阻碍例如活的、高细胞计数的产物以及细胞最初在其中生长的相关培养基和代谢物的及时递送和应用的其它突发事件而致使产品质量受损。
[0186]
此外，通过本地生产组合物，可以针对特定位置和应用时存在的条件实时调整配方和效力。这提供了优于在中心位置预制并且具有例如对于给定位置可能不是最佳的设定比率和配方的组合物的优点。
[0187]
微生物生长场所因其能够订做微生物基产物以改进与目的地地区的协同作用而提供了制造多功能性。有利地，在优选实施例中，本发明的系统利用天然存在的本地微生物体和其代谢副产物的力量。
[0188]
在例如发酵的24小时之内的本地生产和递送产生纯、高细胞密度组合物并且大大降低了运输成本。鉴于在开发更有效和更强大的微生物接种剂方面有快速进展的前景，消费者将从这种快速递送微生物基产物的能力中受益匪浅。
[0189]
实例
[0190]
可以从以下以说明方式给出的实例中更深入地理解本发明和其许多优点。以下实例说明了本发明的一些方法、应用、实施例和变型。不应将所述实例认为是对本发明的限制。可以关于本发明作出许多改变和修改。
[0191]
实例1
–
芽孢杆菌孢子的发酵
[0192]
对于芽孢杆菌属孢子生产，使用麦麸基培养基。培养基在不锈钢蒸汽锅中被灭菌，然后用盖子和锅带加以密封。灭菌后，向平锅接种种子培养物并在发酵烤箱中培育48-72小时。在发酵结束时，收获1
×
10
10
个孢子/克芽孢杆菌。
[0193]
实例2
–
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的固态发酵
[0194]
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以使用固态发酵方法来进行培养。培养基仅包含玉米粉(部分水解的玉米粉)或麦麸。任选地，可以包括附加营养物例如盐、糖蜜、淀粉、葡萄糖、蔗糖等以促进微生物生长。
[0195]
铝箔覆盖的托盘在接种前经受高压釜处理。培养基以约1到2英寸厚的层形式铺展于托盘上。在衬底中制作凹槽和/或孔以增加培养基的表面积。为了提高生长速度，即增加细菌的运动性和在整个培养基中的分布，可以将马铃薯萃取物或香蕉皮萃取物添加到培养物中。
[0196]
然后，将所选的芽孢杆菌菌株的孢子喷洒到衬底的表面上，并将托盘置入发酵烤箱中。发酵烤箱内的发酵是在32℃-40℃之间的温度下进行。环境空气被泵送通过烤箱以使温度稳定。
[0197]
根据这种方法生长的微生物在溶解于水中时的浓度可以达到至少5
×
109到5
×
10
10
个孢子/毫升。然后，在混合槽中用水将产物稀释到1
×
106到1
×
107个孢子/毫升的浓度。也可以添加的营养物包括例如钾盐(0.1％或更低)、糖蜜和/或葡萄糖(1-5g/l)和硝酸盐。
[0198]
参考文献
[0199]
taguchi,k.,yasuda,k.,hanai,y.,abe,t,mae,h.《废水处理工艺(wastewater treatment process)》.美国专利9,994,469b2,2018年6月12日.(“taguchi等人”)。
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年3月27日提交的美国临时专利申请第62/824,382号的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
背景技术：
3.以工业规模生产和加工食品会产生数百万吨废弃物，废弃物如果未经处理就分散到环境中，那么其可能会是危害人类健康以及污染空气和水的源头。脂肪、油和油脂(fog)、动物尸体边角料、植物纤维和其它固体或形成固体的物质只是肉类、家禽、海鲜、乳品和一些植物基食品加工过程中留下来的废弃物类型中的一些。许多这些废料储存于会散发臭味和污染性温室气体的污水贮留池或大型池塘中。一些食品废弃物被释放到下水道和排水管中，食品废弃物在下水道和排水管里积聚并造成堵塞，以及被释放到水道中，食品废弃物在水道里耗尽水中的含氧量并促使藻类大量繁殖。
4.已经尝试使用与市政废水处理中使用的废水处理方法类似的废水处理方法来处理食品加工废料。一般来说，“废水”是来自家庭、市政、工业、商业或农业活动、地表径流或暴雨雨水以及任何下水道流入物或下水道渗透物的任何组合的使用过的水。废水处理涉及从废水中去除固体材料、杂质和污染物的多个过程，包括机械、化学和/或生物过程；然而，许多这些过程效率低下，从而难以跟上食品废料生产的高速率。
5.包括例如牛肉、家禽、猪肉和其它牲畜加工的肉类加工以及难以修复的废污水可能是特别大的污染源。在加工之前，在畜栏或箱中饲养活动物，活动物在那里会释放自己的代谢废料和粪便。除了在清洁期间从动物身上洗掉的任何油、头发、羽毛和污垢之外，这些废料最终会作为径流进入废水和地下水。
6.一旦动物被屠宰，它们就可能会被脱毛/脱羽毛、放血、剖腹和清洗，从而进一步将这些材料添加到废水流中。尸体可能会被切割、修剪和去骨，其中组织和骨头的碎片会掉到地板上被冲走。毛皮的进一步固化和清洗会将盐分添加到废水中。
7.海鲜加工还会产生大量污染性污水，污染性污水包含大量油脂fog，部分原因在于某些海鲜的脂肪含量天然地较高。鱼可能会被清洗、灭菌、切除内脏、去头、去鳍、去骨、去鳞、去皮或以其它方式加工，从而导致废水中有固体颗粒和脂肪。鱼例如金枪鱼可能会被进一步烹煮(例如，通过蒸)和罐装，从而产生来自蒸冷凝物以及罐头填充过程中使用的酱汁、盐水和油的油性废料。
8.乳品加工连同肉类和海鲜加工是污染性污水的主要来源。在乳品的情况下，生奶被转化为巴氏杀菌奶和酸腐牛奶、酸奶、硬奶酪、软奶酪和茅屋奶酪、奶油和黄油产品、冰淇淋、奶粉、乳糖、炼乳、开菲尔(keifer)和甜点产品。在生产奶酪和酸奶的情况下，例如乳清副产品(包括酸乳清)可能会对水生生态系统特别不利。当主要含有蛋白质和肽的酸乳清进入溪流或其它水道时，其会耗尽水中溶解的氧气含量，并且其高营养物含量会导致藻类大量繁殖。这些条件使本地鱼类几乎不可能存活。
9.动物基食品的生产和加工并不是食品废料污染和废水的唯一来源。植物基油例如
棕榈油的生产是水污染的主要来源。棕榈油厂污水(pome)或碾磨棕榈油过程中的灭菌和澄清过程产生的液体废料含有90％-95％水，并且剩余部分包含残油、土壤颗粒和悬浮固体。由于pome有高生物需氧量(bod)、低ph和胶体性质，所以其可能会具有高度污染性并且难以修复。
10.此外，萃取后的棕榈果实被保存在大型污水贮留池中，大型污水贮留池由于生活在地表以下的产甲烷微生物的活动而冒泡并散发出强烈气味。污水贮留池通常被用作用于分解大量有机物的低成本方法；然而，与棕榈油的情况一样，有机物通常会被转化为温室气体，温室气体包括二氧化碳和甲烷。
11.除了污水贮留池以外，其它形式的食品废料处理利用厌氧微生物。举例来说，在机械筛选出较大的固体材料之后，通常使用厌氧消化池来消化剩余的固体物质(污泥)并分离出液体(水)。在厌氧消化池中，一群微生物体在缺氧的情况下共同代谢或分解可生物降解的材料—可能花费长达45天的过程。由于微生物体利用废水组分来满足其对应的营养需求，因此其会在所述过程中产生有益于废水处理以及其它有益微生物体的代谢需求的其它化学物质。目标在于让这些生物体共同作用以分解化学和生物污水。
12.所述过程从废水的污泥部分的细菌水解开始，所述污泥部分通常含有不溶性复杂有机物质例如fog。不溶性物质被转化为可溶性分子例如脂肪酸、氨基酸和糖。然后，产酸细菌将这些化合物转化为二氧化碳、氢气、氨和有机酸例如乙酸、丁酸、丙酸以及乙醇。接着，产甲烷菌将例如乙酸转化为甲烷和二氧化碳。然后，剩余的难消化组分例如木质素和非有机成分被转移用于进一步处理或以其它方式重新使用。
13.酶和表面活性剂也可以用于修复食品加工废料。酶主要用于攻击或降解有机化合物，而表面活性剂用于将降解的颗粒分散于水相中。然而，已经发现这些组合物中的一些是不稳定的并且产生在一种类型的废料到另一种类型的废料之间不同的结果，从而未能解决含有大量各种其它fog或结垢物质的废料所呈现的问题。
14.微生物与废水和其它微生物体的相互作用可以非常有效地处理废水。因此，需要更通用、更有力并且对环境友好的微生物基方法来处理食品生产和加工废弃物例如肉类、海鲜、乳品和植物油加工厂排放的废弃物。
技术实现要素：
15.在一个实施例中，本发明提供了用于修复食品生产和加工污水和废弃物的改良方法。更具体地，本发明提供了从废水或其它水体中去除因食品加工产生的杂质、污染物或废料物质的方法。本发明还提供了生产微生物体和/或其生长副产物以用于处理食品加工废料的系统和方法。有利地，本发明的方法是对环境友好的、操作友好的和成本高效的。
16.本发明提供了用于改进食品加工废料处理的方法，特别地，用于生物强化生物废水处理方法。
17.食品加工废弃物的处理或修复可以包含从废水中消化、纯化、净化和/或去除废料物质。废水可以来自例如肉类、家禽或海鲜加工厂、乳品场或用于碾磨、处理、萃取和/或精炼植物基油的场所。举例来说，废水可以含有有机废料物质例如动物粪便、血液、尿液和/或胃内容物、尸体残余物、烹饪残留物、脂肪、油和油脂(fog)、乳清、不溶性多糖和其它杂质例如来自加工厂清洁的悬浮固体、病原体和残留物。
18.在一个实施例中，所述方法包含从存在于厌氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料物质的另一种水体中的废水采取样品，其中所述样品包含食品加工废料物质。在一些实施例中，废水已经被预处理以去除大固体，例如通过使其穿过筛子、筛网或过滤器来去除。
19.所述方法可以进一步包含分析样品以鉴别所存在的废料物质的类型。基于所鉴别的废料物质的类型，生产定制微生物混合物，其中混合物包含最适用于消化、纯化、净化和/或去除所鉴别的废料物质的有益微生物体的混合物。
20.在一些实施例中，本发明的方法可以利用存在于厌氧消化池、污水贮留池或水体中的本地微生物体。在一些实施例中，所述方法可以利用起初不存在于消化池、污水贮留池或水体中的补充性微生物体。
21.在某些优选实施例中，所述方法利用兼性厌氧细菌。微生物混合物可以包含例如不同的芽孢杆菌属(bacillus spp.)微生物，例如芽孢杆菌属细菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、侧孢芽孢杆菌(bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。在一些实施例中，微生物可以是假单胞菌属(pseudomonas spp.)细菌，例如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、鼻疽假单胞菌(pseudomonas mallei)、类鼻疽假单胞菌(pseudomonas pseudomallei)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、产碱假单胞菌(pseudomonas alcaligenes)、门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina)和斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)。有利地，在存在有机废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于有机物分解的其它生长副产物。
22.根据本发明的方法的微生物混合物可以包含微生物体本身以及微生物生长副产物和微生物培养产生的任何残留生长培养基。混合物可以进一步包含用于微生物生长的附加营养物。
23.微生物可以呈营养细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或其组合的形式。在某些实施例中，微生物是使用深层发酵、固态发酵(ssf)或其组合和/或改良型式产生的。在优选实施例中，发酵是使用改良的固态发酵系统执行的。
24.在某些实施例中，将微生物生物强化混合物引入废水中，例如通过将混合物倒入废水中并在其中将其混合。此后，混合物中的微生物在废水内生长和/或萌发，产生代谢物以从其中去除杂质、污染物和/或废料物质。在一些实施例中，萌发增强剂可以与微生物混合物一起施用，特别是在微生物以孢子形式施用的情况下。在一些实施例中，所述过程被加热以更进一步提高去除速率。
25.在某些实施例中，废水样品进一步包含微生物群落。在一个实施例中，样品包含厌氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料的其它水体内的整个微生物群落的代表。
26.在一些实施例中，分析微生物群落以确定存在于微生物群落内的微生物物种的身份，并确定每个物种相对于微生物群落的其它物种的群体百分比。分析可以包含所属领域中的标准方法，例如dna测序、dna指纹鉴定、elisa和细胞涂铺。
27.然后，可以将存在于微生物群落中的微生物物种分类为对废料处理过程有益的、与其共生的或对其有害的。在一些实施例中，分析样品的目的在于判定微生物群落是否处于“失调”。根据本发明，“失调”意思指共生和/或有害微生物体、或包含相对于有益微生物体数量而言更高百分比的共生和/或有害微生物体的微生物群落的过度生长。
28.处于失调的废水处理场所的效率低于包含较少共生和/或有害微生物体的废水处理场所，这意味着处理速率较慢。
29.共生和/或有害微生物体百分比是总群体的至少25％被认为是失调的。在一些实施例中，与有益微生物体相比，失调微生物群落可以具有更多或大于50％的群体百分比的共生和/或有害微生物体。
30.在确定样品内的微生物群落失调之后，可以定制微生物混合物以改善微生物群落(即，使微生物群落摆脱失调)。因此，微生物混合物将生物强化废水处理过程的速度(即，使用生物手段提高所述过程的效率)。在某些实施例中，这还可以通过减少产生这些化合物的共生和/或有害微生物的数量来帮助减少废水处理厂产生的一氧化二氮和甲烷的量。
31.在一个实施例中，所述方法进一步包含引入可以进一步增强废料处理过程的微生物生长副产物。生长副产物可以包括由微生物混合物中的微生物产生的生长副产物，或者它们可以作为单独组分添加。
32.在一个实施例中，生长副产物是生物表面活性剂、酶、生物聚合物、溶剂、酸、蛋白质、氨基酸或可用于修复食品加工废料物质的其它代谢物。在一个具体实施例中，生长副产物是选自例如以下的生物表面活性剂：低分子量糖脂(例如槐糖脂、鼠李糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节杆菌脂肽和地衣素)、纤维二糖脂、黄酮哌脂(flavolipid)、磷脂(例如心磷脂)和高分子量聚合物(例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。
33.一种或多种生物表面活性剂可以进一步包含以下中的任一种或组合：生物表面活性剂的改良形式、衍生物、级分、同种型、异构体或亚型，包括以生物方式或以合成方式改良的形式。在某些实施例中，一种或多种生物表面活性剂以纯形式施用。
34.有利地，生物表面活性剂可以液化某种废料物质例如固化fog，以便疏通堵塞管道，以及增加那些化合物的流动和排水，并使它们更容易被微生物降解。另外，生物表面活性剂可以与酶协同作用和/或协同不同的酶，这些酶由微生物混合物产生以增强废料处理。此外，生物表面活性剂是可生物降解的。
35.有利地，本发明的方法通过增加处理环境中有益微生物体的比例来改进食品生产和加工废料物质。另外，特定废水处理系统的微生物群体可能基于系统位置和废料物质含量而有很大不同；因此，所述方法可以通过利用定制生物体群来加速厌氧过程，所述定制生物体群被选择性地添加到所述群体中以完成窄范围的首选任务。
具体实施方式
36.本发明提供了用于改进在食品加工和生产期间产生的污水和废料物质的处理的方法。特别地，本发明提供了用于修复从加工例如肉类、家禽、海鲜、乳品和植物基油的工厂排放的脂肪、油和油脂(fog)、悬浮固体、蛋白质和其它有机物质的方法。
37.本发明的方法利用定制微生物混合物以及一种或多种微生物生长副产物例如酶
和/或生物表面活性剂，以消化和/或液化动物和/或植物基食品加工废料物质。有利地，本发明的方法提高了在需氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料物质的其它水体中进行废料物质消化、纯化、净化和/或去除的速率。
38.选择的定义
39.本发明利用“微生物基组合物”，“微生物基组合物”意思指包含因微生物体或其它细胞培养物生长而产生的组分的组合物。因此，基于微生物的组合物可以包含微生物本身和/或微生物生长副产物。微生物可以是营养状态、孢子形式、菌丝形式、任何其它形式的微生物繁殖体或它们的混合物。微生物可以是浮游生物或生物膜形式，或两者的混合物。生长的副产物可以是例如代谢产物(例如生物表面活性剂)、细胞膜成分、表达的蛋白质和/或其它细胞组分。微生物可以是完整的或裂解的。细胞可以总体不存在，或以例如至少1
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或更高cfu/毫升所述组合物的浓度存在。
40.本发明进一步提供了“微生物基产物”，所述“微生物基产物”是在实践中将被应用以实现期望结果的产物。微生物基产物可以简单地是从微生物培养过程中收获的微生物基组合物。或者，微生物基产物可以包含已经添加的其它成分。这些附加成分可以包括例如稳定剂、缓冲剂、载体(如，水或盐溶液)、支持进一步的微生物生长的附加营养物、非营养生长增强剂和/或有助于在其应用环境中追踪微生物和/或组合物的试剂。微生物基产物还可以包含微生物基组合物的混合物。微生物基产物还可以包含已经以某种方式诸如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等加工过的微生物基组合物的一种或多种组分。
41.如本文所用，“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质、有机化合物例如小分子(例如下文所述的小分子)或其它化合物大体上不含与其在性质上相关的其它化合物例如细胞物质。举例来说，纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna))在其天然存在状态时不含侧接其的基因或序列。纯化或分离的多肽在其天然存在状态时不含侧接其的氨基酸或序列。将纯化或分离的微生物菌株从其在自然界中存在的环境中移除。因此，分离的菌株可以以例如生物学上纯的培养物或与载体结合的孢子(或菌株的其它形式)形式存在。
42.在某些实施例中，纯化的化合物是感兴趣的化合物的至少60重量％。优选地，制剂是感兴趣的化合物的至少75重量％、更优选地至少90重量％并且最优选地至少99重量％。举例来说，纯化的化合物是作为期望化合物的至少90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％或100重量％(w/w)的纯化的化合物。通过任何适当的标准方法，例如通过柱色谱、薄层色谱或高效液相色谱(hplc)分析来测量纯度。
[0043]“代谢物”是指由代谢产生的任何物质(例如，生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是有机化合物，所述有机化合物是代谢的起始材料、中间物或最终产物。代谢物的实例可以包括但不限于酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、生物聚合物和生物表面活性剂。
[0044]
如本文所用，术语“多个”是指大于一个的任何数量或量。
[0045]“减少”是指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的负变化。
[0046]“表面活性剂”是指降低两种液体之间、液体与气体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的表面活性化合物。表面活性剂用作例如清洁剂、湿润剂、乳化剂、发泡
剂和分散剂。“生物表面活性剂”是由活细胞产生的表面活性物质。
[0047]
本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。举例来说，1到20的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20组成的群组的任何数值、数值组合或子范围以及前述整数之间的所有中间十进制值例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别地考虑了从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。举例来说，1到50示范性范围的嵌套子范围可以在一个方向上包含1到10、1到20、1到30和1到40，或者在另一个方向上包含50到40、50到30、50到20和50到10。
[0048]
与“包含”或“具有”同义的过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。相反，过渡短语“由
……
组成”不包括权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由
……
组成”将权利要求书的范围限制为指定的材料或步骤“以及实质上不影响要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征的材料或步骤”。术语“包含”的使用涵盖了“由一种或多种所叙述的组分组成”或“基本上由一种或多种所叙述的组分组成”的其它实施例。
[0049]
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用的术语“一个(a/an)”和“所述”应理解为单数或复数。
[0050]
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所使用的，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差之内。约可以理解为在所陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。
[0051]
在本文对变量的任何定义中列举化学基团的列举包括将该变量定义为所列基团的任何单个基团或组合。本文中对变量或方面的实施例的叙述包括作为任何单个实施例的所述实施例、或所述实施例与任何其它实施例或其部分的组合。
[0052]
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种组合。
[0053]
本发明的其它特点和优点将从其优选实施例的以下描述以及从权利要求书中显而易见。本文引用的所有参考文献都特此通过引用的方式并入。
[0054]
处理食品加工废料的方法
[0055]
在一个实施例中，本发明提供了用于修复食品生产和加工污水和废弃物的改良方法。更具体地，本发明提供了从废水或其它水体中去除因食品加工产生的杂质、污染物或废料物质的方法。本发明还提供了生产微生物体和/或其生长副产物以用于处理食品加工废料的系统和方法。有利地，本发明的方法是对环境友好的、操作友好的和成本高效的。
[0056]
本发明提供了用于改进食品加工废料处理的方法，特别地，用于生物强化生物废水处理方法。优选地，在一些实施例中，所述方法利用有益微生物体，所述有益微生物体在存在于废水中的有机物和其它废料物质存在的情况下产生酶和其它生长副产物。在某些实施例中，微生物是兼性厌氧菌。在某些实施例中，微生物生长副产物是作为单独的处理组分和/或与有益微生物体组合的处理组分被引入废水中。
[0057]
食品加工废弃物的处理或修复可以包含消化、纯化、净化和/或去除存在于废水中的食品加工废料物质。处理可以是部分的和/或其可以是完整的。
[0058]
如本文所用，“食品加工废弃物”是源自用于生产、加工、碾磨、处理、萃取、精炼和/
或包装人类或动物食品商品的任何类型的场所的废弃物。这些场所可以包括但不限于屠宰场，例如用于牛肉、猪肉、羊羔肉、山羊、马、家禽和其它肉类牲畜的屠宰场；肉类包装厂；海鲜加工厂，例如用于养殖或野生捕捞的鱼、虾、螯虾、螃蟹、龙虾、扇贝、蛤蜊、贻贝、章鱼、鱿鱼和鳗鱼的海鲜加工厂；海鲜罐头厂，例如用于金枪鱼罐头或鲑鱼罐头的海鲜罐头厂；牛奶乳品场；用于生产乳品例如牛奶、奶酪、酸奶、开菲尔(kiefer)和冰淇淋的工厂；食用油厂，例如用于萃取和精炼棕榈油、橄榄油和其它植物油或果实油的食用油厂；以及生产加工食品例如零食、新奇食品、糖果、烘焙食品和饮料的工厂。
[0059]
食品加工废弃物可以包括例如有机废料物质，例如动物粪便、血液、尿液和/或胃(肚)内容物、尸体残余物(例如骨头、皮肤、毛皮、羽毛、鳍、指甲、牙齿、组织和器官)、烹饪残留物、脂肪、油和油脂(fog)、乳清、酸乳清、不溶性多糖(例如纤维素、木质素)和其它杂质例如悬浮固体、有害和/或病原性微生物体以及来自加工厂清洁过程中的残留物。废料物质可以进一步包含来自某些加工食品清洁、灭菌、调味、染色或保存过程中的化学物质和/或冷凝物。
[0060]
在一个具体实施例中，食品加工废弃物包含乳清，所述乳清是通过乳品加工产生的。在一个实施例中，乳清是酸乳清，所述酸乳清是在生产茅屋奶酪、奶油奶酪以及希腊酸奶和其它脱乳清酸奶期间产生的。酸乳清包含乳糖、水和多种蛋白质、肽和脂质。
[0061]
在一个具体实施例中，食品加工废弃物包含棕榈油厂污水(pome)，pome是由棕榈油加工厂产生的并包含悬浮组分，所述悬浮组分包括油、压榨棕榈果实过程中剩下的含油纤维素材料以及糖例如阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
[0062]
在一个实施例中，所述方法包含从存在于厌氧消化池、污水贮留池或其中已经引入食品加工废料物质的另一种水体(例如，池塘、溪流、湖泊或河流)中的废水采取样品，其中所述样品包含食品加工废料物质。在一些实施例中，废水已经被预处理以去除大固体例如骨头和头发，例如通过使其穿过筛子、筛网或过滤器来去除。
[0063]
所述方法可以进一步包含分析样品以鉴别所存在的废料物质的类型。基于样品中所鉴别的废料物质的类型，生产定制微生物混合物，其中混合物包含最适用于消化、纯化、净化和/或去除所鉴别的废料物质的有益微生物体的混合物。
[0064]
在一些实施例中，本发明的方法可以利用存在于厌氧消化池、污水贮留池或水体中的本地微生物体。在一些实施例中，所述方法可以利用起初不存在于消化池、污水贮留池或水体中的补充性微生物体。
[0065]
微生物混合物可以包含例如不同的芽孢杆菌属(bacillus spp.)微生物，例如芽孢杆菌属细菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、侧孢芽孢杆菌(bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。在一个具体示范性实施例中，利用解淀粉芽孢杆菌nrrl b-67928。
[0066]
在一些实施例中，微生物可以是假单胞菌属(pseudomonas spp.)细菌，例如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、鼻疽假单胞菌(pseudomonas mallei)、类鼻疽假单胞菌(pseudomonas pseudomallei)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、产碱假单胞菌(pseudomonas alcaligenes)、门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina)和斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)。
[0067]
这些微生物可以以定制比例存在。有利地，在存在有机废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于有机物分解的其它生长副产物。
[0068]
有利地，在存在废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于食品加工废料物质分解的其它生长副产物。
[0069]
在一些实施例中，本发明的方法可用于废水反硝化和/或从废水和/或活性污泥中去除硝酸盐和/或铵，其中高浓度微生物培养物包含硝酸盐还原菌(nrb)，例如脱氮硫杆菌(thiobacillus denitrificans)、微球菌属(micrococcus spp.)(例如，脱氮微球菌(micrococcus denitrificans)、玫瑰色微球菌(micrococcus roseus))、沙雷氏菌属(serratia spp.)、假单胞菌属和无色杆菌属(achromobacter spp.)。
[0070]
根据本发明的方法的微生物混合物可以包含微生物体本身以及微生物生长副产物和微生物培养产生的任何残留生长培养基。混合物可以进一步包含用于微生物生长的附加营养物。
[0071]
优选地，单独培养微生物混合物中的微生物，并且在将混合物引入废水中之前或之时将所得高浓度微生物产物组合。
[0072]
微生物可以呈营养细胞、孢子、分生孢子、菌丝和/或其组合的形式。在某些实施例中，微生物是使用深层发酵、固态发酵(ssf)或其组合和/或改良型式产生的。在优选实施例中，发酵是使用改良的固态发酵系统进行的。
[0073]
在某些实施例中，废水样品进一步包含微生物群落。在一个实施例中，样品包含厌氧消化池、污水贮留池或另一种水体内的整个微生物群落的代表。
[0074]
可以分析来自废水样品的微生物群落以确定存在于微生物群落内的微生物物种的身份，并确定每个物种相对于微生物群落的其它物种的群体百分比。分析可以包含所属领域中的标准方法，例如dna测序、dna指纹鉴定、elisa和细胞涂铺。
[0075]
可以将存在于微生物群落中的微生物物种分类为对水处理过程有益的、与其共生的或对其有害的。在一些实施例中，分析样品的目的在于判定微生物群落是否处于“失调”。根据本发明，“失调”是指共生和/或有害微生物体、或包含量、百分比或数量大于有益微生物体的量、百分比或数量的共生和/或有害微生物体的微生物群落的过度生长。
[0076]
如本文所用，“有益”微生物是赋予废水处理过程益处的微生物，而不是仅仅共生的微生物或有害的微生物。益处可以包括例如直接消化废水中的废料物质和/或生产有助于此举的代谢物。
[0077]“共生”微生物体是以非有益方式存在于微生物群落内，但不一定对其造成任何直接危害的微生物体。然而，共生微生物体可能会在废水处理过程中在与有益微生物体的空间和资源竞争中胜出，从而导致效率降低。废水处理中的共生微生物体的实例可以包括例如乳杆菌属(lactobacillus spp.)和双歧杆菌属(bifidus spp.)。
[0078]“有害”微生物体是例如通过杀死和/或寄生有益微生物体或产生有害的生长副产物(包括温室气体，例如一氧化二氮和甲烷)对废水处理过程造成直接或间接危害的微生物体。有害微生物体还可以包括病原性生物体，所述病原性生物体如果不从废水中去除，就可能会对其它活生物体或环境造成危害。
[0079]
共生和/或有害微生物体百分比是总群体的至少25％、30％、35％、40％、45％或更
高被认为是失调的。在一些实施例中，与有益微生物体相比，失调微生物群落可以存在有更多或大于50％的群体百分比的共生和/或有害微生物体。
[0080]
处于失调的废水处理场所的效率低于包含较少共生和/或有害微生物体的废水处理场所。因此，本发明优选用于将失调废水处理系统恢复为具有平衡微生物群落的废水处理系统。平衡微生物群落是包含多种微生物物种的微生物群落，多种微生物物种中的大多数对废水处理过程有益。举例来说，在优选实施例中，微生物群落群体的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多包含有益微生物物种。
[0081]
在确定样品内的微生物群落失调之后，所述方法可以进一步包含生产定制“微生物混合物”以添加到微生物群落中，从而使微生物群落摆脱失调。因此，微生物混合物将生物强化废水处理过程的速度(即，使用生物手段提高所述过程的效率)。
[0082]
在某些实施例中，这还可以通过减少产生这些化合物的微生物的数量来帮助减少厌氧消化池、污水贮留池和其它排水场所产生的一氧化二氮和甲烷(都是温室气体)的量。在一些实施例中，所述方法可用于减少废水中的有害和/或病原性微生物体的数量。在一些实施例中，有害微生物体是能够产生有害硫化氢气体的硫酸盐还原菌(srb)。
[0083]
在某些实施例中，将微生物生物强化混合物引入废水中，例如通过将混合物倒入废水中并在其中将其混合。此后，混合物中的微生物在废水内生长和/或萌发，产生必需代谢物以从其中去除杂质、污染物和/或废料物质。在一些实施例中，萌发增强剂可以与微生物混合物一起施用，特别是在微生物以孢子形式施用的情况下。在一些实施例中，所述过程被加热以更进一步提高效率。
[0084]
在一个实施例中，所述方法进一步包含引入可以进一步增强混合物处理能力的微生物生长副产物。生长副产物可以包括由混合物中的微生物产生的生长副产物，或者它们可以作为单独组分添加。
[0085]
在一个实施例中，生长副产物是生物表面活性剂、酶、生物聚合物、溶剂、酸、蛋白质、氨基酸或可用于处理废水的其它代谢物。在一个具体实施例中，生长副产物是生物表面活性剂。
[0086]
生物表面活性剂是由微生物体产生的一组结构多样的表面活性物质。生物表面活性剂是可生物降解的，并且可以在可再生衬底上使用选定的生物体产生。大多数产生生物表面活性剂的生物体响应于生长培养基中烃源(例如油、糖、甘油等)的存在而产生生物表面活性剂。其它培养基组分例如铁浓缩物也可能会显著地影响生物表面活性剂生产。微生物生物表面活性剂由多种微生物体产生，所述微生物体例如是假单胞菌属(绿脓杆菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、莓实假单胞菌、丁香假单胞菌)；黄杆菌属；芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、蜡样芽孢杆菌)；威克汉姆酵母菌属(例如异常威克汉姆酵母菌)、假丝酵母菌属(例如白假丝酵母菌、皱褶假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、解脂假丝酵母、球拟假丝酵母)；红球菌属；节杆菌属；弯曲菌属；棒杆菌属；毕赤酵母属(例如异常毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、西方毕赤酵母)；斯塔莫酵母(例如熊蜂生斯塔莫酵母)等等。
[0087]
所有生物表面活性剂均为两亲分子。它们由两部分组成：极性(亲水)部分和非极性(疏水)部分。脂肪酸的烃链充当生物表面活性剂分子的常见亲脂部分，而亲水部分由中性脂质的酯或醇基团、脂肪酸或氨基酸(或肽)的羧酸酯基团、在黄酮哌脂情况下的有机酸
或在糖脂情况下的碳水化合物形成。由于其两亲结构，生物表面活性剂增加了疏水性水不溶性物质的表面积，增加了此类物质的水生物利用度，并改变了细菌细胞表面的特性。
[0088]
生物表面活性剂在界面处积聚，从而降低了界面张力并导致溶液中聚集胶束结构的形成。生物表面活性剂形成孔并破坏生物膜稳定性的能力允许其用作抗菌剂、抗真菌剂和溶血剂。结合低毒性和可生物降解性的特征，生物表面活性剂有利于用于包括废水处理的多种应用中。
[0089]
根据本发明的方法的生物表面活性剂可以选自例如糖脂(例如槐糖脂、鼠李糖脂、纤维二糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖脂)、脂肽(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节杆菌脂肽和地衣素)、黄酮哌脂、脂肪酸酯、磷脂(例如心磷脂)和高分子量聚合物(例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。
[0090]
一种或多种生物表面活性剂可以进一步包含以下中的任一种或组合：生物表面活性剂的改良形式、衍生物、级分、同种型、异构体或亚型，包括以生物方式或以合成方式改良的形式。在某些实施例中，一种或多种生物表面活性剂以纯形式施用。
[0091]
有利地，生物表面活性剂可以液化某种废料物质例如固化fog，以便疏通堵塞管道，以及增加那些化合物的流动和排水。另外，生物表面活性剂可以与酶协同作用和/或协同不同的酶，这些酶由微生物混合物产生以增强废料处理。此外，生物表面活性剂是可生物降解的。
[0092]
有利地，本发明的方法通过增加处理环境中有益微生物体的比例来提高废水处理效率。另外，特定废水处理系统的微生物群体可能基于系统位置和废水含量而有很大不同；因此，所述方法可以通过利用定制生物体群来加速厌氧过程，所述定制生物体群被选择性地添加到所述群体中以完成窄范围的首选任务。通过优化微生物群体，处理厂可以极大地降低其能源消耗和成本。此外，废水处理不需要停止，这意味着根据处理厂的标准操作程序的处理可以在取样、测试、培养期间以及在根据本发明的方法引入微生物混合物之后不间断地继续进行。
[0093]
根据本发明的微生物的生长
[0094]
本发明提供了使用新型固态发酵或表面发酵来培养微生物体和生产微生物代谢物和/或其它微生物生长副产物的方法。也可以使用混合系统。如本文所用，“发酵”是指细胞在受控条件下的生长。生长可以是好氧的或厌氧的。
[0095]
在一个实施例中，本发明提供了用于生产生物质(例如，活细胞物质)、细胞外代谢物(例如，小分子、聚合物和分泌的蛋白质)、残留营养物和/或细胞内组分(例如，酶和其它蛋白质)的物质和方法。
[0096]
根据本发明使用的微生物生长容器可以是用于工业用途的任何封闭式发酵罐或培养反应器。在一个实施例中，反应器是发酵(proofing)烤箱，例如在商业烘焙中用于例如发酵面团的标准烤箱。在一个实施例中，反应器呈放大外壳的形式，例如拖车或房间，其配备必需组件以例如在基质上提供要被同时培育的数十或数百个培养物生长盘。在一个实施例中，反应器可以任选地配备用于连续生产的自动传送系统或滑轮系统。
[0097]
在一个实施例中，容器可以任选地具有功能控制器/传感器或可以连接到功能控制器/传感器以测量培养过程中的重要因素，例如ph、氧气、压力、温度、搅动器轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。然而，优选地，不需要所述控制。
[0098]
在另一个实施例中，容器还能够监测容器内微生物体的生长(例如，细胞数量和生长阶段的测量)。或者，可以从容器中采取每日样品，并通过所属领域中已知的技术例如稀释涂铺技术对所述样品进行计数。稀释涂铺是用于估计样品中的微生物数量的简单技术。所述技术还可以提供一个指标，通过所述指标可以比较不同的环境或处理。
[0099]
在一个实施例中，所述方法包括用氮源补充培养物。氮源可以是例如硝酸钾、硝酸铵硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用或者以两种或更多种氮源组合的形式使用。
[0100]
所述方法可以为培养物生长提供氧合。一个实施例利用了慢速空气运动来去除含低氧的空气并引入含氧空气。含氧空气可以是每天通过例如气泵补充的环境空气。
[0101]
所述方法可以进一步包含用碳源补充培养物。碳源通常是碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和/或麦芽糖；有机酸，诸如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇，诸如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；脂肪和油诸如大豆油、低芥酸菜子油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和/或亚麻子油；等等。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种碳源组合的形式使用。
[0102]
在一个实施例中，培养基中包括用于微生物体的生长因子、痕量营养物和/或生物刺激物。这在无法产生其所需的所有维生素的微生物生长时是特别优选的。培养基中还可以包括无机营养物，所述无机营养物包括痕量元素例如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴。此外，可以包括维生素、基础氨基酸和微量元素的来源，例如呈面粉或谷物粗粉例如玉米粉的形式，或呈萃取物例如马铃薯萃取物、牛肉萃取物、大豆萃取物、香蕉皮萃取物等的形式，或呈纯化形式。也可以包括氨基酸，例如适用于蛋白质的生物合成的氨基酸。
[0103]
在一个实施例中，还可以包括无机盐。可用的无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁(例如七水合硫酸亚铁)、氯化铁、硫酸锰、单水合硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或者以两种或更多种无机盐组合的形式使用。
[0104]
在一些实施例中，例如，当用于接种底物的微生物呈孢子(例如，细菌内生孢子)形式时，可以将萌发增强剂添加到底物中。根据本发明的萌发增强剂的实例包括但不限于l-丙氨酸、锰、l-缬氨酸和l-天冬酰胺或任何其它已知的萌发增强剂。
[0105]
在一些实施例中，培养方法可以任选地包含在培养过程之前和/或期间向底物中添加附加的酸和/或抗微生物剂。然而，有利地，本发明的方法减少或消除了在培养期间对防止污染的需要，此部分归因于较慢的微生物生长速率。
[0106]
混合物的ph应该适合于感兴趣的微生物体，但有利的是，当使用本发明的培养方法时，不需要使用缓冲剂或ph调节剂来稳定ph。
[0107]
用于培养微生物体和生产微生物副产物的方法和设备可以在分批工艺或准连续工艺中执行。
[0108]
在一个实施例中，用于培养微生物体的方法是在约15℃至60℃、优选地25℃至40℃并且在具体实施例中25℃至35℃或32℃至37℃下进行。在一个实施例中，培养可以在恒温下连续进行。在另一个实施例中，培养可以经受温度变化。可以通过将环境空气泵入反应器中并使其在整个过程中循环来将温度保持在优选范围内。
[0109]
在一个实施例中，不需要对本发明的培养方法中使用的设备和衬底进行完全灭
菌。然而，设备和衬底可以任选地被灭菌。可以在用营养培养基铺展之前和/或之后例如使用高压釜来对托盘进行灭菌。另外，在接种固体底物之前，可以例如通过高压釜处理来对蒸汽锅盖和锅带进行灭菌。
[0110]
培养设备例如反应器/容器可以与灭菌单元例如高压釜是间隔开但连接的。培养设备还可以具有在开始接种之前原位灭菌的灭菌单元。可以通过所属领域中已知的方法对空气进行灭菌。举例来说，环境空气在被引入到容器中之前可以穿过至少一个过滤器。在其它实施例中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或任选地，完全不加热，其中，可以利用低水分活度和低ph来控制细菌生长。
[0111]
在一个实施例中，本发明进一步提供了通过在适合生长和代谢物生产的条件下培养微生物菌株来产生微生物代谢物的方法。任选地，所述方法可以包含纯化代谢物。本发明提供了生产代谢物的方法，所述代谢物例如是生物表面活性剂、生物聚合物、乙醇、乳酸、β-葡聚糖、蛋白质、肽、代谢中间物、多不饱和脂肪酸、脂质和酶。
[0112]
感兴趣的微生物体所产生的微生物生长副产物可以被保留在微生物体中或被分泌到底物中。代谢物含量可以是例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
[0113]
在另一个实施例中，用于生产微生物生长副产物的方法可以进一步包含浓缩和纯化感兴趣的微生物生长副产物的步骤。在另一个实施例中，底物可以含有稳定微生物生长副产物活性的化合物。
[0114]
在一个实施例中，在培养完成时(例如，在例如实现期望的孢子密度或规定代谢物密度时)去除所有微生物培养组合物。在这一分批程序中，在收获第一批后启动全新的批次。
[0115]
在另一个实施例中，在任何一个时间仅去除一部分发酵产物。在这个实施例中，具有活细胞的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。被去除的组合物可以是无细胞底物或含有细胞。以这种方式创建了准连续系统。
[0116]
基质发酵
[0117]
在优选实施例中，本发明提供了使用用于固态发酵或表面发酵的新程序和系统来培养微生物基产物的方法。有利地，本发明不需要具有用于测量和/或稳定do、ph和其它发酵参数的复杂曝气系统、混合器或探针的发酵系统。
[0118]
在优选实施例中，培养微生物体和/或生产微生物生长副产物的方法包含：将一层与水和任选的微生物生长增强营养物混合的固体底物铺展在托盘上以形成基质；将期望种类的接种剂施用到基质表面上；将接种过的托盘放入发酵反应器中；使空气通过反应器以将温度稳定在25℃-40℃之间；并允许微生物体在整个基质中繁殖。
[0119]
在优选实施例中，根据本发明的方法的基质底物包含食料。食料可以包括例如大米、大豆或豆科植物、玉米和其它谷物、面食、麦麸、面粉或谷物粗粉(例如，玉米粉、碱法烹制的玉米粉、部分水解的玉米粗粉)和/或其它类似食料来为微生物培养物的生长和/或取食提供表面区域。
[0120]
在一个实施例中，其中基质底物包含预制面食，所述面食可以由例如玉米粉、小麦粉、粗面粉、米粉、藜麦粉、马铃薯粉、大豆粉、鹰嘴豆粉和/或其组合制成。在一些实施例中，面食由强化面粉制成。
[0121]
在一些实施例中，面食可以呈长绳或带的形状，例如意大利细面或意大利宽面。在
一些实施例中，面食可以呈例如片状、壳状、螺旋状、螺旋形开瓶器状、轮状、中空管状、弓状或其任何变异形状。有利地，微生物可以在面食内部和/或面食外表面上生长。这增加了微生物体可以在其上生长的表面区域，增加了底物内微生物生长的深度，并在培养物内提供了增强的氧气渗透。
[0122]
在一个实施例中，其中基质底物包含米粒，基质底物可以通过将米粒与水和取决于正在培养的微生物，附加的营养培养基混合来制备。
[0123]
在一个实施例中，培养方法包含准备托盘，所述托盘可以是例如适于标准发酵烤箱的金属板平锅或蒸汽平锅。在一些实施例中，“托盘”可以是由例如塑料、金属或玻璃制成的能够容纳底物和培养物的任何器皿或容器，例如烧瓶、杯、桶、板、平锅、槽、筒、盘或柱。
[0124]
制备可以包含用例如箔覆盖托盘的内表面。制备还可以包含通过例如对托盘进行高压釜处理来对托盘进行灭菌。
[0125]
接下来，通过混合食料、水和任选的附加盐和/或营养物以支持微生物生长来制备基质底物。在一个具体实施例中，营养培养基可以包含例如麦芽糖、酵母萃取物或另一种蛋白质源以及矿物质、钾、钠、磷和/或镁源。
[0126]
然后，将混合物铺展到托盘上并分层以形成厚度为约1英寸到12英寸、优选地1英寸到6英寸的基质。基质的厚度可以取决于托盘或在其中准备托盘的其它容器的体积而变化。
[0127]
在优选实施例中，基质底物提供了微生物可以在其上生长的充足的表面区域以及增强的获得氧气供应的途径。因此，微生物在其上生长和繁殖的底物也可以用作微生物的营养培养基。
[0128]
在一些实施例中，可以在基质中形成凹槽、脊、通道和/或孔以增加微生物可在其上生长的表面区域。这也增加了底物内微生物生长的深度，并在整个培养物中提供增强的氧气渗透。
[0129]
为了增加整个底物中的微生物运动性，所述方法可以进一步包含将生物刺激物、马铃薯萃取物和/或香蕉皮萃取物施用到底物上。这允许提高培养物在整个底物表面的分布速度。
[0130]
在一些实施例中，例如，当用于接种底物的微生物呈孢子形式时，可以将萌发增强剂施用到底物。根据本发明的萌发增强剂的实例包括但不限于l-丙氨酸、锰、l-缬氨酸和l-天冬酰胺或任何其它已知的萌发增强剂。
[0131]
然后，可以在将基质铺展到托盘上之后对托盘和基质执行灭菌。灭菌可以通过高压釜或所属领域中已知的任何其它手段来执行。在一些实施例中，这一方法还将有效地烹煮底物。
[0132]
如果期望的话，可以提供盖子和硅锅带用于密封托盘。为了创建完全无菌的系统，也可以对盖子和锅带进行灭菌。
[0133]
在托盘中制备基质底物之后，可以向托盘接种期望微生物体，所述微生物体任选地与无菌营养培养基预混合。任选地，取决于所培养的微生物体和/或所生产的生长副产物，随后可以用盖子和锅带密封托盘。在一个实施例中，例如，当微生物体是芽孢杆菌属细菌时，托盘优选地不被密封。
[0134]
接种物可以包含营养细胞、孢子或其它形式的微生物体。在一个实施例中，通过将
接种物均匀地施用到底物层的表面上来执行接种。接种物可以通过例如喷洒、撒布、倾倒、注射或铺展来施用。在一个实施例中，接种是使用移液管进行的。
[0135]
然后，可以将接种过的托盘放置在发酵反应器内。在一个实施例中，托盘被放置在发酵烤箱内。发酵烤箱可以是例如商业烘焙中使用的标准发酵烤箱。任选地，反应器可以配备传送系统，其中使用例如传送带或滑轮系统使托盘连续移动通过反应器。
[0136]
在一个实施例中，可以使用多个反应器，例如多个发酵烤箱。在一个实施例中，反应器是可分布的和便携的。在其中使用多个反应器的另一个实施例中，多个反应器可以被组装到单个平台上以便于运输。
[0137]
发酵参数可以基于要被生产的期望产品(例如，期望的微生物生物表面活性剂)和所培养的微生物体进行调整。
[0138]
反应器内的温度取决于所培养的微生物体，但一般来说，使用泵送通过反应器的环境空气将温度保持在约25℃-40℃之间。循环空气还可以为培养物提供持续的氧合。空气循环还可以帮助将do保持在期望水平下，例如环境空气的约90％。
[0139]
在一个实施例中，不需要监测或稳定培养物的ph。可以在整个发酵过程中定期向托盘喷洒无菌营养培养基(例如，每天一次、每隔一天一次、每周一次)以实现最大微生物浓度。
[0140]
培养物可以被培育持续使得微生物体达到期望浓度或达到50％-100％孢子形成的时间量，优选地1天到14天、更优选地2天到10天。
[0141]
在一些实施例中，微生物体将在整个发酵过程中消耗基质底物的一部分或全部。
[0142]
一旦培养物形成孢子，就可以从托盘中收获培养物和剩余的底物，然后将其混合在一起以产生微生物浆料。根据这种方法生长的微生物的浓度可以在溶于水中时达到例如1
×
106到1
×
10
13
个繁殖体(或cfu)/克，优选地1
×
108到1
×
10
13
cfu/g、或至少5
×
109到5
×
10
10
cfu/ml。
[0143]
在一个实施例中，微生物浆料被碾磨、微粉化和/或干燥以产生含有微生物体、其生长副产物和基质底物的干燥微生物基产物。微生物浆料可以使用所属领域中已知的任何干燥方法来干燥。在一个实施例中，干燥产物具有约3％至6％保水度。
[0144]
在一个实施例中，使用水将含有溶解的培养物的溶液稀释到1
×
106到1
×
107cfu/ml的浓度以形成液体微生物基产物，所述产物可用于广泛多种的环境和应用中。任选地，可以向水中添加营养物，所述营养物包括例如钾、磷、镁、碳、蛋白质、氨基酸源等等以增强微生物生长。
[0145]
可以在培养期间或在应用微生物基产物时通过添加低(微摩尔)浓度的l-丙氨酸、锰或任何其它已知的萌发增强剂来增强形成孢子的微生物的活化和/或萌发。
[0146]
在一个实施例中，本发明的系统和方法可用于生产微生物代谢物，其中不干燥微生物浆料，而是过滤微生物浆料以将液体与固体分离。随后，如果期望的话，可以使用例如离心、旋转蒸发、微滤、超滤和/或色谱进一步纯化所萃取的包含微生物代谢物的液体。
[0147]
代谢物和/或生长副产物可以是例如生物表面活性剂、酶、生物聚合物、酸、溶剂、氨基酸、核酸、肽、蛋白质、脂质和/或碳水化合物。具体地，在一个实施例中，所述方法可用于生产生物表面活性剂。有利地，所述方法不需要复杂的设备或高能耗。感兴趣的微生物体可以就地小规模或大规模培养并利用，甚至仍与它们的培养基混合。类似地，微生物代谢物
也可以在有需要的位置处被大量生产。
[0148]
有利地，微生物基产物可以在偏远位置中被生产。微生物生长场所可以通过利用例如太阳能、风能和/或水电力而脱离电网运行。
[0149]
发酵室系统
[0150]
在一个实施例中，本发明的方法中利用的发酵反应器可以包含具有四个竖直墙壁、一个地板和一个天花板的大型、防潮、封闭的空间。墙壁可以任选地包含一个或多个窗户和/或门。这个“发酵室”可以复制存在于例如发酵烤箱、发酵反应器中的环境，但规模要大得多。
[0151]
在一个实施例中，发酵室被固定到便携式平台例如带有轮子的拖车上。
[0152]
在一个实施例中，发酵室的内壁具有多个水平表面，用于容纳接种过的底物的容器可以被放置在所述水平表面上。
[0153]
在一个实施例中，表面呈搁板形式。搁板可以被固定到外壳的墙壁上。搁板单元可以被悬挂在天花板上和/或固定到地板上。
[0154]
在一个实施例中，发酵室包含多个金属片盘架。所述片盘架优选地包含多个用于容纳托盘的载玻片，固体底物和微生物培养物被铺展在托盘中。在一个实施例中，架子是便携式的，这意味着可以用轮子将其固定。
[0155]
在一个实施例中，盘架可以容纳10到50个托盘。优选地，载玻片彼此间隔至少3英寸以允许每个托盘之间有最佳的空气循环。
[0156]
在一个实施例中，房间的天花板可以任选地被容纳以允许空气流动，例如具有天花板通风口和/或空气过滤器。此外，天花板和墙壁可以安装uv灯以帮助对系统内的空气和其它表面进行灭菌。有利地，金属托盘和金属盘架的使用增强了uv灯的反射以加强uv灭菌。
[0157]
房间可以配备温度控制器，但优选地，整个房间的空气循环提供期望的发酵温度。
[0158]
发酵室的尺寸可以基于各种因素来定制，所述因素例如是房间的位置和放置在其中的托盘的数量。在一个实施例中，天花板的高度是至少8英尺，而地板的面积是至少80平方英尺。
[0159]
微生物生物强化混合物
[0160]
在某些实施例中，本发明提供了包含一种或多种微生物体和/或一种或多种微生物生长副产物的微生物基产物以用于处理食品加工废料物质，其中产物中的细胞浓度是约1
×
106到1
×
10
13
个细胞(或cfu)/克或更高。在一个实施例中，组合物包含含有微生物体和/或微生物体产生的代谢物和/或任何残留营养物的基质底物。
[0161]
发酵产物无需萃取或纯化即可直接使用。如果期望的话，可以使用所属领域中的技术人员已知的标准萃取方法或技术来实现萃取和纯化。
[0162]
在收获基质底物、微生物和/或副产物后，可以将产物溶解于水中以形成液体产物。
[0163]
或者，在收获基质、微生物和/或副产物后，可以将产物掺合、碾磨和/或微粉化，然后干燥以形成干燥产物。可以将这种干燥产物溶解于水中并根据需要进行稀释。
[0164]
微生物基产物中的微体生物体可以呈活性或非活性形式。在一些实施例中，微生物呈营养体、孢子、菌丝体、菌丝、分生孢子形式和/或它们的混合物的形式。微生物基产物无需进一步稳定、保存和储存即可使用。
[0165]
干燥产物和/或液体产物可以通过例如罐车转移到应用位置以立即使用。
[0166]
在其它实施例中，考虑到例如预期用途、预期应用方法、发酵容器尺寸以及从微生物生长场所到使用位置的任何运输模式，可以将组合物置于合适尺寸的容器中。因此，其中放置微生物基组合物的容器可以是例如1加仑到1,000加仑或更大。在某些实施例中，容器是2加仑、5加仑、25加仑或更大。
[0167]
在从反应器收获微生物基组合物后，可以在收获的产物被加工和/或置入容器中(或以其它方式运输以供使用)时添加其它组分。添加剂可以是例如缓冲剂、载体、在相同或不同场所处生产的其它微生物基组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物、示踪剂、杀虫剂和其它特定于预期用途的成分。
[0168]
有利地，根据本发明，微生物基产物可以包含微生物在其中生长的底物。所述产物中的生物质的量(按重量计)可以是例如0％至100％之间的任何值，包括其间的所有百分比。
[0169]
任选地，产物可以在使用之前被储存。优选地，储存时间短。因此，储存时间可以少于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选实施例中，如果产物中存在活细胞，则将产物储存在冷温度例如低于20℃、15℃、10℃或5℃下。另一方面，生物表面活性剂组合物通常可以被储存在环境温度下。
[0170]
可以根据本发明培养的生物体可以包括例如从活性污泥槽中取样和鉴别的酵母、真菌、细菌、古生菌、原生动物、后生动物和藻类。
[0171]
微生物混合物可以包含例如不同比例的芽孢杆菌属微生物，例如芽孢杆菌属细菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在一个具体示范性实施例中，使用解淀粉芽孢杆菌nrrl b-67928。
[0172]
在一些实施例中，微生物可以是假单胞菌属细菌，例如铜绿假单胞菌、绿针假单胞菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱假单胞菌、门多萨假单胞菌和斯氏假单胞菌。有利地，在存在有机废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于有机物分解的其它生长副产物。
[0173]
有利地，在存在废料物质的情况下，这些微生物产生酶例如蛋白酶、脂肪酶、还原酶和淀粉酶以及有益于食品加工废料物质分解的其它生长副产物。
[0174]
在一个实施例中，细菌是反硝化细菌或硝酸盐还原菌，例如脱氮硫杆菌、微球菌属(例如，脱氮微球菌、玫瑰色微球菌)、沙雷氏菌属、假单胞菌属和/或无色杆菌属。
[0175]
在一些实施例中，微生物体是原生动物和/或后生动物，例如变形虫、鞭毛虫、纤毛虫、轮虫、线虫和水熊虫。在一些实施例中，微生物体是酵母、真菌或藻类。
[0176]
在一个实施例中，微生物混合物包含微生物生长副产物。这些微生物生长副产物可以由培养物中的微生物体产生，和/或可以将它们添加到培养物中，之后将培养物引入废水中。生长副产物可以包括例如生物表面活性剂、酶、生物聚合物、溶剂、酸、蛋白质、氨基酸、碳水化合物和/或可用于处理废水的其它代谢物。在一个实施例中，生长副产物是生物表面活性剂。
[0177]
在某些其它实施例中，组合物包含一种或多种微生物生长副产物，其中生长副产物已经被从微生物培养物中萃取并且任选地被纯化。举例来说，在一个实施例中，可以掺合本发明的方法的基质底物以形成浓浆料，可以将所述浓浆料过滤或离心以将液体部分与固
体部分分离。然后，包含微生物生长副产物的液体部分可以原样使用或使用已知方法来纯化。
[0178]
微生物基产物的本地生产
[0179]
在本发明的某些实施例中，微生物生长场所以期望规模生产感兴趣的新鲜、高密度的微生物体和/或微生物生长副产物。微生物生长场所可以位于应用位置(例如，在食品加工厂)处或附近。所述场所在分批培养、准连续培养或连续培养中生产高密度微生物基组合物。
[0180]
本发明的微生物生长场所可以位于将使用微生物基产物的位置处。举例来说，微生物生长场所可以距使用位置小于300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。
[0181]
本发明的微生物生长场所产生新鲜的微生物基组合物，所述组合物包含微生物本身、微生物代谢物和/或微生物在其中生长的培养基的其它组分。如果期望的话，组合物可以具有高密度的营养细胞或繁殖体、或营养细胞与繁殖体的混合物。
[0182]
由于微生物基产物可以无需借助常规微生物生产的微生物体稳定、保存、储存和运输过程而在本地生产，所以可以产生密度高得多的微生物体，从而需要更小体积的微生物基产物以用于现场应用，或允许需要实现期望功效的密度高得多的微生物应用。系统是高效的并且可以消除使细胞稳定或将细胞从其培养基中分离出来的需要。微生物基产物的本地生产也有助于在产物中包括生长培养基。培养基可以含有在发酵期间产生的特别充分适用于本地使用的试剂。
[0183]
本地生产的高密度、稳健的微生物培养物在现场比留在供应链中一段时间的微生物培养物更有效。与传统产物(其中，细胞已与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物分离)相比，本发明的微生物基产物是特别有利的。减少的运输时间允许根据本地需求以一定的时间和体积生产和递送新鲜批次的微生物和/或其代谢物。
[0184]
在一个实施例中，微生物生长场所位于将使用微生物基产物的位置上或附近，例如在300英里、200英里或甚至100英里内。有利地，这允许组合物被订做以在指定位置处使用。微生物基组合物的配方和效力可以针对特定应用并根据应用时的当地条件来进行定制。
[0185]
有利地，分布式微生物生长场所提供了依赖分布广的工业规模的生产商的针对当前问题的解决方案，这些生产商由于上游加工延迟、供应链瓶颈、存储不当和阻碍例如活的、高细胞计数的产物以及细胞最初在其中生长的相关培养基和代谢物的及时递送和应用的其它突发事件而致使产品质量受损。
[0186]
此外，通过本地生产组合物，可以针对特定位置和应用时存在的条件实时调整配方和效力。这提供了优于在中心位置预制并且具有例如对于给定位置可能不是最佳的设定比率和配方的组合物的优点。
[0187]
微生物生长场所因其能够订做微生物基产物以改进与目的地地区的协同作用而提供了制造多功能性。有利地，在优选实施例中，本发明的系统利用天然存在的本地微生物体和其代谢副产物的力量。
[0188]
在例如发酵的24小时之内的本地生产和递送产生纯、高细胞密度组合物并且大大降低了运输成本。鉴于在开发更有效和更强大的微生物接种剂方面有快速进展的前景，消费者将从这种快速递送微生物基产物的能力中受益匪浅。
[0189]
实例
[0190]
可以从以下以说明方式给出的实例中更深入地理解本发明和其许多优点。以下实例说明了本发明的一些方法、应用、实施例和变型。不应将所述实例认为是对本发明的限制。可以关于本发明作出许多改变和修改。
[0191]
实例1
–
芽孢杆菌孢子的发酵
[0192]
对于芽孢杆菌属孢子生产，使用麦麸基培养基。培养基在不锈钢蒸汽锅中被灭菌，然后用盖子和锅带加以密封。灭菌后，向平锅接种种子培养物并在发酵烤箱中培育48-72小时。在发酵结束时，收获1
×
10
10
个孢子/克芽孢杆菌。
[0193]
实例2
–
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的固态发酵
[0194]
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以使用固态发酵方法来进行培养。培养基仅包含玉米粉(部分水解的玉米粉)或麦麸。任选地，可以包括附加营养物例如盐、糖蜜、淀粉、葡萄糖、蔗糖等以促进微生物生长。
[0195]
铝箔覆盖的托盘在接种前经受高压釜处理。培养基以约1到2英寸厚的层形式铺展于托盘上。在衬底中制作凹槽和/或孔以增加培养基的表面积。为了提高生长速度，即增加细菌的运动性和在整个培养基中的分布，可以将马铃薯萃取物或香蕉皮萃取物添加到培养物中。
[0196]
然后，将所选的芽孢杆菌菌株的孢子喷洒到衬底的表面上，并将托盘置入发酵烤箱中。发酵烤箱内的发酵是在32℃-40℃之间的温度下进行。环境空气被泵送通过烤箱以使温度稳定。
[0197]
根据这种方法生长的微生物在溶解于水中时的浓度可以达到至少5
×
109到5
×
10
10
个孢子/毫升。然后，在混合槽中用水将产物稀释到1
×
106到1
×
107个孢子/毫升的浓度。也可以添加的营养物包括例如钾盐(0.1％或更低)、糖蜜和/或葡萄糖(1-5g/l)和硝酸盐。
[0198]
参考文献
[0199]
taguchi,k.,yasuda,k.,hanai,y.,abe,t,mae,h.《废水处理工艺(wastewater treatment process)》.美国专利9,994,469b2,2018年6月12日.(“taguchi等人”)。
再多了解一些
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