利用呼吸道上皮细胞膜防治呼吸道传染病的方法及应用与流程

1.本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及利用呼吸道上皮细胞膜防治呼吸道传染病病原体感染的方法及应用。


背景技术：

2.呼吸道传染病是指病原体(如病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体等)从人体的鼻腔、咽、喉、气管、支气管和肺部等呼吸道感染侵入而引起的传染性疾病。
3.由呼吸道感染病病原体感染而导致的新发、突发、重症传染病严重威胁人民健康与社会稳定，对区域交流与经济建设造成重创，其中最具有代表性的包括例如：冠状病毒如2003年的非典型肺炎(severe acute respiratory syndrome,sars)、2012的中东冠状病毒(middle east respiratory syndrome，mers)、2019新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)；以及高致病性流感病毒(influenza virus)，如2009h1n1“猪流感”、2013人感染h7n9等。其他通过呼吸道传播的病原体(包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体等)，如麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、脑膜炎球菌、结核杆菌等也对全球公共卫生带来严峻的挑战。
4.目前，针对重大呼吸道传染病病原体的特异性或通用型疫苗仍有待开发，以获得更为有效的治疗性疫苗或药物。传统的抗病原体药物，如干扰素(interferon，ifn)或单克隆中和抗体在临床治疗中存在较大的局限性，如ifnα的应用反而容易加剧肺部炎症反应，而抗体药物因其靶点较为单一而容易促使病原体产生突变株从而逃逸免疫应答。此外，现有抗体的广谱性不足，难以有效应对新发突发传染病疫情。因此，开发新型、通用型抗呼吸道传染病病原体防治生物产品以及药物具有重大意义。
5.呼吸道传染病病原体(例如病毒)特异性受体在人类呼吸道组织细胞膜表面广泛表达。例如，病毒侵入的首要条件以及病毒组织嗜性和发病机理的决定因素就是呼吸道组织细胞膜表面的病毒特异性受体。病毒的主要膜蛋白能够特异性识别靶细胞膜表面的病毒受体分子，进而吸附、入侵靶细胞，利用宿主细胞的复制系统完成自身的复制周期。因此，切断病毒膜蛋白和宿主细胞受体分子之间的“作用联系”，有望阻断病毒的入侵。
6.已鉴定了多种常见重要呼吸道传染病病原体的靶细胞膜表面受体分子，例如：流感病毒、腮腺炎病毒的受体包括唾液酸或唾液酸修饰的糖蛋白；高致病性冠状病毒(sars-cov和sars-cov-2)的受体是血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme 2,ace2)；中东冠状病毒(mers-cov)的受体是cd26(又称为dipeptidyl peptidase-4,dpp4)分子；人类冠状病毒(hcov-229e)的受体是cd13肽酶(apn)；麻疹病毒利用cd46和slam家族分子作为受体；呼吸道合胞病毒利用cx3cr1作为受体分子；人肺炎衣原体利用igf-2分子结合进入靶细胞。呼吸道传染病病原体的特异性受体可包括不止一种分子，常出现共受体分子以及多受体分子。因此，人类呼吸道上皮细胞膜表面不仅具有已鉴定出的受体分子，还可能具有未知的、尚未被鉴定的其他受体分子。
7.同时，呼吸道上皮细胞的细胞膜上还存在诸多的抗感染蛋白分子(如抗病毒感染
蛋白分子，例如干扰素诱导的跨膜蛋白ifitm1)和调节机体细胞免疫反应的分子(如tnf-α受体，干扰素受体α/β)。这些蛋白分子在宿主抗呼吸道病原体感染过程中发挥了重要作用。
8.美国专利申请公开号us20130337066a1、us20160136106a1、us20170274059a1、us20180169027a1描述了利用细胞膜(包括细菌包膜和哺乳动物细胞膜)，在体外包裹纳米材料(内含特异性药物)作为药物传递载体，应用于疫苗、肿瘤、传染病等方面防治。其哺乳动物细胞膜主要指的是人红细胞膜、免疫细胞细胞膜、以及血小板细胞膜。其涉及的主要原理是通过纳米颗粒外层包裹的细胞膜将纳米颗粒内核所含的抗肿瘤等药物靶向递送至特定组织细胞中，从而达到药物定向递送的目的。然而，这些文献中并未公开以细胞膜及其表面上的受体为抑制病毒感染的手段。
9.综上，本领域中仍然迫切需要开发出能够有效预防和/或治疗呼吸道传染病病原体感染的方法和产品。


技术实现要素：

10.本公开中提供了一种有效预防和/或治疗呼吸道传染病的应用、方法和产品，其优选具有广谱性和/或特异性。本公开的应用、方法和产品中采用了未经修饰或经修饰呼吸道上皮细胞的细胞膜，所述细胞膜可稳定表达例如病原体特异性受体分子、免疫调节分子和/或抗感染分子(如抗病毒感染分子)，以对呼吸道病原体起到抑制作用，从而可将其应用至防治呼吸道病原体的感染与传播中。
11.在本公开的第一方面中，提供了呼吸道上皮细胞的细胞膜在制备用于预防和/或治疗呼吸道传染病病原体感染的产品中的应用。
12.在一些实施方式中，所述病原体通过呼吸道传播。
13.在一些实施方式中，所述病原体作用于呼吸道上皮细胞以实现入侵和/或感染。
14.在一些实施方式中，所述病原体选自：呼吸道传染病病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体等。
15.在一些实施方式中，所述呼吸道上皮细胞选自：肺上皮细胞、气管上皮细胞、支气管上皮细胞、鼻咽部上皮细胞，例如所述上皮细胞选自a549细胞、calu-1细胞、calu-3细胞、beas-2b细胞或np69细胞等。
16.在一些实施方式中，所述呼吸道上皮细胞的来源为哺乳动物来源，例如来源于人、大鼠、小鼠，优选来源于人。
17.在一些实施方式中，所述细胞膜为未经修饰的细胞膜或经修饰的细胞膜，例如所述细胞膜为野生型呼吸道上皮细胞的细胞膜、经基因工程化改造的细胞膜、经化学修饰的细胞膜。
18.在一些实施方式中，所述细胞膜为细胞膜碎片。
19.在一些实施方式中，所述经修饰的细胞膜选自：经修饰以在其上具有过表达的呼吸道传染病病原体细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子的细胞膜；经修饰以在其上表达野生型中不存着的呼吸道传染病病原体细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子的细胞膜；或以上的任意组合。
20.在一些实施方式中，所述细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子为全长序列、其活性片段、与其他分子融合表达形成的融合蛋白；融合表达的方式包括但不限于与
抗体的fc序列融合、与抗体的可变区融合以靶向免疫原至特定的细胞或区域、与不同信号肽的融合、与细胞因子融合等。
21.在一些实施方式中，所述细胞表面受体为选自下组中的一种或多种：唾液酸或唾液酸修饰的糖蛋白、血管紧张素转化酶2(ace2)、cd26分子、cd13肽酶(apn)、cd46、slam家族分、cx3cr1分子、igf2分子等。
22.在一些实施方式中，所述免疫调节分子或抗病原体分子为选自下组中的一种或多种：ifitm1、ifn-k、il-7、il-15、il-21、il-6受体、tnf-a受体、il-1受体、i类干扰素受体或其亚单位和毒素受体。
23.在一些实施方式中，所述呼吸道传染病病原体为选自下组中的一种或多种：流感病毒(例如h1n1、h3n2、h7n9、h5n1等)、冠状病毒(例如sars-cov、sars-cov-2、mers-cov)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、尼帕病毒、人偏肺病毒和人肺炎衣原体等。
24.在一些实施方式中，所述产品为药物。
25.在一些实施方式中，所述产品的形式适于如下施用方式：滴鼻、喷雾、雾化吸入或其任意组合。
26.在本技术的一个方面中，提供了制备本文所述细胞膜和/或产品的方法，其包括：
27.(a)提供呼吸道上皮细胞，其中所述细胞经修饰或未经修饰；以及
28.(b)分离所述细胞的细胞膜，以获得未经修饰的细胞膜或经修饰的细胞膜；
29.(c)可任选地，将分离得到的细胞膜制成产品，例如直接制成药物、包被或偶联于载体材料(例如生物可降解纳米材料)形成药物(例如纳米颗粒药物)。
30.在一些实施方式中，通过工程化改造使得所述细胞过表达呼吸道传染病病原体的细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子或表达野生型中不存在的呼吸道传染病病原体细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子。
31.在一些实施方式中，采用慢病毒载体、质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、cmv载体对细胞进行工程化改造，以使所述细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子高表达于呼吸道上皮细胞膜表面。
32.在本技术的另一方面中，提供了一种产品，其包含本文所述的呼吸道上皮细胞的细胞膜或包含通过本文所述方法制备的细胞膜。
33.在本公开的其他方面中，还提供了一种预防和/或治疗呼吸道传染病病原体感染或其相关病症的方法，所述方法包括给予有需要的对象有效量的如前所述的呼吸道上皮细胞的细胞膜或产品。
34.在本公开的其他方面中，还提供了一种呼吸道上皮细胞的细胞膜或包含该细胞膜的产品，其用于预防和/或治疗呼吸道传染病病原体感染或其相关病症。
35.本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
36.下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
37.图1：在细胞膜上稳定且大量表达ace2蛋白的ace2-a549细胞系的成功构建：
38.a图：蛋白免疫印迹(wb)结果显示ace2得到大量表达；
39.b图：用带有荧光标记的sars-cov-2受体结合域蛋白rbd对ace2-a549细胞进行染色，流式细胞术结果显示a549细胞膜表面表达了大量功能性ace2蛋白。
40.图2：蛋白免疫印迹(wb)实验显示了ace2-a549细胞膜成功分离制备。图中显示，在细胞膜组分中可以检测到细胞膜表面蛋白表皮生长因子受体(egfr)及ace2蛋白，而几乎检测不到细胞质蛋白组分——β-肌动蛋白(β-actin)。而在细胞质组分中只能检测到β-肌动蛋白，却不能检测到细胞膜蛋白egfr和ace2。
41.图3：显示了a549细胞膜组分对新型冠状病毒“假病毒”感染具有抑制作用。图中显示，野生型a549细胞膜组分能够有效抑制新冠假病毒感染，而高表达ace2的细胞膜组分对新冠假病毒感染具有更强的抑制作用，两种细胞膜的半数抑制浓度(ic
50
)可相差两倍以上。
42.图4：显示了野生型a549细胞膜组分能够有效抑制甲型流感病毒h1n1(a图和b图)和h7n9(c图和d图)感染靶细胞；a图和c图蛋白免疫印迹结果显示了细胞膜组分对甲型流感病毒h1n1和h7n9的抑制作用具有剂量依赖关系，500μg/ml的细胞膜组分能够非常有效的抑制病毒复制；b图和d图分别反映了a图和c图中病毒蛋白表达水平与细胞骨架蛋白表达水平之间的相对表达值，最后转换成了对病毒感染抑制率的表述。
43.图4中的标注1～5分别对应于：1、未感染对照；2、pbs处理对照；3、wt-a549膜组分500μg/ml；4、wt-a549膜组分250μg/ml；5、wt-a549膜组分125μg/ml。
具体实施方式
44.本技术提供了广谱或特异地预防和/或治疗呼吸道传染病的技术、方法和产品。具体而言，本技术中提供了直接采用野生型呼吸道上皮细胞的细胞膜组分来预防和/或治疗呼吸道传染病的技术方案。本技术中还进一步提供了采用稳定高表达病原体(如病毒)特异性受体分子和/或免疫调节分子的呼吸道上皮细胞膜及其组分来防治呼吸道传染病病原体感染与传播的技术方案。
45.更具体而言，本技术中公开了一种针对呼吸道传染病病原体感染(如甲型流感病毒h1n1/h7n9和冠状病毒sars-cov-2)的广谱或特异防治技术。在一些实施方式中，将呼吸道传染病病原体(如病毒)受体蛋白(如ace2)或其他抗病原体分子和免疫调节分子稳定并且大量表达在人源呼吸道上皮细胞(如a549)的细胞膜上，制备含有所述受体和其他抗病原体分子的细胞膜及其组分；用含有这些蛋白分子的细胞膜生物产品去竞争性结合病原体膜蛋白，从而阻断病原体感染靶细胞。亦或是免疫调节分子直接或间接参与抗病原体的免疫反应，进而起到了防治呼吸道传染病病原体感染的作用。本技术重点阐述了利用野生型呼吸道上皮细胞膜组分或稳定且大量表达病毒受体蛋白和抗病毒蛋白分子的细胞膜组分，以及利用包含所述细胞膜的制品防治呼吸道传染病病原体感染的技术方法。
46.本文所提供的呼吸道上皮细胞膜及其产品可通过竞争性结合病原体(包括原始入侵的病原体和/或在体内复制或繁殖后进一步产生的病原体)起到预防和/或治疗由病原体引起的呼吸道传染病及其症状。
47.本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本公开提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭
示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
48.如本文所用，在数值或范围上下文中的“约”表示所引用或要求保护的数值或范围的
±
10％。
49.应理解，当提供参数范围时，本发明同样提供了在该范围内的所有整数及其十分位小数。例如，“0.1-2.5”包括0.1、0.2、0.3等直至2.5。
50.如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
51.呼吸道上皮细胞的细胞膜及其表面分子
52.如本文所用，呼吸道上皮细胞是指分布于或分离自呼吸道组织上皮处的细胞，其通常为呼吸道传染病病原体感染的主要部分。呼吸道是呼吸时气流所经过的通道，其包括：上呼吸道，例如鼻、咽和喉；以及下呼吸道，例如气管、支气管和肺部。呼吸道上皮细胞包括但不限于如上所述呼吸道组织的上皮细胞，例如可选自a549细胞、calu-1细胞、calu-3细胞、beas-2b细胞、np69细胞等。
53.呼吸道上皮细胞的细胞膜(或称“本技术的细胞膜”或“细胞膜制品”)是指分离自呼吸道上皮细胞的细胞膜或其组分，其可包括细胞膜碎片(即非完整细胞膜)。
54.本文所用的呼吸道上皮细胞的细胞膜可为天然的细胞膜(即未经人工修饰)，也称野生型细胞膜，也可为经修饰以在其上具有过表达的病原体细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子的细胞膜，或可为经修饰以在其上表达野生型中不存着的病原体细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病原体分子的细胞膜；或以上的任意组合。
55.该细胞膜上携带了与作用于呼吸道上皮细胞膜的病原体直接或间接相互作用的各种分子，例如病毒细胞表面受体、免疫调节分子和/或抗病毒分子，这些分子可为已知分子或未知分子，单独的分子或接合、复合或融合的分子。例如，所述分子可为全长序列、其活性片段、与其他分子融合表达形成的融合蛋白。
56.病原体细胞表面受体包括但不限于选自下组中的一种或多种：唾液酸或唾液酸修饰的糖蛋白、血管紧张素转化酶2(ace2)、cd26分子、cd13肽酶(apn)、cd46、slam家族分子、cx3cr1和igf2分子。抗抗原肽分子或免疫调节分子包括但不限于选自下组中的一种或多种：ifitm1、ifn-k、il-7、il-15、il-21、il-6受体、tnf-a受体、il-1受体、i类干扰素受体或其亚单位和毒素受体。
57.本技术所述病原体特异性受体分子包含但不仅限于已经被报道的受体分子，还包括未被报道的存在于呼吸道上皮细胞膜上的潜在共受体分子。
58.可采用各种方法对呼吸道上皮细胞进行工程化改造。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。例如，采用慢病毒载体、质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、cmv载体对细胞进行工程化改造。
59.例如，可使得呼吸道上皮细胞膜上表达有ace2受体分子，所述ace2分子可具有例如seq id no:3所示的氨基酸序列、或为与seq id no:3具有90％以上同源性的氨基酸序列，或者可由包含seq id no:1所示序列的核酸分子所编码或由与seq id no:1所示序列具
有90％以上同源性的核酸分子所编码。经证实，在细胞膜上稳定高表达ace2分子的呼吸道上皮细胞膜对于通过结合ace2受体分子实现感染的呼吸道病毒(例如sars-cov和sars-cov-2)具有优异的抑制感染作用。
60.本技术所述的技术方法包含但不仅限于将直接编码病原体特异性受体分子的膜蛋白基因通过生物技术使其在呼吸道上皮细胞中表达、编码相应受体蛋白，还包括将促进相应受体蛋白基因表达的其他基因或者dna/rna元件通过生物技术方法使其在细胞中发挥促进相应病原体受体蛋白表达的功能。
61.本技术所述的技术方法包括将一种特异性病毒受体分子稳定且高表达在呼吸道上皮细胞膜上，还包括将两种或者更多种病毒受体和抗病毒分子同时表达在呼吸道上皮细胞膜上，以达到广谱防治呼吸道传染病的目的。
62.可采用常规的方法(例如使用市售的细胞膜制备试剂盒)分离获得呼吸道上皮细胞的细胞膜，去除细胞内细胞器和细胞核等组分的干扰。例如，可裂解细胞后对其膜组分进行分离(例如离心分离)。
63.包含细胞膜的药物
64.本文中还提供了一种包含本公开呼吸道上皮细胞的细胞膜的产品。在一些实施方式中，产品可为包含本公开呼吸道上皮细胞的细胞膜的药物组合物(如药品)。
65.本文中的产品可包含有效量的本公开所述的呼吸道上皮细胞的细胞膜，以及药学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”或“本发明的活性物质”可互换使用，是指本公开呼吸道上皮细胞的细胞膜(包括其组分或碎片)。
66.在本公开的实施方式中，本文的产品可用于预防和/或治疗与呼吸道传染病病原体感染相关的疾病或病症。例如，本发明的产品可用于预防和/或治疗呼吸道病毒感染。
67.如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
68.如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(remington’s pharmaceutical sciences，mack pub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
69.在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地，ph约为6-8。
70.本公开产品中的细胞膜活性物质可占产品总重量的0.001～99.9wt％，例如1～95wt％，5～90wt％，10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
71.如本文所用，术语“单位剂型”是指为了方便施用，将本发明产品制备成单次施用所需的剂型，包括但不限于各种喷雾剂、液体剂、固体剂(如片剂)等。
72.应理解，所用活性呼吸道上皮细胞膜的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效
果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。
73.此外，本文的产品还可含有用于预防、改善和/或治疗呼吸道病原体感染性疾病的其它活性物质，所述的其它活性物质可包括但不限于：临床常用抗生素(包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)。
74.应用
75.本文还提供了一种用于预防和/或治疗呼吸道传染病病原体感染和/或其症状的方法，其包括：至少一次给予预防和/或治疗有效量的本公开一种或多种细胞膜和/或产品。
76.本技术针对的是防治呼吸道传染病病原体，包含但不仅限于流感病毒(甲型流感病毒和乙型流感病毒)、冠状病毒(sars-cov-2、sars-cov、mers-cov)、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒等，还包含其他通过呼吸道传播的病原体(病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体等)。
77.本技术产品的应用对象可为人或其他哺乳动物，例如非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜诸如牛、羊、猪和马；家养哺乳动物诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠等。术语“哺乳动物”和“动物”被包括在这个定义中，旨在涵盖成年、幼年以及新生个体。
78.以药物包或药盒的形式提供本文的组合产品可，例如可将本文的一种或多种药物组合物或药物或其一种或多种成分包装在一个或多个容器中，例如包装在指明组合物的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。可以液体、无菌冻干粉或无水浓缩物等形式提供组合物，可在临用前用适当液体(例如水、盐水等)对其进行稀释、复原和/或配制以获得用于给予至对象的适当浓度和形式。
79.可采用的给药方式包括但不限于：呼吸道内给药方式，如雾化、滴鼻、喷剂等；系统性给药方式，如静脉注射等。在本技术的优选实施方式中，本技术产品可通过呼吸道给药。在该方面中，本技术的产品可无需额外添加特定的药物递呈材料如纳米材料包裹的其他药物，无需体内注入如静脉注射等，从而可显著降低成本，提升用药安全性，是一种广谱且特异的防治呼吸道传染病的技术方法。
80.实施例
81.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
82.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，new york：cold spring harbor laboratory press，1989)或按照供应商所建议的条件。dna的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
83.除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
84.实施例1：构建稳定表达ace2蛋白的肺上皮细胞系ace2-a549
85.肺上皮细胞系a549(购自atcc#ccl-185)来源于人非小细胞肺癌上皮细胞，是用于研究呼吸道传染病病原体感染的主要体外细胞模型。
86.通过基因合成技术体外合成人ace2基因(seq id no:1)，将ace2基因插入至慢病毒载体phage-puro(addgene#118692)中，并与包装质粒pspax2(addgene#12260)以及包膜质粒pmd2.g(addgene#12259)共转染293t细胞，48小时后收取慢病毒上清。用重组ace2慢病毒感染a549细胞，离心感染2小时，继续培养24小时后利用嘌呤霉素筛选表达ace2的a549细胞，连续加药筛选14天，最后获得ace2-a549细胞。
87.通过蛋白免疫印迹(western blot)验证a549细胞中ace2基因表达情况(图1a)，以及利用流式细胞术验证ace2在a549细胞膜上的表达情况(图1b)。蛋白免疫印迹实验中人ace2抗体稀释比例为1:1000(兔多克隆抗体abcam#ab15348)，β-肌动蛋白(β-actin)抗体稀释比例为1:3000(兔单克隆抗体abcam#ab179467)。流式细胞术实验中利用荧光染料(alexa fluor488，invitrogen#a30006)标记的sars-cov-2受体结合域rbd和小鼠fc的融合蛋白(rbd-mfc，novoprotein#dra32)，常温与ace2-a549孵育20分钟后，用流式检测仪检测ace2在细胞膜上的表达。
88.结果显示，野生型a549不表达ace2蛋白，而采用上述方法构建的ace2-a549细胞系可稳定高效表达ace2。上述结果证明了稳定高效表达ace2的a549细胞系的成功构建。
89.实施例2：细胞膜的分离、制备
90.本实施例中对如下三种细胞系分别进行细胞膜分离和制备：野生型a549(wt-a549)、空载体对照a549(vector-a549)以及稳定表达ace2的a549(ace2-a549)。
91.利用细胞膜分离试剂盒(thermo fisher scientific#89842)进行提取、分离、制备细胞膜样品。简要实验步骤如下：将4
×
106个细胞铺在10厘米细胞培养皿中，总共准备5个皿共计2
×
107个细胞数量。37℃细胞培养箱中常规培养12小时后，用冷的pbs缓冲液清洗三遍，再用细胞刮将细胞收集起来备用。用试剂盒里的细胞清洗液清洗细胞两遍之后，用透化缓冲液处理细胞10分钟，使细胞质组分释放。16,000g离心15分钟后，去除上清，用增溶缓冲液重悬沉淀，使细胞膜组分重新溶解至溶液中，4℃处理30分钟。16,000g离心15分钟后，将含有细胞膜组分的上清液转移至新的ep管中。利用超滤管(merck，#ufc9003-3kd)进行脱盐。每次用预冷的pbs稀释细胞膜样品，4℃，4,500g离心30分钟，直至脱盐稀释比例达到1000倍。
92.利用标准bca方法定量细胞膜组分样品中蛋白质浓度(以备后续试验中定量添加蛋白质)，再用蛋白免疫印迹验证细胞膜组分分离效率。通过检测细胞膜组分相关蛋白表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)和ace2的表达，以及细胞质组分标志物β-肌动蛋白(β-actin)的表达，验证了细胞膜分离制备成功(图2)。
93.实施例3：利用细胞膜或其组分体外抑制sars-cov-2感染
94.本实施例采用冠状病毒假病毒系统，在细胞层面检测假病毒感染细胞。利用新型冠状病毒(sars-cov-2)棘突蛋白基因(spike，seq id no:4，参考genbank:qhd43416.1表达质粒pcdna3.1-spike(由上海捷瑞生物科技有限公司进行spike全基因合成，克隆至pcdna3.1表达载体中)和带有荧光素酶报告基因的hiv-1骨架质粒(pnl4-3-luc-δenv，nih aids reagent program#3418)共转染293t细胞，48小时后收取含有冠状病毒假病毒的细胞培养上清。
95.用含有假病毒的上清感染表达ace2的293t细胞(ace2-293t细胞系构建方法同ace2-a549)，如果假病毒成功感染靶细胞，则通过检测感染细胞中报告基因荧光素酶的表达水平，即可反映假病毒的感染效率。步骤如下：用细胞完全培养基两倍比系列稀释实施例2中分离制备的细胞膜样品，将50微升体积的细胞膜稀释样品与50微升含有200tcid
50
的冠状病毒假病毒混合，37℃孵育1小时，加入到含有20,000个ace2-293t细胞的96孔细胞培养板，培养48小时后检测荧光素酶的表达水平。
96.结果显示，野生型a549和ace2-a549细胞膜组分均可有效抑制新型冠状病毒感染靶细胞，并且过表达了ace2蛋白后的细胞膜组分抑制效果更显著(图3)，其半数抑制浓度ic
50
较野生型低了约2倍。
97.实施例4：利用a549细胞膜组分体外抑制甲型流感病毒感染
98.本实施例验证了在体外细胞水平，a549细胞膜组分能够有效抑制甲型流感病毒感染靶细胞(野生型a549)。
99.选择了两种甲型流感病毒，分别是甲型/加利福尼亚/07/2009h1n1(a/california/07/2009h1n1)和甲型/上海/4664t h7n9(a/shanghai/4664t/2013h7n9)(上海市公共卫生临床中心生物安全三级实验室保存)，并分别在生物安全二级实验室和生物安全三级实验室进行相关实验。
100.提前12小时在24孔细胞培养板铺上100,000个野生型a549细胞。将实施案例2制备的细胞膜组分100微升的稀释液(500微克/毫升、250微克/毫升、125微克/毫升)和100微升含有100,000个感染性流感病毒粒子(感染复数moi为1)在37℃孵育1小时，然后加入至提前准备好的细胞中，感染8小时后收取细胞样本。利用蛋白免疫印迹实验检测流感病毒核蛋白(np)和聚合酶蛋白(pb2)，以及细胞骨架蛋白(gapdh)的表达水平。
101.图4a/b分别为细胞膜组分抑制甲型流感病毒h1n1感染的蛋白免疫印迹结果及相应的病毒蛋白相对表达抑制率(膜处理组相对于pbs处理组的表达水平)。图4c/d分别为细胞膜组分抑制甲型流感病毒h7n9感染的蛋白免疫印迹结果及相应的病毒蛋白相对表达抑制率(膜处理组相对于pbs处理组的表达水平)。
102.结果显示，野生型a549细胞膜组分能够有效抑制甲型流感病毒h1n1(图4a/b)和h7n9(图4c/d)感染靶细胞a549。
103.该结果证明了野生型a549细胞膜组分对流感病毒感染具有有效抑制作用。
104.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。