一种用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器的制备和使用方法与流程

1.本发明涉及卡那霉素光电化学适配体传感器的制备及使用方法。


背景技术：

2.卡那霉素(kanamycin，kan)是一种氨基糖苷类抗生素，用于治疗多种感染。它通过和原核核糖体的30s亚单位相互作用，诱导误译并阻断易位。当过量的卡那霉素通过食物摄入或药物处方而在人体内存在时，卡那霉素会导致严重的副作用，包括听力丧失和对肾脏的毒性。目前，欧盟、中国、日本等国家明确规定牛奶中卡那霉素的最大残留量(mrl)为200μg/kg。因此，抗生素的使用量至关重要，在销售和市场分销之前，必须测试食品中的抗生素含量进行检测，以确保是否含有超过mrl的残留抗生素。对于食品中抗生素的检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法和酶学等。然而，这些检测方法都存在着操作繁琐、成本高、需要专业的技术人员操作以及难以实现现场的快速检测。因此，有必要开发出一种简便、快捷和灵敏度高的分析检测方法，以实现对kan的快速检测。
3.光电化学(pec)传感采用电极界面上的光活性材料作为信号转换器，在光照射下产生的电信号作为读出信号。对于pec生物传感器而言，用于特定识别的生物元素也是必不可少的。适配体是一种生物识别原件，能与目标物发生特异性结合。基于适配体的pec生物传感器在许多应用中有着较为突出的优点。适配体的核酸结构的高度灵活性以及结构设计的便利性，使得开发各种新型适配子传感器成为可能。
4.申请号为cn202010430562.5的发明专利一种高效灵敏检测卡那霉素的光电化学传感器的制备方法中，先制备石墨相氮化碳g-c3n4和mofs(pcn-222)，将g-c3n4和mofs的复合物滴涂于掺杂氟的sno2透明导电玻璃(fto电极)上，g-c3n4为具有2.7ev带隙的片层状结构，mofs是带隙约为1.65ev的针状结构，两者复合，g-c3n4为mofs提供大的比表面积，mofs@g-c3n4电子复合率低可产生较强的光电流。卡那霉素的加入会结合导带上的电子从而产生降低的阴极光电流。该传感器对卡那霉素的线性范围为1-1000nm，检出限为0.127nm，灵敏度较低。


技术实现要素：

5.本发明是要解决现有的检测卡那霉素的光电化学适配体传感器的灵敏度低的技术问题，而提供一种用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器的制备和使用方法。
6.本发明的用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器的制备方法，按以下步骤进行：
7.一、tio
2 nra的制备：将去离子水和质量百分浓度为35％～36％的盐酸按体积比为1:(1～1.2)搅拌均匀，得到混合溶剂；随后向混合溶剂中滴加钛酸丁酯，搅拌均匀，得到混合溶液；将洗净的fto玻璃基片倾斜放置反应釜内胆中，再倒入上述的混合溶液，随后将反应釜置于干燥箱中，在150～160℃的条件下保持5～7h进行反应，反应结束后，将带有薄
膜的fto玻璃基片再置于马弗炉中在温度为450～480℃的条件下煅烧1.5～2h，在fto玻璃基片上得到tio
2 nra，用tio
2 nra/fto表示；
8.更进一步地，步骤一中洗净的fto玻璃基片是将fto玻璃基片依次放入丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗5～10min，再干燥后得到的。
9.更进一步地，步骤一中钛酸丁酯与混合溶剂的体积比为1：(60～65)；
10.二、bi/biobr/tio
2 nra的制备：将0.012～0.143g kbr加入到30ml含有0.079～0.632gbi(no3)3·
5h2o和0.36g葡萄糖的乙二醇溶液中，搅拌至溶液完全溶解呈透明状态，得到前驱液；将前驱液倒入到装有tio
2 nra/fto的高压釜中；再将高压釜置于马弗炉中，在温度为160～170℃的反应18～20h，反应结束后，带有薄膜的fto玻璃基片用去离子水冲洗干净，得到bi/biobr/tio
2 nra/fto电极；
11.三、光电化学适配体传感器的制备：将质量百分浓度为0.1％～0.15％的壳聚糖(cs)溶液滴涂到bi/biobr/tio
2 nra/fto电极上，干燥后将电极置于质量百分浓度为2.5％～3.0％的戊二醛溶液中浸泡1～3h；接着将氨基修饰的卡那霉素适配体滴涂到bi/biobr/tio2nra/fto电极表面孵育3～6h；随后用ph为7.4的pbs溶液冲洗电极，得到aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto电极；再将aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto电极放入质量百分浓度为1～3％的牛血清蛋白(bsa)溶液中孵育0.5～1h，然后用ph＝7.4的pbs溶液清洗干净，得到用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器，记为bsa/aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto。
12.更进一步地，bi/biobr/tio
2 nra/fto电极上滴加的质量百分浓度为0.1％～0.15％的壳聚糖溶液的体积是按每平方厘米电极上滴加30～50μl质量百分浓度为0.1％～0.15％的壳聚糖溶液。
13.更进一步地，其中所述的氨基修饰的卡那霉素适配体的碱基序列是5'-nh
2-(ch2)
6-tgg-ggg-ttg-agg-cta-agc-cga-3'。
14.用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器定量检测卡那霉素的方法为标准曲线法，具体按以下步骤进行：
15.一、将bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto传感器分别置于1pm～200nm的卡那霉素标准溶液中保持1h，接着用ph＝7.4的pbs溶液冲洗电极，得到kan/bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto电极；
16.二、在电化学工作站上，配备500w氙灯光源和400nm截止滤光片，采用三电极体系，以kan/bsa/aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto作为工作电极、铂片电极为对电极、饱和甘汞电极(sce)为参比电极，电解液为ph＝7.4的pbs缓冲溶液，在0.3v外加偏压下进行安培瞬态光电流-时间测试，得到不同的卡那霉素浓度对应的光电信号，以卡那霉素浓度的对数为横坐标，以对应的光电信号为纵作标绘制标准曲线；
17.三、将bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto传感器置于待测卡那霉素溶液中保持1h，接着用ph＝7.4的pbs溶液冲洗电极，得到测试电极；在电化学工作站上，配备500w氙灯光源和400nm截止滤光片，采用三电极体系，以测试电极为工作电极，以铂片电极为对电极、饱和甘汞电极(sce)为参比电极，电解液为ph＝7.4的pbs缓冲溶液，在0.3v外加偏压下进行安培瞬态光电流-时间测试，得到光电信号；再在标准曲线出查出该光电信号对应的卡那霉素浓度，从而达到检测卡那霉素的目的。
18.本发明的卡那霉素光电化学适配体传感器是以葡萄糖为绿色还原剂，采用简单的
一锅溶剂热法制备bi/biobr并负载于tio
2 nra上，制备出bi/biobr/tio
2 nra三元复合材料。通过tio
2 nra、biobr和bi三相结合，根据tio
2 nra与biobr形成的p-n异质结与bi的表面等离子体共振(spr)效应结合，提高光电材料的可见光利用率，改善其光电性能，从而提高光电化学生物传感器的灵敏度。另外biobr与tio
2 nra构建的p-n异质结有利于提高电子的转移速率，金属bi的spr效应结合p-n异质结结构极大程度的利用可见光光源，有利于提高光电化学适配体传感器的光电性能。
19.本发明引入的适配体识别元件，提高了光电化学传感器的特异性识别能力，降低了其他抗生素的干扰，实现了针对卡那霉素的特异性检测。而且光电化学卡那霉素配体传感器用于卡那霉素的检测时，它是基于适配体将半导体空穴氧化的卡那霉素捕获，所发生的光电流变化进行检测，具有检测成本低、高灵敏度、线性检测范围为1pm～200nm，线性检测范围宽，检测限低至0.7pm、设备简便、易操作等优点。
20.本发明将氨基修饰的卡那霉素适配体负载于bi/biobr/tio
2 nra电极表面，以提高该传感器的特异性识别能力，构建出的光电化学适配体传感器灵敏度高、选择性好，有利于实现对卡那霉素的精准检测，可应用于食品质量安全检测领域。
附图说明
21.图1为实施例1的步骤一制备的tio
2 nra的sem照片；
22.图2是实施例1步骤二的对比操作中制备的biobr/tio
2 nra的sem照片；
23.图3是实施例1步骤二制备的bi/biobr/tio
2 nra的sem照片。
24.图4是实施例1中制备的tio2nra/fto、biobr/tio
2 nra/fto二元复合物、bi/biobr/tio2nra/fto电极材料、aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto和bsa/aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto电极的交流阻抗图谱。
25.图5是实施例1中制备的tio2nra/fto、biobr/tio
2 nra/fto二元复合物、bi/biobr/tio2nra/fto电极材料、aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto和bsa/aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto电极的时间-电流测试曲线图。
26.图6为实施例1制备的用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器检测不同浓度的卡那霉素的电流响应曲线图。
27.图7为实施例1制备的用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器检测不同浓度的卡那霉素的线性曲线图。
28.图8为实施例2制备的用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器对不同干扰物的抗干扰测试图。
具体实施方式
29.实施例1：本实施例的用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器的制备方法，按以下步骤进行：
30.一、tio
2 nra的制备：首先将长
×
宽＝2cm
×
1cm的fto玻璃基片依次放入丙酮、乙醇和去离子水中各超声5min进行清洗，再干燥后备用；将去离子水和质量百分浓度为36％的盐酸按体积比为1:1搅拌均匀，得到混合溶剂；随后向60ml混合溶剂中滴加2ml钛酸丁酯，搅拌均匀，得到混合溶液；将洗净的fto玻璃基片倾斜放置反应釜内胆中，再倒入上述的混
合溶液，随后将反应釜置于干燥箱中，在150℃的条件下保持6h进行反应，反应结束后，将带有薄膜的fto玻璃基片再置于马弗炉中在温度为450℃的条件下煅烧1.5h，在fto玻璃基片上得到tio
2 nra，用tio
2 nra/fto表示；
31.二、bi/biobr/tio
2 nra的制备：将0.0714g kbr加入到30ml含有0.316g bi(no3)3·
5h2o和0.36g葡萄糖的乙二醇溶液中，搅拌至溶液完全溶解呈透明状态，得到前驱液；将前驱液倒入到装有tio
2 nra/fto的高压釜中；再将高压釜置于马弗炉中，在温度为160℃的反应18h，反应结束后，将带有薄膜的fto玻璃基片样品用去离子水冲洗干净，得到bi/biobr/tio2nra/fto电极；
32.同时将步骤二的前驱液中的葡萄糖去掉，其它步骤二相同，制备biobr/tio
2 nra/fto电极作为对比电极；
33.三、光电化学适配体传感器的制备：将50μl质量百分浓度为0.1％的壳聚糖(cs)溶液滴涂到bi/biobr/tio
2 nra/fto电极上，干燥后将电极置于5ml质量百分浓度为2.5％的戊二醛溶液中浸泡1h；接着将50μl氨基修饰的卡那霉素适配体滴涂到bi/biobr/tio2nra/fto电极表面孵育3h；随后用ph为7.4的pbs溶液冲洗电极，得到aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto电极；再将aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto电极放入5ml质量百分浓度为3％的牛血清蛋白(bsa)溶液中孵育1h，然后用ph＝7.4的pbs溶液清洗干净，得到用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器，记为bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto。其中所述的氨基修饰的卡那霉素适配的碱基序列是5'-nh
2-(ch2)
6-tgg-ggg-ttg-agg-cta-agc-cga-3'。
34.实施例1中步骤一得到的tio
2 nra/fto的扫描电镜照片如图1所示，其中图1a为tio2nra的顶部的sem图像，图1b分别为tio
2 nra的截面sem图像，从图1中可以看出tio2nra与fto紧密结合并且棒状的tio
2 nra整齐有序排列将fto表面均匀覆盖。这为后续的材料负载起到了支撑作用并且提供了足够的负载空间。
35.实施例1中步骤二制备的作为对比的biobr/tio
2 nra的sem图像如图2所示，从图2可以看出，片层结构的biobr在tio
2 nra顶部相互堆叠，形成菊花状的biobr。
36.实施例1中步骤二得到的bi/biobr/tio
2 nra的sem图像如图3所示，从图3可以看出，随着葡萄糖的加入，部分金属bi逐渐在biobr表面生成，呈光滑的球状形貌。
37.对本实施例1中所制备的tio2nra/fto、biobr/tio
2 nra/fto二元复合物、bi/biobr/tio
2 nra/fto电极材料、aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto和bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto电极进行交流阻抗测试和时间-电流测试。如图4和图5所示。在图4中，曲线的半圆直径反映出电子所受阻力的大小，直径越小，说明电子在转移的过程中所受的的阻力越小，电子转移速率越大。图中的a～e依次代表tio2nra/fto、biobr/tio2nra/fto、bi/biobr/tio2nra/fto、aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto和bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto曲线。曲线c的半圆直径最小，相对应的电流越大，说明bi/biobr/tio
2 nra的光电性能强于tio
2 nra(曲线a)和biobr/tio
2 nra(曲线b)的光电性能。然而添加了卡那霉素适配体和bsa后，曲线d和曲线e的半圆直径逐渐增大，相对应的电流则进一步减小。这是由于适配体和bsa属于绝缘性生物大分子，阻碍了电子的移动。这一系列的曲线变化说明用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器的成功制备。
38.为了定量检测卡那霉素的含量，用实施例1中所制备的光电化学适配体传感器检测卡那霉素，采用标准曲线法，具体的操作步骤如下：
39.一、配制卡那霉素标准溶液，标准溶液浓度分别为200nm、100nm、50nm、10nm、1nm、500pm、100pm、50pm、10pm、5pm和1pm；将用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器分别浸入不同浓度的卡那霉素标准溶液中孵育1h。反应结束后用ph为7.4的pbs缓冲溶液清洗干净，晾干。所获得的电极记为kan/bsa/aptamer/bi/biobr/tio2nra/fto。
40.二、在电化学工作站上配备500w氙灯光源和400nm截止滤光片，采用三电极体系，以kan/bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto作为工作电极、铂片电极为对电极、饱和甘汞电极(sce)为参比电极，电解液为0.1m pbs(ph,7.4)缓冲溶液，在0.3v外加偏压下进行安培瞬态光电流-时间(i-t)测试。不同浓度的卡那霉素溶液对应的光电流如图6所示，其中kan的浓度从a到k依次为：1pm、5pm、10pm、50pm、100pm、500pm、1nm、10nm、50nm、100nm和200nm，kan的浓度越大，电流值i增强。随着kan的浓度增加而增加。以δi(δi＝i
0-i，其中i0和i分别表示适配体传感器在孵育kan前和孵育kan后的光电流值)为纵作标，kan浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，所得到的标准曲线如图7所示。从图7可以看出，在1pm～200nm的线性范围内，δi与kan浓度的对数呈现线性关系。所得到的线性方程为δi(μa)＝8.08916lg(c/nm) 36.76843，相关系数为0.998。在信噪比为3(s/n＝3)时，检测限(s/n＝3)为0.7pm。说明该传感器用于检测卡那霉素具有宽的检测范围和低的检测限。
41.三、将所制备的bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto置于实际样品的目标待测溶液中，根据检测的光电响应信号，采用步骤二中的计算方法得出δi值。根据标准曲线得出目标物中kan的浓度以完成对卡那霉素的检测。
42.实施例2：为了考察用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器的稳定性、重复性和选择性，分别制备了5支独立的工作电极，并在相同的实验条件下对相同浓度的卡那霉素进行检测。具体的操作过程如下：
43.一、tio
2 nra的制备：一、tio
2 nra的制备：首先将5支长
×
宽＝2cm
×
1cm的fto玻璃基片依次放入丙酮、乙醇和去离子水中各超声5min进行清洗，再干燥后备用；将去离子水和质量百分浓度为36％的盐酸按体积比为1:1搅拌均匀，得到混合溶剂；随后向60ml混合溶剂中滴加1ml钛酸丁酯，搅拌均匀，得到混合溶液；将洗净的fto玻璃基片倾斜放置反应釜内胆中，再倒入上述的混合溶液，随后将反应釜置于干燥箱中，在150℃的条件下保持6h进行反应，反应结束后，将带有薄膜的fto玻璃基片再置于马弗炉中在温度为450℃的条件下煅烧1.5h，在fto玻璃基片上得到tio
2 nra，用tio
2 nra/fto表示；
44.二、bi/biobr/tio
2 nra的制备：0.0714g kbr加入到30ml含有0.316g bi(no3)3·
5h2o和0.36g葡萄糖的乙二醇溶液中，搅拌至溶液完全溶解呈透明状态，得到前驱液；将前驱液倒入到装有tio
2 nra/fto的高压釜中；再将高压釜置于马弗炉中，在温度为160℃的反应18h，反应结束后，将带有薄膜的fto玻璃基片样品用去离子水冲洗干净，得到bi/biobr/tio2nra/fto电极；
45.三、光电化学卡那霉素适配体传感器的制备：
46.将50μl 0.1％的壳聚糖(cs)溶液滴涂到5支bi/biobr/tio
2 nra/fto电极上，干燥后将电极置于5ml 2.5％的戊二醛溶液中浸泡1h。接着将氨基修饰的卡那霉素适配体滴涂到bi/biobr/tio
2 nra/fto电极表面孵育3h。随后用ph为7.4的pbs溶液冲洗电极，得到aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto。将aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto电极放入5ml 3％的牛血清蛋白(bsa)溶液中孵育1h，然后用ph为7.4的pbs溶液清洗干净，所得到的5支用于检
测卡那霉素的光电化学适配体传感器，记为bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto。其中所述的氨基修饰的卡那霉素适配的碱基序列是5'-nh
2-(ch2)
6-tgg-ggg-ttg-agg-cta-agc-cga-3'。
47.将5支独立的用于检测卡那霉素的光电化学适配体传感器分别与100nm的标准卡那霉素标准液孵育1h，接着用ph为7.4的pbs溶液清洗干净，干燥后获得的电极记为kan/bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto电极。在电化学工作站上配备500w氙灯光源和400nm截止滤光片，采用三电极体系，以kan/bsa/aptamer/bi/biobr/tio
2 nra/fto作为工作电极、铂片电极为对电极、饱和甘汞电极(sce)为参比电极，电解液为0.1m的ph为7.4的pbs缓冲溶液，在0.3v外加偏压下进行安培瞬态光电流-时间(i-t)测试。通过光电流的响应信号计算5支独立电极的相对标准偏差(rsd)来评估传感器的重现性，rsd的计算结果为4.73％。说明实施例2制备的光电化学适配体传感器具有较好的重现性。在600s记录了连续10次开关，光电流响应信号几乎未发生明显改变，这说明本发明的用于检测卡那霉素传感器具有良好的稳定性。
48.为了验证实例2所制备的光电化学卡那霉素适配体传感器的选择性，选择土霉素、氯霉素、金霉素、氟氧沙星、阿莫西林以及含有这5种抗生素的卡那霉素“混合样品”作为干扰物。其中，卡那霉素与干扰物的浓度均为100nm。在电化学工作站上采用500w氙灯光源配备400nm截止滤光片，0.3v外加偏压下进行安培瞬态光电流-时间(i-t)测试。测试结果如图8所示，从图8中可以看出实施例2所制备的光电化学卡那霉素传感器只对含有卡那霉素的样品有明显的光电流响应，而对其他干扰物的响应信号相对较弱。这些结果证实了本发明的光电化学卡那霉素适配体传感器对氯霉素的选择性较高。