本发明涉及药物质量检测
技术领域：
，具体涉及一种巴柳氮钠胶囊中有关物质的检测方法。
背景技术：
巴柳氮钠胶囊(BalsalazideSodiumCapsules)的主要成分为巴柳氮钠，化学名为5-[[对-[(2-羧乙基)氨甲酰基]苯基]偶氮]水杨酸二钠盐二水合物，适用于轻度至中度活动性溃疡性结肠炎。巴柳氮钠是一种前体药物，口服后以原药形式到达结肠，在结肠细菌的作用下释放出5-氨基水杨酸和4-氨基苯甲酰-β-丙氨酸，其中，5-氨基水杨酸可以通过阻断结肠中花生四烯酸代谢产物的生成而发挥减轻炎症的作用。巴柳氮钠一般以对-硝基苯甲酰氯为起始原料，经与β-丙氨酸缩合、氢气还原、重氮化后与水杨酸偶合、成盐四步反应制得，根据美国药典标准，巴柳氮钠胶囊在合成和贮存过程中，会产生杂质水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、巴柳氮钠有关物质B，化学结构式依次如下：巴柳氮钠胶囊现行的国内标准由于颁布时间较久，按照该方法检测的产品杂质个数较少且峰型较差，不能较好地控制产品中的杂质，已不适用国家食品药品监督管理局现在的要求。此外，由于国内巴柳氮钠原料中杂质较多，采用美国药典标准仍有部分色谱峰的分离度未达到要求，检测效果仍然不理想。技术实现要素：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种巴柳氮钠胶囊中有关物质的检测方法，该方法实现了巴柳氮钠胶囊中杂质成分的最佳分离，从而使杂质能被更好地检出，提高了产品质量的可控性和安全性。为实现上述发明目的，本发明公开了一种巴柳氮钠胶囊中有关物质的检测方法，具体采用高效液相色谱法，色谱条件如下：柱温：40～50℃(优选为43～47℃)。检测波长：235～245nm(优选为236～240nm)。流动相流速：0.8～1.2mL/min(优选为0.9～1.1mL/min)。填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶。稀释剂：水。流动相A：0.02mol/L～0.05mol/L(优选为0.05mol/L)醋酸铵溶液，其pH值为6.5～7.5(优选为7.1～7.3)。所述流动相A的pH调节剂为氨溶液，优选为将质量百分比浓度为25～28％的浓氨水稀释至原浓度的10％～35％后使用。流动相B：乙腈。梯度洗脱程序：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)085～955～15585～955～154070～8020～304570～8020～306085～955～157085～955～15流动相A和流动相B之和为100(％)。本发明所述检测方法中的有关物质包括水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、联苯偶氮水杨酸和巴柳氮钠有关物质B。其中，水杨酸、巴柳氮钠有关物质A和巴柳氮钠有关物质B均源自美国药典，但由于国内外原料合成工艺的差异，国内的质量标准中还应该明确其他需要鉴定的工艺杂质。巴柳氮钠胶囊中的有关物质联苯偶氮水杨酸为发明人经过大量定性分析确定的，采用本发明方法能较好地鉴别出该杂质，从而实现巴柳氮钠胶囊中所有杂质成分的最佳分离，联苯偶氮水杨酸的化学结构如下所示：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的检测方法可控、灵敏度高、专属性和准确度好，通过进一步优化色谱条件，可实现同时检测联苯偶氮水杨酸等多种已知杂质和其他未知杂质，为控制巴柳氮钠胶囊中的有关物质提供了新方法，提高了产品的质量可控性。采用本发明有关物质检测方法能较好地鉴别出杂质联苯偶氮水杨酸，可实现巴柳氮钠胶囊杂质成分的最佳分离，从而达到本品杂质被更好检出的目的，提高了产品的安全性。附图说明图1为WS1-(X-109)-2011Z方法检测的供试品溶液色谱图；图2为USP40-NF35巴柳氮钠胶囊方法检测的供试品溶液色谱图图3为本发明方法检测的供试品溶液色谱图；图4-11中的供试品为更换原料药后的巴柳氮钠胶囊产品；图4为本发明方法检测的供试品溶液色谱图；图5为溶剂空白、系统适应性溶液、对照品溶液和供试品溶液叠图；图6为酸破坏样品叠图；图7为碱破坏样品叠图；图8为氧化破坏样品叠图；图9为高温破坏样品叠图；图10为高湿破坏样品叠图；图11为光照破坏样品叠图。具体实施方式下面申请人结合实施例和说明书附图对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不限于这些实施例。相关技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。以下各实施例中检测所用的巴柳氮钠胶囊供试品为马应龙药业集团股份有限公司生产的样品(规格为：以巴柳氮钠计，0.45g，使用时取胶囊中的内容物，即“本品细粉”)，巴柳氮钠对照品来自中国食品药品检定研究所，纯度为100％；水杨酸来自中国食品药品检定研究所，纯度为99.3％；巴柳氮钠有关物质A来自USP，纯度为100％；巴柳氮钠有关物质B来自USP，纯度为98％；联苯偶氮水杨酸为康龙化成(北京)新药技术股份有限公司制备纯化，纯度为98.1％。实施例1：巴柳氮钠胶囊有关物质分析方法建立按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)对巴柳氮钠胶囊中有关物质进行检测，先配制供试品溶液：精密称取本品细粉适量(约相当于巴柳氮钠100mg)，置100ml量瓶中，加入稀释剂70ml，超声5分钟使溶解，冷至室温后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。分别按照现行国内药典方法(标准编号：WS1-(X-109)-2011Z)和美国药典方法(标准编号：USP40-NF35)检测巴柳氮钠胶囊的有关物质。按照WS1-(X-109)-2011Z巴柳氮钠胶囊的方法检测的供试品溶液色谱图见图1，由图可知，检测到巴柳氮钠胶囊供试品溶液的杂质个数较少，且峰型较差。按照USP40-NF35巴柳氮钠胶囊的方法检测的供试品溶液色谱图见图2，由图可知，检测到巴柳氮钠胶囊供试品溶液的杂质个数较国标方法更多，且色谱峰的分离度更好；但是尚有个别色谱峰的分离度未达到要求，仍然不理想。基于此，本发明对现有检测方法进行优化，优化后的高效液相色谱条件如下：色谱柱：WelchXtimateC185μm4.6*250mm柱温：45℃检测波长：238nm流速：1.0ml/min稀释剂：水进样体积：30μl流动相为流动相A和流动相B混合流动相流动相A：醋酸铵溶液(用醋酸铵3.86g，加水800ml溶解，用8wt％氨溶液调节pH值至7.20，加水至1000ml)流动相B：乙腈梯度洗脱程序：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0901059010407525457525609010709010按照优化后的色谱条件检测的供试品溶液色谱图见图3，由图可知，采用本发明检测方法能较好地鉴别出杂质联苯偶氮水杨酸，可实现巴柳氮钠胶囊杂质成分的最佳分离，从而达到本品杂质更好检出的目的。由上述检测结果可知，由这批原料药制得的胶囊产品杂质较多，因此更换了原料药并用于实施例2的方法学验证中。按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)对更换原料药后的巴柳氮钠胶囊中有关物质进行检测，检测得到的供试品溶液色谱图见图4，具体的色谱条件以及供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液的配制方法如下所示：(1)色谱条件色谱柱：WelchXtimateC185μm4.6*250mm柱温：45℃检测波长：238nm流速：1.0mL/min稀释剂：水进样体积：30μl流动相为流动相A和流动相B混合流动相流动相A：醋酸铵溶液(用醋酸铵3.86g，加水800mL溶解，用8wt％氨溶液调节pH值至7.20，加水至1000mL)流动相B：乙腈梯度洗脱程序：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0901059010407525457525609010709010(2)溶液的配制方法供试品溶液：精密称取本品细粉适量(约相当于巴柳氮钠100mg)，置100mL量瓶中，加入稀释剂70mL，超声5分钟使溶解，冷至室温后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液：精密称取巴柳氮钠对照品10.0mg，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取1mL，置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。系统适用性溶液：分别精密称取10mg水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、联苯偶氮水杨酸、巴柳氮钠有关物质B至4个100mL量瓶中，各加入约70mL稀释剂，超声使溶解，冷却至室温，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得分离度储备液。再精密称取100mg巴柳氮钠对照品至100mL量瓶中，并分别向其中精密加入分离度储备液各10mL，加入约70mL稀释剂，超声使溶解，冷却至室温，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液。试验结果表明：由图4可知，采用本发明有关物质检测方法能较好地鉴别出杂质联苯偶氮水杨酸，可实现巴柳氮钠胶囊杂质成分的最佳分离，从而达到本品杂质更好检出的目的。实施例2：巴柳氮钠胶囊有关物质分析方法验证对本发明制定的有关物质测定方法专属性、耐用性、检测限、定量限、线性、准确度、精密度、样品溶液稳定性进行验证，结果如下，证明本发明有关物质测定方法可行性良好。(1)专属性试验按实施例1有关物质方法配制空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，试验结果见图5。试验结果表明：溶剂空白在巴柳氮钠主峰及各杂质保留时间处无明显干扰，巴柳氮钠与相邻杂质巴柳氮钠有关物质A的分离度为25.21(>1.5)，巴柳氮钠与相邻杂质巴柳氮钠有关物质B的分离度为14.00(>1.5)，已知杂质之间分离度均较好。结论：本品空白溶剂不干扰有关物质测定。强制降解试验：强制降解试验各条件项下供试品溶液配制方法见表1，精密量取30μl，注入液相色谱仪，色谱条件同实施例1，通过比较未破坏样品与酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏、高湿破坏、光照破坏样品的峰面积，考察其是否可以达到物料平衡，验证方法的可行性，各条件下试验结果见图6～图11。表1试验结果表明：在高温条件下，产生了一个新的未知杂质峰；在碱破坏条件下，杂质峰巴柳氮钠有关物质A峰面积增大；在氧化破坏条件下，产生的杂质个数较多，说明样品在氧化条件下不稳定；在高湿、光照和酸破坏条件下均较稳定。各破坏条件下，其他杂质峰与已知杂质峰均可达到基线分离，已知杂质峰与主峰的纯度因子均大于单点阈值，说明峰纯度良好。各破坏条件下，物料平衡值均在90％～110％，符合标准规定。结论：各破坏样品色谱图中已知杂质与其他杂质峰之间的分离度良好，不干扰测定，色谱条件良好。(2)系统适用性试验按实施例1有关物质测定项下的色谱条件，精密量取有关物质测定项下的系统适用性溶液30μl，连续进样6次，记录色谱图，系统适用性试验结果汇总见表2。表2试验结果表明：本品有关物质项下系统适用性溶液重复进样6次，峰保留时间RSD均小于1.0％，峰面积的RSD均小于2.0％，符合规定。结论：仪器进样精密度良好。(3)检测限和定量限试验采用L-0.05％的线性溶液，精密量取30μl，照实施例1有关物质项下色谱条件，注入液相色谱仪，当信噪比S/N≥3时，即得检测限。直接采用L-0.1％的线性溶液，精密量取30μl，照实施例1有关物质项下色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，当信噪比S/N≥10时，即得定量限，结果见表3～7。表3水杨酸的检测限和定量限结果汇总表4巴柳氮钠有关物质A的检测限和定量限结果汇总表5联苯偶氮水杨酸的检测限和定量限结果汇总表6巴柳氮钠的检测限和定量限结果汇总表7巴柳氮钠有关物质B的检测限和定量限结果汇总试验结果表明：巴柳氮钠及其各已知杂质检测限溶液的信噪比以及峰面积的RSD均符合可接受标准(S/N≥3，RSD≤20％)。巴柳氮钠及其各已知杂质定量限溶液的信噪比以及峰面积的RSD均符合可接受标准(S/N≥10，RSD≤10％)。结论：本发明的有关物质测定方法灵敏度较高，能准确测定供试品溶液中定量杂质的含量。(4)线性试验和已知杂质的校正因子杂质储备液的配制：采用实施例1项下系统适应性溶液配制中的分离度储备液作为杂质储备液。巴柳氮钠对照品储备液的配制：精密称取10mg巴柳氮钠对照品至10mL量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。按表8分别用储备液稀释出校正因子线性溶液。表8不同浓度线性溶液的配制方法照实施例1有关物质测定项下色谱条件，精密量取线性溶液各30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表9。表9线性试验结果汇总名称相关系数r线性方程线性范围(μg/mL)巴柳氮钠1.0000y＝51.367x 0.99190.26～10.42水杨酸0.9999y＝65.369x 0.14710.26～10.57巴柳氮钠有关物质A1.0000y＝65.738x 1.08790.27～10.88联苯偶氮水杨酸0.9999y＝79.011x-0.74870.25～10.16巴柳氮钠有关物质B1.0000y＝89.681x 1.33780.26～10.33取各已知杂质与巴柳氮钠的线性方程的斜率进行计算，得到各已知杂质相对于巴柳氮钠的校正因子，见表10。表10各已知杂质相对于巴柳氮钠的校正因子试验结果表明：巴柳氮钠、水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、联苯偶氮水杨酸、巴柳氮钠有关物质B在线性浓度范围内均呈良好线性关系。结论：本品有关物质检测方法的线性关系良好。(5)准确度试验按照表11分别制备各杂质浓度水平为0.05％,0.1％和1.0％的准确度溶液，每一水平平行配制3份，配制示例如下：表11照实施例1有关物质测定项下色谱条件，精密量取对照品溶液(同实施例1项下)及9份准确度溶液各30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质的回收率(将已知杂质的校正因子带入计算回收率)。试验结果表明：在0.05％浓度水平，水杨酸回收率为108.4～113.5％，平均回收率为111.8％，RSD为2.6％；巴柳氮钠有关物质A回收率为95.3～97.1％，平均回收率为96.4％，RSD为1.0％；联苯偶氮水杨酸回收率为95.4～98.9％，平均回收率为97.3％，RSD为1.8％；巴柳氮钠有关物质B回收率为102.8～103.4％，平均回收率为103.1％，RSD为0.3％；均符合可接受标准(浓度水平0.05％的3份溶液中单个回收率为85-115％，平均回收率为85-115％，RSD应≤20％)。在0.1％浓度水平，水杨酸回收率为107.7～109.8％，平均回收率为108.7％，RSD为1.0％；巴柳氮钠有关物质A回收率为100.7～103.2％，平均回收率为102.0％，RSD为1.2％；联苯偶氮水杨酸回收率为94.4～95.5％，平均回收率为94.9％，RSD为0.6％；巴柳氮钠有关物质B回收率为104.1～106.3％，平均回收率为104.9％，RSD为1.2％；均符合可接受标准(浓度水平0.1％的3份溶液中单个回收率为85-115％，平均回收率为85-115％，RSD应≤20％)。在1.0％浓度水平，水杨酸回收率为100.3～101.6％，平均回收率为101.1％，RSD为0.7％；巴柳氮钠有关物质A回收率为105.8～106.4％，平均回收率为106.0％，RSD为0.4％；联苯偶氮水杨酸回收率为102.1～103.9％，平均回收率为103.2％，RSD为1.0％；巴柳氮钠有关物质B回收率为103.5～103.9％，平均回收率为103.7％，RSD为0.2％；均符合可接受标准(浓度水平1.0％的3份溶液中单个回收率为90-110％，平均回收率为90-110％，RSD应≤10％)。结论：本发明的有关物质测定方法准确度良好，方法准确可行。(6)重复性照实施例1有关物质测定项下对照品溶液和供试品溶液的配制方法，平行配制6份供试品溶液。照实施例1色谱条件及方法，精密量取对照品溶液及供试品溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质含量。试验结果见表12。表12有关物质重复性试验结果试验结果表明：6份样品溶液，各杂质含量的RSD最大为1.23％，符合可接受标准(RSD≤10％)。结论：本方法重复性良好。(7)溶液放置稳定性试验对照品溶液稳定性：直接采用实施例1中的对照品溶液，分装后放置在室温条件，以预定的时间间隔测试(例如：间隔6，12，18，24，36，48，72，108h)稳定性。汇总不同时间点对照品溶液含量与0小时含量结果的比值，结果见表13。供试品溶液稳定性：任取一份0.1％浓度水平已知杂质的准确度溶液，分装后放置在室温条件，以预定的时间间隔测试(例如：间隔6，12，18，24，36，48，72，108，120h)稳定性。汇总不同时间间隔样品溶液各杂质含量与0小时结果的相对值，结果见表14。表13有关物质溶液稳定性试验结果-对照品溶液时间点含量(％)与0点的含量比值(％)0h100.23——6h99.9399.7112h100.50100.2718h100.54100.3125h100.87100.6435h100.61100.392days100.43100.2010days101.81101.58表14供试品溶液有关物质溶液稳定性试验结果试验结果表明：对照品溶液在10天内与0点的含量比值符合接受标准(98.0％～102.0％)。供试品溶液在10天内与0点检出杂质的最小相对值和最大相对值均符合接受标准(±20％)。结论：样品溶液放置在室温条件下至少稳定10天，对照品溶液放置在室温条件下至少稳定10天。(8)耐用性照实施例1有关物质测定项下方法配制供试品溶液，对有关物质检测色谱条件做适度调整(每次只调一个条件)，考察方法的耐用性，其中更换色谱柱的参数为：将WELCHxtimateC18(25cm×4.6mm，5μm)替换为InertsilODS-3(25cm×4.6mm，5μm)，试验结果见表15。表15有关物质耐用性试验结果汇总试验结果表明：各色谱条件下，各杂质最大相对值(％)为-19.65％，符合可接受标准(±20％)。总杂的绝对差值最大为-0.08％，符合可接受标准(±0.1％)。结论：测定条件有小的变动时，试验结果无影响，方法有效，本品有关物质方法的耐用性良好。当前第1页12
技术领域：
，具体涉及一种巴柳氮钠胶囊中有关物质的检测方法。
背景技术：
巴柳氮钠胶囊(BalsalazideSodiumCapsules)的主要成分为巴柳氮钠，化学名为5-[[对-[(2-羧乙基)氨甲酰基]苯基]偶氮]水杨酸二钠盐二水合物，适用于轻度至中度活动性溃疡性结肠炎。巴柳氮钠是一种前体药物，口服后以原药形式到达结肠，在结肠细菌的作用下释放出5-氨基水杨酸和4-氨基苯甲酰-β-丙氨酸，其中，5-氨基水杨酸可以通过阻断结肠中花生四烯酸代谢产物的生成而发挥减轻炎症的作用。巴柳氮钠一般以对-硝基苯甲酰氯为起始原料，经与β-丙氨酸缩合、氢气还原、重氮化后与水杨酸偶合、成盐四步反应制得，根据美国药典标准，巴柳氮钠胶囊在合成和贮存过程中，会产生杂质水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、巴柳氮钠有关物质B，化学结构式依次如下：巴柳氮钠胶囊现行的国内标准由于颁布时间较久，按照该方法检测的产品杂质个数较少且峰型较差，不能较好地控制产品中的杂质，已不适用国家食品药品监督管理局现在的要求。此外，由于国内巴柳氮钠原料中杂质较多，采用美国药典标准仍有部分色谱峰的分离度未达到要求，检测效果仍然不理想。技术实现要素：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种巴柳氮钠胶囊中有关物质的检测方法，该方法实现了巴柳氮钠胶囊中杂质成分的最佳分离，从而使杂质能被更好地检出，提高了产品质量的可控性和安全性。为实现上述发明目的，本发明公开了一种巴柳氮钠胶囊中有关物质的检测方法，具体采用高效液相色谱法，色谱条件如下：柱温：40～50℃(优选为43～47℃)。检测波长：235～245nm(优选为236～240nm)。流动相流速：0.8～1.2mL/min(优选为0.9～1.1mL/min)。填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶。稀释剂：水。流动相A：0.02mol/L～0.05mol/L(优选为0.05mol/L)醋酸铵溶液，其pH值为6.5～7.5(优选为7.1～7.3)。所述流动相A的pH调节剂为氨溶液，优选为将质量百分比浓度为25～28％的浓氨水稀释至原浓度的10％～35％后使用。流动相B：乙腈。梯度洗脱程序：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)085～955～15585～955～154070～8020～304570～8020～306085～955～157085～955～15流动相A和流动相B之和为100(％)。本发明所述检测方法中的有关物质包括水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、联苯偶氮水杨酸和巴柳氮钠有关物质B。其中，水杨酸、巴柳氮钠有关物质A和巴柳氮钠有关物质B均源自美国药典，但由于国内外原料合成工艺的差异，国内的质量标准中还应该明确其他需要鉴定的工艺杂质。巴柳氮钠胶囊中的有关物质联苯偶氮水杨酸为发明人经过大量定性分析确定的，采用本发明方法能较好地鉴别出该杂质，从而实现巴柳氮钠胶囊中所有杂质成分的最佳分离，联苯偶氮水杨酸的化学结构如下所示：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的检测方法可控、灵敏度高、专属性和准确度好，通过进一步优化色谱条件，可实现同时检测联苯偶氮水杨酸等多种已知杂质和其他未知杂质，为控制巴柳氮钠胶囊中的有关物质提供了新方法，提高了产品的质量可控性。采用本发明有关物质检测方法能较好地鉴别出杂质联苯偶氮水杨酸，可实现巴柳氮钠胶囊杂质成分的最佳分离，从而达到本品杂质被更好检出的目的，提高了产品的安全性。附图说明图1为WS1-(X-109)-2011Z方法检测的供试品溶液色谱图；图2为USP40-NF35巴柳氮钠胶囊方法检测的供试品溶液色谱图图3为本发明方法检测的供试品溶液色谱图；图4-11中的供试品为更换原料药后的巴柳氮钠胶囊产品；图4为本发明方法检测的供试品溶液色谱图；图5为溶剂空白、系统适应性溶液、对照品溶液和供试品溶液叠图；图6为酸破坏样品叠图；图7为碱破坏样品叠图；图8为氧化破坏样品叠图；图9为高温破坏样品叠图；图10为高湿破坏样品叠图；图11为光照破坏样品叠图。具体实施方式下面申请人结合实施例和说明书附图对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不限于这些实施例。相关技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。以下各实施例中检测所用的巴柳氮钠胶囊供试品为马应龙药业集团股份有限公司生产的样品(规格为：以巴柳氮钠计，0.45g，使用时取胶囊中的内容物，即“本品细粉”)，巴柳氮钠对照品来自中国食品药品检定研究所，纯度为100％；水杨酸来自中国食品药品检定研究所，纯度为99.3％；巴柳氮钠有关物质A来自USP，纯度为100％；巴柳氮钠有关物质B来自USP，纯度为98％；联苯偶氮水杨酸为康龙化成(北京)新药技术股份有限公司制备纯化，纯度为98.1％。实施例1：巴柳氮钠胶囊有关物质分析方法建立按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)对巴柳氮钠胶囊中有关物质进行检测，先配制供试品溶液：精密称取本品细粉适量(约相当于巴柳氮钠100mg)，置100ml量瓶中，加入稀释剂70ml，超声5分钟使溶解，冷至室温后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。分别按照现行国内药典方法(标准编号：WS1-(X-109)-2011Z)和美国药典方法(标准编号：USP40-NF35)检测巴柳氮钠胶囊的有关物质。按照WS1-(X-109)-2011Z巴柳氮钠胶囊的方法检测的供试品溶液色谱图见图1，由图可知，检测到巴柳氮钠胶囊供试品溶液的杂质个数较少，且峰型较差。按照USP40-NF35巴柳氮钠胶囊的方法检测的供试品溶液色谱图见图2，由图可知，检测到巴柳氮钠胶囊供试品溶液的杂质个数较国标方法更多，且色谱峰的分离度更好；但是尚有个别色谱峰的分离度未达到要求，仍然不理想。基于此，本发明对现有检测方法进行优化，优化后的高效液相色谱条件如下：色谱柱：WelchXtimateC185μm4.6*250mm柱温：45℃检测波长：238nm流速：1.0ml/min稀释剂：水进样体积：30μl流动相为流动相A和流动相B混合流动相流动相A：醋酸铵溶液(用醋酸铵3.86g，加水800ml溶解，用8wt％氨溶液调节pH值至7.20，加水至1000ml)流动相B：乙腈梯度洗脱程序：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0901059010407525457525609010709010按照优化后的色谱条件检测的供试品溶液色谱图见图3，由图可知，采用本发明检测方法能较好地鉴别出杂质联苯偶氮水杨酸，可实现巴柳氮钠胶囊杂质成分的最佳分离，从而达到本品杂质更好检出的目的。由上述检测结果可知，由这批原料药制得的胶囊产品杂质较多，因此更换了原料药并用于实施例2的方法学验证中。按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)对更换原料药后的巴柳氮钠胶囊中有关物质进行检测，检测得到的供试品溶液色谱图见图4，具体的色谱条件以及供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液的配制方法如下所示：(1)色谱条件色谱柱：WelchXtimateC185μm4.6*250mm柱温：45℃检测波长：238nm流速：1.0mL/min稀释剂：水进样体积：30μl流动相为流动相A和流动相B混合流动相流动相A：醋酸铵溶液(用醋酸铵3.86g，加水800mL溶解，用8wt％氨溶液调节pH值至7.20，加水至1000mL)流动相B：乙腈梯度洗脱程序：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0901059010407525457525609010709010(2)溶液的配制方法供试品溶液：精密称取本品细粉适量(约相当于巴柳氮钠100mg)，置100mL量瓶中，加入稀释剂70mL，超声5分钟使溶解，冷至室温后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液：精密称取巴柳氮钠对照品10.0mg，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取1mL，置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。系统适用性溶液：分别精密称取10mg水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、联苯偶氮水杨酸、巴柳氮钠有关物质B至4个100mL量瓶中，各加入约70mL稀释剂，超声使溶解，冷却至室温，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得分离度储备液。再精密称取100mg巴柳氮钠对照品至100mL量瓶中，并分别向其中精密加入分离度储备液各10mL，加入约70mL稀释剂，超声使溶解，冷却至室温，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液。试验结果表明：由图4可知，采用本发明有关物质检测方法能较好地鉴别出杂质联苯偶氮水杨酸，可实现巴柳氮钠胶囊杂质成分的最佳分离，从而达到本品杂质更好检出的目的。实施例2：巴柳氮钠胶囊有关物质分析方法验证对本发明制定的有关物质测定方法专属性、耐用性、检测限、定量限、线性、准确度、精密度、样品溶液稳定性进行验证，结果如下，证明本发明有关物质测定方法可行性良好。(1)专属性试验按实施例1有关物质方法配制空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，试验结果见图5。试验结果表明：溶剂空白在巴柳氮钠主峰及各杂质保留时间处无明显干扰，巴柳氮钠与相邻杂质巴柳氮钠有关物质A的分离度为25.21(>1.5)，巴柳氮钠与相邻杂质巴柳氮钠有关物质B的分离度为14.00(>1.5)，已知杂质之间分离度均较好。结论：本品空白溶剂不干扰有关物质测定。强制降解试验：强制降解试验各条件项下供试品溶液配制方法见表1，精密量取30μl，注入液相色谱仪，色谱条件同实施例1，通过比较未破坏样品与酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏、高湿破坏、光照破坏样品的峰面积，考察其是否可以达到物料平衡，验证方法的可行性，各条件下试验结果见图6～图11。表1试验结果表明：在高温条件下，产生了一个新的未知杂质峰；在碱破坏条件下，杂质峰巴柳氮钠有关物质A峰面积增大；在氧化破坏条件下，产生的杂质个数较多，说明样品在氧化条件下不稳定；在高湿、光照和酸破坏条件下均较稳定。各破坏条件下，其他杂质峰与已知杂质峰均可达到基线分离，已知杂质峰与主峰的纯度因子均大于单点阈值，说明峰纯度良好。各破坏条件下，物料平衡值均在90％～110％，符合标准规定。结论：各破坏样品色谱图中已知杂质与其他杂质峰之间的分离度良好，不干扰测定，色谱条件良好。(2)系统适用性试验按实施例1有关物质测定项下的色谱条件，精密量取有关物质测定项下的系统适用性溶液30μl，连续进样6次，记录色谱图，系统适用性试验结果汇总见表2。表2试验结果表明：本品有关物质项下系统适用性溶液重复进样6次，峰保留时间RSD均小于1.0％，峰面积的RSD均小于2.0％，符合规定。结论：仪器进样精密度良好。(3)检测限和定量限试验采用L-0.05％的线性溶液，精密量取30μl，照实施例1有关物质项下色谱条件，注入液相色谱仪，当信噪比S/N≥3时，即得检测限。直接采用L-0.1％的线性溶液，精密量取30μl，照实施例1有关物质项下色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，当信噪比S/N≥10时，即得定量限，结果见表3～7。表3水杨酸的检测限和定量限结果汇总表4巴柳氮钠有关物质A的检测限和定量限结果汇总表5联苯偶氮水杨酸的检测限和定量限结果汇总表6巴柳氮钠的检测限和定量限结果汇总表7巴柳氮钠有关物质B的检测限和定量限结果汇总试验结果表明：巴柳氮钠及其各已知杂质检测限溶液的信噪比以及峰面积的RSD均符合可接受标准(S/N≥3，RSD≤20％)。巴柳氮钠及其各已知杂质定量限溶液的信噪比以及峰面积的RSD均符合可接受标准(S/N≥10，RSD≤10％)。结论：本发明的有关物质测定方法灵敏度较高，能准确测定供试品溶液中定量杂质的含量。(4)线性试验和已知杂质的校正因子杂质储备液的配制：采用实施例1项下系统适应性溶液配制中的分离度储备液作为杂质储备液。巴柳氮钠对照品储备液的配制：精密称取10mg巴柳氮钠对照品至10mL量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。按表8分别用储备液稀释出校正因子线性溶液。表8不同浓度线性溶液的配制方法照实施例1有关物质测定项下色谱条件，精密量取线性溶液各30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表9。表9线性试验结果汇总名称相关系数r线性方程线性范围(μg/mL)巴柳氮钠1.0000y＝51.367x 0.99190.26～10.42水杨酸0.9999y＝65.369x 0.14710.26～10.57巴柳氮钠有关物质A1.0000y＝65.738x 1.08790.27～10.88联苯偶氮水杨酸0.9999y＝79.011x-0.74870.25～10.16巴柳氮钠有关物质B1.0000y＝89.681x 1.33780.26～10.33取各已知杂质与巴柳氮钠的线性方程的斜率进行计算，得到各已知杂质相对于巴柳氮钠的校正因子，见表10。表10各已知杂质相对于巴柳氮钠的校正因子试验结果表明：巴柳氮钠、水杨酸、巴柳氮钠有关物质A、联苯偶氮水杨酸、巴柳氮钠有关物质B在线性浓度范围内均呈良好线性关系。结论：本品有关物质检测方法的线性关系良好。(5)准确度试验按照表11分别制备各杂质浓度水平为0.05％,0.1％和1.0％的准确度溶液，每一水平平行配制3份，配制示例如下：表11照实施例1有关物质测定项下色谱条件，精密量取对照品溶液(同实施例1项下)及9份准确度溶液各30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质的回收率(将已知杂质的校正因子带入计算回收率)。试验结果表明：在0.05％浓度水平，水杨酸回收率为108.4～113.5％，平均回收率为111.8％，RSD为2.6％；巴柳氮钠有关物质A回收率为95.3～97.1％，平均回收率为96.4％，RSD为1.0％；联苯偶氮水杨酸回收率为95.4～98.9％，平均回收率为97.3％，RSD为1.8％；巴柳氮钠有关物质B回收率为102.8～103.4％，平均回收率为103.1％，RSD为0.3％；均符合可接受标准(浓度水平0.05％的3份溶液中单个回收率为85-115％，平均回收率为85-115％，RSD应≤20％)。在0.1％浓度水平，水杨酸回收率为107.7～109.8％，平均回收率为108.7％，RSD为1.0％；巴柳氮钠有关物质A回收率为100.7～103.2％，平均回收率为102.0％，RSD为1.2％；联苯偶氮水杨酸回收率为94.4～95.5％，平均回收率为94.9％，RSD为0.6％；巴柳氮钠有关物质B回收率为104.1～106.3％，平均回收率为104.9％，RSD为1.2％；均符合可接受标准(浓度水平0.1％的3份溶液中单个回收率为85-115％，平均回收率为85-115％，RSD应≤20％)。在1.0％浓度水平，水杨酸回收率为100.3～101.6％，平均回收率为101.1％，RSD为0.7％；巴柳氮钠有关物质A回收率为105.8～106.4％，平均回收率为106.0％，RSD为0.4％；联苯偶氮水杨酸回收率为102.1～103.9％，平均回收率为103.2％，RSD为1.0％；巴柳氮钠有关物质B回收率为103.5～103.9％，平均回收率为103.7％，RSD为0.2％；均符合可接受标准(浓度水平1.0％的3份溶液中单个回收率为90-110％，平均回收率为90-110％，RSD应≤10％)。结论：本发明的有关物质测定方法准确度良好，方法准确可行。(6)重复性照实施例1有关物质测定项下对照品溶液和供试品溶液的配制方法，平行配制6份供试品溶液。照实施例1色谱条件及方法，精密量取对照品溶液及供试品溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质含量。试验结果见表12。表12有关物质重复性试验结果试验结果表明：6份样品溶液，各杂质含量的RSD最大为1.23％，符合可接受标准(RSD≤10％)。结论：本方法重复性良好。(7)溶液放置稳定性试验对照品溶液稳定性：直接采用实施例1中的对照品溶液，分装后放置在室温条件，以预定的时间间隔测试(例如：间隔6，12，18，24，36，48，72，108h)稳定性。汇总不同时间点对照品溶液含量与0小时含量结果的比值，结果见表13。供试品溶液稳定性：任取一份0.1％浓度水平已知杂质的准确度溶液，分装后放置在室温条件，以预定的时间间隔测试(例如：间隔6，12，18，24，36，48，72，108，120h)稳定性。汇总不同时间间隔样品溶液各杂质含量与0小时结果的相对值，结果见表14。表13有关物质溶液稳定性试验结果-对照品溶液时间点含量(％)与0点的含量比值(％)0h100.23——6h99.9399.7112h100.50100.2718h100.54100.3125h100.87100.6435h100.61100.392days100.43100.2010days101.81101.58表14供试品溶液有关物质溶液稳定性试验结果试验结果表明：对照品溶液在10天内与0点的含量比值符合接受标准(98.0％～102.0％)。供试品溶液在10天内与0点检出杂质的最小相对值和最大相对值均符合接受标准(±20％)。结论：样品溶液放置在室温条件下至少稳定10天，对照品溶液放置在室温条件下至少稳定10天。(8)耐用性照实施例1有关物质测定项下方法配制供试品溶液，对有关物质检测色谱条件做适度调整(每次只调一个条件)，考察方法的耐用性，其中更换色谱柱的参数为：将WELCHxtimateC18(25cm×4.6mm，5μm)替换为InertsilODS-3(25cm×4.6mm，5μm)，试验结果见表15。表15有关物质耐用性试验结果汇总试验结果表明：各色谱条件下，各杂质最大相对值(％)为-19.65％，符合可接受标准(±20％)。总杂的绝对差值最大为-0.08％，符合可接受标准(±0.1％)。结论：测定条件有小的变动时，试验结果无影响，方法有效，本品有关物质方法的耐用性良好。当前第1页12
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