本发明涉及电化学传感器技术领域，尤其涉及一种磁性分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
甲氨蝶呤是一种叶酸还原酶抑制剂，为橙黄色结晶性粉末，易溶于稀碱、酸或碱金属的碳酸盐溶液，微溶于稀盐酸，几乎不溶于水、乙醇、氯仿、乙醚。目前，检测样品中甲氨蝶呤含量通常采用的方法为高效液相色谱法、毛细管电泳法以及电化学检测法，而高效液相色谱法检测通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长；毛细管电泳法虽然节省样本，但由于进样量很少重现性有一定局限；现有的电化学传感器电化学检测主要是基于常规的电化学修饰材料如乙炔黑和石墨烯等，电极对甲氨蝶呤的选择性相对较弱，即对抗与检测物质同时存在的一些物质的干扰能力较差，导致电化学检测的实际应用性比较差。
技术实现要素：
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种磁性分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用，制备出来的电化学传感器对甲氨蝶呤的特异性识别性较好，即使是对甲氨蝶呤的结构类似物甲氧苄啶、甲磺隆、叶酸也表现出较好的抗干扰特性。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种磁性分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：将碳粉、石蜡油、甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物充分研磨，制成均质的磁性分子印迹碳糊粉末；
S2：将步骤S1中制得的磁性分子印迹碳糊粉末作为填充物填充至碳糊电极中，并在光滑称量纸上打磨电极表面，制备磁性分子印迹碳糊电极；
S3：将步骤S2中制备的磁性分子印迹碳糊电极作为工作电极，制备磁性分子印迹电化学传感器。
进一步的，步骤S1中碳粉的质量为250～300mg，石蜡油的体积为10～50μL，甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物的质量为20～90mg。
进一步的，步骤S1中碳粉的质量为280mg，石蜡油的体积为30μL，甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物的质量为70mg。
进一步的，步骤S1中所述的甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物的制备方法包括以下步骤，
S101：Fe3O4胶体溶液制备；
S102：对步骤S101中制备的Fe3O4胶体溶液进行包硅处理；
S103：使用包硅处理后的Fe3O4胶体溶液制备甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物。
进一步的，步骤S101的具体操作包括以下步骤，
S1011：将FeSO4˙7H2O和FeCl3˙6H2O溶于去离子水中，使用0.22μm过滤膜过滤，滤液留用；所述FeSO4˙7H2O和FeCl3˙6H2O的质量比为7:12；
S1012：在N2氛围中将步骤S101得到的滤液加入装有去离子水的烧瓶中，机械搅拌均匀；
S1013：在烧瓶中加入氨水，继续搅拌；待反应完后冷却至室温；所述FeSO4˙7H2O与氨水的质量体积比为7:100g/mL；
S1014：将步骤S103中反应后的产物依次用乙醇和去离子水振荡洗涤，洗涤时通过磁性分离，得到Fe3O4颗粒；
S1015：将步骤S104中得到的Fe3O4颗粒加入去离子水中进行分散，制成40mg/mL的胶体溶液备用。
进一步的，步骤S102的具体操作包括以下步骤，
S1021：将正硅酸四乙酯溶于无水乙醇中混匀，配制成2.5mmol/mL的硅溶液备用；
S1022：将步骤S105中制得的40mg/mL的Fe3O4胶体溶液、无水乙醇、去离子水和NH3˙H2O混匀后超声分散，作为基底溶液；所述Fe3O4胶体溶液、无水乙醇、去离子水和NH3˙H2O的体积比为10:80:20:1；
S1023：将步骤S107中的基底溶液置于30℃水浴中，机械搅拌；分多次将步骤S106中配制的硅溶液加入，持续反应6小时；
S1024：将步骤S108中反应后所得材料依次用乙醇和去离子水振荡洗涤两次，洗涤时通过磁性分离，得到Fe3O4@SiO2；
S1025：将Fe3O4@SiO2加入去离子中进行分散，制成浓度为12.25mg/mL的Fe3O4@SiO2胶体溶液备用。
进一步的，步骤S103中Fe3O4@SiO2@MIP的制备方法具体包括以下步骤，
S1031：将甲氨喋呤溶于甲醇溶液中，然后加入NH3˙H2O超声混匀，并进行机械搅拌；所述甲氨喋呤与甲醇溶液的质量体积比为1:80mmol/mL，甲醇溶液与NH3˙H2O的体积比为800:3；
S1032：在步骤S1031的混合溶液中加入12.25mg/mL的Fe3O4@SiO2胶体溶液，继续搅拌，然后再加入NH3˙H2O；该步骤中加入的Fe3O4@SiO2胶体溶液、NH3˙H2O与步骤S1031中甲醇溶液的体积比为20:1:80；
S1033：15分钟后，在步骤S1032的混合溶液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应30分钟，然后再加入正硅酸乙酯，继续反应19小时；该步骤中3-氨丙基三乙氧基硅烷、正硅酸乙酯的加入量为1:3；
S1034：反应结束后，将反应液转移到离心管中，选择磁性分离，弃掉上清液，得到Fe3O4@SiO2@MIP；
S1035：将Fe3O4@SiO2@MIP用甲醇洗涤，洗掉反应体系中的未反应物，再用0.05mol/L的KOH/甲醇溶液洗涤Fe3O4@SiO2@MIP，洗掉甲氨蝶呤，形成空白孔穴，直至洗脱液为无色，则甲氨蝶呤完全洗掉；所述KOH/甲醇溶液中KOH和甲醇的体积比为1:1；
S1036：用甲醇洗涤Fe3O4@SiO2@MIP上残余的KOH，然后将所得材料放于干燥箱中，45℃干燥12小时，得到甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物。
进一步的，步骤S3中所述的磁性分子印迹电化学传感器中，磁性分子印迹碳糊电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。
进一步的，根据所述的制备方法制得的磁性分子印迹电化学传感器。
进一步的，磁性分子印迹电化学传感器在甲氨蝶呤识别中的应用。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的改进之处在于，
本发明中磁性分子印迹电化学传感器的制备方法制备出来的甲氨蝶呤磁性分子印迹电化学传感器对甲氨蝶呤的特异性识别性较好，即使是对甲氨蝶呤的结构类似物甲氧苄啶、甲磺隆、叶酸也表现出较好的抗干扰特性。
附图说明
图1为本发明实施例一中不同电极阻抗表征对比图。
图2为本发明实施例一中磁性分子印迹电化学传感器特异性检测结果。
图3为本发明实施例二中不同甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物添加量制备得到的磁性分子印迹碳糊电极性能对比图。
图4为本发明实施例三中不同石蜡油添加量制备得到的磁性分子印迹碳糊电极性能对比图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例一：
一种磁性分子印迹电化学传感器的制备方法，包括以下步骤，
S1：将280mg碳粉、30μL石蜡油、70mg甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物在石英研钵中充分研磨10～30分钟，制成均质的磁性分子印迹碳糊粉末；
S2：将步骤S1中制得的磁性分子印迹碳糊粉末作为填充物填充至碳糊电极中，并在光滑称量纸上打磨电极表面，制备磁性分子印迹碳糊电极；
S3：将步骤S2中制备的磁性分子印迹碳糊电极作为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，制备磁性分子印迹电化学传感器。
进一步的，步骤S1中所述的甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物的制备方法包括以下步骤，
S101：Fe3O4胶体溶液制备；
具体的，S1011：将0.70gFeSO4˙7H2O和1.2gFeCl3˙6H2O溶于20mL去离子水中，使用0.22μm过滤膜过滤，滤液留用；
S1012：在N2氛围中将步骤S101得到的滤液加入装有240mL去离子水的三口烧瓶中，在80℃条件下机械搅拌60分钟，搅拌速度260rpm；
S1013：在三口烧瓶中加入10mL氨水，继续80℃搅拌60分钟；待反应完后冷却至室温；
S1014：将步骤S103中反应后的产物依次用乙醇和去离子水振荡洗涤三次，洗涤时通过磁性分离，得到约为400mg±10mg的Fe3O4颗粒；
S1015：将步骤S104中得到的Fe3O4颗粒加入10mL去离子水中进行分散，制成40mg/mL的胶体溶液备用，此处需要说明的是，经多次试验，步骤S1014中最终得到的Fe3O4的质量为400mg±10mg，在该步骤配制胶体溶液时加入的去离子水的体积根据实际Fe3O4的质量进行微调，使胶体溶液的浓度为40mg/mL即可。
进一步的，S102：对步骤S101中制备的Fe3O4胶体溶液进行包硅处理；
具体的，S1021：取2.2mmol正硅酸四乙酯(TEOS)溶于1mL无水乙醇中混匀，配制成2.5mmol/mL的硅溶液备用；
S1022：取10mL步骤S105中制得的40mg/mL的Fe3O4胶体溶液、80mL无水乙醇、20mL去离子水和1mLNH3˙H2O在三口烧瓶中混匀后超声分散，作为基底溶液；
S1023：将步骤S107中的基底溶液置于30℃水浴中，450rpm机械搅拌；分六次将步骤S106中配制的硅溶液加入，每次间隔一小时，且每次加入259μL，共计6次，持续反应6小时；
S1024：将步骤S108中反应后所得材料依次用乙醇和去离子水振荡洗涤两次，洗涤时通过磁性分离，得到约为490mg±10mg的Fe3O4@SiO2；
S1025：将Fe3O4@SiO2加入40mL去离子中进行分散，制成浓度为12.25mg/mL的Fe3O4@SiO2胶体溶液备用；需要说明的是，经多次试验，步骤S1024中最终得到的Fe3O4@SiO2的质量为490mg±10mg，在该步骤配制胶体溶液时加入的去离子水的体积根据实际Fe3O4@SiO2的质量进行微调，使胶体溶液的浓度为12.25mg/mL即可。
进一步的，S103：使用包硅处理后的Fe3O4胶体溶液制备甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物。
具体的，S1031：将454.44mg甲氨喋呤(1mmol)溶于80mL甲醇溶液中，然后加入300μLNH3˙H2O超声混匀，260rpm机械搅拌10分钟；
S1032：在步骤S1031的混合溶液中加入20mL 12.25mg/mL的Fe3O4@SiO2胶体溶液，继续搅拌6分钟，然后再加入1mLNH3˙H2O；
S1033：15分钟后，在步骤S1032的混合溶液中加入2mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应30分钟，然后再加入6mmol的正硅酸乙酯，继续反应19小时；
S1034：反应结束后，将三口烧瓶中的反应液转移到离心管中，选择磁性分离，弃掉上清液，所得反应物即为Fe3O4@SiO2@MIP；
S1035：将Fe3O4@SiO2@MIP用甲醇洗涤2遍，洗掉反应体系中的未反应物，再用0.05mol/L的KOH/甲醇溶液洗涤Fe3O4@SiO2@MIP，洗掉甲氨蝶呤，形成空白孔穴，直至洗脱液为无色，则甲氨蝶呤完全洗掉；所述KOH/甲醇溶液中KOH和甲醇的体积比为1:1；
S1036：用甲醇洗涤Fe3O4@SiO2@MIP上残余的KOH，然后将所得材料放于干燥箱中，45℃干燥12小时，得到甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物。
对比例一：
对比例一中提供一种非分子印迹电化学传感器的制备方法，包括以下步骤，
S1：将280mg碳粉、30μL石蜡油、70mg非分子印迹聚合物在石英研钵中充分研磨10～30分钟，制成均质的非分子印迹碳糊粉末；
S2：将步骤S1中制得的非分子印迹碳糊粉末作为填充物填充至碳糊电极中，并在光滑称量纸上打磨电极表面，制备非分子印迹碳糊电极；
S3：将步骤S2中制备的非分子印迹碳糊电极作为工作电极，制备磁性分子印迹电化学传感器。
对比例一中非分子印迹聚合物的制备方法与实施例一种甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物的制备步骤相同，只是在制备过程中没有加入甲氨蝶呤模板。
性能表征：
对本发明实施例一以及对比例一中制得的电极进行电化学阻抗表征对比，结果如附图1所示。其中，电化学阻抗法(Electrochemical impedance spectroscopy，EIS)是在含有5mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的0.1M KCl溶液中进行的，频率范围为0.01～100000Hz。
在附图1中，a-f分别为吸附甲氨蝶呤前的碳糊电极、非分子印迹碳糊电极(对比例一中的电极)、甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物(实施例一中的电极)，吸附甲氨蝶呤后的碳糊电极、非分子印迹碳糊电极、甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物。从附图1中可以看出，吸附甲氨蝶呤后的三个电极阻抗均明显增大，且吸附甲氨蝶呤前的甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物阻抗小于非分子印迹碳糊电极，吸附甲氨蝶呤后则相反，说明实施例一中制备的MMIPs修饰碳糊电极具有更好吸附甲氨蝶呤的能力。
进一步的，将实施例一中制得的磁性分子印迹碳糊电极浸泡在pH值范围为4-8的甲氨蝶呤PBS缓冲液(甲氨蝶呤浓度为(0.01-20μM)中，在50-400r/min搅拌速度下吸附3-11min。将吸附甲氨蝶呤后的磁性分子印迹碳糊电极再置于pH范围4-8的PBS缓冲液中，以吸附甲氨蝶呤后的磁性分子印迹碳糊电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，采用差分脉冲伏安法进行电化学检测。差分脉冲伏安法检测条件为扫速20mV s-1，脉冲振幅50mV，脉冲宽度40ms。检测方法为：在检测溶液PBS缓冲液里加入甲氨蝶呤使其浓度为0.5μM，之后加入相应不同倍数的干扰物质如Na ,K ,Cl-，柠檬酸甘胆酸等，将得到的DPV电流值与不加干扰物质的甲氨蝶呤的电流值进行比较，差值在加减10％范围内为无干扰。
检测结果显示本发明中制得的磁性分子印迹电化学传感器对甲氨蝶呤的检测限为6.2nM，检测线性范围为0.01-20μM，说明该磁性分子印迹电化学传感器具有较好的灵敏度，
进一步的，本发明中制得的磁性分子印迹电化学传感器对甲氨蝶呤检测的特异性结果如附图2所示，从附图2中可以看出，本发明中制得的磁性分子印迹电化学传感器对抗与甲氨蝶呤结构类似物(甲氧苄啶、甲磺隆、叶酸)干扰的能力较好(对甲氨蝶呤检测响应信号比其他物质高出三倍以上，且分子印迹电极和非分子印迹电极对甲氨蝶呤响应有差别，对其他物质的响应两电极无差别)，且该电极能够对抗1000倍的Na ,K ,Cl-干扰，500倍的Fe3 ,Fe2 ,Zn2 ,SO42-,维生素C和柠檬酸干扰，100倍的甘胆酸干扰，50倍葡萄糖干扰，说明本发明中制得的磁性分子印迹电化学传感器对甲氨蝶呤具有较好的特异性。
实施例二：
实施例二与实施例一的区别仅在于步骤步骤S1中甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物的添加量不同，其余均相同。
分别添加20、30、40、50、60、80、90mg甲氨蝶呤磁性分子印迹聚合物，将最终制备出来的磁性分子印迹碳糊电极与实施例一中甲氨蝶呤分子印迹聚合物添加量为70mg制备出来的磁性分子印迹碳糊电极进行性能对比，结果从附图3所示。
从附图3中可以看出，实施例一中甲氨蝶呤分子印迹聚合物添加量为70mg制备出来的磁性分子印迹碳糊电极的电流最大，说明当磁性分子印迹聚合物的量为70mg时制备电极对甲氨蝶呤的吸附及催化效果最好，原因是当磁性分子印迹聚合物的量小于70mg时，电极表面的甲氨蝶呤特异性吸附位点较少，未能达到对甲氨蝶呤的最大吸附，而当磁性分子印迹聚合物的量超过70mg时，会相对导致碳粉的量减少，导致催化能力的减弱，因此，当磁性分子印迹聚合物的量为70mg时，制备电极对甲氨蝶呤的吸附及催化性能最优，电流响应值最大。
实施例三：
实施例三与实施例一的区别仅在于步骤步骤S1中石蜡油的添加量不同，其余均相同。
分别添加10、20、40、50μL石蜡油，将最终制备出来的磁性分子印迹碳糊电极与实施例一中石蜡油添加量为30μL制备出来的磁性分子印迹碳糊电极进行性能对比，结果从附图4所示。
从附图4中可以看出，实施例一中石蜡油添加量为30μL制备出来的磁性分子印迹碳糊电极的电流最大，说明当石蜡油用量为30μL时制备电极对甲氨蝶呤的吸附及催化效果最好，这是因为当石蜡油用量小于30μL时，石墨粉与磁性分子印迹聚合物不能充分的糅合形成均匀的粉末，在填充电极时由于粘度不够不能够形成光滑的电极表面，使得电极对甲氨蝶呤的吸附及催化性能不足而引起电流响应值的降低，而当石蜡油用量超过30μL时，由于石蜡油不导电，过多的石蜡油会影响电极对甲氨蝶呤的催化能力，导致电流响应值得降低，因此最佳石蜡油用量为30μL。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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