本发明属于生物检测技术领域，具体的说，涉及一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条及其制备方法。
背景技术
犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，传染性强，死亡率达30%~80%，在世界范围内广泛流行；近年来，由于环境变化，动物栖息地人为干预，病毒的进化，该病在我国的发病率不断上升，其宿主范围也有不断扩大的趋势，对犬饲养业、经济动物养殖业及野生动物保护事业造成了严重危害，因此，对该病的防控和诊断尤为重要。
犬瘟热病毒的传统检测方法有血清学检测方法和病原学检测方法；其中，血清学检测方法主要包括：血凝试验、酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析等方法，但均存在灵敏度不高、特异性不强的问题，且宠物疾病抗体检测的需求相对于抗原偏少。
病原学检测方法主要包括：病毒分离法、分子生物学检测、酶联免疫和免疫层析法；病毒分离方法虽然在理论上可以检出一个感染性的病毒粒子，确诊犬瘟热病毒的感染，但也因分离病毒的操作繁琐、成本高及确诊缓慢等因素不适于临床使用。
分子生物学检测和酶联免疫吸附试验则由于需要使用配套的精密仪器、检测步骤繁琐、用时长、价格昂贵，对技术人员和环境要求高的原因，不适于在小型诊所和野外现场检测。
免疫层析法因其操作简单、方便快捷，无需仪器和专业人员，结果判定只需3-10分钟、适于现场使用等优点，深受客户偏爱。
目前，已有的犬瘟热病毒抗原免疫层析检测试纸条大多采用胶体金标记，但是胶体金的烧制容易出现颗粒不均匀的现象，导致产品质量不稳定，均一性差；且已有的犬瘟热病毒免疫层析试纸条只采用了抗单一蛋白的单克隆抗体进行抗原检测，其灵敏度和特异性相对较低；另外，也有采用病毒颗粒制备单克隆抗体进行抗原检测的产品，但由于病毒颗粒制备单克隆抗体时，非特异性抗原表位产生的非特异性抗体太多，给阳性克隆的筛选带来了很大困难，所以，对免疫层析试纸条进行工艺改进和突破具有重要意义。
技术实现要素：
本发明要解决的主要技术问题是提供一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条及其制备方法，能够解决目前现有犬瘟热病毒抗原胶体金检测试纸条制备过程中胶体金的烧制容易出现颗粒不均匀的现象，导致产品质量不稳定，均一性差的问题；解决现有犬瘟热病毒抗原检测试纸条只采用了抗单一蛋白的单克隆抗体进行抗原检测，其灵敏度和特异性相对较低的问题；解决现有犬瘟热病毒抗原检测试纸条采用病毒颗粒制备单克隆抗体进行标记或作为检测线捕获抗体时，由于非特异性抗原表位产生的非特异性抗体太多，给阳性克隆的筛选带来了很大困难的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条，包括外壳和配套使用的样品稀释液，外壳内装配有试纸条，试纸条包括PVC底板，PVC底板上黏贴有样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫，标记垫为玻璃纤维素膜，包被有抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体与乳胶微球的偶联标记物；包被膜为硝酸纤维素膜，包被膜上涂设有一条包被有抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的检测线和一条包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线。
以下是本发明对上述技术方案的进一步优化：
样品稀释液包括基液，基液中加入有质量百分数为0.3%的蔗糖和0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.4%的Tween-20；
所述基液为PBS溶液，所述PBS溶液的浓度为0.02mol/L，PBS溶液的pH值为7.2。
进一步优化：外壳上开设有观察窗和加样孔，试纸条装配在外壳内后，包被膜位于观察窗位置处、样品垫位于加样孔位置处，外壳上设置有标记:“C”和“T”，标记“C”与质控线相对应，标记“T”与检测线相对应。
本发明还提供一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳胶微球的处理：在乳胶微球清洗液中加入有质量百分数为0.05%的乳胶微球，在2～8℃的条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，弃上清，在沉淀物中加入与乳胶微球清洗液相同体积的清洗液重悬，重复清洗1次，悬浮后的乳胶微球溶液中，先加入浓度20mg/mL的NHS溶液，再加入浓度20mg/mL的EDC溶液，NHS溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:20；EDC溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:100；而后震荡15分钟，震荡速度为140～150 r/min，震荡完成后在2～8℃的条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，弃上清，在沉淀物中加入原乳胶微球清洗液体积的乳胶微球保存液重悬；
S2、蛋白标记：在处理好的乳胶微球中按乳胶微球质量的1/10加入抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体，而后振荡1小时，震荡速度为140～150 r/min，然后加入原乳胶微球清洗液1/10体积的封闭液，并振荡30分钟，震荡速度为140～150 r/min；震荡完成后在2～8℃的条件下离心15分钟，离心速度为13000 r/min，离心完成后，弃上清，在沉淀物中加入原乳胶微球清洗液2倍体积的复溶液复溶；
S3、标记垫的制备：标记垫为玻璃纤维素膜，将步骤S2中复溶后的蛋白溶液在玻璃纤维素膜上进行铺垫，而后在37℃的室温中干燥2小时，即获得标记垫。
以下是本发明对上述技术方案的进一步优化：
该制备方法还包括：
S4、包被膜的制备：选择硝酸纤维素膜作为包被膜，将抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体用划膜液稀释至浓度为1.0mg/mL ，用于检测线划线；将羊抗鼠IgG抗体用划膜液稀释至浓度为1.2mg/mL，用于质控线划线；采用三维划膜喷金仪依次以1μL/cm的浓度在硝酸纤维素膜上进行检测线和质控线的划线，而后在37℃的环境中烘干包被2小时，即获得包被膜。
进一步优化：该制备方法还包括：
S5、样品稀释液制备：样品稀释液的配方包括基液，基液中加入有质量百分数为0.3%的蔗糖和0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.4%的Tween-20；
基液为PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.02mol/L，PBS溶液的pH值为7.2。
S6、检测试纸条的组装：将包被膜、标记垫、样品垫、吸水垫依次贴于PVC底板上，制得试纸条，将试纸条装入外壳中，得到犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条；
S7、包装：将组装好的犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条连同干燥剂装入铝箔袋中密封，贴签，而后将样品稀释液管放入外包装盒内。
进一步优化：乳胶微球清洗液的配方为：pH值为6.1、浓度为25mmol/L的MES溶液。
进一步优化：乳胶微球保存液的配方为：pH值为7.2、浓度为25mmol/L的MES溶液。
进一步优化：封闭液的配方包括水，水中加入有质量百分数为1.2%的BSA；
复溶液的配方为：pH值为7.2、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，PBS缓冲液中加入有质量百分数为：12%的蔗糖、1.2%的BSA、0.05%的PVP和0.05%的NaN3，PBS缓冲液中还加入有体积百分数为0.5%的Tween-20。
进一步优化：划膜液的配方成分为：pH值为7.2、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，PBS缓冲液中加入有质量百分数为：1%蔗糖，PBS缓冲液中还加入有体积百分数为0.1%Tween-20。
本发明采用上述技术方案，具有如下有益效果：
1.本发明犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条的制备成本低廉、检测时方便快速，并且无需专业设备和仪器，不需要专业人员。
2.本发明首次采用乳胶微球代替胶体金进行标记，能够使检测试纸条的制备工艺可重复性更好、灵敏度更高、稳定性更强。
3.本发明首次采用抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体和抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体作为结合抗体和捕获抗体，相对于采用抗单一蛋白的单克隆抗体，能够提高试纸条的敏感性和特异性。
4.可以避免因采用病毒颗粒制备单克隆抗体导致产生的非特异性抗体太多，给阳性特异性单克隆抗体的筛选带来很多困难的问题。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例的总体结构示意图；
图2为本发明实施例中试纸条的结构示意图；
图3为本发明实施例中检测试纸条在使用时强阳性结果判定图；
图4为本发明实施例中检测试纸条在使用时弱阳性结果判定图；
图5为本发明实施例中检测试纸条在使用时阴性结果判定图；
图6为本发明实施例中检测试纸条在使用时只有检测线显示的无效结果判定图；
图7为本发明实施例中检测试纸条在使用时无效结果判定图；
图8为本发明实施例中不同标记pH值的检测结果；
图9为本发明实施例中不同蛋白标记量的实验结果；
图10为本发明实施例中不同封闭液配方的实验结果；
图11为本发明实施例中不同复溶液的实验结果；
图12为本发明实施例中不同划膜液的实验结果；
图13为本发明实施例中检测线最佳划线浓度的实验结果；
图14为本发明实施例中质控线最佳划线浓度的实验结果；
图15为本发明实施例中敏感性的检测结果；
图16为本发明实施例中特异性的检测结果；
图17为本发明实施例中第一次批内重复试验的实验结果图；
图18为本发明实施例中第二次批内重复试验的实验结果图；
图19为本发明实施例中第三次批内重复试验的实验结果图；
图20为本发明实施例中第一次批间重复试验的实验结果图；
图21为本发明实施例中第二次批间重复试验的实验结果图；
图22为本发明实施例中第三次批间重复试验的实验结果图；
图23为本发明实施例中第四次批间重复试验的实验结果图。
图中：1-样品垫；2-PVC底板；3-标记垫；4-检测线（T线）；5-质控线（C线）；6-包被膜；7-吸水垫；8-外壳；81-观察窗；82-加样孔。
具体实施方式
实施例：请参阅图1-2，一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条，包括外壳8和配套使用的样品稀释液，所述外壳8内装配有试纸条。
所述试纸条包括PVC底板2，所述PVC底板2上由PVC底板2的一侧向另一次依次黏贴由样品垫1、标记垫3、包被膜6和吸水垫7。
所述包被膜6为硝酸纤维素膜。
在本实施例中，所述包被膜6采用Sartorius公司生产的型号为CN140的硝酸纤维素膜。
所述包被膜6上涂设有检测线4和质控线5，所述检测线4涂设在靠近标记垫3的位置处，所述质控线5涂设在靠近吸水垫7的位置处。
所述检测线4上包被有抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体（CDV-Mab-H），所述质控线5上包被有羊抗鼠IgG抗体。
所述标记垫为玻璃纤维素膜，包被有抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体（CDV-Mab-F）与乳胶微球的偶联标记物。
在本实施例中，所述标记垫3采用型号为8964的玻璃纤维素膜，由上海捷宁生物科技有限公司生产，能够在市面上直接购买获得。
在本实施例中，所述抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体和抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体均由“迈迪安生命科学公司”生产的，且能够在市面上购买获得。
所述外壳8上靠近试纸条的包被膜6的位置处开设有观察窗81。
所述试纸条装配在外壳8内后，所述包被膜6位于观察窗81位置处。
所述外壳8上位于观察窗81的两侧分别设置有标记:“C”和“T”，所述标记“C”与质控线5相对应，所述标记“T”与检测线4相对应。
所述外壳8上靠近试纸条的样品垫1的位置处开设有加样孔82。
上所述试纸条装配在外壳8内后，所述样品垫1位于加样孔82位置处。
所述样品稀释液包括基液，基液中加入有质量百分数为1%的蔗糖和0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.3%的Tween-20；
所述基液为PBS溶液，所述PBS溶液的浓度为0.02mol/L，PBS溶液的pH值为7.2。
本发明还公开了一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S1、乳胶微球的处理：在乳胶微球清洗液中加入有质量百分数为0.05%的乳胶微球，在环境温度为2～8℃的条件下采用离心机进行离心工序，离心速度为13000 r/min，离心时间为15分钟，弃上清，获得沉淀物，在沉淀物中加入有与乳胶微球清洗液相同体积的清洗液重悬，重复清洗1次。
在上述悬浮后的乳胶微球溶液中，先加入浓度20mg/mL的NHS（N-羟基丁二酰亚胺）溶液，再加入浓度20mg/mL的EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酸氢二亚胺盐酸盐）溶液，NHS溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:20；EDC溶液与悬浮后的乳胶微球溶液的体积比为1:100。
而后在室温环境中进行震荡，所述震荡速度为140～150 r/min，震荡时间为15分钟。
震荡完成后，在环境温度为2～8℃的条件下采用离心机进行离心工序，所述离心速度为13000 r/min，离心时间为15分钟，离心完成后，弃上清，获得沉淀物，在沉淀物中加入原乳胶微球清洗液体积的乳胶微球保存液重悬。
所述步骤S1中，乳胶微球的平均直径为100nm。
所述乳胶微球可由市面上直接购买获得。
所述步骤S1中，乳胶微球清洗液的配方为：pH值为6.1、浓度为25mmol/L的MES溶液（2-(N-吗啡啉）乙磺酸溶液）。
所述步骤S1中，乳胶微球保存液的配方为：pH值为7.2、浓度为25mmol/L的MES溶液。
S2、蛋白标记：在处理好的乳胶微球中按乳胶微球质量的1/10加入抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体（CDV-Mab-F），而后在室温环境中进行震荡，所述震荡速度为140～150 r/min，振荡时间为1小时，然后加入原乳胶微球清洗液1/10体积的封闭液，并在室温环境下继续震荡，所述震荡速度为140～150 r/min，振荡时间为30分钟。
震荡完成后，在环境温度为2～8℃的条件下采用离心机进行离心工序，所述离心速度为13000 r/min，离心时间为15分钟，离心完成后，弃上清，获得沉淀物，在沉淀物中加入原乳胶微球清洗液5倍体积的复溶液复溶。
所述步骤S2中，乳胶微球与标记用的抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体（CDV-Mab-F）的质量比为10:1。
所述步骤S2中，所述封闭液的配方包括水，水中加入有质量百分数为1.2%的BSA（牛血清白蛋白）。
所述步骤S2中，乳胶微球清洗液体积与封闭液的体积比为10:1。
所述步骤S2中，复溶液的配方为：pH值为7.2、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，PBS缓冲液中加入有质量百分数为：12%的蔗糖、1.2%的BSA、0.05%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和0.05%的NaN3，PBS缓冲液中还加入有体积百分数为0.5%的Tween-20。
所述步骤S2中，乳胶微球清洗液的体积与复溶液的体积比为1:5。
S3、标记垫的制备：所述标记垫3为玻璃纤维素膜，将步骤S2中复溶后的蛋白溶液在玻璃纤维素膜上进行铺垫，而后放置在37℃的室温环境中干燥2小时，即获得标记垫3，然后将标记垫3密封于锡箔袋内，常温保存备用。
所述标记垫6制备完成后，包被有抗犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体（CDV-Mab-F）与乳胶微球的偶联标记物。
S4、包被膜的制备：选择硝酸纤维素膜作为包被膜6，将抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体（CDV-Mab-H）用划膜液稀释至浓度为1.0mg/mL ，用于检测线4（T线）划线。
将羊抗鼠IgG抗体用划膜液稀释至浓度为1.2mg/mL，用于质控线5（C线）划线。
采用三维划膜喷金仪依次以1μL/cm的浓度在硝酸纤维素膜上进行检测线4和质控线5的划线。
划线完成后将其放置在37℃的环境中烘干包被2小时，即得到包被膜6，将包被膜6密封于锡箔袋内，常温保存备用。
所述三维划膜喷金仪的型号为HM3030。
所述步骤S4中，划膜液的配方成分为：pH值为7.2、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，PBS缓冲液中加入有质量百分数为：1%的蔗糖，PBS缓冲液中还加入有体积百分数为0.1%的Tween-20。
S5、样品稀释液制备：样品稀释液的配方包括基液，基液中加入有质量百分数为0.3%的蔗糖和0.05%的NaN3，基液中还加入有体积百分数为0.4%的Tween-20。
所述基液为PBS溶液，所述PBS溶液的浓度为0.02mol/L，PBS溶液的pH值为7.2。
所述稀释液制备完成后，将稀释液装入稀释液管中。
在本实施例中，所述样品稀释液的具体配方为：pH值为7.2、浓度为0.02mol/L的PBS溶液100mL，PBS溶液中加入0.3g的蔗糖、0.4mL的Tween-20和0.05g的NaN3。
S6、检测试纸条的组装：将包被膜6、标记垫3、样品垫1、吸水垫7依次贴于PVC底板2上，而后采用切条机进行切条，获得试纸条，将试纸条装入外壳8中，获得犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条。
S7、包装：将组装好的犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条连同干燥剂装入铝箔袋中密封，贴签，而后将样品稀释液管放入外包装盒内。
本发明还提供一种犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条的使用方法，该使用方法的步骤如下：
（1）用棉签取适量眼部及结膜分泌物、鼻液、唾液进行检测，或取血清待检。
（2）将棉签浸入样品稀释液管，充分搅拌混匀后，静置5分钟，用一次性滴管取上清液作为检测液。
所述步骤（2）中，若检测样品为血清时，则向稀释液管中滴加2-3滴血清，搅拌均匀后，取混合液检测。
所述步骤（2）中，样品若不能立即检测，应避光冷藏保存，超过24小时，应冷冻保存；样品再次检测前需恢复至室温。
（3） 将未开封的犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条和检测样品恢复至室温。
（4）将犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条水平放置，用滴管向犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条的加样孔82缓慢逐滴加入4-5滴不含气泡的检测液。
（5）加样品液后，红色的液体从靠近加样孔82的观察窗81边缘涌出，朝另一方向流动。
（6）5-10分钟判断结果，10分钟后的结果仅作参考。
结果判断：如图3-图7所示，阳性：质控线5显示红色色带，检测线4也显示红色色带，无论颜色深浅均判为阳性。
阴性：质控线5显示红色色带，检测线4不显示红色色带，判为阴性。
无效：质控线5不显示红色色带，无论检测线4是否显示红色色带，该犬瘟热病毒乳胶微球检测试纸条均判为无效。
实施例2：在上述实施例1中，最佳蛋白标记pH值的确定：在乳胶微球的蛋白标记过程中，分别采用pH值为6.8、7.2和7.6的MES溶液进行标记，比较不同pH值对该检测试纸条特异性和敏感性的影响，从而确定最佳蛋白标记pH值；实验结构如下表和图8所示。
下表为：不同标记pH值的实验结果：
上表中，“ ”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图8可以看出，pH值为7.2时试纸条检测线显色较好，pH值为6.8和7.2时敏感性较差，均有假阴性出现，因此根据实验结果选择标记pH值为7.2。
实施例3，在上述实施例1中，最佳蛋白标记量的选择：在乳胶微球的蛋白标记过程中，分别采用标记蛋白CDV-Mab-F与乳胶微球质量比例为1:12、1:10、1:8的比例进行蛋白标记，实验结构如下表和图9所示。
下表为：不同蛋白标记量的实验结果：
上表中，“ ”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图9可以看出，CDV-Mab-F与乳胶微球的质量比例为1:12时，敏感性较差；质量比例为1:10时敏感性和特异性均较好，质量比例为1:8时检测试纸条显色效果较1:10时无明显变化，因此根据实验结果最终选择CDV-Mab-F与乳胶微球质量比例为1:10。
实施例4：在上述实施例1中，最佳封闭液配方的选择：采用终浓度为0.7%、1.2%、1.7%BSA溶液作为封闭液对标记蛋白后的乳胶微球进行封闭，实验结构如下表和图10所示。
下表为：不同封闭液配方的实验结果：
上表中：“ ”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图10可以看出，BSA溶液终浓度为0.7%时，特异性较差；BSA溶液终浓度为1.2%时敏感性和特异性均较好；BSA溶液终浓度为1.7%时敏感性相对较差，检测线显色较弱，因此根据实验结果最终选择BSA溶液终浓度为1.2%。
实施例5：在上述实施例1中，最佳复溶液的选择：采用不同复溶液进行复溶，复溶液配方如下表所示，根据不同复溶液配方对检测试纸条特异性和敏感性的影响，确定最佳复溶液配方。
下表为：不同复溶液配方：
不同复溶液配方对检测试纸条特异性和敏感性的影响实验结构如下表和图11所示。
下表为：不同复溶液的实验结果：
上表中，“ ”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图11可以看出，从特异性方面来看，4组复溶液均无假阳性出现；从敏感性方面来看，复溶液3敏感性最高，检测线显色最好，所以，最终选用复溶液3，作为本产品的复溶液。
实施例6：上述实施例1中，最佳划膜液配方的选择：采用不同的划膜液配方（如下表所示），将CDV-Mab-H稀释至1.0mg/mL，用于检测线4（T线）的划线，将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.2mg/mL用于质控线5（C线）的划线；根据不同划膜液配方对检测特异性和敏感性的影响，确定最佳划膜液配方。
下表为3种不同划膜液配方
不同划膜液配方对检测特异性和敏感性的影响，实验结构如下表和图12所示。
下表为：3种不同划膜液的实验结果
上表中：“ ”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图12可以看出待选的3种缓冲体系中PBS缓冲体系敏感性相对于PBST缓冲液体系和TRIS缓冲液体系检测卡的敏感性和特异性均较好，其中，TRIS缓冲液体系敏感性较差，检测线显色较弱；PBST缓冲体系特异性较差，有假阳性出现，因此，最终选择pH值为7.2、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲体系作为最佳划膜液配方。
实施例7：上述实施例1中，检测线最佳划线浓度的确定：将CDV-Mab-H的浓度分别设为0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL用于检测线（T线）划线，，检测本发明中的检测试纸条的特异性和敏感性，确定检测线最佳划线浓度，实验结构如下表和图13所示。
下表为：检测线最佳划线浓度的实验结果：
上表中：“ ”表示阳性；“-”表示阴性。
根据上表和图13可以看出，CDV-Mab-H浓度为0.6mg/mL时敏感性较差，有假阴性；0.8mg/mL时检测线颜色较弱；1.0mg/mL时，敏感性较高，检测线显色较深；1.2mg/mL时检测线颜色相对1.0mg/mL时显色效果无明显变化，所以，最终选择1.0mg/mL作为检测线的划线浓度。
实施例8：上述实施例1中，质控线最佳划线浓度的确定：将羊抗鼠IgG抗体的浓度分别设为0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL用于质控线5（C线）划线。
检测线用CDV-Mab-H进行划线，CDV-Mab-H的浓度设定为1.0mg/mL，划线量均为1µL/cm，划线后置37℃鼓风干燥箱2小时，观察质控线5的实验情况，确定质控线5最佳划线浓度，实验结构如下表和图14所示。
下表为：质控线最佳划线浓度的实验结果：
根据上表和图14可以看出，羊抗鼠IgG抗体浓度为0.8mg/mL和1.0mg/mL时质控线颜色较弱；1.2mg/mL时，敏感性较高，检测线显色较深；1.4mg/mL时检测线颜色相对1.2mg/mL时显色效果无明显变化，所以，最终选择1.2mg/mL作为检测线的划线浓度。
实施例9：敏感性检测：对犬瘟热病毒阳性样品依次倍比稀释至1000TCID50500TCID50、250TCID50、125TCID50、62.5TCID50、31.3TCID50、15.6TCID50、7.8TCID50和3.9TCID50 而后采用本发明中的检测试纸条进行检测，检测结构如下表和图15所示。
下表为：敏感性检测结果：
注：“ ”表示犬瘟热病毒阳性，“-”表示犬瘟热病毒阴性。
根据上表和图15可以看出，血清样品稀释至15.6TCID50时检测结果均为阳性。
实施例10：特异性试验：采用本发明中的检测试纸条对犬瘟热病毒阴性样品（N1和N2）、犬细小病毒(N3)、犬副流感病毒(N4)、犬腺病毒型(N5)和犬冠状病毒(N6)进行检测，检测结构如下表和图16所示。
下表为：特异性检测结果：
上表中：“-”表示犬瘟热病毒阴性。
根据上表和图16可以看出，采用本发明中的检测试纸条对犬瘟热病毒阴性样品（N1和N2）、犬细小病毒(N3)、犬副流感病毒(N4)、犬腺病毒型(N5)和犬冠状病毒(N6)的检测结构均为阴性，因此本发明中的检测试纸条能够满足特异性要求。
实施例11：重复性试验：批内重复试验：
采用同一批次本发明的检测试纸条随机抽取5盒，对已知的30份犬瘟热病毒阳性临床样品和阴性临床样品进行检测，每个样品重复检测4次，检测结构如图17-图19所示。
所述图17-图19中，“ ”表示阳性，“-”表示阴性；根据图17-图19可以看出，30份已知阳性样品均为阳性，30份已知阴性样品均为阴性。
批间重复试验： 采用3个批次本发明的检测试纸条，每批随机抽取5盒，对已知的30份犬瘟热病毒阳性临床样品和阴性临床样品进行检测，每个样品做4重复，检测结构如图20-图23所示。
所述图20-图23中，“ ”表示阳性，“-”表示阴性。根据图20-图23可以看出，30份已知阳性样品均为阳性，30份已知阴性样品均为阴性。
对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
