基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法及其应用与流程

1.本技术属于生物检测技术领域，具体涉及基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法及其应用。


背景技术：

2.胆汁酸是肝脏中胆固醇代谢的终产物，是肌体清除胆固醇的主要途径。人类肝脏每天合成约200至600毫克的胆汁酸，经通过胆盐排泌泵（bsep）、多药耐药蛋白 2（mrp2）等转运蛋白主动运输到胆汁中并储存在胆囊内，摄取膳食后释放到十二指肠。肌体进食后在胆囊收缩素（cck）的刺激下被释放至十二指肠。肠道内的约95%的初级、次级胆汁酸混合物通过胆汁酸转运体(asbt)进入小肠黏膜细胞，于回肠末端通过回肠胆汁酸结合蛋白（ibabp）进入门静脉，在na

牛磺胆酸盐协同转运多肽（ntcp）介导下被肝脏摄取并被肝细胞加工转化，再与新合成的胆汁酸一起分泌到胆囊内，等待下一次循环。此外，无法被重新吸收的胆汁酸通过粪便排出体外，这是哺乳动物消除胆固醇及其衍生物的重要途径。上述过程被称为胆汁酸的肝肠循环，肌体中一天约发生六次，经此过程，胆汁酸被肌体充分利用，发挥促进脂类、营养素消化吸收的作用并维持肌体的代谢稳态。
3.胆汁酸的合成过程复杂，涉及到至少17种酶，并且发生在包括胞浆、内质网、线粒体和过氧化物酶体在内的多个胞内区域。胆汁酸种类繁多，经由上述过程可在肌体内形成数量超过数百种的胆汁酸池。胆汁酸作为重要的信号分子，通过激活不同的胆汁酸受体在糖代谢、脂代谢和能量稳态中起重要作用。胆汁酸合成和代谢失调与啮齿动物及人类的代谢性疾病密切相关，例如肝病、肥胖、糖尿病和心血管疾病等。
4.胆汁酸检测方法主要包括薄层色谱法（tlc）、高效液相色谱法（hplc）、毛细管区带电泳法（cze）、气相色谱-质谱联用技术（gc-ms）以及液相色谱-质谱联用技术（lc-ms/ms）等。其中，lc-ms/ms技术采用多反应监测模式（mrm）在负离子模式下定量分析各种胆汁酸兼顾了所需样本量少、处理方法简单，灵敏度高、特异性强等优点，符合现代医学检测技术所追求的高通量、高灵敏度、高稳定性的目标，适用于高通量的生物样本中胆汁酸检测。
5.然而，游离型胆汁酸结构稳定，不易碎裂出特征碎片；结合型胆汁酸的特征裂解碎片离子来源于共有的侧链酰氨键裂解，特征碎片质荷比相同，仅依靠质谱的mrm模式的母子离子对难以分离，这对前端液相色谱的分离能力提出较大的要求。此外，由于上述难点及标准品缺乏或者定制需求，在生物标本中对氧代及硫酸化胆汁酸的定量分析研究很少，这阻碍了对其潜在生理作用的评估及胆汁酸全通路代谢机制的分析。现有技术中，目前发展的lc-ms方法可实现血清中40种以上内源性胆汁酸的检测，还没有利用lc-ms/ms实现胆固醇、羟化固醇、初级胆汁酸、次级胆汁酸、三级胆汁酸的全通路代谢的检测方法。增加胆汁酸的检测数量，特别是没有标准品又有重要生理意义的胆汁酸类别，阐述涵盖全面的胆汁酸代谢通路对各类代谢性疾病的早期诊断、治疗评价、机制研究十分关键。


技术实现要素：

6.有鉴于此，一方面，一些实施例公开了基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，该检测方法包括步骤：1.1、样本制备：在血清样本中加入四倍体积的冷甲醇，涡旋5分钟后在4℃、13200rpm条件下离心处理10分钟，得到上清液；1.2、基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱定性分析血清样本上清液中的胆汁酸种类，其中，对有标准品的胆汁酸，通过标准品的保留时间及一级质谱准分子离子和特征二级碎片离子的精确质荷比，确定血清样本中存在的胆汁酸种类；对没有标准品的胆汁酸，依据同类别胆汁酸的裂解规律及色谱特点，结合血清中一级和二级质谱数据及色谱行为，确定胆汁酸种类；其中，液相色谱的条件包括：仪器为acquity uplc系统，waters公司；流动相为a：0.1%甲酸-水，b：0.1%甲酸-乙腈；色谱柱为beh c18，2.1x100mm, 1.7μm，waters公司；流速为0.4ml/min；柱温为40℃；流动相梯度为：质谱的条件包括：仪器为xevo g2-s质谱检测器，waters公司；检测时间0～19.5min；离子扫描范围50～1200da；碰撞能量20～50v；锥孔电压25v；脱溶剂气流速800 l/h；脱溶剂气温度450℃；锥孔气流速50l/h；离子源温度100 ℃；毛细管电压2kv；采集模式为负离子模式；1.3、基于超高效液相色谱串联三重四极杆质谱拟靶向定量分析血清样本中的胆汁酸、胆固醇、羟化固醇的种类，对有标准品的胆汁酸、胆固醇或羟化固醇，通过标准品摸索其母子离子对，优化检测过程中的锥孔电压、碰撞电压，实现定量分析；对无标准品的胆汁酸，基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱数据中的色谱行为以及一级和二级特征质谱数据，以[m-h]-作为母离子、特征碎片作为子离子优化质谱方法，并通过有标准品的同种类或类似结构的胆汁酸作为优化基础，优化确定锥孔电压和碰撞电压，以胆汁酸保留时间前后0.5分钟为采集窗口进行质谱信息采集，实现定量分析；其中，检测胆汁酸的液相色谱条件同1.2中液相色谱的条件；
检测胆固醇及羟化固醇的液相条件包括：仪器为acquity uplc系统，waters公司；流动相为a：0.1%甲酸-水，b：0.1%甲酸-乙腈；色谱柱为beh c18，2.1x100mm, 1.7μm，waters公司；流速为0.35ml/min；柱温为40℃；流动相梯度为：检测胆汁酸的质谱条件包括：仪器为三重四级杆质谱（tq-s）仪，waters公司；检测时间0-19.5min；洗脱温度400℃；洗脱气流速800 l/h；锥孔气流量150l/h；离子源温度150 ℃；采集模式为负离子模式；检测胆固醇及羟化固醇的质谱条件包括：仪器为三重四级杆质谱（tq-s）仪，waters公司；检测时间0-12min；洗脱温度400℃；洗脱气流速800 l/h；锥孔气流量150l/h；离子源温度150 ℃；采集模式为正离子模式；1.4、基于检测的胆汁酸、胆固醇及羟基固醇的定量分析结果，分析得到胆汁酸全通路代谢轮廓。
[0007]
另一方面，一些实施例公开了基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法得到的胆汁酸全通路代谢轮廓在疾病致病机理预测中的应用，能够应用于构建多种代谢性疾病的代谢机制。
[0008]
本技术实施例公开的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法实现了胆汁酸从上游合成到下游代谢的整体代谢通路分析，样品处理方法简单，具有高通量、高灵敏度、获得信息全面等优点，能够通过检测胆汁酸代谢通路在代谢性疾病中的异常情况，在疾病预测、诊断、检测和疾病预后等方面有重要应用价值。
附图说明
[0009]
图1 胆汁酸全通路代谢轮廓示意图图2 初级胆汁酸在肝脏内的代谢途径示意图图3 胆酸在肠道内的代谢途径示意图图4 鹅去氧胆酸在肠道中的代谢途径示意图图5 鼠胆酸在肠道中的代谢途径示意图图6 猪胆酸在肠道中的代谢途径示意图图7 大鼠血清样本中55种胆汁酸、胆固醇的mrm图谱（一）图8 大鼠血清样本中55种胆汁酸、胆固醇的mrm图谱（二）图9 大鼠血清样本中55种胆汁酸、胆固醇的mrm图谱（三）
1.7μm，waters公司；流速为0.4ml/min；柱温为40℃；发明人针对具有相同质量数和相同二级碎片离子的胆汁酸分子进行定量分析中，对色谱流动相进行了优化，实现了良好的分离效果。具体地，例如牛磺ω鼠胆酸（tωmca）、牛磺β鼠胆酸（tβmca）的甾醇母核r6位羟基分别是α、β构型，分子质量一致、化学结构相近，对此，通过延长25%比例乙腈的洗脱时间实现了分离；牛磺熊去氧胆酸（tudca）、牛磺猪去氧胆酸（thdca），其羟基分别在甾醇母核的r6和r7位上，分子质量一致、化学结构相近，对此，通过将出峰时间段内乙腈比例梯度上升的梯度改为25%比例乙腈的等度洗脱实现了分离；熊去氧胆酸（udca）、猪去氧胆酸（hdca）的羟基分别在甾醇母核的r6和r7位上，分子质量一致、化学结构相近，对此，通过减缓出峰时间段内乙腈比例上升的梯度实现了分离。发明人经过大量的优化实验，得到了优化的流动性梯度为：质谱的条件包括：仪器为xevo g2-s质谱检测器，waters公司；检测时间0～19.5min；离子扫描范围50～1200da；碰撞能量20～50v；锥孔电压25v；脱溶剂气流速800 l/h；脱溶剂气温度450℃；锥孔气流速50l/h；离子源温度100 ℃；毛细管电压2kv；采集模式为负离子模式；其中，基于uplc-q-tof-ms技术推测得到的胆汁酸，有标准品的，通过标准品的保留时间以及准分子离子及特征二级碎片离子的精确质荷比定性确定血清样本中存在的胆汁酸种类；对于没有标准品的胆汁酸，根据总结相似类别或类似结构的胆汁酸标准品特征的质谱裂解规律，分析一级质谱和在低到高范围碰撞能下得到的二级质谱特征，同时根据其色谱行为进行定性确定胆汁酸种类；进而为建立定量分析胆汁酸全通路代谢的方法提供指导。基于非靶向的uplc-q-tof-ms技术，采用全信息串联质谱（mse）模式收集血清样品中胆汁酸分子的一级离子及二级碎片离子的质谱信息，通过获得的一级质谱图和二级质谱图对样品中的胆汁酸进行定性预测和鉴定，例如，扫描游离型胆汁酸的碎片离子时可检测到特征离子碎片[m-h-h2o]-，其产生方式为甾核母体的脱水重排；扫描牛磺酸结合型胆汁酸的碎片离子时可检测到m/z 79.95，106.98，124.00的特征离子碎片，来源于牛磺酸侧链酰氨键的断裂；扫描甘氨酸结合型胆汁酸可检测到丰度较强的特征离子碎片[nh
2-ch
2-coo]-；扫描硫酸化胆汁酸获得m/z 75.95，96.96的特征离子碎片，为侧链磺酸基的断裂而产生的特征碎片。再结合胆汁酸的结构特征和理化性质分析确定保留时间，以一级质谱准分子离子
的精确质荷比（m/z
ꢀ±ꢀ
10ppm）和二级质谱特征碎片离子的精确质荷比为依据进行胆汁酸种类的确认。
[0018]
检测到的胆汁酸中，有标准品的胆汁酸为30种，具体的胆汁酸种类、理论分子量、保留时间、测得分子量见表1表1 检测到的有标准品的胆汁酸种类列表：
检测到的胆汁酸中，没有标准品的胆汁酸有17种，其种类和理论分子质量、保留时间、实测分子质量和碎片离子的对应关系见表2，其种类和分子式见列表3。
[0019]
表2中所列的碎片离子信息包括碎片离子及其质量数，例如6-酮石胆酸对应的碎片离子中，[m-h-h2o]
‑ꢀ
371.26表示碎片离子为[m-h-h2o]
‑ꢀ
，其质量数为371.26。
[0020]
ms/ms技术，在与定性分析同一流动相条件下通过mrm采集模式对鉴定的关键功能性胆汁酸、胆固醇及羟化固醇进行定量；除了胆固醇及3种羟化固醇，本发明实现同时定量 67种胆汁酸，其种类与锥孔电压、碰撞能量、母离子、子离子的对应关系见表4。表4中，标准品列中，标记√表示有标准品的胆汁酸，没有标记√，则表示没有标准品的胆汁酸。
[0021]
胆固醇及羟化固醇化合物的锥孔电压、碰撞能量、母离子、子离子的对应关系见表5。表5中，标准品列中，标记√表示有标准品的化合物。
[0022]
1.4、根据得到的胆汁酸定量分析结果，分析得到胆汁酸全通路代谢轮廓。即，通过对血清样本的上清液中的定量的重要胆汁酸进行分析确定胆汁酸全代谢通路。
[0023]
胆汁酸全通路代谢轮廓基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，实现了对胆汁酸代谢通路中涉及到的胆固醇、3种羟化固醇和67种胆汁酸的定量分析，进一步，能够实现对胆汁酸全通路代谢轮廓的确定。具体地，根据对胆汁酸种类的定量检测结果，得到胆汁酸全通路代谢轮廓包括肝脏内合成初级胆汁酸的过程以及在肠道内代谢为次级或三级胆汁酸的过程，其中，肝脏合成初级胆汁酸的过程为初级胆汁酸在肝脏内的代谢途径，肠道内代谢为次级或三级胆汁酸的过程包括胆酸在肠道内的代谢途径、鹅去氧胆酸在肠道中的代谢途径、鼠胆酸在肠道中的代谢途径、猪胆酸在肠道中的代谢途径，如图1所示。
[0024]
初级胆汁酸在肝脏内的代谢途径如图2所示，初级胆汁酸在肝脏内的代谢途径包括：以胆固醇作为起始分子，胆固醇在肝脏中先后经胆固醇7-羟化酶（cyp7a1）、cyp8b1和线粒体固醇27-羟化酶（cyp27a1）介导，产生约占75％总胆汁酸量的胆酸及鹅去氧胆酸，是为胆汁酸合成的经典途径；胆固醇在cyp27a1酶的作用下被代谢为27-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇，胆固醇在cyp46a1酶的作用下代谢为24(s)-羟基胆固醇，27-羟基胆固醇在7α-羟化酶（cyp7b1）的作用下最终被代谢为鹅去氧胆酸，是为胆汁酸代谢的替代途径；
在啮齿类动物体内，鹅去氧胆酸进一步在肝脏中转化为熊去氧胆酸，在cyp3a酶的介导下转化为猪胆酸、在cyp2c70酶的介导下转化为α-鼠胆酸；熊去氧胆酸进一步在肝脏中转化为β-鼠胆酸；鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、猪胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、胆酸为游离型胆汁酸，分别与甘氨酸和牛磺酸结合形成结合型胆汁酸：甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、甘氨猪胆酸、牛磺猪胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、甘氨-β-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸。
[0025]
结合型胆汁酸水溶性增强。肝脏内合成的游离型或结合型初级胆汁酸储存在胆囊中，餐后分泌进入肠道，并在水解酶（bsh）的作用下去结合化，转化为游离型胆汁酸。
[0026]
胆汁酸的全通路代谢途径中涉及到的胆固醇、羟化固醇的结构可以用下述分子结构中的（i）表示，胆汁酸的结构可以用表示：牛磺酸（taurine）、甘氨酸（glycine）、硫酸盐（sulfate）的分子结构见如下分子结构所示：胆固醇在肝脏内羟基化得到羟化固醇，胆固醇及羟化固醇对应的分子结构中的基团x
24
、x
25
、x
27
见表6化合物种类列表。
[0027]
初级胆汁酸在肝脏内的代谢途径涉及到的每一种胆汁酸对应的分子结构中的基团r3、r5、r6、r7、r
12
、r
24
见表7初级胆汁酸及其结合形式的化学结构。
胆酸在肠道内的代谢途径如图3所示，胆酸在肠道内的代谢途径，具体包括：牛磺胆酸和甘氨胆酸在肠道内在水解酶（bsh）的作用下去结合化，转化为胆酸；胆酸在bai基转录簇所得一系列酶的作用下通过7β去羟基反应得到去氧胆酸，去氧胆酸在12-羟基类固醇脱氢酶（12-hsdh）介导下进一步代谢为12-酮石胆酸，并最终代谢得到12-表去氧胆酸；胆酸通过7-羟基类固醇脱氢酶（7-hsdh）代谢经7-酮去氧胆酸中间体代谢为熊胆酸；也可以经过3-羟基类固醇脱氢酶（3-hsdh）代谢经3-酮胆酸中间体，进一步代谢为异胆酸；此外经过12-羟基类固醇脱氢酶（12-hsdh）代谢为12-酮鹅去氧胆酸中间体进一步代谢为12-表胆酸；胆酸与牛磺酸、甘氨酸结合形成牛磺胆酸、甘氨胆酸及三级胆汁酸7-硫酸化胆酸，去氧胆酸与牛磺酸、甘氨酸结合形成甘氨去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、及三级胆汁酸3-硫酸化去氧胆酸，熊胆酸与牛磺酸结合形成牛磺熊胆酸。
[0028]
胆酸在肠道中代谢涉及的胆汁酸种类及每一种胆汁酸所对应的分子结构中的基团r3、r5、r6、r7、r
12
、r
24
见表8胆酸及其在肠道内代谢物的化学结构。
[0029]
表 8 胆酸及其在肠道内代谢物的化学结构
鹅去氧胆酸在肠道中的代谢途径如图4所示，鹅去氧胆酸在肠道中的代谢途径包括：甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸转化为鹅去氧胆酸；鹅去氧胆酸由bai基因簇转录所得一系列酶的介导下代谢为石胆酸，在此过程中，通过5β-h位置脱羟基作用可形成别异石胆酸；石胆酸一方面通过6-羟基化酶转化形成猪去氧胆酸和鼠去氧胆酸，另一方面还可通过结合化形成牛磺石胆酸、甘氨石胆酸和3-硫酸化石胆酸，再一方面，3-hsdh酶将二级胆汁酸石胆酸代谢为脱氢石胆酸，并最终形成三级胆汁酸异石胆酸；鹅去氧胆酸同时经由7-hsdh酶和3-hsdh酶的作用形成7-酮石胆酸中间体和3-酮鹅去氧胆酸中间体，7-酮石胆酸中间体进一步代谢得到三级胆汁酸熊去氧胆酸，熊去氧胆酸通过r3位羟基异构化形成异熊去氧胆酸；通过与牛磺酸、甘氨酸、硫磺酸作用，去氧胆酸还进一步转化为3-硫酸化鹅去氧胆酸，7-酮石胆酸还进一步转化为牛磺-7-酮石胆酸，熊去氧胆酸还进一步转化为三级胆汁酸甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、3-硫酸化熊去氧胆酸。
[0030]
鹅去氧胆酸在肠道中代谢涉及的胆汁酸种类及每一种胆汁酸所对应的分子结构中的基团r3、r5、r6、r7、r
12
、r
24
见表9鹅去氧胆酸及其在肠道内代谢物的化学结构。
鼠胆酸在肠道中的代谢途径如图5所示，鼠胆酸在肠道中的代谢途径包括：在啮齿类动物体内，牛磺-α-鼠胆酸在bsh酶的作用下转化为α-鼠胆酸，甘氨-β-鼠胆酸和牛磺-β-鼠胆酸在bsh酶的作用下转化为β-鼠胆酸；α-鼠胆酸和β-鼠胆酸进一步在7-hsdh酶的作用下形成鼠去氧胆酸和牛磺别鼠去氧胆酸；鼠去氧胆酸进一步转化为6-酮石胆酸中间体，6-酮石胆酸中间体进一步转化为猪去氧胆酸；β-鼠胆酸经过r6羟基异构化得到ω-鼠胆酸；猪去氧胆酸、鼠去氧胆酸、ω-鼠胆酸进一步通过与牛磺酸、甘氨酸结合得到结合型胆汁酸甘氨猪去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺异鼠去氧胆酸、牛磺鼠去氧胆酸、牛磺-ω-鼠胆酸。
[0031]
鼠胆酸在肠道中代谢涉及的胆汁酸种类及每一种胆汁酸所对应的分子结构中的基团r3、r5、r6、r7、r
12
、r
24
见表10鼠胆酸及其在肠道内代谢物的化学结构。
猪胆酸在肠道中的代谢途径如图6所示，猪胆酸在肠道中的代谢途径包括：甘氨猪胆酸和牛磺猪胆酸转化为猪胆酸；猪胆酸进一步转化为猪去氧胆酸和牛磺别猪去氧胆酸；猪去氧胆酸进步转化为结合型胆汁酸甘氨猪去氧胆酸和牛磺猪去氧胆酸。
[0032]
猪胆酸在肠道中代谢涉及的胆汁酸种类及每一种胆汁酸所对应的分子结构中的基团r3、r5、r6、r7、r
12
、r
24
见表11猪胆酸及其在肠道内代谢物的化学结构。
[0033]
基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓在心肌梗死致病机理预测中的应用。
[0034]
试验样品：空白大鼠血清样本、心梗模型大鼠血清样本、给药后大鼠的血清样本。
[0035]
样本处理方式：20μl血清加入80μl冷甲醇，涡旋5min后在4℃ 13200rpm条件下离心10min，上清液吸至进样小瓶中进样。液相条件和质谱条件同基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法中的1.3。
[0036]
实验结果：表12列出了空白大鼠、心梗模型大鼠及给药后大鼠三种血清样本中55种胆汁酸和胆固醇的比较表，其中，模型组相比空白组所列为心梗模型大鼠血清样本中与空白大鼠血清样本中相同胆汁酸的含量变化，箭头向上表示含量增加，箭头向下表示含量降低，没有箭头标识说明含量无变化；空白大鼠样本保留时间所列的保留时间为nd，表示没有检测到对应的胆汁酸。55种胆汁酸、胆固醇的mrm谱图如图7～9所示。表12中所列的编号
①
、
②
等为对应的胆汁酸在图7～9中的对应图谱中峰位置编号。
[0037]
由表12所列的结果可知，与空白组大鼠血清样本相比，心梗模型大鼠血清样本中6-酮石胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺去氧胆酸的水平降低；与心梗模型大鼠血清样本相比，给药大鼠模型血清中α-鼠胆酸、、β-鼠胆酸、ω-鼠胆酸、鹅去氧胆酸的含量上升，提示给药过程可能影响胆汁酸的经典合成途径，产生鹅去氧胆酸、鼠胆酸的替代途径成为初级胆汁酸合成的主要途径。6-酮石胆酸、7-酮石胆酸、12-酮石胆酸、3-酮鹅去氧胆酸等在给药大鼠模型血清样本中的含量比心梗模型大鼠模型高，提示hsdh酶及产生hsdh酶的肠道菌群可能在给药过程中发挥了介导作用，导致氧代胆汁酸在给药大鼠血清中含量上升。
[0038]
基于血清样本的胆汁酸代谢轮廓的检测方法在致病机理预测中的应用，通常是指基于血清样本中的胆汁酸全通路代谢轮廓确定的胆汁酸代谢途径，结合对具体样本的血清样本中的胆汁酸种类的检测分析，能够分析该具体样本是否存在具体胆汁酸的代谢障碍。利于胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，能够在血清样本基质中实现多通路检测胆汁酸代谢情况分析，从而实现肌体不同疾病的诊断与评估，达到一测多评的目的。
[0039]
例如，通过检测胆固醇-胆酸-去氧胆酸通路及胆固醇-鹅去氧胆酸-石胆酸途径，能够判断肌体是否存在胆汁酸合成障碍，从而推测肠炎发生的可能性；通过检测胆酸-12-酮去氧胆酸或3-酮胆酸通路及鹅去氧胆酸-7-酮石胆酸或3-酮去氧胆酸代谢途径，判断肌体是否存在3-羟基甾体脱氢酶（3-hsdh）、7-羟基甾体脱氢酶（7-hsdh）、12-羟基甾体脱氢酶（12-hsdh）的缺失；通过检测胆酸-去氧胆酸-23-脱甲去氧胆酸通路，可以指导冠心病的早期发现等。
[0040]
通过对胆汁酸代谢通路的检测可深入了解代谢类疾病致病机理，及时进行疾病预测。例如次级胆汁酸可作为尼法醇x受体（fxr）及g蛋白偶联受体（tgr5）的激活剂，而与两种受体接触的胆汁酸的特征决定了它们的调节水平，通过通路分析可以从胆汁酸各成分组间、胆汁酸比例、不同种类胆汁酸等变化规律入手联系胆汁酸变化与疾病间的关联性，并可选择信号通路上的相关指标进行验证；循环胆固醇水平的升高及羟基化胆固醇的水平变化对于动脉粥样硬化、癌症、2型糖尿病和神经退行性疾病等病理情况中起标志性作用，通过代谢通路分析羟化固醇与胆固醇的比例可提示疾病与胆汁酸代谢酶（如cyp7a1、cyp8b1、cyp27a1等）的关联性；通过代谢通路得到胆汁酸组成变化信息也可与相关肠道菌群（如参
与胆汁酸去结合化的拟杆菌、梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、利斯特氏杆菌等菌属），指导后续的验证工作。
[0041]
本技术实施例公开的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，能够对缺少标准品、但具有重要生理意义的胆汁酸进行定量研究，减少了现有技术中需要前期合成标准品的必须步骤，实现了胆汁酸从上游合成前体到下游代谢的整体代谢通路分析，样品处理方法简单、高通量、高灵敏度、获得信息量全面，能够通过胆汁酸代谢通路分析发现代谢性疾病中出现的异常情况，有助于对代谢性疾病致病机理的研究。
[0042]
本技术公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本技术的发明构思，并不构成对本技术技术方案的限定，凡是对本技术公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本技术具有相同的发明构思，都在本技术权利要求的保护范围之内。