基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法及其应用与流程

技术特征：
1.基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，该检测方法包括步骤：1.1、样本制备：将血清样本加入四倍体积的冷甲醇中，涡旋5分钟后在4℃、13200rpm条件下离心处理10分钟，得到上清液；1.2、基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱定性分析血清样本上清液中的胆汁酸种类，其中，对有标准品的胆汁酸，通过标准品的保留时间及一级质谱准分子离子和特征二级碎片离子的精确质荷比进行确认，确定血清样本中存在的胆汁酸种类；对没有标准品的胆汁酸，依据同类别胆汁酸的裂解规律及色谱特点，结合血清中一级和二级质谱数据及色谱行为进行鉴定，确定胆汁酸种类；其中，液相色谱的条件包括：仪器为acquity uplc系统，waters公司；流动相为a：0.1%甲酸-水，b：0.1%甲酸-乙腈；色谱柱为beh c18，2.1x100mm, 1.7μm，waters公司；流速为0.4ml/min；柱温为40℃；流动相梯度为：质谱的条件包括：仪器为xevo g2-s质谱检测器，waters公司；检测时间0～19.5min；离子扫描范围50～1200da；碰撞能量20～50v；锥孔电压25v；脱溶剂气流速800 l/h；脱溶剂气温度450℃；锥孔气流速50l/h；离子源温度100 ℃；毛细管电压2kv；采集模式为负离子模式；1.3、基于超高效液相色谱串联三重四极杆质谱拟靶向定量分析血清样本中的胆汁酸、胆固醇及羟化固醇，对有标准品的胆汁酸、胆固醇或羟化固醇，通过标准品摸索其母子离子对，优化检测过程中的锥孔电压、碰撞电压，实现定量分析；对无标准品的胆汁酸，基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱数据中的色谱行为以及一级和二级特征质谱数据，以[m-h]-作为母离子、特征碎片离子作为子离子优化质谱方法，并通过有标准品的类似结构或同类别的胆汁酸为优化基础确定锥孔电压和碰撞电压，以胆汁酸保留时间前后0.5分钟为采集窗口进行质谱信息采集，实现定量分析；其中，检测胆汁酸的液相色谱条件同1.2中液相色谱的条件；检测胆固醇及羟化固醇的液相条件包括：仪器为acquity uplc系统，waters公司；流动
相为a：0.1%甲酸-水，b：0.1%甲酸-乙腈；色谱柱为beh c18，2.1x100mm, 1.7μm，waters公司；流速为0.35ml/min；柱温为40℃；流动相梯度为：检测胆汁酸的质谱条件包括：仪器为三重四级杆质谱仪，waters公司；检测时间0～19.5min；洗脱温度400℃；洗脱气流速800 l/h；锥孔气流量150l/h；离子源温度150 ℃；采集模式为负离子模式；检测胆固醇及羟化固醇的质谱条件包括：仪器为三重四级杆质谱仪，waters公司；检测时间0～12min；洗脱温度400℃；洗脱气流速800 l/h；锥孔气流量150l/h；离子源温度150 ℃；采集模式为正离子模式；1.4、基于检测的胆汁酸、胆固醇及羟化固醇的定量分析结果，分析得到胆汁酸全通路代谢轮廓。2.根据权利要求1所述的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，步骤1.2中检测到的有标准品的胆汁酸为30种，具体为：
步骤1.2中，检测到的没有标准品的胆汁酸有17种，分别与碎片离子的对应关系为：
。3.根据权利要求2所述的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，步骤1.3中，胆汁酸种类与锥孔电压、碰撞能量、母离子、子离子的对应关系为：
胆固醇及羟化固醇化合物的锥孔电压、碰撞能量、母离子、子离子的对应关系为：。4.根据权利要求3所述的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，胆汁酸全通路代谢轮廓包括初级胆汁酸在肝脏内的代谢途径，具体包括：胆固醇以经典途径在肝脏中产生约占75％总胆汁酸量的胆酸及鹅去氧胆酸；胆固醇以替代途径被代谢为27-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇及24（s）-胆固醇，所述27-羟基胆固醇进而代谢得到鹅去氧胆酸；所述鹅去氧胆酸进一步在肝脏中转化为熊去氧胆酸、猪胆酸、α-鼠胆酸；所述熊去氧胆酸进一步在肝脏中转化为β-鼠胆酸；所述胆酸、所述鹅去氧胆酸、所述熊去氧胆酸、所述猪胆酸、所述α-鼠胆酸、所述β-鼠胆酸分别与甘氨酸和牛磺酸结合形成结合型胆汁酸：甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、甘氨猪胆酸、牛磺猪胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、甘氨-β-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸。5.根据权利要求4所述的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，胆汁酸全通路代谢轮廓包括胆酸在肠道内的代谢途径，具体包括：牛磺胆酸和甘氨胆酸在肠道内转化为胆酸；所述胆酸转化得到去氧胆酸，所述去氧胆酸一方面代谢得到异去氧胆酸，另一方面代谢为12-酮石胆酸，并最终代谢得到12-表去氧胆酸；所述胆酸分别经7-酮去氧胆酸、3-酮胆酸和12-酮鹅去氧胆酸中间体进一步分别代谢为熊胆酸、异胆酸和12-表胆酸；所述胆酸与硫磺酸结合形成7-硫酸化胆酸，所述去氧胆酸与牛磺酸、甘氨酸、硫磺酸结合形成甘氨去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、3-硫酸化去氧胆酸，熊胆酸与牛磺酸结合形成牛磺熊胆酸。6.根据权利要求4所述的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，胆汁酸全通路代谢轮廓包括鹅去氧胆酸在肠道中的代谢途径，具体包括：甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸转化为鹅去氧胆酸；
所述鹅去氧胆酸进一步转化为别异石胆酸和石胆酸；所述石胆酸一方面转化形成猪去氧胆酸和鼠去氧胆酸，另一方面还转化为牛磺石胆酸、甘氨石胆酸和3-硫酸化石胆酸，再一方面，代谢为脱氢石胆酸，并最终形成异石胆酸；所述鹅去氧胆酸同时形成7-酮石胆酸中间体和3-酮鹅去氧胆酸中间体，所述7-酮石胆酸中间体进一步代谢得到熊去氧胆酸，所述熊去氧胆酸可进一步代谢并异构化形成异熊去氧胆酸；所述鹅去氧胆酸还进一步转化为3-硫酸化鹅去氧胆酸；所述7-酮石胆酸还进一步转化为牛磺-7-酮石胆酸；所述熊去氧胆酸还进一步转化为甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、3-硫酸化熊去氧胆酸。7.根据权利要求4所述的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，胆汁酸全通路代谢轮廓包括鼠胆酸在肠道中的代谢途径，具体包括：牛磺-α-鼠胆酸转化为α-鼠胆酸，甘氨-β-鼠胆酸和牛磺-β-鼠胆酸转化为β-鼠胆酸；所述α-鼠胆酸和所述β-鼠胆酸进一步转化为鼠去氧胆酸和牛磺别鼠去氧胆酸；所述鼠去氧胆酸进一步转化为6-酮石胆酸中间体，所述6-酮石胆酸中间体进一步转化为猪去氧胆酸；所述β-鼠胆酸进一步转化为ω-鼠胆酸；所述猪去氧胆酸、所述鼠去氧胆酸、所述ω-鼠胆酸进一步通过与牛磺酸、甘氨酸结合得到结合型胆汁酸甘氨猪去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、牛磺异鼠去氧胆酸、牛磺鼠去氧胆酸、牛磺-ω-鼠胆酸。8.根据权利要求4所述的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，其特征在于，胆汁酸全通路代谢轮廓包括猪胆酸在肠道中的代谢途径，具体包括：甘氨猪胆酸和牛磺猪胆酸转化为猪胆酸；所述猪胆酸进一步转化为猪去氧胆酸和牛磺别猪去氧胆酸；所述猪去氧胆酸进一步转化为结合型胆汁酸甘氨猪去氧胆酸和牛磺猪去氧胆酸。9.权利要求1～8任一项所述的检测方法得到的基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓在致病机理预测中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，基于血清样本中的胆汁酸全通路代谢轮廓确定的胆汁酸代谢途径，通过分析具体样本的血清样本中的胆汁酸种类，以分析所述血清样本是否存在具体胆汁酸的代谢障碍。

技术总结
本发明公开了基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法，包括：制备样本；使用超高效液相色谱串联飞行时间质谱推测鉴定血清样本中的胆汁酸，有标准品的，通过标准品的保留时间，一级质谱准分子离子和特征二级碎片离子的精确质荷比进行确认；没有标准品的，依据同类别胆汁酸的裂解规律及色谱特点，结合血清中一级和二级质谱数据及色谱行为进行鉴定；采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱定量分析胆汁酸、胆固醇和羟基固醇，有标准品的，通过标准品优化合适的检测条件，无标准品的，以超高效液相色谱串联飞行时间质谱定性一级和二级质谱数据为基础，优选特征子离子，优化锥孔电压和碰撞能量，实现定量分析；得到胆汁酸全通路代谢轮廓。通路代谢轮廓。通路代谢轮廓。


技术研发人员：郭娜 杨洪军 范斌 闫寒 杨祎晴 李贤煜 陈鹏
受保护的技术使用者：中国中医科学院医学实验中心
技术研发日：2021.12.23
技术公布日：2022/1/21