靶向CD47和CD24的重组融合蛋白及其制备和用途的制作方法

靶向cd47和cd24的重组融合蛋白及其制备和用途
发明领域
1.本技术涉及一种靶向cd47、cd24和/或fcr的重组融合蛋白、及其制备和用途，特别是其在肿瘤治疗中的用途。


背景技术：

2.癌细胞已经发展出一些逃避宿主免疫监视的机制，包括：1)通过高表达膜蛋白cd24来逃避巨噬细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞和自然杀伤细胞的免疫监视，其中膜蛋白cd24能与免疫细胞表面的siglec-10受体结合，从而抑制免疫激活；2)通过高表达cd47来逃避巨噬细胞(mφ)的免疫监视，cd47与巨噬细胞表面上的信号调节蛋白α(sirpα)结合，从而引发抑制性信号的生成，该抑制信性号抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。可以看出，癌细胞相当聪明，可以基于它们发展出的逃避机制而迅速增殖。因此，有效杀灭所有癌细胞的抗癌药物的开发可以针对这些机制。
3.sirp和cd47
4.信号调节蛋白(sirp)是跨膜糖蛋白，包括三个家族成员，sirpα(cd172a)、sirpβ(cd172b)和sirpγ(cd172g)。这三种蛋白均包含相似的胞外区域，但是具有不同的胞内结构域。胞外区域包含三个免疫球蛋白样结构域，一个ig-v和两个ig-c结构域。sirpα(cd172a)的胞内结构域包含两个抑制性信号转导区域，其可以抑制信号转导以及相应的细胞功能。sirpβ(cd172b)和sirpγ(cd172g)的胞内区域非常短，不含信号转导结构域。但是，sirpβ(cd172b)能够经由衔接蛋白例如dap12而起到信号转导的功能。sirp主要表达于巨噬细胞(mφ)、树突状细胞(dc)和神经元。
5.cd47是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在包括红细胞在内的所有细胞类型的表面上表达。cd47的配体包括整联蛋白、血小板反应蛋白-1和sirp。cd47，通过与sirpα相互作用发出“不要吃我”的信号，可以抑制巨噬细胞的吞噬作用，并从而保护例如血细胞等免收巨噬细胞的攻击。
6.已经有研究表明，很多过表达cd47的肿瘤或癌细胞可以抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。过表达cd47的癌细胞包括急性髓细胞样白血病(aml)、慢性髓细胞样白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞。有报道称，向荷肿瘤的小鼠注射阻碍cd47与sirpα结合的cd47特异性抗体，可以显著地抑制肿瘤生长。当将同一种抗体注射到携带人白血病细胞的小鼠中时，肿瘤细胞或癌细胞完全消除(theocharides apa，et al.，2012)。
7.cd24和siglec-10
8.唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(siglecs)是一种免疫球蛋白样i型跨膜蛋白。在siglecs家族中，siglec-10是一种抑制性受体，广泛表达于巨噬细胞、b细胞、nk细胞和活化的t细胞等免疫细胞上。它有五个细胞外ig样结构域、一个跨膜区和一个胞质尾区。siglec-10的igv结构域包含一个关键的精氨酸残基，它与唾液酸的识别有关(yin，et al.，2020)。
已知t细胞上的siglec-10表达通过抑制t细胞主要组织相容性复合物i类(mhc-i)肽复合物的形成和t细胞受体相关激酶lck和zap-70的磷酸化来干扰t细胞活化(yin，et al.，2020)。b细胞和nk细胞上表达的siglec-10能够抑制bcr介导和nk细胞受体介导的信号转导(yin，et al.，2020)。
9.cd24是一种糖基-磷脂酰肌醇锚定蛋白，存在于发育中的t淋巴细胞和大多数b淋巴细胞的表面(yin et al.，2020)。很多癌细胞，包括卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、急性淋巴细胞白血病(all)、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、胃腺癌和胶质母细胞瘤，也高表达cd24(barkal et al.，2019；liu et al.，2013)。癌细胞上的cd24与免疫细胞上的siglec-10相互作用，产生“不要吃我”的信号，用于免疫逃避和保护肿瘤细胞免受免疫攻击。
10.研究表明cd24表达与膀胱肿瘤复发存在相关性(liu et al.，2013)。在卵巢癌患者中，cd24的表达是总生存期的独立预测因子，并与肿瘤分期、腹膜和淋巴结转移相关；cd24阳性细胞增殖增强，是一种高度侵袭性的表型，并且与卵巢癌细胞的顺铂耐药性相关(nakamura et al.2017)。
11.研究表明cd24单克隆抗体能够在膀胱癌和三阴性乳腺癌的小鼠模型中，减少肺部转移并且延长总体存活期。文献还表明，通过抗体阻断cd24-siglecs 10相互作用能够经巨噬细胞引起肿瘤生长减少，并且延长荷瘤小鼠的生存期(barkal，et al.，2019；chan et al.，2019；overdevest et al.，2011)。
12.此外，之前的研究表明cd47/cd24双特异性抗体可以有效激活大脑中的髓系免疫(wuh，etal，2021)。cd24抗体和cd47抗体的联合用药可增强对人卵巢癌细胞的吞噬作用(barkal et al.，2019)。barakal等人还发现，与单独治疗相比，cd24抗体和西妥昔单抗联合治疗进一步增强了对胰腺腺癌细胞的吞噬作用，这表明包含cd24中和的联合疗法可能会产生协同抗肿瘤作用。
13.fc和fcr
14.可结晶区段(fc区)是抗体的尾部区，是决定抗体的效应子功能(即，抗体如何与特定细胞受体或其他防御蛋白建立关系)的结构域。
15.fc受体(fcr)是在某些细胞，包括b淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、和肥大细胞等的表面上的蛋白。这些细胞有助于免疫系统的保护功能。
16.fc区可以与fc受体以及补体系统的一些蛋白相互作用，激活免疫系统。
17.治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体
18.靶向单一抗原的抗体具有有限的疗效。例如，获批的pd-l1抗体，avelumab总的缓解率仅为33％。
19.近年来已经开发出双特异性或三特异性融合蛋白，且这些融合蛋白已经在临床前和临床试验中显示出相当不错的效果。
20.尽管从概念上讲，在传统抗体上附加额外的结合基团不是很复杂的事，然而，这种改造会显著地改变抗体的结构，抗体和额外结合基团间可能会相互影响结合力和/或药效(wang s et al.，2021)。为优化体内疗效和药物性质，需要在主次基团(序列)的选择、目标物结合力的平衡、结合位点(重链或轻链的n-或c-端)的选择、结构稳定性、接头长度和序列方面做出精心的设计和改造(shimh.2020)。
21.us 10,800,821 b2公开了一种约90k道尔顿的重组双特异性融合蛋白，靶向cd47和fcr，在治疗携带hl细胞的balb/c裸鼠中观察到增强的抗肿瘤效果。
22.对于本技术中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本技术的现有技术。


技术实现要素：

23.本技术提供一种新的重组融合蛋白，包含cd24抗体和cd47结合肽，其在体内抗肿瘤实验中显示出比cd47结合肽与cd24抗体联用更好的效果。
24.具体地，本技术公开一种重组融合蛋白，其包含特异结合cd24的cd24抗体或其抗体片段、以及特异结合cd47的cd47结合肽，其中该cd47结合肽与该cd24抗体或其抗体片段连接，其中该cd24抗体或其抗体片段包含重链可变区、重链恒定区、和轻链可变区，重链可变区包含hv-cdr1、hv-cdr2和hv-cdr3，hv-cdr1、hv-cdr2和hv-cdr3分别包含seq id nos：7、8和9所示的氨基酸序列，轻链可变区包含lv-cdr1、lv-cdr2和lv-cdr3，lv-cdr1、lv-cdr2和lv-cdr3分别包含seq id nos：10、11和12所示的氨基酸序列，重链恒定区具有fcr结合力且与重链可变区的c端连接，其中该cd47结合肽包含突变的信号调节蛋白(sirp)胞外ig样结构域，该突变的信号调节蛋白(sirp)胞外ig样结构域包含与seq id no：1具有至少95％序列一致度所示的氨基酸序列，其中该重组融合蛋白能够同时结合cd47和cd24。该cd47结合肽可以与该cd24抗体或其抗体片段的重链可变区或轻链可变区的n端结合。
25.cd24抗体或其抗体片段的重链可变区可以包含与seq id nos：2、或5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列。在一个实施方式中，重链可变区可以包含seq id nos：2、或5所示的氨基酸序列。cd24抗体或其抗体片段的轻链可变区可以包含与seq id nos：3、4、或6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列。在一个实施方式中，轻链可变区可以包含seq id nos：3、4、或6所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区可以包含分别与i)seq id nos：2和3；ii)seq id nos：2和4；或iii)seq id nos：5和6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列。在一些实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的重链可变区和轻链可变区可以分别包含i)seq id nos：2和3；ii)seq id nos：2和4；或iii)seq id nos：5和6所示的氨基酸序列。
26.具有fcr结合力的重链恒定区可以是天然存在的或经改造的人igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区，或其功能片段。在一些实施方式中，具有fcr结合力的重链恒定区是人igg1重链恒定区，或其功能片段。在一些实施方式中，具有fcr结合力的重链恒定区具有seq id no：13所示的氨基酸序列。
27.cd24抗体或其抗体片段可以包含轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区，或其功能片段，与轻链可变区的c端连接。在一些实施方式中，cd24抗体或其抗体片段可以包含seq id no：14所示的氨基酸序列。
28.在一些实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的至少一个互补位在构成该互补位的重链可变区或轻链可变区的n端与cd47结合肽连接。在一些实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的各个互补位在构成该互补位的重链及可变区或轻链可变区的n端与cd47结合肽连接。在一些实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的各个互补位在构成该互补位的重链可变
区的n端与cd47结合肽连接。在一些实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的各个互补位在构成该互补位的轻链可变区的n端与cd47结合肽连接。
29.本技术的cd24抗体或其抗体片段可以与cd47结合肽经接头而连接。接头可以是5-30、10-30、10-20、或15个氨基酸长度的肽。接头可以是例如-(gly-gly-gly-gly-ser)
2-(seq id no：16)、-(gly-gly-gly-gly-ser)
3-(seq id no：15)、或-(gly-gly-gly-gly-ser)
4-(seq id no：17)。在一些实施方式中，接头是-(gly-gly-gly-gly-ser)
3-(seq id no：15)。
30.本技术的重组融合蛋白可以包含cd47结合肽-接头-cd24抗体重链、和cd24抗体轻链，其中cd47结合肽-接头-cd24抗体重链含有与seq id no：18具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列，cd24抗体轻链含有与seq id nos：20或22具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列。在一些实施方式中，本技术的重组融合蛋白可以包含cd47结合肽-接头-cd24抗体重链、和cd24抗体轻链，其中cd47结合肽-接头-cd24抗体重链含有seq id no：18所示的氨基酸序列，cd24抗体轻链含有seq id nos：20或22所示的氨基酸序列。seq id nos：18、20和22的氨基酸序列可以分别由seq id nos：19、21和23所示的核酸序列编码。
31.本技术的重组融合蛋白可以包含cd24抗体重链、和cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链，其中cd24抗体重链含有与seq id no：24具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列，cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链含有与seq id no：26具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列。在一些实施方式中，本技术的重组融合蛋白可以包含cd24抗体重链、和cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链，其中cd24抗体重链含有seq id no：24所示的氨基酸序列，cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链含有seq id no：26所示的氨基酸序列。本技术的重组融合蛋白可以包含cd24抗体重链、和cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链，其中cd24抗体重链含有与seq id no：28具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列，cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链含有与seq id no：30具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列。在一些实施方式中，本技术的重组融合蛋白可以包含cd24抗体重链、和cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链，其中cd24抗体重链含有seq id no：28所示的氨基酸序列，cd47结合肽-接头-cd24抗体轻链含有seq id no：30所示的氨基酸序列。seq id nos：24、26、28和30所示的氨基酸序列可以分别由seq id nos：25、27、29和31所示的核酸序列编码。
32.本技术还提供编码本技术重组融合蛋白的核酸分子，以及包含该核酸分子的表达载体、和包含该表达载体的宿主细胞。还提供一种使用本技术的宿主细胞来制备重组融合蛋白的方法，包括(i)在宿主细胞中表达重组融合蛋白，以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离重组融合蛋白。
33.本技术还提供一种药物组合物，其可以包含本技术的重组融合蛋白、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含至少一种药学上可接受的佐剂。
34.本技术的重组融合蛋白或药物组合物可以用于治疗与cd47和/或cd24过表达相关的疾病，或用于制备治疗与cd47和/或cd24过表达相关的疾病的药物。
35.一方面，本技术提供一种用于在有需求受试者中治疗或减轻与cd47和/或cd24过表达相关的疾病的方法，包括向该受试者施用治疗有效量的本技术药物组合物。
36.与cd47和/或cd24过表达相关的疾病可以是急性髓细胞样白血病(aml)、慢性髓细胞样白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃腺癌、或胶质母细胞瘤。
37.基于以下的详细描述和实施例，当前公开的其他特征和有利之处将是非常明晰可见的，详细描述和实施例不应当解读为是限制性的。所有在说明书中引用的文献、genbank登记号、专利和公开专利申请均通过引用的方式并入本文。
附图说明
38.详细描述在以下以示例方式给出但不意在将本技术限制于所述具体实施方式，可以结合附图更好地进行理解。
39.图1是本技术重组融合蛋白imm4701c、imm4701、imm4702c、和imm4702h的结构示意图。圆形结构表示突变的sirpα第一胞外结构域(sirpαd1)，其具有seq id no：1所示的氨基酸序列。在imm4701c中，突变的sirpα第一胞外结构域(sirpαd1)通过连接肽与cd24抗体imm47c重链的n端相连，其中imm47c为igg抗体，具有鼠源重链可变区、和鼠源轻链可变区。接头具有seq id no：15所示的氨基酸序列。imm47c包含seq id no：2的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：4的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。在imm4701中，突变的sirpαd1通过连接肽和cd24抗体imm47重链的n端相连，其中imm47为igg抗体，具有鼠源重链可变区、和人源化轻链可变区。imm47包含seq id no：2的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：3的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。在imm4702c中，突变的sirpαd1通过连接肽与cd24抗体imm47c轻链的n端相连。在imm4702h中，突变的sirpαd1通过连接肽与cd24抗体imm47h轻链的n端相连，其中，imm47h为igg抗体，具有人源化的重链可变区、和人源化的轻链可变区。imm47h包含seq id no：5的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：6的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
40.图2a和2b示出imm4701c(a和b)、imm4701(b)、imm4702c(a)、和imm4702h(a)对jurkat人t淋巴细胞白血病细胞上表达的cd47的结合活性。imm01用作阳性对照，其记载于us 2021/0024598 a1，包含两个突变sirpαd1(seq id no：1)，与fc二聚体片段连接，其单体含有分别如seq id no：33和seq id no：32所示的核酸序列和氨基酸序列。cd24抗体imm47用作阴性对照。
41.图3a和3b分别示出mm4701c、imm4702c、和imm4702h与cd47

cd24

mcf-7人乳腺癌细胞的结合活性(a)，以及imm4701c和imm4701与cd47

cd24

mcf-7人乳腺癌细胞的结合活性。higg-fc用作阴性对照。imm01和imm47h用作阳性对照。
42.图4示出imm4701c、imm4702c和imm4702h与cd47

cd24

reh人类急性淋巴瘤细胞的结合活性。higg-fc用作阴性对照。imm01和imm47h用作阳性对照。
43.图5示出imm4701、imm4701c、imm4702c和imm4702h阻断sirpα-fc与人乳腺癌细胞mcf-7上表达的cd47结合的能力。imm01用作阳性对照。higg1-fc用作阴性对照。
44.图6示出imm4701c和imm4701对cd24

cd47

mcf-7人类乳腺癌细胞引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应(adcc)的能力。higg1-fc用作阴性对照。能引发adccimm47c用作阳性对照。
45.图7示出imm4701c、imm4702c、和imm4702h对cd24

cd47

reh人类急性淋巴细胞白血病细胞引发adcc的能力。具有很低adcc活性的higg1-fc与imm01用作阴性对照。具有adcc活性的imm47c用作阳性对照。
46.图8示出imm4701c和imm4701对基因改造成表达人类cd24的mc38-hcd24鼠类结肠癌细胞引发adcc的能力。higg1-fc用作阴性对照，imm47c用作阳性对照。
47.图9示出imm4701c在携带cd24

cd47

mcf-7人类乳腺癌肿瘤的异种移植的cb17-scid小鼠中的体内抗肿瘤效果。dpbs作为阴性对照，imm47c和imm01用作阳性对照。
具体实施方式
48.从原理上讲，主要有三种不同的途径来靶向两种或更多种肿瘤生长的药理机制。最常见的，可以给予患者两种或更多种不同药物的组合。尽管这种选择使得对于可能的药物组合和不同剂量有着最大化的灵活度，其面临的问题是：a)由于药物变多且各个药物有不同的剂量安排，患者依从性变差；b)由于药物-药物相互作用，存在可能的不相容性；以及c)药物副作用风险增加。这些问题会降低治疗的有效性并妨碍治疗目标的达成，尤其在慢性疾病例如癌症的管理中。
49.第二个途径是在单剂型中使用多种药物的固定剂量组合。该途径减少药物数量负担，患者依从性改善。固定剂量组合的不利之处主要在于，对于活性成分之间可能的剂量比的选择是有限的，这使得更加难以恰当地针对个体患者将剂量调至最大功效和最小不利作用。此外，组合中不同药物的代谢动力学特性可能在各目标患者中引起复杂的药效时间错位，从而使总的功效折中。
50.第三个途径是使用在单个化合物中结合两种或更多种药理机制的多功能药物。这些多功能分子的设计和鉴定更加复杂，并需要大量的研究来确认分子中靶向活性的最佳比，而联合的药物代谢动力学可能会在分子靶标级别产生匹配的药物代谢动力学活性。多功能分子也可以改造成与其他药物的固定剂量组合，从而在单一的药片中结合三种、甚至四种药理机制，以产生功效的进一步增长。
51.经过大量的实验，当前的发明人发明出了一种新的重组多功能融合蛋白，其能够通过三种作用机制来攻击肿瘤，一个是解除cd24-siglec-10介导的免疫抑制，一个是解除sirp介导的抑制信号对巨噬细胞的检查，另一个是激活nk细胞和/或巨噬细胞等对癌细胞的杀灭。
52.本技术的重组融合蛋白包含cd24抗体或其抗体片段，该cd24抗体或其抗体片段的至少一个互补位在构成该互补位的重链或轻链的n端经接头与信号调节蛋白(sirp)的胞外ig样结构域连接。该重组蛋白可以同时与cd47、cd24以及fcr结合，i)阻断癌细胞上cd24与免疫细胞上siglec-10之间的相互作用，从而解除cd24-siglec-10介导的免疫抑制；ii)阻断癌细胞上cd47与巨噬细胞上sirp的相互作用，解除sirp介导的抑制信号对巨噬细胞的检
查；以及iii)抗体fc区与nk细胞或巨噬细胞上fcr结合，激活nk细胞或巨噬细胞对癌细胞的灭杀。在一个实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的一个互补位在构成该互补位的重链或轻链的n端经接头与信号调节蛋白(sirp)的胞外ig样结构域连接。在另一实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的各互补位在构成该互补位的重链或轻链的n端经接头与信号调节蛋白(sirp)的胞外ig样结构域连接。在一个实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的各互补位在构成该互补位的重链的n端经接头与信号调节蛋白(sirp)的胞外ig样结构域连接。在一个实施方式中，cd24抗体或其抗体片段的各互补位在构成该互补位的轻链的n端经接头与信号调节蛋白(sirp)的胞外ig样结构域连接。本技术的重组融合蛋白尺寸较小(150-180kda)，具有5-10天的较长半衰期。
53.包含在本技术融合蛋白中的三个主要组成部分为信号调节蛋白(sirp)的胞外ig样结构域、接头、和cd24抗体或其抗体片段。本领域技术人员将意识到，对于上述三个组成部分，存在很多种设计选择。优选地，在人癌症治疗中使用人源序列，因为非人动物蛋白或肽的强烈免疫原性可能会引起过敏反应和其他不良反应。然而，基于不同的应用目的，也可以在本技术中使用其他动物蛋白或肽，可以进行人源化。
54.能够与cd47结合的任何sirp(sirpα、sirpβ和sirpγ)的任何胞外ig样结构域均可以选择用于融合蛋白的构建。在一个实施方式中，重组融合蛋白中的信号调节蛋白是sirpα，且信号调节蛋白的胞外ig样结构域为sirpα的第一胞外ig样结构域(sirpαd1)。在一个实施方式中，sirpαd1为突变sirpαd1，相比于野生型sirpαd1，在seq id no：1的第80位处存在n80a突变，该位点的突变可实现去糖基化的效果。
55.在一个实施方式中，重组融合蛋白包含氨基酸序列如seq id no：1所示的sirpαd1。在另一实施方式中，sirpαd1可以包含与seq id no：1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列，其中sirpαd1能够与癌/肿瘤细胞表面的cd47结合并阻断cd47与巨噬细胞表面sirp的相互作用。
56.接头主要起到sirp的胞外ig样结构域与cd24抗体重链或轻链n端之间的间隔的作用。接头可以由肽键连接的氨基酸构成，优选肽键连接的5-30个、10-30个、10-20个、或15个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一个或多个可以糖基化或去糖基化，如本领域技术人员所了解的。在一个实施方式中，5-30个10-30个、10-20个、或15个氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和赖氨酸。在一个实施方式中，接头由大部分有空键位阻的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头为多聚甘氨酸(特别是gly、多聚(gly-ala))、以及多聚丙氨酸。以下实施例中示出的示例性合适接头为(gly-ser)，例如-(gly-gly-gly-gly-ser)
3-(seq id no：15)。
57.接头也可以是非肽类接头。例如，可以使用烷基接头，例如-nh-、-(ch2)s-c(o)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以经任何非空间位阻基团例如低级烷基(例如c
1-4
低级酰基)、卤素(例如cl、br)、cn、nh2、苯基等进行取代。
58.在一些实施方式中，cd24抗体是分离的igg单克隆抗体，包含两条重链和两条轻链，各重链可包含重链可变区和重链恒定区，各轻链可包含轻链可变区和(任选地，即，可以有，也可以没有)轻链恒定区。其中cd24抗体的重链可变区和轻链可变区可以分别包含i)seq id nos：2和3；ii)seq id nos：2和4；或iii)seq id nos：5和6所示的氨基酸序列。重链恒定区可以包含seq id no：13的氨基酸序列。轻链恒定区可以包含seq id no：14的氨基酸
序列。cd24抗体的fab部分(或互补位)可以与癌/肿瘤细胞表面的cd24结合，以阻断cd24与免疫细胞如t细胞表面siglec-10的相互作用，从而解除cd24-siglec-10介导的免疫抑制，而cd24抗体的fc部分可以与nk细胞和/或巨噬细胞表面的fcr结合，以刺激nk细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。在一些实施方式中，重链可变区可包含与seq id nos：2、或5具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列，重链恒定区可包含与seq id no：13具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列，其中该cd24抗体能够与癌/肿瘤细胞表面的cd24结合，阻断cd24与免疫细胞如t细胞表面siglec-10的相互作用，并且能够与nk细胞或巨噬细胞表面的fcr结合，以激活nk细胞和/或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。在一些实施方式中，轻链可变区可以具有与seq id nos：3、4或6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列一致度的氨基酸序列，其中该cd24抗体能够与与癌/肿瘤细胞表面的cd24结合，以阻断cd24与免疫细胞如t细胞表面siglec-10的相互作用。
59.本文中的术语“抗体”包括例如igg、iga、igd、ige和igm的全抗体、及其任意的抗原结合片段(或抗原结合部分)或单链。全抗体是包含至少两条重链和两条轻链的糖蛋白，重链和轻链间经二硫键连接。每一重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，c
h1
、c
h2
和c
h3
。每一轻链包含轻链可变区(v
l
)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域c
l
。vh和v
l
区域还可以再分成高度变化区，即cdr区，cdr区之间分布有较为保守的框架区(fr)。每一vh和v
l
由三个cdr和四个fr区构成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排列。重链和轻链的可变区包含与抗原反应的结合域。抗体的恒定区可以接到免疫蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如效应细胞)和补体系统第一成分(c1q)。
60.本文的术语“抗体片段”是指本技术抗体中保持有特异结合抗原(例如cd24)、以及任选地结合fcr的能力的部分或片段。
61.本技术抗体或其抗体片段的重链可变区cdr和轻链可变区cdr通过imgt编号系统确定。领域内熟知，重链可变区和轻链可变区cdr可以通过例如chothia、kabat、abm或contact编号系统/方法确定。
62.术语“鼠源”是指抗体的可变区骨架和cdr区得自小鼠种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本技术的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，鼠源抗体不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的cdr序列的抗体。
63.术语“人源化”是指来源于非人物种的抗体，其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度。
64.术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体如cd24抗体、或sirpα结合的靶细胞例如癌细胞裂解。
65.术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
66.本文中提到的“序列一致度”是指在进行序列比对后，一条序列中与参照序列中核
苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸百分比，如果需要的话，在序列对比中引入空格来达到两条序列间最大的序列一致性百分比。本领域技术人员可以通过多种方法，例如使用计算机软件，来进行两两序列对比或多序列比对，以确定两条或多条核酸或氨基酸序列之间的序列一致性百分比，此类计算机软件为例如clustalomega、t-coffee、kalign和mafft等。
67.同时，本技术提供编码重组融合蛋白的多核苷酸和表达重组融合蛋白的表达载体。载体的例子包括但不限于质粒、病毒载体、酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、可转化人工染色体(tac)、哺乳动物人工染色体(mac)和人工附加染色体(haec)。
68.本技术提供包含上述表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以用表达载体进行转化或转染。合适的宿主细胞包括大肠杆菌(r.coli)、酵母和其他真核生物。优选地，使用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系(例如cos或cho)。
69.另一方面，本技术提供一种药物组合物，其包含本技术的与药学上可接受佐剂配制在一起的融合蛋白。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学活性成分，例如另一种抗体或药物。本技术的药物组合物也可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌药物、抗病毒剂或疫苗一起在联合疗法中进行施用。
70.药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬助剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。合适赋形剂的选择和使用在gennaro，ed.，remington：the science and practice of pharmacy，20th ed.(lippincott williams&wilkins2003)中有过教导，其公开内容通过引用的方式并入本文。
71.药物组合物中的主要媒介物或载体可以本质上是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水或人工脑脊液，可以补充有注射中常见的其他材料。例如，媒介物或载体可以是中性缓冲盐溶液或混有血清白蛋白的盐溶液。其他示例性的药物组合物包含tris缓冲液、或醋酸盐缓冲液，其还可以包含山梨醇或其合适的替代物。在本技术的一个实施方式中，组合物可以通过混合具有所需纯度的所选组分与任意的配制剂(remington’s pharmaceutical sciences，如上)以冻干或水溶液形式制备而用于储存。此外，治疗组合物可以使用合适的赋形剂例如蔗糖配制为冻干剂。
72.优选地，药物组合物适用于静脉、肌内、皮下、非肠道、脊柱、或表皮给药(例如，通过注射或推注)。取决于给药途径的不同，活性分子可以包裹在材料中以保护其免受酸和可能使其失活的其他自然条件的作用。本文所用的术语“非肠道给药”是指除通常通过注射进行的肠道和局部给药外的给药模式，包括而不限于，静脉、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜、和胸骨内注射和输注。或者，本技术的抗体可以通过非注射途径给药，例如局部的、表皮的或粘膜的给药模式，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部给药。
73.药物组合物可以是无菌水溶液或混悬液的形式。它们也可以配制成微乳剂、脂质体、或其他适用于高浓度药物的有序结构。
74.可以与载体材料结合来制备单剂型的活性成分的量，取决于待治疗的受试者和特定的给药途径而各异，且通常是产生疗效的组合物的量。通常而言，以百分比计，该量为约0.01％-约99％的活性成分，与药学上可接受的载体组合在一起。
75.给药方案可以调整以达成最优的所需反应(例如，治疗反应)。例如，随着时间的推进施用多个分剂量，或者根据治疗情况的危急程度而成比例地减少或增加剂量。特别有利的是，以剂量单位配制非肠道组合物，以方便给药且有利于剂量的均一性。本文所用的剂量单位型是指适用于待治疗受试者的单次给药的物理上分离的单元；各单元包含事先计算出的与药物载体一起产生所需的疗效的活性化合物的量。或者，融合蛋白可以以持续释放剂型进行给药，在这种情况下，给药的频率降低。
76.对于融合蛋白的给药，剂量范围为约0.0001-100mg/kg受体体重。示例性的治疗方案为每周两次。
[0077]“治疗有效量”的本技术融合蛋白优选地引起疾病症状严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的上升、或防止由疾病引起的损伤或失能。例如，对于荷肿瘤受试者的治疗，“治疗有效量”是指，相对于未治疗的受试者，优选地，肿瘤生长抑制至少约40％，更优选抑制至少约60％，更优选抑制至少约80％，更优选抑制至少约99％。治疗有效量的本技术融合蛋白可以在受试者(通常为人，或者可以为另一种哺乳动物)中减小肿瘤体积、或者减轻症状。
[0078]
药物组合物可以是受控的缓释制剂，包括植入体、透皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性多聚物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如sustained and controlled release drug delivery systems，j.r.robinson，ed.，marcel dekker，inc.，new york，1978。
[0079]
药物组合物可以通过以下医疗装置进行施用，例如(1)无针皮下注射装置(例如，美国专利5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、和4,596,556)；(2)微输注泵(美国专利4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利4,486,194)；(4)输注装置(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透装置(美国专利4,439,196和4,475,196)，以上公开内容通过引用的方式并入本文。
[0080]
在某些实施方式中，本技术的融合蛋白可以配制成保证合适的体内分布。例如，为保证本技术的治疗融合蛋白跨过血脑屏障，将融合蛋白配制在脂质体中，还可以额外地包含靶向基团以加强对特定细胞或器官的选择性传输。参见，例如，美国专利4,522,811、5,374,548、5,416,016、和5,399,331。
[0081]
本技术还涉及体内基因疗法，其中将编码本技术融合蛋白或其衍生物的核酸分子直接引入受试者中。例如，将编码本技术重组融合蛋白的核酸序列经由带有或不带有合适递送载体例如腺相关病毒载体的核酸构建体经局部注射而引入目标细胞。其他可供选择的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的体内物理转移可以通过所需核酸构建体或包含所需核酸序列的其他合适递送载体的局部注射、脂质体介导的转移、直接注射(裸露的dna)、或微粒轰击(基因枪)而实现。
[0082]
本公开的组合物可以单独使用，或者与其他用于增强其疗效或降低潜在副作用的治疗剂联合使用。
[0083]
本技术的另一目的是提供制备上述重组融合蛋白以及包含该重组融合蛋白的药物组合物的方法。在一个实施方式中，制备方法包括以下步骤：(1)提供编码融合蛋白的核酸分子；(2)构建包含(1)的核酸分子的表达载体；(3)用(2)中的表达载体转染或转化合适的宿主细胞并培养这些宿主细胞以表达蛋白；以及(4)纯化蛋白。制备可以由普通技术人员
以熟知的技术进行。
[0084]
本技术的另一目标是提供使用本技术药物组合物来治疗癌症的方法，包括向有该需求的患者或受试者施用有效量的上述药物组合物。在一个实施方式中，药物组合物用于治疗过表达cd47和/或cd24的肿瘤或癌症，包括但不限于急性髓细胞样白血病(aml)、慢性髓细胞样白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃腺癌、和胶质母细胞瘤。
[0085]
在一个实施方式中，与过表达cd47和/或cd24相关的疾病包括但不限于克罗恩病、过敏性哮喘和类风湿性关节炎。
[0086]
本技术将参照以下非限制性实施例进行进一步说明。
[0087]
实施例
[0088]
在本技术中提及的示例性融合蛋白、抗体等如下所述。部分融合蛋白的结构示于图1。
[0089]
imm4701c包含igg抗体imm47c，sirpαd1(seq id no：1)经接头(seq id no：15)与imm47c各重链的n端连接。其中imm47c包含seq id no：2的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：4的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
[0090]
imm4701包含igg抗体imm47，sirpαd1(seq id no：1)经接头(seq id no：15)与imm47各重链的n端连接。其中imm47包含seq id no：2的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：3的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
[0091]
imm4702c包含igg抗体imm47c，sirpαd1(seq id no：1)经接头(seq id no：15)与imm47c各轻链的n端连接。其中imm47c包含seq id no：2的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：4的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
[0092]
imm4702h包含igg抗体imm47h，sirpαd1(seq id no：1)经接头(seq id no：15)与imm47h各轻链的n端连接。其中imm47h包含seq id no：5的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：6的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
[0093]
imm47c为igg抗体，包含seq id no：2的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：4的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
[0094]
imm47为igg抗体，包含seq id no：2的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：3的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
[0095]
imm47h为igg抗体，包含seq id no：5的重链可变区、seq id no：13的重链恒定区、seq id no：6的轻链可变区、以及seq id no：14的轻链恒定区。
[0096]
imm01记载于us 2021/0024598a1，包含两个突变sirpαd1(seq id no：1)，与fc二聚体片段连接，其单体含有分别如seq id no：33和seq id no：32所示的核酸序列和氨基酸序列。
[0097]
实施例1.imm4701、imm4701c、imm4702c、imm4702h表达载体的构建及蛋白表达
[0098]
imm4701、imm4701c、imm4702c、imm4702h、imm47、imm47c和imm47h的结构如图1所示。人工设计出这些重组融合蛋白的全长编码序列。
[0099]
具体地，对于imm4701c的长链，将编码小鼠igg1重链信号肽的57个核苷酸(seq id no：34)加至sirpαd1-接头-cd24抗体重链编码序列(seq id no：19)的5’端，并将kozak序列
(seq id no：35)加至信号肽序列的5’端。最后，将hindiii和nhei限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。对于imm4701c的短链，将相同的信号肽序列以及kozak序列加至轻链编码序列(seq id no：21)的5’端，并将hindiii和xbai限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。所得的序列经金斯瑞生物科技股份有限公司合成，并分别克隆到pmac-h和pmac-l载体中。
[0100]
对于imm4701的长链，将编码小鼠igg1重链信号肽的57个核苷酸(seq id no：34)加至sirpαd1-接头-cd24抗体重链编码序列(seq id no：19)的5’端，并将kozak序列(seq id no：35)加至信号肽序列的5’端。最后，将hindiii和nhei限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。对于imm4701c的短链，将相同的信号肽序列以及kozak序列加至cd24抗体轻链编码序列(seq id no：23)的5’端，并将hindiii和xbai限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。所得的序列经金斯瑞生物科技股份有限公司合成，并分别克隆到pmac-h和pmac-l载体中。
[0101]
对于imm4702c的长链，将编码小鼠igg1重链信号肽的57个核苷酸(seqid no：34)加至cd24抗体重链编码序列(seq id no：25)的5’端，并将kozak序列(seq id no：35)加至信号肽序列的5’端。最后，将hindiii和nhei限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。对于imm4701c的短链，将相同的信号肽序列以及kozak序列加至sirpαd1-接头-cd24抗体轻链编码序列(seq id no：27)的5’端，并将hindiii和xbai限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。所得的序列经金斯瑞生物科技股份有限公司合成，并分别克隆到pmac-h和pmac-l载体中。
[0102]
对于imm4702h的长链，将编码小鼠igg1重链信号肽的57个核苷酸(seq id no：34)加至cd24抗体重链编码序列(seq id no：29)的5’端，并将kozak序列(seq id no：35)加至信号肽序列的5’端。最后，将hindiii和nhei限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。对于imm4701c的短链，将相同的信号肽序列以及kozak序列加至sirpαd1-接头-cd24抗体轻链编码序列(seq id no：31)的5’端，并将hindiii和xbai限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。所得的序列经金斯瑞生物科技股份有限公司合成，并分别克隆到pmac-h和pmac-l载体中。
[0103]
构建好的表达载体，利用cho-s细胞瞬转表达蛋白。大致过程如下：1)瞬转前一天将cho-s细胞按照1
×
106个/ml密度接种至含6mm谷氨酰胺的瞬转培养基(transfx-ctmcho瞬转培养基，hyclone)；2)重/轻(长/短)链表达载体质量比为1∶1，按照1μg/ml准备所需dna，加入至瞬转体积1/20的opti-mem培养基(gibco)；3)pei(mw40,000聚氮丙啶盐酸盐，polysciences)配置成1mg/ml，按照pei∶dna＝4∶1质量比例准备所需pei，加入至瞬转体积1/20的opti-mem培养基(gibco)；4)将pei稀释液缓慢加入至dna稀释液中，混匀，室温孵育20分钟；5)将pei/dna混合液加入至细胞液中，并将细胞置于37度5％co2，转速110rpm培养箱振荡培养；6)隔天添加转染增强剂(1mm丁酸钠，0.25％v/v dmso)，同时将培养温度降至33度；7)当细胞活率降至50％以下时，3000rpm，离心5分钟收集上清利用protein a填料进行亲和纯化。
[0104]
实施例2.imm4701、imm4701c、imm4702c和imm4702h与jurkat细胞上的cd47结合
[0105]
将自然表达cd47的jurkat细胞密度调整为1
×
106/ml，取100μl，分别在100μl梯度稀释(起始浓度为30μg/ml，3倍梯度稀释)的imm4701、imm4701c、imm4702c、imm4702h和对照
液imm01、imm47中4℃孵育1小时。细胞用冷的pbs清洗两遍，之后用100μl fitc标记的针对人igg-fc的二抗(cat#f9512，sigma)孵育45分钟。细胞清洗两遍，并重悬浮于200μlpbs。之后，细胞用流式细胞仪(merck millipore，easycyte 5ht)进行facs分析。
[0106]
图2a与2b显示，imm4701、imm4701c、imm4702c、imm4702h可以与jurkat细胞上的cd47结合，比传统的单抗原靶向蛋白imm01略差。
[0107]
实施例3.imm4701、imm4701c、imm4702c和imm4702h与cd24

cd47

mcf-7细胞结合
[0108]
将cd24

cd47

mcf-7细胞密度调整为1
×
106/ml，取100μl，分别在100μl起始浓度为30μg/ml、3倍梯度稀释的imm4701、imm4701c、imm4702c、imm4702h和对照液imm01、imm47h中4℃孵育1小时，higg-fc用作阴性对照。细胞用冷的pbs清洗两遍，之后用100μl fitc标记的针对人igg-fc的二抗(cat#f9512，sigma)孵育45分钟。细胞清洗两遍，并重悬浮于200μl pbs。之后，细胞用流式细胞仪(merck millipore，easycyte 5ht)进行facs分析。
[0109]
图3a与3b显示，imm4701、imm4701c、imm4702c和imm4702h结合cd24

cd47

mcf-7细胞的能力，与传统的单抗原靶向蛋白imm47h相当，比传统的单抗原靶向蛋白imm01稍强。
[0110]
实施例4.imm4701c、imm4702c和imm4702h与cd24

cd47

reh细胞结合
[0111]
将cd24

cd47

reh细胞密度调整为1
×
106/ml，取100μl，分别在100μl起始浓度为30μg/ml、3倍梯度稀释的imm4701c、imm4702c、imm4702h和对照液imm01、imm47h中4℃孵育1小时，higg-fc用作阴性对照。细胞用冷的pbs清洗两遍，之后用100μl fitc标记的针对人igg-fc的二抗(cat#f9512，sigma)孵育45分钟。细胞清洗两遍，并重悬浮于200μl pbs。之后，细胞用流式细胞仪(merck millipore，easycyte 5ht)进行facs分析。
[0112]
图4显示，imm4701c、imm4702c和imm4702h均与cd24

cd47

reh细胞结合，且结合力与传统的单抗原靶向蛋白imm47h相当，略优于传统的单抗原靶向蛋白imm01。
[0113]
实施例5.imm4701、imm4701c、imm4702c、imm4702h抑制cd47与sirpα的相互作用
[0114]
取50μl 3μg/ml sirpα-mfc(野生型人sirpα 鼠igg1 fc，seq id no：36)，分别与50μl起始浓度为30μg/ml、3倍梯度稀释的imm4701、imm4701c、imm4702c、imm4702h以及imm01混合，higg-fc用作阴性对照。将上述混合物添加到含50μl密度为1
×
106个/ml的同时表达cd24和cd47的mcf7细胞的96孔板中，板于4℃孵育45分钟。细胞用pbs洗，之后用100μl pe标记的针对鼠igg-fc的二抗(cat#405307，biolegend)孵育45分钟。细胞清洗两遍，并重悬浮于200μl pbs，并经facs分析sirpα-fc-cd47的相互作用。
[0115]
对于cd24

cd47

细胞，如图5所示，cd24和cd47双特异性分子，即imm4701、imm4701c、imm4702c和imm4702h，显示出比单特异的imm01更高的cd47-sirpα抑制活性。
[0116]
实施例6.imm4701和imm4701c针对cd24

cd47

mcf-7细胞引发高水平抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)
[0117]
用1mm cfse(cat#21888-25mg，sigma))500倍稀释标记mcf-7细胞。
[0118]
取50μl密度为6
×
105/ml的mcf-7细胞(用作靶向细胞)，与100μl密度为6
×
105/ml且稳定表达fcγriiia(158v)的nk92mi细胞(效应细胞)按照效靶比2∶1混合，且混合的细胞在5％co2下分别与50μl起始浓度为1000ng/ml、3倍梯度稀释的imm47c、imm4701以及imm4701c于37℃培养4小时，higg-fc用作阴性对照。之后向细胞培养液中加入碘化丙啶(pi)(cat#p4170，sigma)，浓度5μg/ml，细胞经facs分析pi信号。由adcc造成的细胞裂解百分比基于以下公式进行计算：
[0119]
％裂解＝(％imm47c、imm4701或imm4701c处理的pi阳性靶细胞-％阴性对照蛋白处理的pi阳性靶细胞)/(100-％阴性对照蛋白处理的pi阳性靶细胞)
×
100
[0120]
如图6所示，对于cd24

cd47

mcf-7人类乳腺癌细胞，相比于cd24单特异性抗体imm47c，imm4701和imm4701c引发更高水平的adcc。
[0121]
实施例7.imm4701c、imm4702c和imm4702h针对cd24

cd47

reh细胞引发高水平抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)
[0122]
用1mm cfse(cat#21888-25mg，sigma)500倍稀释标记reh细胞。
[0123]
取50μl密度为6
×
105/ml的reh细胞(用作靶向细胞)，与100μl密度为6
×
105/ml且稳定表达fcγriiia(158v)的nk92mi细胞(效应细胞)按照效靶比2∶1混合，且混合的细胞在5％co2下分别与50μl起始浓度为1000ng/ml、3倍梯度稀释的imm47c、imm4701c、imm4702c以及imm4702h于37℃培养4小时，higg-fc用作阴性对照。之后向细胞培养液中加入碘化丙啶(pi)(cat#p4170，sigma)，浓度5μg/ml，细胞经facs分析pi信号。由adcc造成的细胞裂解百分比基于以下公式进行计算：
[0124]
％裂解＝(％imm47c、imm4701c、imm4702c或imm4702h处理的pi阳性靶细胞-％阴性对照蛋白处理的pi阳性靶细胞)/(100-％阴性对照蛋白处理的pi阳性靶细胞)
×
100
[0125]
如图7所示，对于cd24

cd47

reh人类急性淋巴细胞白血病细胞，相比于cd24单特异性抗体imm47c，imm4701c引发更高水平的adcc。
[0126]
实施例8.imm4701c和imm4701针对cd24

mc38-hcd24细胞引发高水平抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)
[0127]
用1mm cfse(cat#21888-25mg，sigma)500倍稀释标记mc38-hcd24细胞。
[0128]
取50μl密度为6
×
105/ml的mc38-hcd24细胞(用作靶向细胞)，与100μl密度为6
×
105/ml且稳定表达fcγriiia的nk92mi细胞(效应细胞)按照效靶比2∶1混合，且混合的细胞在5％co2下分别与50μl起始浓度为1000ng/ml、3倍梯度稀释的imm4701c和imm4701于37℃培养4小时，higg-fc用作阴性对照。之后向细胞培养液中加入碘化丙啶(pi)(cat#p4170，sigma)，浓度5μg/ml，细胞经facs分析pi信号。由adcc造成的细胞裂解百分比基于以下公式进行计算：
[0129]
％裂解＝(％imm4701c或imm4701处理的pi阳性靶细胞-％阴性对照蛋白处理的pi阳性靶细胞)/(100-％阴性对照蛋白处理的pi阳性靶细胞)
×
100
[0130]
如图8所示，对于表达人cd24的mc38-hcd24小鼠结肠癌细胞(mc38细胞不表达人类cd47)，相比于cd24单特异性抗体imm47，imm4701c和imm4701均引发更高水平的adcc。
[0131]
实施例9.imm4701c显示出强劲的体内抗肿瘤活性
[0132]
40只6-8周龄的scid小鼠在癌细胞接种前3天，将β-雌二醇缓释药片(0.36mg)接种于每只小鼠的左后背。右前肢腋窝皮下注射mcf-7乳腺癌癌细胞，每只小鼠1x107个细胞。当肿瘤体积达到100-150mm3时，小鼠随机分成5组，每组8只小鼠，分组当天定义为d0。从这一天开始，各组小鼠分别腹膜注射pbs、imm47c(2.5mg/kg)、imm01(2.5mg/kg)、imm4701c(3mg/kg)、和imm01(2.5mg/kg) imm47c(2.5mg/kg)，持续4周，每周2次。在4周后结束给药，持续观察1周后结束实验。每3-4天测量一次肿瘤体积和小鼠体重。当pbs组肿瘤平均体积达到3000mm3时，所有试验终止。
[0133]
肿瘤体积(v)计算为(长
×
宽2)/2。tgi(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体
积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]
×
100％。
[0134]
测试的方案和结果总结在如下表1中。
[0135]
表1.imm4701c和其他治疗剂的抗肿瘤效果
[0136][0137]
开始给药后第28天，溶剂对照组荷瘤鼠的瘤体积达到646.87mm3。与溶剂对照组相比，imm47c处理组和imm01处理组均延缓了肿瘤生长，但无明显抑瘤作用，这两组在第28天时的肿瘤体积分别为463.26mm3(t/c＝71.60％，tgi＝37.30％，p＝0.009)和562.24mm3(t/c＝86.92％，tgi＝17.19％，p＝0.375)；imm4701c处理组和imm47c imm01联合组均具有显著的抑瘤作用，这两组在第28天时的肿瘤体积分别为44.61mm3(t/c＝6.89％，tgi＝122.32％，p＝0.001)和192.63mm3(t/c＝29.81％，tgi＝92.22％，p＝0.001)。
[0138]
从表1和图9可以进一步看出，imm4701c的体内抑制肿瘤方面，能够更快地发挥作用，且总体的抑瘤效果比imm47c和imm01联合用药更好。
[0139]
本技术的序列信息总结如下。
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
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[0165]
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