一种合并型甲基丙二酸血症基因突变检测试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种合并型甲基丙二酸血症基因突变检测试剂盒。


背景技术：

2.甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，mma）是一种常见的有机酸血症，属常染色体隐性遗传病。该病临床表现以反复呕吐、喂养困难、嗜睡、智力体力发育落后或倒退、惊厥、呼吸困难和肌张力异常、毛发黄为主要表现。血串联质谱中酰基肉碱和气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸是甲基丙二酸血症的主要诊断依据。根据同型半胱氨酸水平，分为单纯型甲基丙二酸血症和甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症两种类型。该病临床表现个体差异大，可表现为多系统受累，自胎儿时期至成年时期均可发病，容易漏诊、误诊，基因检测是临床分型的可靠依据。中国mma患儿中以mma合并同型半胱氨酸血症最常见，单纯mma较少见。目前，尚无专门针对mma基因突变检测方案，mma患者基因突变检测仅有二代测序，该方法通量大、覆盖度高，但是价格昂贵，技术要求高临床推广具有一定困难。另有研究者，采用高分辨率溶解曲线法对种14mmachc基因突变位点进行检测，但是该方法依赖于专用溶解曲线分析软件不利于临床推广，同时该方法检测位点依然有限，不能充分满足临床实际检测需求，对众多新发突变和散发突变无法检测。
3.研究发现，合并型mma包括cb1c、cb1d及cb1f三种亚型，其中以cb1c型为主。其编码基因是mmachc，位于染色体1p34. 1区，约有90%的患者是由mmachc突变导致，其中c.609g》a、c.658_660delaag、c.80a》g、c.567dupt、c.482g》a和c.394c》t 6个突变位点共覆盖大于79%的突变，该基因突变还有众多散发突变。但是目前没有专门用于该基因热点突变区域（指各种主要、新发或散发突变主要发生的基因区段）基因突变快速简便检测试剂盒。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种合并型甲基丙二酸血症基因突变检测试剂盒。
5.本发明所采用的技术方案为：一种合并型甲基丙二酸血症基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括mmachc基因检测液、扩增反应体系、测序检测液、阳性对照品、阴性对照品和无核酶水；所述mmachc基因检测液包括mmachc基因的引物对，引物对包括第一引物、第二引物和第三引物，第一引物包括第一上游引物和第一下游引物，第二引物包括第二上游引物和第二下游引物，第三引物包括第三上游引物和第三下游引物，上述第一上游引物至第三下游引物的核苷酸序列依次如 seq id no.1-seq id no.6 所示。
6.上述该试剂盒的检测液仅设计了三组引物对，是由于发明人通过对引物对的设计，针对三个热点突变区域进行设计，三组引物对即可完成上述检测，并且还能够快速、准确且灵敏地检测出该基因三个热点突变区域突变位点，实验结果重复性好，精密度高。
7.作为优选地，所述mmachc基因检测液的引物对的浓度为50-420 nm。
8.作为优选地，所述mmachc基因检测液的引物对的浓度为400 nm。
9.作为优选地，所述扩增反应体系包括taq dna聚合酶、dntps、dsdna 染料、pcr 扩增缓冲液、mg 2
、ung 酶和 dutp。
10.作为优选地，所述测序检测液包括测序染料、测序反应液和去离子甲酰胺。
11.作为优选地，所述测序染料包括脱氧核苷三磷酸、双脱氧核苷三磷酸和dna聚合酶。
12.作为优选地，所述测序反应液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
13.作为优选地，所述阳性对照品为含有mmachc基因6个位点突变的质粒。
14.6个位点突变具体为c.609g》a、c.658_660delaag、c.80a》g、c.567dupt、c.482g》a和c.394c》t 6个突变位点。
15.作为优选地，所述阴性对照品为未突变的mmachc基因质粒。
16.本发明的有益效果为：本发明旨在建立一种能够在临床快速便捷开展合并型mma基因突变检测方法及试剂盒，有助于提高我国合并型mma的基因检测水平。
17.（一）本发明有效满足了临床合并型mma的基因检测需求，提供了mmachc基因热点突变区域检测的引物、试剂盒及检测方法，能够快速、准确且灵敏地检测出热点突变区域各种类型突变情况。实验结果重复性好，精密度高。另外，本发明检测时间周期短，最快能在8小时内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率，是一种高效的辅助检测手段。
18.（二）造成甲基丙二酸血症的原因多种多样，且合并型mma临床表现不特异，以神经系统脑损伤最为显著，远期预后差。本发明可以从基因突变层面上辅助找出造成甲基丙二酸血症的根本原因，进行针对性治疗和复健。
19.（三）由于合并型mma属于常染色体隐性遗传病，表型正常的人群也有一定的携带概率。如果夫妻双方都是该基因突变的携带者，子女患病的概率较大，所以针对此突变的检测对于优生优育有着重大意义。
20.（四）本发明采用多重pcr-sanger测序法进行检测，该方法具有灵敏度高、耗时短、通量高、一次检测多个突变位点等优点。本发明旨在建立一种利用多重pcr-sanger测序技术简便、快速、准确检测人mmachc基因热点突变区域基因突变的引物及试剂盒，为临床诊断提供参考依据。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
22.实施例：本发明建立了一种利用多重pcr-sanger测序技术简便、快速、准确、高通量检测人mmachc基因热点突变区域的引物及试剂盒，从而为mmachc基因突变的检测提供参考依据，试剂盒保存于-20 ℃。试剂盒规格：50人份/盒，具体组分见表1。
23.试剂盒性能验证1、样本处理选用企业参考品进行试剂盒性能验证。所有样本按照美基生物核酸提取试剂盒（产品编号：ivd4173）进行核酸，所得dna样本保存于2-8℃；若样本长时间不使用可保存于-20℃。
24.2、pcr扩增按下表配置pcr扩增反应液（每个反应45μl）。
25.将配置好的pcr扩增反应液按45μl每个反应空进行分装。将已提取好的样品dna、阳性对照品dna、阴性对照品dna各5μl加入相应反应孔，上机进行pcr扩增。
26.3扩增程序：95℃ 5 min（1个循环）；95℃ 30sec ，60℃ 90 sec，72℃ 30sec（35个循环）；72℃ 10min（1个循环）；4℃ ∞（1个循环）。
27.4产物纯化：pcr扩增结束以后，取 5
µ
l pcr产物进行 1-2%琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增（目的条带大小为500bp），如观察到目的条带，则将上述 pcr 产物及时进行纯化，具体操作详见pcr产物纯化试剂盒说明书。按试剂盒步骤纯化获得的pcr产物进行电泳鉴定
定值（pcr产物浓度范围为10-50ng），可立即进行测序pcr或置于-20
±
2℃保存备用（保存时间不要超过2天）。
28.5测序pcr：经过电泳鉴定定值的pcr产物，按下表配制测序pcr体系：。
29.将各反应管放入定性pcr仪，按下列条件扩增：96℃ 1分钟
→
（96℃ 10秒
→ꢀ
50℃ 5秒
→
60℃ 4分钟）
×
25个循环
→
4℃保温。
30.6测序准备：6.1取测序pcr反应结束后的pcr反应管，各pcr反应管加入2
µ
l 125 mmol/l edta和2
µ
l 3 mol/l醋酸钠（ph 5.2）到管底。
31.6.2再加入50
µ
l 100%无水乙醇，盖紧管盖，短时振荡后，室温避光放置15分钟。
32.6.3 4℃下12000rpm离心30分钟，立即小心去上清（若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟）。
33.6.4 每管加入150
µ
l 预冷70%乙醇，4℃下12000rpm离心10分钟，立即小心去上清（尽量将管底的70%乙醇吸干净，若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟），此步骤可重复操作一次。
34.6.5 室温避光放置15-30分钟（观察管底液体，使70%乙醇挥发干净），此步骤产物可密封避光置于-20
±
2℃保存5天。
35.6.6 加入10
µ
l hi-di formamide，短时振荡溶解dna，进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底。
36.6.7 溶解后的样品在定性pcr仪上 95℃变性5分钟，迅速置冰中冷却4分钟后，准备上样电泳。
37.7基因分析仪测序：7.1加样：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，盖好，按加样顺序编辑样品列表。根据测序仪型号选用具有ivd 标志的 seq_std_bdtv3.1_assyxl_pop7 或seq_std_bdtv3.1_assy_pop7 进行测序。
38.7.2使用 abi 基因分析仪时，应用 abi公司data collectio与sequencing analysis 软件进行数据收集和分析。data collection与sequencing analysis分析软件的进一步信息请参阅data collection与 analysis software用户手册。测序结果自动保存在预设位置，反应结束后打开测序结果进行分析，得到.ab1、.phd.1 格式的文件。
39.8结果分析：8.1运行seqscanner程序，导入测序结果。
40.8.2测序结果.应用软件对比野生型序列逐个碱基比较，查找突变点，记录突变的
碱基类型即可。
41.9试剂盒性能：9.1 阳性符合率100%：对企业参考品的阳性（表2）样本进行检测，结果均为阳性，阳性符合率为 100%。
42.表2.mmachc突变位点企业阳性参考品。
43.9.2阴性符合率100%：对企业参考品中的阴性（表3）样本进行检测，检测结果为阴性，符合率100%。
44.表3.mmachc突变位点企业阴性参考品。
45.9.3重复性：检测20ng/
µ
l的p1，重复检测10次，cv≤5%。
46.9.4最低检出限：本试剂盒最低检测限为5ng/
µ
l。
47.本试剂盒对稀释至不低于5ng/
µ
l的p1，检测结果均为阳性。
48.实验例：对60份临床样本检测。
49.1.1样本处理采集20名合并型mma及40名健康人受检者离体血液标本。
50.样本采集要点：采用紫色头盖管（含有乙二胺四乙酸以及其盐的采血管）采集静脉血，采集后4℃保存备用。
51.每份样本取200
ꢀµ
l，按照美基生物核酸提取试剂盒（产品编号：ivd4173）进行核酸提取dna待用。
52.1.2 pcr扩增按下表配置pcr扩增反应液（每个反应45 μl）。
53.将配置好的pcr扩增反应液液按45 μl每个反应空进行分装。将已处理样本dna、阳性对照品dna、阴性对照品dna各5 μl加入相应反应孔，上机进行pcr扩增。
54.1.3扩增程序：95℃ 5 min（1个循环）；95℃ 30sec ，60℃ 90 sec，72℃ 30sec（35个循环）；72℃ 10min（1个循环）；4℃ ∞（1个循环）。
55.1.4产物纯化：pcr扩增结束以后，取 5
µ
l pcr产物进行1-2%琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带扩增（目的条带大小为500bp），如观察到目的条带，则将上述 pcr 产物及时进行纯化，具
体操作详见pcr产物纯化试剂盒说明书。按试剂盒步骤纯化获得的 pcr产物进行电泳鉴定定值（pcr产物浓度范围为10-50ng），可立即进行测序 pcr或置于-20
±
2℃保存备用（保存时间不要超过2天）。
56.1.5测序pcr：经过电泳鉴定定值的pcr产物，按下表配制测序pcr体系：。
57.将各反应管放入定性pcr仪，按下列条件扩增：96℃ 1分钟
→
（96℃ 10秒
→ꢀ
50℃ 5秒
→
60℃ 4分钟）
×
25个循环
→
4℃保温。
58.1.6测序准备：1.6.1取测序pcr反应结束后的pcr反应管，各pcr反应管加入2
µ
l 125 mmol/l edta和2
µ
l 3 mol/l醋酸钠（ph 5.2）到管底。
59.1.6.2再加入50
µ
l 100%无水乙醇，盖紧管盖，短时振荡后，室温避光放置15分钟。
60.1.6.3 4℃下12000rpm离心30分钟，立即小心去上清（若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟）。
61.1.6.4 每管加入150
µ
l预冷70%乙醇，4℃下12000rpm离心10分钟，立即小心去上清（尽量将管底的70%乙醇吸干净，若不能立即操作，请在操作前重新离心3分钟），此步骤可重复操作一次。
62.1.6.5 室温避光放置15-30分钟（观察管底液体，使70%乙醇挥发干净），此步骤产物可密封避光置于-20
±
2℃保存5天。
63.1.6.6 加入10
µ
l hi-di formamide，短时振荡溶解dna，进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底。
64.1.6.7 溶解后的样品在定性pcr仪上95℃变性5分钟，迅速置冰中冷却4分钟后，准备上样电泳。
65.1.7基因分析仪测序：1.7.1加样：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的 96 孔板，盖好，按加样顺序编辑样品列表。根据测序仪型号选用具有ivd 标志的 seq_std_bdtv3.1_assyxl_pop7或seq_std_bdtv3.1_assy_pop7进行测序。
66.1.7.2使用 abi 基因分析仪时，应用 abi公司data collection与sequencing analysis 软件进行数据收集和分析。data collection与sequencing analysis分析软件的进一步信息请参阅data collection与 analysis software用户手册。测序结果自动保存在预设位置，反应结束后打开测序结果进行分析，得到.ab1、.phd.1格式的文件。
67.1.8结果分析：1.8.1运行seqscanner程序，导入测序结果。
68.1.8.2测序结果：应用软件对比野生型序列逐个碱基比较，查找突变点，记录突变的碱基类型即可。
69.最终结果显示利用全外显子测序技术，其中17例阳性（14名患者，3名携带者），43例阴性。本发明试剂盒检测发现患者中有13名基因诊断阳性（其中1例仅检测到一个突变位点，表3），健康人中检出携带者3名。两种试剂盒在患者中应用一致性为92%，在携带者中应用一致性为100%。总一致性96%（表4）。新发突变检出率一致性75%（本试剂盒最大优点）。
70.表3. 60例临床样本mmachc突变位点检出比较。
71.表4. 60例临床样本mmachc突变检测结果。
72.本试剂盒对20例合并型mma患者基因突变检测发现14例基因突变，阳性检出率70%；对40例健康人进行基因突变检测发现有3例杂合突变，为mmachc基因突变携带者，阳性检出率7.5%。检出新发突变3种。
73.本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。