应用于生物样本液液萃取前处理中的添加剂以及萃取方法与流程

1.本发明涉及生物样本前处理技术，具体涉及一种应用于生物样本液液萃取前处理中的添加剂以及萃取方法。


背景技术：

2.在生物样本的前处理过程中，液液萃取是应用最广泛的方法之一。常用的萃取溶剂有正己烷、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等。这些有机溶剂的比重通常都小于水。待萃取完成后，一般上层为有机相，下层为水相。生物样本前处理过程中常规的液液萃取操作如图1所示，先取空心离心管，加入样品，加入萃取溶剂，振摇提取、离心后，吸取上清液；这时需要用吸管将上清液小心翼翼的移取出来。此时遇到的问题是很难将上清液全部吸取完全，且吸取上清液的过程中，当吸管接近两相液面时，很容易触碰到水相，从而污染有机萃取相。
3.通过对现有专利文献的检索发现，申请号为202010730521.8的中国发明专利申请公开了一种优化的生物样品液液萃取前处理方法；其为了克服生物分析中液液萃取使用的有机溶剂较难使用移液装置进行转移，且容易出现相互污染的问题，提供的优化的前处理方法使用干冰-乙醇浴或干冰-异丙醇浴将加入有机溶剂的生物样品进行速冻，在水相被冻结的情况下可轻松倾倒转移出有机相用于后续样品处理和分析。然而，干冰不易获取且干冰温度过低(-78.5度)需低温操作。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种应用于生物样本液液萃取前处理中的添加剂以及萃取方法；通过在液液萃取过程中加入适量的特定的固体吸附剂来固定其中的水相，从而达到可以快速倾倒出有机相，简化液液萃取操作的目的。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
6.本发明涉及一种应用于生物样本的液液萃取前处理方法中的水相固定剂,所述水相固定剂由大孔硅藻土和微晶纤维素组成。
7.作为本发明的一个实施方案，所述大孔硅藻土的粒径为600-900μm。
8.作为本发明的一个实施方案，所述微晶纤维素的粒径为20-100μm。
9.作为本发明的一个实施方案，所述大孔硅藻土和微晶纤维素的重量比为2:1-3:1。
10.作为本发明的一个实施方案，所述水相固定剂是将大孔硅藻土粉末和微晶纤维素粉末混合均匀后，压制成片剂。
11.作为本发明的一个实施方案，所述压制见采用10mm内径的压片机压制成300
±
10mg的片剂。
12.本发明还涉及一种应用于生物样本的液液萃取前处理方法，所述方法包括如下步骤：
13.s1、在空白离心管预先加入水相固定剂；
14.s2、加入生物样本，固定剂很崩解且吸附住样本；
15.s3、加入萃取溶剂；
16.s4、振摇提取、离心；
17.s5、直接倾倒出上清液。
18.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述生物样本的重量用量为水相固定剂重量的0.8-1.2倍。在一些实施例中，生物样本的重量用量为水相固定剂重量的1倍。
19.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述萃取溶剂包括正己烷、乙酸乙酯、叔丁基甲醚中的一种或几种。
20.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述萃取溶剂的重量用量为生物样本重量的2-5倍。
21.本发明主要为了简化液液萃取的分液操作，加入特定的固体吸附剂可以很好地将下层的水相吸附住，且加入的吸附剂不会影响整个液液萃取的过程和效率，待离心完成后即可轻松倾倒出上层有机溶液。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.(1)本发明通过在液液萃取过程中加入适量的特定的固体吸附剂来固定其中的水相，从而达到可以快速倾倒出有机相，简化液液萃取操作的目的。
24.(2)加入的固体吸附剂为大孔硅藻土和微晶纤维素按一定比例混合后压制成的片剂，成本较低。
25.(3)液液萃取操作中，大大简化了倾取上清液的操作，省去了使用吸管吸取上层清液的操作，时间和成本上可以至少节约一半。
附图说明
26.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
27.图1为生物样本前处理过程中常规的液液萃取操作流程示意图；
28.图2为本发明的生物样本前处理过程中液液萃取操作流程示意图。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
30.本发明提供一种应用于生物样本的液液萃取前处理方法，其操作流程示意图如图2所示，在空白离心管预先加入水相固定剂；加入样本，固定剂很快崩解且吸附住样本；加入萃取溶剂；振摇提取、离心后直接倾倒出上清液。
31.加入的水相固定剂主要组成成分为大孔硅藻土(600-900μm)，还添加了微晶纤维素(20-100μm)，微晶纤维素和大孔硅藻土的比例为1:3。
32.将上述两种原料混合均匀后，采用10mm内径的压片机，将上述混合粉末压制成300mg左右的片剂，该片型可用于吸附约200μl左右的生物样本液。片型的大小可根据样本量做适当调整。
33.具体应用见以下实施例：
34.实施例1：人血浆样品中醛固酮的含量分析
35.概述：采用叔丁基甲醚液液萃取和柱前衍生化相结合，测定血浆样品中的醛固酮。样品前处理部分，比较了传统的液液萃取方法和添加固体吸附剂的液液萃取方法所测得结果的一致程度。
36.方法一、传统的液液萃取法(如图1)
37.样品制备：
38.1、取200μl血浆样品加入2ml离心管中，一式三份；
39.2、加入1ml叔丁基甲醚；
40.3、涡旋混合3min；
41.4、在10℃下14000转/分钟离心5min；
42.5、用吸管尽可能多吸取上层清液转移至另一2ml离心管中，室温氮吹至干；
43.6、依次加入乙酸，衍生化试剂；
44.7、室温反应10min；
45.8、氮气吹干，流动相初始溶液50ul复溶；
46.9、将各个复溶液20μl注入超高效液相色谱-串联质谱仪分析。
47.方法二、添加固体吸附剂的液液萃取法(如图2)
48.样品制备：
49.1、取200μl血浆样品加入至预先放入固体吸附剂的2ml离心管中，生物样本的重量用量为水相固定剂(即固体吸附剂)重量的1倍，一式三份；
50.2、加入1ml叔丁基甲醚；
51.3、涡旋混合3min；
52.4、在10℃下14000转/分钟离心5min；
53.5、倒出上清液至2ml离心管中，室温氮吹至干；
54.6、依次加入乙酸，1mg/ml的杰拉德p试剂衍生化试剂；
55.7、室温反应10min；
56.8、氮气吹干，流动相初始溶液(0.1％甲酸水溶液：甲醇＝85:15)50ul复溶；
57.9、将各个复溶液20μl注入超高效液相色谱-串联质谱仪分析。
58.使用waters acquity uplc i-class/xevo tq-s三重四极杆串联质谱系统进行分析，采用waters acquity uplc beh c8色谱柱(1.8μm，2.1mm
×
100mm)分析样品，以0.1％甲酸水溶液(含2mm甲酸铵)和甲醇分别为流动相a和b进行梯度洗脱，如表中所示。运行时间为5.5min，柱温为40℃，进样体积为20μl。waters xevo tq-s三重四极杆串联质谱系统采用多反应监测的模式操作(494.3
→
415.2)。
59.表1人血浆中醛固酮分析的uplc梯度条件
[0060][0061]
用waters masslynx软件采集数据，使用targetlynx软件测定监测通道的积分峰面积。
[0062]
结果分析：
[0063]
表2
[0064][0065]
如表所示，传统的液液萃取方法和添加固体吸附剂的液液萃取方法所测得结果中，两组样品的待测物醛固酮的峰面积基本一致，说明固体吸附剂的加入对于待测物的测定并没有影响。传统的液液萃取方法中吸取上层清液的操作耗时约为10-15秒一个样品，如需要尽可能把上层清液吸尽，则需耗费更多的时间。而添加固体吸附剂的液液萃取方法中的操作耗时仅为2-3秒一个样品，故对于大量样品的测试，添加固体吸附剂的方法会更具优势。此外，需要说明的是：现有技术中有采用液液萃取柱，液液萃取柱目前来说并不是主流的技术，实际的使用的频率是很低的，不会超过1％。主流的还是传统的液液萃取，因此，本发明的方案是和传统的液液萃取相比。
[0066]
实施例2：人血清样品中25-羟基维生素d3的含量分析
[0067]
概述：采用甲醇/乙腈蛋白沉淀及正己烷液液萃取相结合，测定血清样品中的25羟基维生素d3。同时比较了传统的液液萃取方法和添加固体吸附剂的液液萃取方法所测得结果的一致程度。
[0068]
方法一、传统的液液萃取法
[0069]
样品制备：
[0070]
1、取100μl血清样品加入2ml离心管中，一式三份；
[0071]
2、加入200μl甲醇 乙腈(1 1)溶液；
[0072]
3、涡旋混合30s；
[0073]
4、加入1ml正己烷；
[0074]
5、涡旋混合5min；
[0075]
6、在10℃下14000转/分钟离心5min；
[0076]
7、用吸管尽可能多吸取上层清液转移至另一2ml离心管中，室温氮吹至干；
[0077]
8、加入100μl85％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)复溶；
[0078]
9、涡旋混合30s；
[0079]
10、在10℃下14000转/分钟离心3min；
[0080]
11、吸取上清液至96孔进样板。
[0081]
方法二、添加固体吸附剂的液液萃取法
[0082]
样品制备：
[0083]
1、取100μl血清样品加入至预先放入固体吸附剂的2ml离心管中，生物样本的重量用量为水相固定剂(即固体吸附剂)重量的1倍，一式三份；
[0084]
2、加入200μl甲醇 乙腈(1 1)溶液；
[0085]
3、涡旋混合30s；
[0086]
4、加入1ml正己烷；
[0087]
5、涡旋混合5min；
[0088]
6、在10℃下14000转/分钟离心5min；
[0089]
7、倒出上清液至2ml离心管中，室温氮吹至干；
[0090]
8、加入100μl85％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)复溶；
[0091]
9、涡旋混合30s；
[0092]
10、在10℃下14000转/分钟离心3min；
[0093]
11、吸取上清液至96孔进样板。
[0094]
12、将上清液20μl注入超高效液相色谱-串联质谱仪分析。
[0095]
使用waters acquity uplc i-class/xevo tq-s三重四极杆串联质谱系统进行分析，采用waters acquity uplc hss t3色谱柱(1.8μm，2.1mm
×
100mm)分析样品，以0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸甲醇分别为流动相a和b进行梯度洗脱，如表中所示。运行时间为7.5min，柱温为40℃，进样体积为20μl。waters xevo tq-s三重四极杆串联质谱系统采用多反应监测的模式操作(383.3
→
91.2)。
[0096]
表3血清中25-羟基维生素d3分析的uplc梯度条件
[0097]
[0098][0099]
用waters masslynx软件采集数据，使用targetlynx软件测定监测通道的积分峰面积。
[0100]
结果分析：
[0101]
表4
[0102][0103]
如表4所示，传统的液液萃取方法和添加固体吸附剂的液液萃取方法所测得结果中，两组样品的待测物25-羟基维生素d3的峰面积基本一致，说明固体吸附剂的加入对于待测物的测定并没有影响。
[0104]
上述两个实施例中，水相固定剂的加入应用于液液萃取的操作中，能够很好地固定下层的水相的溶液，轻松倾倒出上层的有机萃取液。而固体吸附剂的加入对于目标物的测定无任何影响。
[0105]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。