用于预防和治疗癌症、炎症性或免疫介导的炎症性疾病的大麻素和药用蘑菇的固定剂量组合的制作方法

1.本发明总体涉及用于癌症、炎症性或免疫介导的炎症性疾病的新颖治疗的手段和方法。
2.更具体地，本发明涉及大麻素和药用蘑菇的协同相互作用和固定剂量组合，用于预防和治疗癌症、炎症性或免疫介导的炎症性疾病。
背景技术
3.虽然已知大麻素(cbd，thc以及一些其他物质)是具有已知抗癌活性的强效抗炎剂，但也发现这些化合物可能削弱、抑制或减弱免疫介导过程。减少免疫介导的过程可能在一些临床适应症中具有积极影响，但可能对需要免疫刺激和抗炎作用(诸如癌症)的过程产生负面影响。
4.此外，用于治疗癌症的大多数化学治疗剂可能在治疗过程期间破坏肿瘤并阻止癌症进展以及损伤健康细胞和组织，此外，对癌症免疫力的负面影响可能会降低其一些有益的抗肿瘤作用。
5.因此，对于用作抗癌治疗和其他免疫介导的炎症性疾病(imid)的治疗的新的更有效和更安全的药剂存在未满足的需求。


技术实现要素：

6.对于用作抗癌治疗的新的更有效和更安全的药剂以及用于其他免疫介导的炎症性疾病(imid)的治疗存在未满足的需求，其中抗炎和促免疫(主要是促th1(pro th1)型)或相关细胞效应(nk细胞刺激)的组合可以被认为是有益的。
7.虽然大麻素具有抗炎作用和抑制免疫，但已知药用蘑菇在具有一些抗炎作用的同时刺激免疫力，因此在某些条件下，以一定比例，它们的组合将具有独特且出乎意料的协同抗炎活性谱以及选择性促免疫特性。
8.本发明的一个目的是公开一种用于治疗哺乳动物受体内的免疫介导的炎症性疾病或癌症及其任何组合的组合物，其中所述组合物包括a.大麻衍生化合物和b.药用蘑菇的协同组合。
9.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所限定的组合物，
10.本发明的一个目的是公开一种可用于协同治疗免疫介导的炎症性疾病或癌症及其任何组合的协同组合物，所述组合物包括：
11.a.对cb1或cbd受体及其任何组合具有激动性的大麻衍生化合物；
12.b.对模式识别受体(prr)具有激动性的药用蘑菇；
13.其中所述大麻衍生化合物在治疗上是抗炎的，并且所述药用蘑菇在哺乳动物受体中是免疫刺激的。
14.本发明的另一个目的是公开如上述任一项所限定的组合物，其中所述免疫介导的
炎症性疾病选自于由下述所构成的组：哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)；银屑病(psoriasis)、类风湿性关节炎、炎症性肠道病(ibd)、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病；巨细胞动脉炎；gn，肾小球肾炎；幼年特发性关节炎、风湿性多肌痛；sapho，滑膜炎，痤疮、脓疱病、骨质增生、骨炎、系统性红斑狼疮；血栓性/特发性血小板减少性紫癜、干燥综合征(sjogren's)、克罗恩氏病(crohn's disease)、多发性肌炎/皮肌炎、韦格纳氏肉芽肿病(wegener's granulomatosis)、韦格纳血管炎(wegener's vasculitis)、银屑病、贝切特氏病(behcet's)、结节性多动脉炎、多发性大动脉炎(takayasu's arteritis)、移植物抗宿主病、结节性多动脉炎、肉样瘤病、成人斯蒂尔病、化脓性汗腺炎(hydradenitis supprativa)、冷球蛋白血症性血管炎(cryoglobulinaemic vasculitis)、坏疽性脓皮病、川崎氏病、复发性多软骨炎、抗磷脂综合征、冷球蛋白血症性血管炎、化脓性汗腺炎、特发性膜质炎(idiopathic membranous)、复发性多软骨炎、乳糜泄(coeliac disease)、慢性丙型肝炎、重症肌无力、骨髓增生异常综合征天疱疮、难治性哮喘、格雷夫斯病(grave's disease)、坏疽性脓皮病、结节性红斑、sapho综合征、多中心网状组织细胞增多症、慢性乙型肝炎、淀粉样变性病(amyloidosis)，及其任何组合。
15.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述模式识别受体(prr)选自于由下述所构成的组：toll样受体(tlr)、甘露糖受体、dectin1及其任何组合。
16.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述药用蘑菇选自于由下述所构成的组：冬虫夏草(cordyseps)、舞茸(maitake)((灰树花)(grifola frondosa))、火鸡尾(turkey tail)(云芝(trametes versicolor)，杂色云芝菌(coriolus versicolor))、灵芝(reishi)(赤灵芝(ganoderma lucidum))、白桦茸(chaga)(桦褐孔菌(inonotus obliquus))、香菇(shiitake)(香菇菌(lentinus edodes))、巴西蘑菇(agaricus blazei murill)，及其任何组合。
17.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述大麻衍生化合物选自于由下述所构成的组：大麻素、萜烯、酚类化合物及其任何组合。
18.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中大麻素是以下中的至少一种：四氢大麻素(tetra-hydro-cannabinoids)(d9-thc)、四氢大麻素(d8-thc)、四氢大麻酚酸(tetra-hydro-cannabinolic acid)(thca-d9)、四氢次大麻酚(tetra-hydro-cannabivarin)(thcv/thc-c3)、大麻二酚(cannabidiol)(cbd)、大麻二酚酸(cannabidiolic acid)(cbda)、次大麻二酚(cannabidivarin)(cbdv)、大麻萜酚(cannabigerol)(cbg)、大麻萜酚酸(cannabigerolic acid)(cbga)、大麻酚(cannabinol)(cbn)、大麻二酚酸(cannabidiolic acid)(cbna)、大麻环萜酚(cannabichromene)(cbc)、大麻环萜酚酸(cannabichromenic acid)(cbca)，及其任何组合。
19.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中萜烯(terpenes)是单萜烯或倍半萜烯。
20.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中酚类化合物是以下中的至少一种：o-糖苷大麻黄素a(o-glycoside cannaflavin a)、大麻黄素b(cannaflavin b)、大麻酰胺d(canabisin d)及其任何组合。
21.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述组合物被配置
成能够以下述方式施用，所述方式选自于由下述所构成的组：吸入器、香烟、片剂、胶囊、丸剂、冻干粉、粉末、乳液、颗粒状粉末、乳膏、软膏、糊剂、洗剂凝胶、液体、溶液、贴剂及其任何组合。
22.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述组合物被配置成能够以下述方式施用，所述方式选自于由下述所构成的组：快速释放、缓慢释放、持续释放、控制释放及其任何组合。
23.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述组合物另外的包括选自于由下述所构成的组的成分：增溶剂、稳定剂、缓冲剂、张力调节剂、填充剂、粘度增强剂/降低剂、表面活性剂、螯合剂、佐剂及其任何组合。
24.本发明的一个目的是公开一种治疗免疫介导的炎症性疾病或癌症及其任何组合的方法，其包括以下步骤：
25.a.提供一种组合物，其中所述组合物包括a.大麻衍生化合物和b.药用蘑菇的协同组合；以及
26.b.将所述组合物施用到哺乳动物受体。
27.本发明的一个目的是公开一种治疗免疫介导的炎症性疾病或癌症及其任何组合的方法，其包括以下步骤：
28.a.提供组合物，所述组合物包括：对cb1或cbd受体及其任何组合具有激动性的大麻衍生化合物，和对模式识别受体(prr)具有激动性的药用蘑菇；以及，
29.b.将所述组合物施用到哺乳动物受体；
30.其中所述大麻衍生化合物在治疗上是抗炎的，并且所述药用蘑菇在所述哺乳动物受体中是免疫刺激的。
31.本发明的一个目的是公开一种可用于治疗哺乳动物受体的免疫介导的炎症性疾病或癌症及其任何组合的组合物，所述组合物包括
32.a.对模式识别受体(prr)具有激动性的至少一种药用蘑菇；以及
33.b.至少第二药用蘑菇。
34.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述用于治疗免疫介导的炎症性疾病的组合物包括冬虫夏草m蘑菇提取物(cordyceps m mushroom extract)和thc。
35.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述治疗免疫介导的炎症性疾病包括抑制一氧化氮分泌。
36.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述组合物可用于治疗免疫介导的炎症性疾病，所述组合物包含灵芝蘑菇提取物和thc。
37.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述治疗免疫介导的炎症性疾病包括减少il-6分泌。
38.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述可用于治疗免疫介导的炎症性疾病的组合物包含冬虫夏草cs-4蘑菇提取物thc。
39.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述治疗免疫介导的炎症性疾病包括减少tnfα分泌。
40.本发明的另一个目的是公开如上述任一项限定的组合物，其中所述治疗免疫介导
的癌症由包含cbd和蘑菇提取物的组合物提供，所述蘑菇提取物选自：冬虫夏草(m)蘑菇提取物和灵芝蘑菇提取物。
附图说明
41.图1：用于一氧化氮标准参考曲线的建议的板甲酸盐；
42.图2：将冬虫夏草cs-4(a)和巴西蘑菇(agaricus blazei)(b)与5000个panc-1细胞一起培养2小时、6小时、24小时和72小时。使用xtt试剂盒测量活力；
43.图3：将冬虫夏草cs-4(a)、冬虫夏草m(b)、灵芝(c)和巴西蘑菇(d)、火鸡尾rm(e)、香菇(f)、火鸡尾ms(g)、白桦茸(h)和舞茸(i)与105个raw细胞一起培养24小时。使用greiss试剂盒测量上清液中的no分泌；
44.图4：在有和没有cbd或thc的情况下，将冬虫夏草cs-4(a)、冬虫夏草m(b)、灵芝(c)和巴西蘑菇(d)与105个raw细胞一起培养24小时。通过多重测量上清液中的il-6和tnf；
45.图5：将cbd(a)和thc(b)与105个raw细胞一起培养24小时。使用greiss试剂盒测量上清液中的no分泌；
46.图6：将灵芝(a b)、巴西蘑菇(c d)、冬虫夏草cs-4(e f)和冬虫夏草m(g h)以及dmso、cbd或thc与105个raw细胞组合24小时。使用greiss试剂盒测量上清液中的no分泌；
47.图7：将灵芝、冬虫夏草m、巴西蘑菇、冬虫夏草cs-4、火鸡尾(ms)(a)、白桦茸、舞茸、火鸡尾(rm)和香菇(b)与7500个panc-1细胞一起培养72小时。使用xtt试剂盒测量活力；
48.图8：将灵芝、冬虫夏草m、巴西蘑菇、冬虫夏草cs-4、火鸡尾(ms)(a)、白桦茸、舞茸、火鸡尾(rm)和香菇(b)与5000个egl-1细胞一起培养72小时。使用xtt试剂盒测量活力；
49.图9：将cbd和thc与7500个panc-1(a)和5000个egl-1(b)细胞一起培养72小时。使用xtt试剂盒测量活力；以及
50.图10：将灵芝(a)、冬虫夏草m(b)、冬虫夏草cs-4(c)和火鸡尾(d)以及dmso、cbd或thc与5000个panc-1细胞组合72小时。使用xtt试剂盒测量活力。
具体实施方式
51.提供以下描述以及本发明的所有章节，以便使本领域任何技术人员能够利用所述发明，并阐述由发明人预期的实施本发明的最佳模式。然而，各种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，因为本发明的一般原理已经被具体定义为提供用于癌症、炎性或免疫介导的炎性疾病和医学病症的新颖治疗的手段和方法，通过大麻素和药用蘑菇的相互作用和固定剂量组合来预防和治疗这些医学病症。
52.本发明公开了用于通过将大麻素与治疗性蘑菇协同组合的组合物治疗癌症、炎性或免疫介导的炎性疾病的手段和方法。
53.本发明公开了这样的组合物，其发挥抗炎作用以及免疫刺激作用的组合作用，从而用作抗炎或抗癌药物，而不抑制或减少免疫介导的过程。此外，本发明公开的组合物衍生自天然产物，因此可以在开发更有效和更安全的用于抑制癌症、炎性或免疫介导的炎性疾病的发展和发作的药剂中起重要作用。
54.具体地，本发明公开大麻素和治疗性蘑菇的协同组合。大麻素(cbd，thc和少数其他物质)是具有已知抗癌活性的强效抗炎剂，其也削弱、抑制或减弱免疫介导过程。减弱免
疫介导的过程可能会对需要免疫刺激和抗炎作用(例如癌症)的过程产生负面影响。
55.已知治疗性蘑菇是主要影响th1、nk和巨噬细胞极化的免疫刺激剂。这些性质可能归因于它们在一些免疫炎性过程中的已知和要求保护的抗癌和调节作用。
56.通过药用蘑菇的免疫刺激通常经由先天免疫发生，并且通常由吞噬细胞介导。这些细胞摄取入侵的病原体或与病原体组分相互作用，其在任一情况下通过分泌细胞因子和趋化因子进一步刺激先天和适应性免疫。细胞表面上的模式识别受体(prr)(诸如toll样受体(tlr)、甘露糖受体和dectin1)通过识别微生物中保守的分子模式来触发反应。对来自蘑菇的免疫调节物质的关注日益增加。例如，香菇多糖(lentinan)在日本已广泛用于治疗癌症患者。
57.主要来源于担子菌科(并且一些来源于子囊菌)和药用蘑菇的真菌生物活性多糖在远亚作为传统饮食和药物的一部分是众所周知的并且被广泛使用，并且在过去的几十年中，已经成为深入研究的核心，用于理解和利用它们在天然药物中的药用性质。事实上，这些生物聚合物中的一些(主要是β-葡聚糖或杂多糖)已经作为抗肿瘤、免疫刺激或预防药物进入市场。这些生物聚合物中的许多由可食用蘑菇产生，使得它们也是配制新颖的功能性食品和营养制品的非常好的候选物，以便利用它们的免疫调节、抗癌、抗微生物、降胆固醇、降血糖和促进健康的性质而没有任何严重的安全问题。
58.将大麻素与治疗性蘑菇组合揭示一种新颖的谱组合物，其对临床病症，诸如免疫介导的炎性疾病(imid)和医学病症和癌症具有独特且强效的作用。
59.还将治疗性蘑菇组合以揭示一种组合物，其对临床病症，诸如免疫介导的炎性疾病(imid)和医学病症以及癌症具有治疗效果。
60.如本文下文所用的那样，术语免疫介导的炎性疾病(imid)是用于集体地描述一组共享共同炎性途径的表面上不相关的病症的概念。
61.免疫介导的炎性疾病(imids)包括但不限于：哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)；银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病(ibd)、溃疡性结肠炎、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病；巨细胞动脉炎；gn，肾小球肾炎；幼年特发性关节炎、风湿性多肌痛；sapho，滑膜炎，痤疮、脓疱病、骨质增生、骨炎、系统性红斑狼疮；血栓性/特发性血小板减少性紫癜、干燥综合征、克罗恩病、多肌炎/皮肌炎、韦格纳肉芽肿病、韦格纳血管炎、银屑病、贝切特氏病、结节性多动脉炎、高安动脉炎、移植物抗宿主病、结节性多动脉炎、结节病、成人斯蒂尔病、化脓性积水炎、冷球蛋白血症性血管炎、坏疽性脓皮病、川崎病、复发性多软骨炎、抗磷脂综合征、冷球蛋白血症性血管炎、化脓性积水炎、特发性膜性、复发性多软骨炎、乳糜泻、慢性丙型肝炎、重症肌无力、骨髓增生异常综合征天疱疮、难治性哮喘、格雷夫斯病、坏疽性脓皮病、结节性红斑、sapho综合征、多中心网状组织细胞增多症、慢性乙型肝炎、淀粉样变性及其任何组合。
62.如本文下文所用的那样，术语“大麻衍生化合物”在本文下文中是指在大麻植物中发现的化合物，包括大麻素、萜烯和酚类化合物。如本文下文所用的那样，术语“大麻素”在本文下文中是指一类不同的化学化合物，其是改变脑中神经递质释放的细胞中大麻素受体的配体。大麻素主要发现于来自大麻(cannabis sativa)植物的大麻(marijuana)(大麻花)和大麻树脂(hashish)(压缩的大麻树脂)中。这种植物含有超过80种植物大麻素。大麻的主要活性成分是精神活性的δ9-四氢大麻酚(δ9-thc)，其作为部分激动剂作用于大麻素1
(cb1)和大麻素2(cb2)受体。大麻中存在的其他重要的天然大麻素是非精神活性的大麻二酚(cbd)、δ9-四氢次大麻酚(δ9-thcv)和大麻色烯(cbc)[1-3]。在它们当中cbd迄今已经吸引了最大的关注。其显示拮抗cb1/cb2受体激动剂的作用，以抵消δ9-thc的精神作用和其它负面作用，并且若干数据表明其表现为cb1和cb2受体的反向激动剂。这些植物衍生的大麻素中的一些用于医疗实践中，诸如δ9-thc(屈大麻酚)及其合成类似物，抗化疗诱导的恶心和呕吐的大麻隆，以及作为食欲刺激剂(例如在aids患者中)。cbd与δ9-thc(纳比莫(nabiximols))组合用于缓解多发性硬化中的神经性疼痛和痉挛状态，并且作为晚期癌症疼痛中的辅助镇痛治疗。
[0063]
如下文所用的那样，术语“萜烯”以下是指由各种植物产生的大而多样的类别的有机化合物。萜烯是由具有分子式c5h8的异戊二烯单元生物合成得到的，萜烯的基本分子式是(c5h8)n的倍数，其中n是链接的异戊二烯单元的数目。萜烯是赋予大麻其芳香多样性的芳香油。
[0064]
如本文下文所用的那样，术语大麻二酚(cbd)是指大麻成分，其是一种药理学广谱药物，近年来其作为一系列病症的治疗方法引起了越来越多的关注。
[0065]
所述大麻衍生化合物包含：
[0066]
大麻素：四氢大麻素(d9-thc)、四氢大麻素(d8-thc)、四氢大麻酚酸(thca-d9)、四氢次大麻酚(thcv/thc-c3)、大麻二酚(cbd)、大麻二酚酸(cbda)、次大麻二酚(cbdv)、大麻萜酚(cbg)、大麻萜酚酸(cbga)、大麻酚(cbn)、大麻二酚酸(cbna)、大麻环萜酚(cbc)、大麻环萜酚酸(cbca)；
[0067]
萜烯：单萜烯和倍半萜烯；以及
[0068]
酚类化合物：o-糖苷，大麻黄素a，大麻黄素b，大麻酰胺d。
[0069]
如本文下文所用的那样，术语“约”表示限定的量或量度或值的
±
25％。
[0070]
如本文下文所用的那样，术语“治疗性蘑菇”或“药用蘑菇”包括但不限于以下的蘑菇：冬虫夏草、舞茸(灰树花)(maitake(grifola frondosa))、火鸡尾(变色栓菌、云芝)、白桦茸(桦褐孔菌)、灵芝(reishi(ganoderma lucidum))、香菇(shiitake(lentinus edodes))、姬松茸(agaricus blazei murill)及其任何组合。
[0071]
冬虫夏草
[0072]


背景技术：
冬虫夏草是虫草目(order hypocreales)麦角科(clavicipitaceae family)中最多样化的属。在已经报道的超过400种物种中，最多记载的物种是冬虫夏草。
[0073]
中华虫草(codyceps sinensis，c sinensis)是一种中药药用蘑菇。它天然存在于海拔3600米以上的喜马拉雅山上。此外，可以从培养的菌丝体提取物生产中华虫草中华虫草用于商业生长。自1964年以来，中国药典将中华虫草中华虫草归类为药物。
[0074]
在传统医学中的用途：在传统中药中，中华虫草已被用于疲劳、食欲差、肾虚弱、结核病、慢性支气管炎、男性阳萎和性欲减退(chen px等人，2017)。治疗与心血管、免疫、内分泌和神经系统相关的健康状况(zhu js等，1998)。
[0075]
此外，据报道中华虫草具有免疫调节、抗癌、抗衰老、抗氧化和抗炎活性(tuli hs等人，2014；shashidhar mg等人，2013；nie s等人，2013)。
[0076]
提取方法：可以通过使用不同的介质如水、甲醇、乙醇、胰蛋白酶、meoh和etoac来提取中华虫草的不同化合物(chen px等，2013)。
[0077]
生物活性化合物
[0078]
中华虫草活性化合物包括但不限于：核苷(虫草素和腺苷)、多糖(从中华虫草分离的水溶性多糖(cps1)、从中华虫草分离的水溶性多糖(cps2)和从培养的中华虫草分离的酸性多糖(apc))、肽(环二肽和虫草素)和甾醇(麦角甾醇和谷甾醇)。
[0079]
临床前研究：中华虫草提取物在不同的临床前研究中用于几种适应症，包括抗氧化剂(vasiljevic jd等人，2016；wang j1等人，2012；ji，d.-b等人，2009)、减少移植动脉硬化的形成(zhang，y等人，2011)和抗肿瘤(chen，y等人，2009)。
[0080]
药理学活性-炎症和癌症：许多研究表明中华虫草活性化合物具有抗炎和抗癌特性。主要的药理学活性通过减弱促炎细胞因子诸如tnf-和icam-1以及减少pcna表达(zhang等人，2011)、il-2和tgf-分泌的抑制和il-4分泌的增强(jeong等人，2002)来介导。此外，显示了cox-2和nf-κb的抑制(wang j1等，2012b)。
[0081]
临床前和临床剂量
[0082]
[0083][0084]
舞茸(maitake)(灰树花(grifola frondosa))
[0085]
背景技术：灰树花(grifola frondosa)是一种深灰棕色真菌，主要在死亡、垂死或老化的硬木(诸如橡树、榆树、枫树、黑胶树、山毛榉和栗树)树干树桩基部处或附近的地面上发现。灰树花(g.frondosa)主要分布在日本、欧洲国家和美国东北部的北部温带地区(全球生物多样性信息设施，www.gbif.or，2017)，并且也可以在亚热带温带气候的高海拔处发现(s.h.han等人，1995)。它在全世界上以不同的名称众所周知，包括舞茸(maitake/kumotake)(日本)、灰树花(中国)、signorina蘑菇(意大利)和“贝叶多孔菌(hen of the woods)”(北美)。
[0086]
在传统医学中的用途：灰树花在传统的中国和日本“草药学”中被认为是药用蘑菇。它在不同的适应症中用于保护脾(中华本草编委会，中华本草，上海科学技术出版社，上海，1999，第548-549页)、胃和肝(c.zhou等人，2013)，并且还可以用于平静神经和精神(t.mizuno，1995)。
[0087]
提取方法：多糖：热水3％nh4草酸盐(100℃)5％naoh溶液(30℃)(mizuno t等人，1995)。grifulan(grn)：使灰树花在100ml含有2％葡萄糖、0.6％聚蛋白胨、2％蔗糖和0.1％大豆油的培养基中在ph 4.5、25℃下生长14天。通过过滤分离菌丝体，并在0.5％柠檬酸盐缓冲液(ph 4.0，含有5％葡萄糖)中于25℃培养6天。培养6天后，离心混合物，上清液用1体积的乙醇稀释，并且沉淀溶于8m尿素。溶液进一步通过deade-sephadex a-25纯化以除去污染的蛋白质，未吸附的级分用水透析并用乙醇沉淀，随后真空干燥(adachi yoshiyuki等，1994)
[0088]
生物活性化合物：灰树花提取物含有广泛的活性化合物，诸如葡聚糖(例如nmf-5n、grifolan le、gfp2、gfpbw1)和杂聚物(例如fii-3、fiii-1a、gfp1)。灰树花也是海藻糖的丰富来源(s.j.huang，s.y等人，2011)，其已被广泛用作食品防腐剂、甜味剂和疫苗稳定剂。
[0089]
在制备的各种舞茸级分(fractions)中，发现d级分对于增强免疫系统是非常有希望的，无论是口服施用还是注射。不同于主要以具有
ˇ1→
6支链的主链的
ˇ-1，3-葡聚糖构成的许多抗肿瘤蘑菇多糖，d级分的多糖部分为(1
→
3)-支链(1
→
6)-ˇ-葡聚糖。d级分的进一步纯化产生md级分(he，xirui等人，2017)。
[0090]
临床前研究：在许多临床前研究(he，xirui等人，2017)中报道了从灰树花分离的多糖的生物活性，用于不同的适应症，诸如抗肿瘤、皮肤病治疗、免疫调节活性和抗氧化活性。
[0091]
药理学活性-炎症和癌症：几项研究已经表明，许多抗肿瘤多糖通过宿主介导的机制起作用，而不是直接作用于肿瘤细胞。灰树花多糖不仅作为生物反应调节剂帮助宿主耐受不利的生物应激并增加针对肿瘤细胞发育的免疫力，而且还直接诱导肿瘤细胞凋亡(he，xirui等人，2017)。另一项研究已经表明，舞茸d-级分诱导由th-0细胞转化的th-1细胞主导的免疫的开始，并因此刺激细胞免疫，并表达抗肿瘤作用(inoue，atsuyuki等人，2002)。大量的研究已经证实了舞茸对免疫功能具有显著的有益效果。它不仅促进巨噬细胞的作用，而且促进多种其他免疫相关细胞的作用，诸如可以攻击肿瘤细胞的自然杀伤(nk)细胞和细胞毒性t细胞(tc)。舞茸还通过增加白细胞介素-1、白细胞介素-2和淋巴因子来增加这些细胞的免疫相关效率。特别地，舞茸级分似乎具有特定的抗肿瘤作用，可能减缓结肠、肺、胃、肝、前列腺、脑和其他器官中肿瘤的生长。(应当指出的是，对d-级分的任何研究参考也适用于md-级分，因为它们是源自灰树花的相同的β1，6/1，3葡聚糖)(mayell，mark，2001)。
[0092]
临床前和临床剂量
[0093]
[0094][0095]
火鸡尾(turkey tail)(变色栓菌(trametes versicolor)，杂色云芝(coriolus versicolor))
[0096]
背景技术：火鸡尾是一种在世界各地的死原木上生长的蘑菇，它被命名为火鸡尾，因为它的褐色和茶色环看起来像火鸡的尾羽毛。其科学名称是变色栓菌或杂色云芝。
[0097]
火鸡尾已被用于传统中药治疗肺部疾病多年。在日本，当给予标准癌症治疗时，火鸡尾已用于增强免疫系统。
[0098]
在传统医学中的用途：增强免疫系统：提取方法
[0099]
从变色栓菌获得的水性提取物具有广泛的生物活性，包括对不同免疫细胞的调节和刺激作用，以及癌细胞生长的抑制，最近已被证明。在衍生自变色栓菌的热水和标准化乙醇-水提取物的不同生物活性组分中，蛋白质结合多糖(psk，也称为云芝素(krestin))和多糖肽(psp)具有强烈的生物活性(habibi，emran等人，2015)。
[0100]
生物活性化合物：从这种蘑菇中获得的多糖肽具有免疫调节、抗肿瘤和保肝活性，并已被用作癌症患者的免疫调节和抗肿瘤药物。一种密切相关的多糖psk(云芝素)已被日本研究者从杂色云芝中分离出来，并被证明具有免疫刺激活性。
[0101]
多糖k(psk)是火鸡尾蘑菇中最著名的活性化合物。在日本，psk是用于治疗癌症的经批准的蘑菇产品(hobbs c.，2004；jeong，sang-chul等人，2015)。
[0102]
临床前研究：psk和psp已经在体外和体内证明了广泛的免疫作用，特别是网状内皮系统活化、细胞因子调节(ifn-γ产生、il-2产生)、增强树突细胞活力、t细胞成熟、自然杀伤细胞活性、抗体产生以及抗肿瘤和抗癌作用。提取物可以通过激活癌细胞凋亡来抑制
癌发生和肿瘤细胞生长(hobbs c.，2005)。
[0103]
临床前和临床剂量
[0104]
[0105][0106]
香菇(shiitake(lentinus edodes))
[0107]
背景技术：在东方自从古代以来，香菇已经并且仍然是显示出具有药用性质的最可食用的蘑菇之一。已证明葡聚糖成分，特别是香菇多糖(一种具有b-1，6分支和三螺旋结构的纯化的b-1，3-d-葡聚糖)具有显著的抗肿瘤活性。香菇多糖也被证明是免疫增强剂，并且似乎刺激巨噬细胞和t细胞增殖，并且对肿瘤细胞没有直接的细胞毒性作用(ng，mah-lee，2002)。
[0108]
在传统医学中的用途：香菇是在几种治疗应用中使用的众所周知的大型真菌之一。它是具有证实的药理学性质的几种充分研究的制剂的来源。从明朝(1369-1644)开始对香菇的药用特性就已经进行了研究。来自日本帝国的老人认为香菇是生命的灵药，增加了活力和精力。在细胞内(子实体和菌丝体)和细胞外(培养基)，已经从香菇中分离出抗生素、防癌、抗癌、抗真菌、抗细菌和抗病毒、抗糖尿病、降血脂化合物。这些物质中的一些是香菇多糖、凝集素和香菇嘌呤(eritadenine)。香菇在医学上用于涉及免疫功能低下(包括aids)、癌症、糖尿病、环境过敏、真菌感染、频繁流感和感冒、支气管炎症和调节尿失禁的疾病(bisen，p.s.，等人，2010)。
[0109]
提取方法：在5℃下用80％甲醇水溶液(3000ml)和50％甲醇水溶液(3000ml)提取乙酸乙酯冷冻的香菇蘑菇(2000g)。合并提取物并在旋转蒸发仪上在减压和室温条件下浓缩，直至除去甲醇。将水性提取物(200ml)用乙酸乙酯分配两次(300ml
×
2)。将合并的乙酸乙酯级分在减压和室温条件下蒸发，然后在冷冻干燥器中干燥。乙酸乙酯级分占香菇蘑菇冷冻重量的2.12％(fang，nianbai等人，2006)。
[0110]
乙醇沉淀和在液氮中冷冻干燥，发现通过该方法分离的β-d-葡聚糖是香菇多糖。
使用碳水化合物分析柱(色谱方法)进行的纯度测试显示出87.50％的显著香菇多糖纯度(yap，ann-teck和mah-lee ng，2001)。
[0111]
将粉末状香菇子实体(a)在42℃下用etoet和etoh的1：1混合物萃取8小时。提取重复3次。将获得的提取物合并，并在n2气体下蒸发。将可提取材料(脂质)作为b级分。香菇粉末的残余物用etoet和etoh混合物提取，以提供c级分。将提取的不溶性残余物(脂质)用120℃的热水处理2小时以提取葡聚糖。将残余物作为e级分。将已经用热水处理的香菇粉末(a)过滤以排除可溶性葡聚糖，并将残余物作为级分d(nanba hiroaki等人，1987)。
[0112]
生物活性化合物：科学研究已经从具有健康促进活性的香菇中分离出许多化合物。香菇子实体含有88-92％的水、蛋白质、脂质、碳水化合物以及维生素和矿物质。蘑菇是维生素，尤其是维生素原d2(麦角甾醇)的良好来源，其在紫外(uv)光和热下产生骨化醇(维生素d2)。它还含有b族维生素，包括b1(硫胺素)、b2(核黄素)和b12(烟酸)。脂肪酸占总脂质的3.38％，具有可观量的氨基酸。除了糖原样多糖，(1-4)-、(1-6)
‑‑
d-葡聚糖和抗肿瘤多糖、香菇多糖、(1-3)-、(1-6)
‑‑
键合的杂葡聚糖、杂半乳聚糖、杂甘露聚糖、木葡聚糖等已经被识别出。在存在的游离糖中包括海藻糖、甘油、甘露醇、阿拉伯糖醇、甘露糖和阿拉伯糖。在香菇蘑菇中，膳食纤维由水溶性材料(例如β-葡聚糖和蛋白质)和可仅用盐、酸和碱提取的水不溶性物质组成，所述水不溶性物质例如多糖醛酸苷(酸性多糖)、半纤维素、具有杂糖链的β-葡聚糖、木质素和壳多糖)，其作为细胞壁成分存在(bisen，p.s.等人，2010)。关于香菇蘑菇中抗癌成分的识别，从子实体中分离出抗肿瘤多糖并命名为香菇多糖。其结构被证实为β-(13)-葡聚糖(c6h10o5)n，具有的平均分子量为5
×
105kda。香菇多糖已被确定为香菇蘑菇中的主要抗肿瘤活性成分。然而，哺乳动物缺乏消化香菇多糖所需的酶β-13-葡聚糖酶，并且据报道分解的香菇多糖和纯化的香菇多糖在口服施用时不具有抗肿瘤活性(fang，nianbai等人，2006)。
[0113]
临床前研究：据报道口服香菇蘑菇子实体对一些肿瘤类型具有抗癌作用，并且这些作用似乎是菌株特异性的。含有香菇蘑菇的饮食显著减少雌性icr小鼠中的肉瘤-180细胞和c3h小鼠中的mm-46癌的生长，但对其他肿瘤类型诸如b-16黑色素瘤、lewis肺癌或meth-a纤维肉瘤的生长几乎没有影响。此外，发现香菇饮食的抗癌作用伴随着巨噬细胞的活化以及nk和杀伤t细胞的细胞毒性作用增加，表明这种肿瘤抑制活性的一种可能机制可能涉及增强免疫监视(fang，nianbai等人，2006)。
[0114]
药理学活性-炎症和癌症：香菇蘑菇已被描述为具有抗病毒、抗生素、抗炎、抗高血压和抗癌性质，并且作为健康食品在东方流行数千年并且最近在西方流行(fang，nianbai等人，2006)。
[0115]
香菇由于其免疫调节作用而引起了许多关注。香菇多糖是众所周知的一类生物反应调节剂(brm)。观察到施用香菇多糖后增强nk(自然杀伤细胞)、ctl(细胞毒性t淋巴细胞)、lak(淋巴因子激活的杀伤细胞)活性和抗肿瘤抗原的dth(迟发型超敏反应)反应。这些活性负责香菇多糖的抗肿瘤作用(bisen，p.s.等人，2010)。
[0116]
临床前和临床剂量
[0117]
[0118][0118][0119]
灵芝(reishi(ganoderma lucidum))
[0120]
背景：灵芝(reishi)是担子菌纲，属于多孔菌科的无片层真菌。在大自然中，它生长在高湿度和昏暗光照的茂密树林的山上。它很少被发现，因为它主要在死李子、锯叶葛或帕斯尼亚树的干燥树干上生长。在10,000株这样的老化树中，也许2株或3株将具有灵芝生
长，因此它确实非常稀少。灵芝在保健食品行业中的地位是无与伦比的。这是5000年来东西方知识和智慧的顶峰。30多年的现代科学研究已经证明了其作为健康食品和作为高效药物的有效性。在所有人中，灵芝可以安全地声称完全没有副作用。
[0121]
灵芝(ganoderma lucidum)是一种被亚洲医生和自然路径广泛使用和推荐的天然药物，因为其对免疫系统的支持作用。实验室研究和少量临床前试验表明g.lucidum具有有希望的抗癌和免疫调节性质。在癌症患者中，使用g.lucidum作为替代药物的普遍性正在增加(jin，xingzhong，等人，2012)。
[0122]
在传统医学中的用途：灵芝(ganoderma lucidum)在中国、韩国和日本已被用作医疗药物几个世纪。这种食用菌被认为可以保护人类的生命力并促进长寿。此外，灵芝(ganoderma lucidum)已用于治疗各种人类疾病，诸如过敏、关节炎、支气管炎、胃溃疡、高血糖症、高血压、慢性肝炎、肝病、失眠、肾炎、神经衰弱、硬皮病、炎症和癌症(daniel sliva，2003)。
[0123]
提取方法：在室温下用乙醇(95％，1l)提取灵芝(ganoderma lucidum)子实体碎片(1kg)24小时，得到35g固体提取物。将乙醇提取物悬浮于氯仿中，用饱和nahco3溶液提取。然后收集nahco3相并用冷hcl溶液(6n)调节至ph3。通过氯仿提取所得沉淀物，并且获得10.9g呈黄色固体的乙醇可溶性和酸性组分(esac)(hu，hongbo，等人，2002)。
[0124]
根据制造商的技术公告，reishimax glp
tm
的活性成分被标准化为13.5％的多糖(β-1，3-葡聚糖)和6％的三萜(灵芝酸等)，这是可提取活性的最高水平，而剩余的80％由核苷、脂肪酸和氨基酸组成。将粉末状提取物用95％乙醇超声处理30分钟，并通过使用无水乙醇连续超声处理进一步提取上清液。在减压下从滤液中回收水不溶性棕色粉末，即gle(通过0.45μm聚丙烯过滤器)(yuen，john wm等人，2007)。
[0125]
将从中国南方收集的灵芝(g.lucidum)子实体洗涤，分解，并如前所述用70℃的热水提取两次，持续3小时。34合并所有热水提取物，并通过加入75％(体积/体积)160gao et al.乙醇沉淀富含ps的级分。使用填充有sephadex g-25的1.6-100-cm柱，通过高效阴离子交换和凝胶过滤色谱进一步纯化富含ps的级分(gao，yihuai，等人，2005)。
[0126]
生物活性化合物：灵芝(reishi)的有效性归因于多糖级分(fraction)，其负责刺激免疫系统，或归因于三萜，其显示出针对多种癌症的细胞毒活性(suarez-arroyo，ivette j.，等人，2013)。
[0127]
生物活性的灵芝多糖主要以β-d-葡聚糖形式存在，而来自灵芝(ganoderma lucidum)的抗肿瘤活性主要以支链(1
→
3)-β-d-葡聚糖形式存在。
[0128]
主要生物活性成分：已经发表了300多篇关于化学成分灵芝(g.lucidum)和相关物种的报告。灵芝(g.lucidum)的子实体、菌丝体和孢子含有约400种不同的生物活性化合物，其主要包括三萜类、甾醇、类固醇、脂肪酸、蛋白质、肽和微量元素(babu，p.dinesh和r.s.subhasree，2008)。
[0129]
临床前研究：灵芝(ganoderma lucidum)是一种药用蘑菇，据报道在小鼠中具有抗肿瘤活性。进一步的研究表明g.lucidum的灵芝多糖(ps)级分参与这种抗肿瘤作用。12，13g.lucidum ps能够激活巨噬细胞、t淋巴细胞和nk细胞，并在体外使用人免疫细胞和在体内在小鼠中诱导细胞因子诸如肿瘤坏死因子(tnf)-α、白细胞介素(il)和干扰素(ifn)的产生。
[0130]
药理活性-炎症和癌症：灵芝(ganoderma lucidum)抑制组成性活性转录因子核因子kappab(nf-κb)和ap-1，从而这导致抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)及其受体upar的表达。灵芝(ganoderma lucidum)还抑制高侵袭性乳腺癌和前列腺癌细胞的细胞粘附和细胞迁移，表明其具有降低肿瘤侵袭性的效力。因此，灵芝(ganoderma lucidum)在使用癌细胞的实验中清楚地显示出抗癌活性，并且作为用于乳腺癌和前列腺癌的替代疗法的膳食补充剂具有可能的治疗潜力(daniel sliva，2003)。灵芝(reishi)处理的肿瘤显示e-钙粘蛋白、mtor、eif4g和p70s6k的表达降低，以及细胞外调节激酶(erk1/2)的活性降低。灵芝(reishi)通过影响作用于翻译的存活和增殖信号传导途径来抑制蛋白质合成和肿瘤生长，表明灵芝(reishi)是乳腺癌和其他癌症的潜在天然治疗剂(suarez-arroyo，ivette j.，等人，2013)。
[0131]
来自灵芝(ganoderma lucidum)的多糖的活性被认为是通过与β-葡聚糖结合的补体受体3型(cr3受体)介导的。来自蘑菇的多糖的活性被证明通过刺激自然杀伤细胞、t细胞、b细胞和巨噬细胞依赖性免疫系统反应激活宿主生物体的免疫反应而间接地阻止肿瘤发生和肿瘤转移。从新鲜灵芝(ganoderma lucidum)子实体分离的多糖(ps-g)刺激从人单核-巨噬细胞产生白细胞介素(il)-1β、肿瘤坏死因子(tnf)-α、il-6和从t淋巴细胞产生干扰素(ifn)-γ。此外，这些ps-g诱导的细胞因子抑制了人白血病细胞的增殖和克隆形成。ps-g还通过激活磷脂酰肌醇(pi)3-激酶/akt途径抑制自发的和fas介导的细胞凋亡来增强人中性粒细胞的免疫应答并引起抗肿瘤作用。此外，ps-g通过促分裂原活化蛋白激酶(mapk)和蛋白激酶c(pkc)途径增强嗜中性粒细胞的吞噬活性。此外，来自灵芝(ganoderma lucidum)的多糖表现出化学预防作用，其由谷胱甘肽s-转移酶(gst)活性的诱导而介导(daniel sliva，2003)。
[0132]
此外，已经从灵芝(ganoderma lucidum)中分离出了超过100种高度氧化和药理学活性的羊毛甾烷型(lanostane-type)三萜。
[0133]
临床前和临床剂量
[0134][0135][0136]
巴西蘑菇(agaricus blazei murill)
[0137]
背景：来自巴西雨林的药用蘑菇巴西蘑菇(agaricus blazei murill)已被用于传统医学和作为健康食品用于预防一系列疾病，包括感染、过敏和癌症。其他科学家和我们已
经检查了这种假设背后是否有科学证据。巴西蘑菇(agaricus blazei m)富含免疫调节多糖、β-葡聚糖，并且已经显示除了在炎症性肠道病患者中的抗炎作用之外，还在小鼠模型中具有抗肿瘤、抗感染和抗过敏/哮喘性质。这些作用是通过蘑菇对先天免疫细胞(诸如单核细胞、nk细胞和树突细胞)的刺激以及偏斜的th1/th2平衡和炎症的改善来介导的(hetland，geir，等人，2011)。
[0138]
在传统医学中的用途
[0139]
巴西蘑菇(agaricus blazei)是在日本广泛食用和开处方的医学上重要的蘑菇。
[0140]
巴西蘑菇(agaricus blazei)传统上用作预防癌症、糖尿病、高脂血症、动脉硬化和慢性肝炎的健康食品。
[0141]
根据传说，该地区的老年人比邻近社区的老年人患有更少的严重疾病，这可能是由于使用巴西蘑菇(agaricus blazei)作为食物的原因。除了癌症和慢性肝炎之外，这种蘑菇已用于对抗多种疾病的民间医学，包括糖尿病、动脉硬化和高脂血症(hetland，geir等人，2008)。
[0142]
提取方法：用热水、冷naoh、然后用热naoh重复提取(ohno，naohito等人，2001)。提取热水溶性级分。将菌丝体级分(100g)用热水(500毫升)提取3次，持续3小时。过滤悬浮液以除去不溶性物质。在减压下蒸发水性提取物后，向提取物中加入等体积的乙醇，并通过以8000rpm离心20分钟收集沉淀的多糖。将粗多糖溶于水中，并用蒸馏水透析。再次向透析液中加入等体积的乙醇，并将悬浮液以10000rpm离心20分钟。将获得的多糖级分溶解并冻干，并且此后称为热水可溶性(hws)级分。
[0143]
从hws级分中分离抗肿瘤多糖：将hws级分(100mg)溶于100毫升水中。将溶液加入到100％饱和(nh4)2so4中用于盐析，然后以120x g离心15分钟。通过纤维素管将上清液(fa)和沉淀物(fb)对蒸馏水透析。将该透析液蒸发至小体积，然后冻干。将fa水溶液(5mg)在deae-sepharose cl-6b柱(5.2
×
38cm)上进行离子交换色谱，逐步洗脱各2000ml含有0.5m和1m nacl的蒸馏水，然后用0.1n naoh洗脱。第二次阴离子交换层析在相同的柱上进行，梯度洗脱在蒸馏水中的0和2m nacl之间。使用蒸馏水作为洗脱剂，在sepharose 4b柱(1.6
×
90cm)上进一步分离活性级分(mizuno，masashi，等人，1999)。
[0144]
用氯仿/甲醇(1:1，v/v)(2l 3 3)直接回流提取1kg巴西蘑菇(a.blazei)干菌体3小时。在减压下浓缩氯仿/甲醇萃取物，得到棕色萃取物(250g)。将氯仿/甲醇提取物(200g)分成丙酮可溶性(160g)和不溶性(40g)级分(fractions)。将丙酮可溶性级分(35g)进一步分成正己烷不溶性级分(16g)和正己烷可溶性级分(14g)。将正己烷不溶性级分(15g)在硅胶柱上进行色谱分离，并分离出麦角甾醇(2.4g)作为活性物质(takaku takeshi等人，2001)。
[0145]
将破碎的干燥子实体(3kg)在70-80℃下在回流下用80％乙醇提取22小时。离心并除去不溶性级分后，将可溶性级分(～200g)冷冻干燥并指定为级分1。然后将不溶性物质(约2.5kg)在80-90℃下用水回流提取22小时，将水溶性级分(约250g)称为级分2。通过在回流下加热12小时，用5％草酸铵萃取水不溶性残余物(～2kg)三次。将约20升可溶于5％草酸铵的级分浓缩至4升。将2升该浓缩级分在截留分子量为5kda的millipore过滤器(pericon minicassette)上超滤并冷冻干燥。将该冷冻干燥的级分(最终产物，711g)指定为级分3。将冷冻干燥的不溶性残余物(309g)指定为级分4(oshiman，ko-ichi等人，2002)。
[0146]
生物活性化合物
[0147]
巴西蘑菇(agaricus blazei)源自巴西，是其子实体中含有的几种抗肿瘤多糖的来源。这些多糖包括b-(1，6)；b-(1，3)葡聚糖、酸性b-(1，6)；a-(1，3)葡聚糖和酸性b-(1，6)；a-(1，4)葡聚糖。与大多数蘑菇葡聚糖相比，上述葡聚糖具有b-(1，6)吡喃葡萄糖主链，而不是更常见的b-(1，3)链接的主链。子实体还含有380,000da的抗肿瘤水溶性蛋白葡聚糖，其具有为4：1比例的a-(1，4)葡聚糖主链和b-(1，6)吡喃葡萄糖苷分支，以及含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖的两种免疫刺激性杂葡聚糖，一种由葡萄糖和核糖以及木葡聚糖(xyloglucan)组成。在生物反应器中的浸没培养物中，巴西蘑菇(a.blazei)还可以合成具有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和核糖基团以及非常高的分子量(1000，000
–
10000，000da)的细胞外蛋白葡聚糖，其表现出显著的抗肿瘤性质(giavasis ioannis，2010)。
[0148]
临床前研究:β-葡聚糖具有已知的抗肿瘤特性，蛋白聚糖和麦角甾醇(巴西蘑菇(a.blazei)的两种其他成分)也是如此。巴西蘑菇(a.blazei)的明显抗肿瘤作用是由于β-1，3-葡聚糖。此外，从巴西蘑菇(a.blazei)提取的β-1，6-葡聚糖在小鼠中诱导肿瘤消退，并且每天补充来自巴西蘑菇(a.blazei)的β-葡聚糖在小鼠模型中减少卵巢和肺癌细胞的自发转移。此外，在小鼠模型中，从巴西蘑菇(a.blazei)分离的β-葡聚糖-蛋白复合物显示出对meth a纤维肉瘤具有抑制作用(hetland，geir等人，2008)。
[0149]
药理活性-炎症和癌症：巴西蘑菇(agaricus blazei)富含免疫调节物质，诸如高度分支的β1，3-/1，6-葡聚糖和蛋白聚糖(proteoglycans)。这些是先天免疫系统的单核细胞、树突细胞(dc)、粒细胞和nk细胞上的cd11b/18(补体受体3，cr3)、dectin-1和toll样受体2(tlr2)的已知配体。巴西蘑菇(agaricus blazei)还显示含有分别诱导白血病细胞凋亡和抑制肿瘤诱导的血管生成的蘑菇素和麦角甾醇(维生素原d2)，以及具有有效降血糖作用的异黄酮类化合物，其可用于抗糖尿病。据报道，abm在纤维肉瘤、骨髓瘤、卵巢癌、肺癌和前列腺癌的小鼠模型中以及在针对妇科癌症(增加的nk细胞活性和生活质量)和白血病的人类研究中具有抗肿瘤性质(hetland，geir等人，2011)。
[0150]
临床前和临床剂量
[0151]
[0152]
[0153]
[0154][0155]
白桦茸(chaga)(桦褐孔菌(inonotus obliquus))
[0156]
背景：桦褐孔菌蘑菇(桦褐孔菌(inonotus obliquus))是一种白腐真菌，其属于担子菌属的膜囊菌科(hymenochaetaceae)。在俄罗斯、西伯利亚西部、亚洲和北美，桦褐孔菌蘑菇已被用于治疗癌症的民间药物中。已经表明，桦褐孔菌蘑菇含有许多多酚化合物并显示出各种生物活性，包括抗细菌、肝保护和抗肿瘤性质(ham，seung-shi等人，2009)。
[0157]
在传统医学中的用途：桦褐孔菌蘑菇在俄罗斯和西伯利亚西部已被用作民间药物，用于预防和治疗胃疾病甚至癌症。桦褐孔菌据称基于其生物活性化合物对人类健康具有多种天然有益特性，诸如抗细菌、抗过敏、抗炎和抗氧化剂(kang，ju-hee等人，2015)。它还用于预防和治疗心脏、肝脏和胃疾病以及结核病。此外，自16世纪以来，它在俄罗斯、波兰和许多波罗的海国家传统上用于治疗胃肠癌、心血管疾病和糖尿病(kim，yu jin等人，2011)。
[0158]
提取方法：将桦褐孔菌(inonotus obliquus)样本干燥、粉碎并储存在-20℃。将粉末状样品(500g)用3l甲醇(99.8％)在45-50℃萃取两次，持续3小时。然后将甲醇级分(45g)旋转蒸发，乳化，溶于水中，并用乙酸乙酯(h2o:etoac，5:7，v/v)萃取三次。旋转蒸发后获得乙酸乙酯级分(12g)，并将干燥的萃取物在甲醇中重构。用与二氯甲烷混合的硅胶(60g，230-400目)对该储备溶液进行真空色谱(n-2n，eyela，tokyo，日本)。使用的流动相是二氯甲烷和具有在二氯甲烷中的递增甲醇(0-100％)梯度的甲醇，并且在下一次运行之前用100％二氯甲烷再平衡柱3分钟。通过tlc证实分馏分离的成功。在三个乙酸乙酯提取物级分中，选择最具生物活性的级分，即vchg-级分1，并使用含有与h2o:meoh(1:30，v/v)混合的lichroprep rp-18(25-40μm)的反相柱(ods-c18)进行反相(ods-c18)柱色谱，梯度程序范围为30％甲醇至100％甲醇(流动相a：甲醇；流动相b：超纯水)。分离出四个级分，其中级分2含有最大的生物活性。通过使用含有与二氯甲烷混合的硅胶(200g，70-230目；默克公司(merck co.))的正相硅胶柱(2.4cm
×
15cm)的色谱法进一步分馏级分2，通过范围为100％二氯甲烷至50％甲醇的流动相梯度洗脱。流速为1.0ml/min。这产生两个子级分，指定为子级分1和2，两者都显示出生物活性。将子级分1和2中的化合物结晶，并通过测定其ms(jeol)、1h nmr和13c nmr(bruker drx 500mhz)谱进行分析(ham，seung-shi等人，2009)。
[0159]
用甲醇(meoh)提取桦褐孔菌(i.obliquus)的菌核(1.3kg)六次，得到提取物(67.5g)，将其依次用正己烷、ch2cl2和乙酸乙酯(etoac)分配。将ch2cl2级分(24g)进行硅胶柱色谱，并用chcl3/etoac梯度系统(50:1
→
1:1)洗脱，得到十三个级分(fr.mcl～13)。将化合物1(105.2mg)在chcl3和meoh溶剂下从级分mc3中重结晶。用正己烷/etoac(10:1
→
1:1)的梯度洗脱对级分mc5进行重复柱色谱，得到10个子级分(fr.mc5-1～mc5-10)。将化合物2
(9.1mg)在chcl3和meoh溶剂下从级分mc5-5中重结晶，得到白色晶体。将级分mc5-6(58mg)用正己烷/etoac梯度(etoac在正己烷中5-100％经70min，100％经10min)进行mplc以得到化合物3(7.1mg)，并将级分mc5-10(13mg)用0.1％三氟乙酸水溶液/meoh梯度(meoh在水中50-80％经5min，80-100％经15min，100％经25min)进行半制备型hplc以得到化合物4(2.2mg)。在chcl3和meoh溶剂下，分别从级分mc7和mc10中重结晶化合物5(301.5mg)和6(8.7mg)。将级分mc9进行硅胶柱色谱，用正己烷/etoac(15:1
→
1:1)梯度洗脱，得到17个子级分(fr.mc9-1～mc9-17)。用0.1％三氟乙酸水溶液/meoh梯度(meoh水溶液50-80％经5分钟，80-100％经15分钟，100％经25分钟)对级分mc9-14进行半制备型高效液相色谱(hplc)，得到化合物7(2.7mg)和8(3.2mg)。将etoac级分(12.4g)进行sephadex lh-20柱色谱，并用100％meoh洗脱，得到十个级分(fr.e1～10)。将级分e4(750mg)进行硅胶柱色谱，用正己烷/etoac(8:5
→
1:2)梯度洗脱，得到10个子级分(fr.e4-1～e4-10)。将化合物9(2.4mg)从级分e4-3分离，并将级分e4-5进行半制备型hplc，用水/meoh梯度(meoh水溶液20-80％经30分钟，80-100％经5分钟，100％经5分钟)，得到化合物10(1.2mg)(kim，yu jin等人，2011)。
[0160]
将干燥的桦褐孔菌蘑菇(8kg)用95％乙醇在回流下萃取3次，每次4小时。将萃取物过滤并真空蒸发，得到乙醇萃取物(212.95g)。然后将该乙醇提取物悬浮在蒸馏水中，并依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇分配。将正己烷级分(28g)在硅胶柱上使用己烷-etoac梯度系统(30:1-15:1-8:1-4:1-1:1，v/v，2l)进行色谱分离，得到11个级分(级分1-11)。通过用1l溶剂洗脱获得级分1-10。级分11用己烷-etoac(0:100，v/v，2l)洗脱。级分15(360mg，白色晶体)最后通过级分10(650mg)的重结晶纯化。通过nmr分析进行级分15的鉴定。级分15的化学结构通过1h nmr确认(kang、ju-hee等，2015)。通过在200ml温水(40℃)中提取粉末状子实体(10gm)来制备来自桦褐孔菌(ioae)的水性提取物(mishra，s.k.等人，2013)。
[0161]
生物活性化合物：在先前对这种蘑菇的化学成分的研究中，据报道羊毛甾烷型三萜类化合物，诸如桦褐孔菌醇(inotodiol)、栓菌酸(trametenolic acid)和inonotsuoxides具有抗肿瘤和抗真菌活性。在这种蘑菇中也发现了一些酚类化合物(kim，yu jin等人，2011)。
[0162]
桦褐孔菌(i.obliquus)含有优异的生物活性化合物。3β-羟基-羊毛甾-8，24-二烯-21-醛已经从桦褐孔菌(i.obliquus)中鉴定出来，并且已经报道了来自桦褐孔菌(i.obliquus)的食用蘑菇的高分子量、水溶性、木质素样物质抑制1型人免疫缺陷病毒的蛋白酶。据报道，从桦褐孔菌(i.obliquus)菌核中分离的桦褐孔菌醇(inotodiol)在使用7，12-二甲基-苯并[α]蒽对小鼠皮肤进行的两阶段致癌试验中具有抑制作用。桦褐孔菌(i.obliquus)的热水提取物对人结肠癌细胞(ht-29)的增殖发挥抑制活性。子级分1和2分别为3β-羟基-羊毛甾8，24-二烯-21-醛和桦褐孔菌醇(inotodial)，这些化合物具有抗突变和抗氧化活性。此外，子级分3具有抗诱变和抗氧化活性(chung，mi ja等人，2010)。
[0163]
临床前研究：桦褐孔菌(chaga)水性提取物在体外和体内抑制结肠直肠癌细胞的增殖。它激活细胞凋亡的线粒体内在途径，诱导自噬和s期细胞周期阻滞。桦褐孔菌(chaga)水性提取物可抑制inos、cox-2和促炎细胞因子的表达，改善肠上皮细胞炎症。此外，它下调β-连环蛋白和nf-κb信号传导，其在结肠直肠癌细胞中发挥抗增殖和抗炎活性(mishra，s.k.，等人，2013)。
[0164]
药理学活性-炎症和癌症：过氧化麦角固醇(ergosterol peroxide)不仅抑制细胞
增殖，而且抑制具有不同易感性的hct116、ht-29、sw620和dld-1crc细胞系中的克隆形成集落形成。在这些crc细胞系中观察到的生长抑制是细胞凋亡的结果。麦角甾醇过氧化物抑制β-连环蛋白的核水平，这最终导致c-myc、细胞周期蛋白d1和cdk-8的转录降低。c-myc、细胞周期蛋白d1和cdk-8是β-连环蛋白的重要下游靶标，其调节恶性肿瘤，包括癌症中的细胞周期和细胞凋亡(kang，ju-hee等人，2015)。ioae以剂量依赖性方式激活人癌细胞系中的半胱天冬酶-9，如通过降低的前半胱天冬酶-9水平和增加的切割的半胱天冬酶-9的积累所观察到的那样。ioae随后活化半胱天冬酶-3并切割其核底物聚(adp-核糖)聚合酶(parp)(mishra，s.k.，等人，2013)。
[0165]
临床前和临床剂量
[0166]
[0167][0168]
cbd
[0169]
背景：大麻是一组至少66种统称为大麻素的化合物的独特来源。其中，关于大麻的主要精神活性成分δ
9-四氢大麻酚(δ
9-thc)的药理学和关于缺乏精神活性的大麻二酚(cbd)的大部分是已知的。还发现了大麻素受体的内源性激动剂。cb1受体存在于中枢和外周神经元的末端，在那里它们调节递质释放。它们也存在于一些非神经元细胞中。cb2受体主要由免疫细胞表达，其作用之一是改变细胞因子释放。cbd对cb1和cb2受体的亲和力比δ
9-thc低得多，并且其药理学作用尚未得到很好的表征。
[0170]
cb1和cb2受体都通过gi/o蛋白偶联，与腺苷酸环化酶负偶联，与丝裂原活化蛋白激酶正偶联。cb1受体还通过gi/o蛋白与某些离子通道偶联，与a型和内向整流钾通道正偶联，与n型和p/q型钙通道以及d型钾通道负偶联。cb1受体还可以通过gs蛋白起作用以激活腺苷酸环化酶。已经提出了大麻素cb1和cb2受体的另外的信号传导机制，并且这些的描述可以在其他地方找到(pertwee，roger g，2004)。令人信服的证据表明，大麻素的使用或大麻素受体和内源性大麻素系统的操作可能对许多疾病有益，包括疼痛、多发性硬化中的痉挛状态和震颤、动脉粥样硬化、炎症性肠道病和癌症。cbd和富含cbd的大麻提取物的潜在临床应用包括产生抗炎和神经保护作用，控
[0171]
制癫痫、焦虑症、青光眼和恶心，以及调节δ
9-thc的一些作用。
[0172]
cbd被证明可拮抗thc的一些不良作用，包括中毒、镇静和心动过速，同时其本身具有镇痛、止吐和抗癌特性。在现代临床试验中，这允许施用更高剂量的thc，为基于大麻的提取物在治疗痉挛状态、中枢性疼痛和多发性硬化中的下尿路症状以及睡眠障碍、外周神经性疼痛、臂丛撕脱症状、类风湿性关节炎和顽固性癌症疼痛中的临床功效和安全性提供了证据。进一步查验全大麻提取物在神经保护、药物依赖性和肿瘤疾病中的未来应用前景。thc和cbd的组合增加临床功效同时减少不良事件的假设得到支持(russo，ethan和geoffrey w.guy，2006)。
[0173]
在传统医学中的用途：大麻(cannabis sativa l.)(大麻科(cannabaceae))在中国作为纤维和种子作物的利用历史悠久，并且其瘦果(“种子”)以及其他植物部分已经在中国医学文本中记录了近2000年。虽然大麻在中药中的主要应用围绕瘦果的使用，但是针对雌性花序和其他植物部分的古代适应症包括诸如疼痛和精神疾病的病症，这些病症是当前对大麻素如大麻二酚(cbd)和δ9-四氢大麻酚(thc)的研究的主题(brand，e.joseph和zhongzhen zhao，2017)。
[0174]
提取方法：在室温下用co2提取大麻干燥的花和叶，得到提取物，其蒸发至干燥，为褐色固体。将一部分提取物溶于甲醇中，使用c18柱(150mm
×
4.6mm，1ml/min流速)进行hplc分析(agilent 1100)(zhu js等人，1998)。
[0175]
临床前研究：cbd基于其针对肿瘤细胞的体外和体内活性而被认为是抗肿瘤剂。然而，cbd介导这种活性的确切分子机制尚未阐明。cbd诱导乳腺癌细胞的细胞死亡，独立于大麻素和缬氨酸受体的激活。电镜显示与自噬和细胞凋亡共存一致的形态。western印迹分析证实了这些发现。cbd诱导内质网应激，随后抑制akt和mtor信号传导，如由磷酸化mtor和4ebp1以及细胞周期蛋白d1的水平降低所示。进一步分析自噬和凋亡信号传导途径之间的串扰，我们发现beclin1在mda-mb231乳腺癌细胞中诱导cbd介导的细胞凋亡中起核心作用。尽管cbd增强beclin1与vps34之间的相互作用，但其抑制beclin1与bcl-2之间的缔合。此外，cbd降低线粒体膜电位，触发bid向线粒体的易位，细胞色素c向胞质溶胶的释放，并最终激活乳腺癌细胞中的固有凋亡途径。cbd增加活性氧(ros)的产生，并且ros抑制阻断细胞凋亡和自噬的诱导。我们的研究揭示了cbd处理的乳腺癌细胞中细胞凋亡和自噬之间的复杂相互作用，并突出了继续研究cbd作为抗肿瘤剂的潜在用途的价值。
[0176]
药理学活性-炎症和癌症：大麻二酚(cbd)，大麻的主要非精神活性成分，基于其针对肿瘤细胞的体外和体内活性而被认为是抗肿瘤剂。大麻素可以调节对癌症生长和扩散至关重要的信号传导途径。它们抑制细胞周期进程和趋化性，并阻断血管生成。cbd对神经胶质瘤具有细胞毒性并在体外抑制肿瘤细胞迁移。此外，cbd通过激活经典半胱天冬酶途径并增强nox4和p22(phox)功能来诱导人白血病细胞系中的细胞凋亡。最近的研究报道cbd抑制乳腺癌生长并下调id1，id1是乳腺癌细胞系中转移的调节剂。此外，cbd与thc联合在神经胶质瘤细胞中诱导程序性细胞死亡(pcd)(shrivastava，ashutosh等人，2011)。此外，大麻素诱导腺苷酸环化酶的抑制，影响离子通道，并刺激细胞外信号调节激酶(erk)、c-jun n-末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶，表明它们可能在细胞存活或死亡决定中起一般作用(vaccani，angelo等人，2005)。
[0177]
临床前和临床剂量
[0178][0179]
[0180]
thc
[0181]
背景：近年来，大麻素(大麻的活性成分，大麻)及其衍生物作为一系列常见疾病的新型治疗剂已经引起了强烈的关注。确定了大麻的主要活性成分δ
9-四氢大麻酚(thc)的鉴定，导致发现大麻素通过激活特异性细胞表面g蛋白偶联的大麻素受体cb1和cb2起作用。cb1受体在脑中特别丰富，并且cb2受体在免疫系统的细胞中高度表达。δ
9-thc的许多作用由大麻素受体介导，其中至少两种类型cb1和cb2存在于哺乳动物组织中。
[0182]
大麻素已被提出作为新的癌症治疗剂，主要是由于它们在许多不同的肿瘤细胞类型中诱导细胞凋亡的能力。thc是大麻的精神活性成分。此外，thc通过模拟内源性化合物，内源性大麻酚类花生四烯酸乙醇胺(endocannabinoids anandamide)和2-花生四烯酰甘油，其激活特异性大麻素受体，发挥多种生物效应。
[0183]
大麻素已经成功地用于治疗一些副作用，例如通常伴随癌症的恶心和呕吐、体重减轻、食欲缺乏和疼痛。δ
9-thc(屈大麻酚(dronabinol))和ly109514(大麻隆(nabilone))被批准用于治疗与癌症化疗相关的恶心和呕吐。尽管大麻素用于癌症的姑息治疗，但它们尚未用作肿瘤进展本身的治疗。
[0184]
thc在肿瘤学中未来可能使用的主要限制可能表现为主要在中枢神经系统水平的不良反应，主要由知觉异常、偶尔幻觉、烦躁不安、思维异常、人格解体和嗜睡组成(ligresti，alessia等人，2006)。
[0185]
在传统医学中的用途：来自大麻的提取物已被用于医学和娱乐目的达几个世纪。
[0186]
提取方法：收获由种子和谷壳组成的大麻；将谷壳与种子分离；用溶剂提取谷壳，从而产生提取物，如果需要，将提取物通过色谱柱，该色谱柱设置成从提取物中分离出δ
9-thc(webster，gr barrie，2002)。
[0187]
δ
9-thc通过逆流分配从大麻(hashish)中获得：自动组装-200个单位(cells)，10ml上相和下相任一，溶剂系统：石油醚/甲醇/二甲基甲酰胺/水，10:8:2:1。蒸发并用石油醚萃取残余物后，分离出δ
9-thc，为流动的无色油状物[α]
25
d-141
°
(etoh；c＝3.16w/w)。它是δ
9-thc与7.90/o w/w二甲基甲酰胺的混合物，其通过酚基的氢键键合保持。通过smr-信号的积分和在二甲基甲酰胺中用异丙醇锂滴定thc来测量二甲基甲酰胺的含量。为了除去酰胺，将混合物溶解在50-100倍量的ccl4中并与水振荡两次。分离有机层，在冷却下在减压下除去溶剂。所得粘性油在暴露于空气和光后不久变暗(silva，m.teresa a。等人，1968)。
[0188]
临床前研究：肿瘤细胞的生长和存活通常取决于通过调节细胞存活和增殖的途径增加的信号传导。这些中的两种包括mapk信号传导途径(ras/raf-mapk，细胞外信号调节激酶(erk1/2))和pi3k/akt途径。cb1和cb2大麻素受体都通过异源三聚体gi/o-蛋白与这些途径偶联。在用人类cb1转染的中国仓鼠卵巢(cho)细胞中，cp 55940(高效非选择性cb1和cb2激动剂)以时间和浓度依赖性方式增加p42/p44mapk活性，并且这被cb1拮抗剂/反向激动剂sr141716a逆转[26]。此外，mapk的活化被百日咳毒素阻断，因此表明cb1和mapk之间的信号转导涉及gtp结合蛋白。当用cb2转染cho细胞时，观察到类似的结果，因为cp 55940增加p42/p44 mapk活性，并且该作用被sr144528(cb2选择性拮抗剂)和百日咳毒素阻断。来自这些研究的结果表明，cb1或cb2受体的活化导致通过mapk途径的信号传导增加(alexander amy等人，2009)。
[0189]
药理学活性-炎症和癌症：已经显示thc在几种肿瘤细胞类型中诱导细胞凋亡。越
来越多的证据表明大麻素可能能够选择性地靶向肿瘤细胞，至少部分地通过控制细胞存活和细胞凋亡的信号传导途径的差异调节。然而，大麻素的抗肿瘤作用的潜在机制尚未完全了解，并且证据表明这些作用可能是细胞类型特异性的。据报道由大麻素正或负调节的两种信号传导途径(取决于细胞类型和所研究的大麻素)是ras-mapk/erk途径和pi3k-akt途径(greenhough，alexander等人，2007)。
[0190]
尽管当前文献中的一般共识表明大麻素具有抗癌作用，但有一些研究表明d9-thc在癌细胞中具有双相作用，其中较低浓度导致癌细胞增殖增加，而较高浓度导致细胞增殖减少。例如，100-300nm的d9-thc分别引起ncl-h292(肺癌)和u373-mg(成胶质细胞瘤)细胞的增殖速率增加1.2倍和2倍。相比之下，较高浓度的d9-thc(4-10 1m)具有细胞毒性并且增加凋亡细胞的数量(30-80％)。众所周知，大麻素可以通过cb2活化引起免疫系统的抑制(alexander amy等人，2009)。
[0191]
临床前和临床剂量
[0192]
[0193]
[0194][0195]
在体外测试包含蘑菇提取物和大麻素的本发明的组合物的抗炎和抗癌作用。
[0196]
本研究的目的是评估：
[0197]
a.不同蘑菇提取物、thc和cbd对raw 264.7细胞的抗炎特性。
[0198]
b.不同蘑菇提取物、thc和cbd对panc-1和egl-1细胞的抗癌特性。
[0199]
本文上文提及的细胞系是：
[0200]
a.raw 264.7(-71
tm
)，鼠巨噬细胞(murine macrophage)(美国典型培养物保藏中心，罗克维尔(rockville)，md，usa)。
[0201]
b.panc-1(-1469
tm
)，人胰腺癌。
[0202]
c.egl-1人肝外胆管癌。
[0203]
在本文下文描述的测定中测试的蘑菇提取物是：
[0204]
a.冬虫夏草c
s-4(蘑菇科学(mushroom science)，批号w0001576，实验11/2020)。热水/酒精提取物。
[0205]
b.冬虫夏草-m(真蘑菇(real mushrooms))，批号18274，实验10/2020)。热水提取物。
[0206]
c.火鸡尾杂色psp(turkey tail colorius psp)(蘑菇科学(mushroom science)，批号1820004，实验07/2020)。热水/酒精提取物。
[0207]
d.火鸡尾(turkey tail)提取物((真蘑菇(real mushrooms))，批号18305，实验11/2020)。热水提取物。
[0208]
e.香菇(shiitake)(蘑菇科学(mushroom science)，批号1800401，实验01/2020)。热水/酒精提取物。
[0209]
f.巴西蘑菇(agaricus blazei)-全谱提取物(蘑菇科学(mushroom science)，批号w0000008，实验08/2020)。热水/醇提取物。
[0210]
g.白桦茸(chaga)(蘑菇科学(mushroom science)，批号w0001580，实验11/2020)。热水/酒精提取物。
[0211]
h.舞茸(maitake)(蘑菇科学(mushroom science)，lot#1802502，exp 11/2020)。热水/酒精提取物。
[0212]
i.cbd(大麻二酚(cannabidiol))，bol pharma，批号lg18086-36-2。coa
[0213]
j.地塞米松(west-ward pharmaceuticals corp，目录号0641-0367-25，批号108381，实验号10/2020)
[0214]
如下制备本文下文所述测定中使用的蘑菇提取物、大麻素溶液和生长培养基：
[0215]
蘑菇提取物：
[0216]
a.将总最终体积的2/3的用于注射的温水(42℃)加入干燥的蘑菇粉末中。
[0217]
b.将悬浮液涡旋并离心(4100rpm，rt，5min)。
[0218]
c.将含有水溶性级分的上清液分离到干净的管中。
[0219]
d.将etoh总最终体积的5％加入到沉淀中并涡旋以提取乙醇可溶性级分。加入适量水到最终体积。
[0220]
e.将悬浮液涡旋并离心。将所得上清液合并并再次离心以除去碎片，得到50mg/ml的最终浓度。
[0221]
f.使所得溶液通过细胞过滤器(40-70微米)。
[0222]
g.在载体(vehicle)(在wfi中的5％etoh)中制备两种另外的存备液(stocks):10mg/ml和2mg/ml。
[0223]
h.将所有测试品/载体以4μl添加到96μl培养基中的细胞中，得到最终工作浓度:
2mg/ml、0.4mg/ml和0.08mg/ml(0.2％etoh，4％wfi中)。
[0224]
大麻素溶液
[0225]
a.用载体(含有5％dmso的wfi)将thc-thc稀释至1875μm、500μm、100μm、25μm和2.5μm的浓度。所有测试thc存备液/载体都与细胞进行了1:15-1:5稀释，这取决于测定。
[0226]
b.将cbd(314.46g/mol)溶解在etoh中至10mg/ml(31.8mm)的浓度。通过将31.8mm乙醇溶液与5％dmso组合并用wfi稀释至500μm的最终浓度来制备500μm存备液。将所得溶液用载体(含有5％dmso的wfi)进一步稀释至浓度:500μm、375μm、125μm、25μm和2.5μm。将所有测试cbd存备液/载体与细胞进行了1:15-1:5稀释，这取决于测定。
[0227]
c.地塞米松(392.46g/mol)存备液10mg/ml(25.47mm)。用载体(含有5％etoh的wfi)将存备液进一步稀释至2.5μm、0.25μm和0.025μm的浓度。将所有地塞米松存备液以4μl添加到96μl培养基中的细胞中，产生100nm、10nm和1nm(在0.2％etoh和4％wfi中)的最终工作浓度。
[0228]
细胞培养基制剂：
[0229]
raw生长培养基：补充有10％胎牛血清(fbs)、4mm l-谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠和1％青霉素-链霉素溶液(ps)的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dulbecco'smodified eagle medium)(dmem)高葡萄糖。
[0230]
用lps和测试项目孵育细胞：
[0231]
a.在80％汇合时收获细胞，计数并重悬于生长培养基中至1
×
106/ml的最终浓度。
[0232]
b.将细胞悬浮液接种在96孔微量滴定板(1
×
105个细胞/100μl/孔)中。-如表1、表2和表3所示设计每个板。
[0233]
c.将细胞温育(37
±
10℃，5％co2)18-24小时。
[0234]
d.去除生长培养基；加入94μl培养基和4μl载体、测试项目和对照物。
[0235]
e.通过上下移液三次来混合所有孔的内容物。
[0236]
f.将板温育2小时(37
±
1℃，5％co2)。
[0237]
g.将lps(10μl，最终浓度为10 0ng/ml lps)添加到所有孔中。
[0238]
h.通过上下移液三次来混合所有孔的内容物。
[0239]
i.将板温育24
±
2h(37
±
1℃，5％co2)。
[0240]
j.从96-微量滴定板收集培养基:50μl用于no分泌测定，并且剩余的储存在-20℃中用于细胞因子分泌测定。
[0241]
实例1
[0242]
为了评估本发明组合物的抗炎特性，进行了与蘑菇提取物和大麻素一起孵育后来自raw细胞的一氧化氮(no)和细胞因子分泌的测定，以及活力测定。
[0243]
表1:*建议的测定设计(suggested assay design)
[0244][0245][0246]
*以红色标记的行是每个板设置(plate set up)
[0247]
**仅在cbd/thc板中
[0248]
表2：蘑菇提取物的板设置(4个蘑菇/板)
[0249][0250][0251]
表3：大麻素提取物的板(plate)设置
[0252][0253]
细胞增殖和活力(xtt测定)
[0254]
a.制备xtt反应溶液。
[0255]
b.向每个孔中加入50μl xtt反应溶液。
[0256]
c.将板在潮湿气氛(例如37℃，5％co2)中孵育。
[0257]
d.轻轻摇动板以使染料均匀分布在孔中。
[0258]
e.用分光光度计(elisa读数器)在450nm波长下相对于作为空白的背景对照测量样品的吸光度。
[0259]
f.为了测量参考吸光度(以测量非特异性读数)，使用620nm的波长以从450nm测量值中减去。
[0260]
g.所有孔中细胞的空闲吸光度为0.5-1.5。
[0261]
一氧化氮(no)试验(griess试验)
[0262]
a.使磺胺溶液和ned溶液平衡至室温(15-30分钟)。
[0263]
b.通过在培养基中以1：1,000稀释所提供的0.1m亚硝酸盐标准物，来制备1ml的100μm亚硝酸盐溶液。
[0264]
c.2列(16个孔)在非结合96孔板中指定用于亚硝酸盐标准参考曲线。将50μl测定培养基分配到b-h行的孔中(图1)。
[0265]
d.将100μl的100μm亚硝酸盐溶液加入到a行的剩余2个孔中。
[0266]
在板上立即进行一式两份的连续两倍稀释(50μl/孔)以产生亚硝酸盐标准参考曲线(100、50、25、12.5、6.25、3.13和1.56μm)
[0267]
e.将50μl磺胺溶液分配到所有实验样品和含有针对亚硝酸盐标准参考曲线的稀释系列的孔中。
[0268]
f.将板在室温下避光孵育5-10分钟。
[0269]
g.将50μl ned溶液分配到所有孔中。
[0270]
h.将板在室温下避光孵育5-10分钟。
[0271]
i.在30分钟内在具有520nm和550nm之间的滤光器的读板器中测量吸光度。
[0272]
j.认为no分泌的抑制仅在对细胞活力没有影响的浓度下相关(与载体对照相比，活力超过95％)。关于活力的代表性结果显示在图2中。
[0273]
结果：蘑菇提取物
[0274]
一氧化氮(no)分泌
[0275]
a.在2-3个独立实验中，灵芝、巴西蘑菇,冬虫夏草cs-4(2mg/ml)和冬虫夏草m(0.08mg/ml)是抑制no分泌(对细胞活力没有任何影响)的唯一有效的蘑菇。
[0276]
b.表4描述了用载体对照、蘑菇提取物处理后raw细胞的no分泌，以及no分泌抑制率(％)的计算(100％
–
无蘑菇/无载体*100％)。发现冬虫夏草m在抑制no分泌方面最有效，这似乎是剂量依赖性的。在用灵芝培养后也可以观察到显著的抑制，然而，仅在最高浓度(2mg/ml)下可以观察到抑制。
[0277]
c.在体外，似乎存在非常窄的活性范围(不影响细胞的活力)。
[0278]
d.火鸡尾、舞茸、香菇和白桦茸对no分泌没有影响(参见表4)。
[0279]
e.图3显示no分泌的代表性结果
[0280]
表4：对no分泌的抑制的总结*
[0281][0282][0283]
*蘑菇按最有效(顶部)和最不有效(底部)排列。
[0284]
细胞因子分泌
[0285]
a.将灵芝、冬虫夏草,巴西蘑菇,和冬虫夏草cs-4与105个raw细胞/孔以0.08-2mg/ml孵育24小时。
[0286]
b.一式两份收集来自细胞的培养基用于多重分析(ccl3/mip1α、il-6、il-1β、tnfα、il-10和il-6)。
[0287]
c.il-4、il-10和il-1β在这些条件下(在检测限下)不分泌。
[0288]
d.ccl3/mip-1α分泌高于检测限，即使当样品以1:20稀释时。
[0289]
e.il-6分泌表5描述了用载体对照、蘑菇提取物处理后raw细胞的il-6分泌，以及
il-6分泌的抑制率(100％-il-6蘑菇/il-6载体*100％)或il-6分泌的升高率(il-6蘑菇/il-6载体*100％-100％)的计算。
[0290]
f.tnfα分泌表6描述了用载体对照、蘑菇提取物处理后raw细胞的tnfα分泌，以及tnfα分泌的分泌率(tnfα蘑菇/tnfα载体*100％)或tnfα分泌的升高率(tnfα蘑菇/tnfα载体*100％-100％)的计算。
[0291]
g.来自测定的结果也显示在图4中。
[0292]
表5:il-6分泌的总结
[0293][0294][0295]
表6:tnfα分泌的总结
[0296][0297]
大麻素提取物
[0298]
一氧化氮分泌：大麻素提取物的no分泌结果显示在下表7中。
[0299]
a.cbd在15-20μm下有效抑制no分泌而不影响细胞活力，而thc在20μm下是有效的。
[0300]
b.几乎没有剂量反应。活性范围非常窄(不影响细胞活力)。
[0301]
c.大麻素提取物对no分泌的影响的结果也显示在图5中。
[0302]
表7：对no分泌的抑制的总结*
[0303][0304]
*大麻素按最有效(顶部)和最不有效(底部)排列。
[0305]
细胞因子分泌
[0306]
a.将cbd(15μm)和thc(20μm)与105个raw细胞/孔一起孵育。
[0307]
b.一式两份收集来自细胞的培养基用于多重分析(ccl3/mip1α、il-6、il-1β、tnfα、il-10和il-6)。
[0308]
c.il-4、il-10和il-1β在这些条件下(在检测限下)不分泌。
[0309]
d.ccl3/mip-1α分泌高于检测限值，即使当样品以1:20稀释时。
[0310]
e.il-6分泌：
[0311]
i.cbd不影响il-6分泌。
[0312]
f.tnfα分泌：
[0313]
i.cbd不影响tnfα分泌。
[0314]
ii.thc不影响tnfα分泌。
[0315]
结果也显示在图4中。
[0316]
蘑菇提取物与大麻素提取物的组合
[0317]
一氧化氮分泌：表8描述了在用载体对照、蘑菇提取物、有/没有大麻素处理后raw细胞的no分泌，以及no分泌的％抑制的计算(100％
–
no蘑菇/no载体*100％)。
[0318]
a.将dmso、cbd(15μm)或thc(20μm)与灵芝,冬虫夏草m,巴西蘑菇,和冬虫夏草c
s-4(0.08-2mg/ml)组合与105个raw细胞/孔一起孵育24小时。
[0319]
b.收集细胞的培养基并测量no分泌(greiss no试剂盒)。
[0320]
c.灵芝：thc显著增加灵芝(2mg/ml)对no分泌的抑制。cbd仅具有轻微的累加效应。就no分泌抑制而言，这种组合似乎是最有效的组合。
[0321]
d.冬虫夏草m(rm)：thc增强了冬虫夏草m(0.08mg/ml)对no分泌的抑制。cbd没有这种效果。
[0322]
e.冬虫夏草c
s-4(cs):thc和cbd都增加了冬虫夏草c
s-4(2mg/ml)对no分泌的抑制。
[0323]
f.巴西蘑菇：thc和cbd都增加了巴西蘑菇(2mg/ml)对no分泌的抑制。
[0324]
g.对于no分泌抑制，冬虫夏草m 0.08mg/ml与thc 20μm是最有效的组合。结果也显示在图6中。
[0325]
表8：对no分泌的抑制的总结*
[0326][0327]
*组合按最有效(顶部)和最不有效(底部)排列
[0328]
细胞因子分泌
[0329]
a.将dmso、cbd(15μm)或thc(20μm)与灵芝,cordyseps冬虫夏草m,agaricus blazai巴西蘑菇,和冬虫夏草cs-4(0.08-2mg/ml)组合与105个raw细胞/孔一起孵育。
[0330]
b.一式两份收集来自细胞的培养基用于多重分析(ccl3/mip1α、il-6、il-1β、tnfα、il-10和il-6)。
[0331]
c.il-4、il-10和il-1β在这些条件下(在检测限下)不分泌。
[0332]
d.ccl3/mip-1α分泌高于检测限值，即使当样品以1:20稀释时。
[0333]
e.il-6分泌(表9描述了在有和没有大麻素的情况下用载体对照、蘑菇提取物处理后来自raw细胞的il-6分泌，以及il-6分泌的％抑制率(100％-il-6蘑菇/il-6载体*100％)或il-6分泌的％升高率的计算。
[0334]
f.蘑菇/il-6载体*100％-100％)。
[0335]
g.tnfα分泌：表10描述了用载体对照、蘑菇提取物、有和没有大麻素处理后raw细胞的tnfα分泌，以及tnfα分泌的％分泌率(tnfα蘑菇/tnfα载体*100％)或tnfα分泌的％升高率(tnfα蘑菇/tnfα载体*100％-100％)的计算。
[0336]
i.与单独的两种提取物相比，cbd 灵芝(2mg/ml)减少il-6分泌-促炎作用。
[0337]
ii.cbd 冬虫夏草cs-4(0.08mg/ml)与单独的两种提取物相比降低il-6分泌-促炎作用。o cbd 冬虫夏草cs-4(2mg/ml)减弱了冬虫夏草cs-4(2mg/ml)单独对il-6分泌的抑制
作用。o cbd 巴西蘑菇(agaricus balzei)(0.4mg/ml)降低了单独的巴西蘑菇(0.4mg/ml)对il-6分泌的抑制作用。
[0338]
iii.thc 灵芝(0.08mg/ml)与单独的两种提取物相比降低il-6分泌。
[0339]
iv.thc 冬虫夏草cs-4(2mg/ml)与单独的两种提取物相比增加il-6分泌。与单独的两种提取物相比，thc 冬虫夏草cs-4(0.08mg/ml)减少il-6分泌。与单独的两种提取物相比，thc 冬虫夏草m(0.08mg/ml)减少il-6分泌。
[0340]
h.tnfα分泌：
[0341]
i.与单独的两种提取物相比，cbd 灵芝(2mg/ml)降低了tnfα分泌。与单独的两种提取物相比,thc 灵芝(0.4-2mg/ml)降低tnfα分泌。ο与单独的两种提取物相比，cbd/thc 冬虫夏草c
s-4(2mg/ml)增加tnfα分泌。
[0342]
ii.与单独的两种提取物相比,thc 冬虫夏草cs-4(0.08mg/ml)降低了tnfα分泌。
[0343]
iii.与单独的两种提取物相比,thc 巴西蘑菇(2mg/ml)降低了tnfα分泌，然而与单独的两种提取物相比,thc 巴西蘑菇(0.08mg/ml)增加了tnfα分泌。
[0344]
iv.thc reishi(0.08mg/ml)减少il-6分泌最多。thc 冬虫夏草cs-4(2mg/ml)最大程度地增加il-6分泌。
[0345]
v.thc 冬虫夏草cs-4(0.08mg/ml)最大程度地降低了tnfα分泌。
[0346]
结果显示在图4中。
[0347]
表9:il-6分泌的总结
[0348]
[0349][0350]
表10:tnfα分泌的总结
[0351]
[0352][0353]
从本文上文提供的数据可以看出，蘑菇提取物与thc或cbd的组合的抗炎特性与单独的每种组分的抗炎特性显著不同，因此显示出蘑菇提取物与thc或cbd的协同抗炎作用。
[0354]
表8具体地显示出相对于单独的每种组分，蘑菇提取物与thc或cbd的组合导致no分泌减少，表明这些组合的抗炎特性增加。对于0.08mg/ml冬虫夏草m与20m thc的组合，观察到no分泌的最高抑制。
[0355]
蘑菇提取物与thc或cbd组合对il-6分泌的影响显示出降低的il-6分泌thc 灵芝(0.08mg/ml)，如表9中所示，而thc 冬虫夏草cs-4(2mg/ml)导致il-6分泌增加最多。
[0356]
蘑菇提取物与thc或cbd组合对tnfα分泌的影响示于表10中：对于thc 冬虫夏草cs-4(0.08mg/ml)，观察到tnfα分泌的最高降低，表明抗炎活性。
[0357]
实例2
[0358]
用蘑菇提取物和大麻素的各种组合处理后panc-1和gl-1细胞的活力测定
[0359]
测试系统
[0360]
a.panc-1细胞(人胰腺癌细胞)(美国典型培养物保藏中心，罗克维尔，马里兰州，美国)。
[0361]
b.egl-1细胞(人肝外胆管癌)
[0362]
细胞生长：
[0363]
适于panc-1/egl-1细胞的生长培养基：补充有10％胎牛血清(fbs)、2mm l-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素溶液(ps)的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dmem)高葡萄糖。
[0364]
适于egl-1细胞的生长培养基：补充有10％胎牛血清(fbs)、2mm l-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素溶液(ps)的rpmi-1640培养基。
[0365]
适于panc-1的测定培养基：测定培养基仅含有1％fbs。
[0366]
适于egl-1的测定培养基：测定培养基在dmem低葡萄糖(1g/l)中仅含有1％fbs
[0367]
实验设计：用测试项目孵育细胞：
[0368]
a.在80％汇合时收获细胞，计数并重悬于生长培养基中至最终浓度为75
×
103/ml(panc-1)或50
×
103(egl-1)。
[0369]
b.将panc-1细胞悬浮液以7500个细胞/100μl/孔接种在96孔微量滴定板中，并将egl-1细胞悬浮液以5000个细胞/100μl/孔接种在96孔微量滴定板中。
[0370]
c.将细胞温育(37
±
10℃，5％co2)18-24小时。
[0371]
d.去除生长培养基；添加80μl测定培养基和20μl载体、测试项目和对照物。如表11、表12和表13所示设计每个板。
[0372]
e.通过上下吸移三次来混合所有孔的内容物。
[0373]
f.将板温育72
±
2h(37
±
1℃，5％co2)。
[0374]
g.用100μl培养基替换所有板上的培养基。
[0375]
xtt测定
[0376]
a.制备xtt反应溶液。
[0377]
b.向每个孔中加入50μl xtt反应溶液。
[0378]
c.将板在潮湿气氛(例如37℃，5％co2)中孵育。
[0379]
d.轻轻摇动板以使染料均匀分布在孔中。
[0380]
e.用分光光度计(elisa读数器)在450nm波长下相对于作为空白的背景对照测量样品的吸光度。
[0381]
f.为了测量参考吸光度(以测量非特异性读数)，使用620nm的波长以便从450nm测量值中减去。
[0382]
g.所有孔中细胞的空闲吸光度为0.5-1.5。
[0383]
表11:*建议的测定设计
[0384][0385][0386]
表12：大麻素提取物的板设置
[0387][0388]
*以红色标记的行是每个板设置
[0389]
**仅在cbd/thc板中
[0390]
表13：大麻素提取物的板设置
[0391]
实例3
[0392]
癌症研究结果：蘑菇提取物
[0393][0394]
a.七种蘑菇提取物与0.5-10mg/ml的panc-1或egl-1温育72小时。
[0395]
b.表12和表13描述了导致最大杀灭(最低存活力)的蘑菇剂量。
[0396]
c.测试细胞的活力(xtt测定)。
[0397]
d.egl-1细胞比panc-1细胞对细胞死亡的抗性高得多。冬虫夏草m(rm)是最有效的蘑菇，其次是灵芝。
[0398]
e.panc-1细胞：白桦茸是最有效的蘑菇，其次是灵芝和火鸡尾(turkey tail)(ms)。
[0399]
f.结果显示在图7和图8中。
[0400]
表12:panc-1细胞活力的总结*
[0401]
[0402]
[0403][0404]
表13:egl-1细胞中活力的总结
[0405]
[0406]
[0407][0408]
结果表明用agaricus和cordyseps cs-4(ms)孵育的egl-1和panc-1细胞均表现出高于100％的％活力
[0409]
为了查验蘑菇是否影响代谢的细胞增殖，将两种蘑菇以相同浓度加入egl-1细胞中，持续2小时、6小时、24小时和72小时。如图2中所见，在cordyseps cs-4的情况下，仅在72小时后观察到更高的活力，这意味着增殖作用。然而，在agaricus blazei的情况下，即使在2小时后也观察到更高的活力(与载体相比)，这意味着代谢变化。
[0410]
·
大麻素提取物
[0411]
a.将cbd(0.1-100μm)或thc(0.5-375μm)与7,500个panc-1细胞/孔(胰腺癌)或egl-1细胞/孔(肝外癌)一起孵育72小时。
[0412]
b.测试细胞的活力(xtt测定)。
[0413]
c.egl-1:
[0414]
i.cbd在40-100μm时是有效的(15％-30％活力)。
[0415]
ii.thc在100-375μm下是有效的(15％活力，无剂量反应)。
[0416]
d.panc-1:
[0417]
i.cbd在40-100μm下是有效的(35％活力，无剂量反应)。
[0418]
ii.thc在100-375μm下是有效的(35％活力，无剂量反应)。
[0419]
结果显示在图9中。
[0420]
蘑菇提取物与大麻素提取物的组合
[0421]
a.将dmso、cbd(40μm)或thc(50μm)与灵芝,冬虫夏草m,冬虫夏草cs-4和火鸡尾(turkey tail)(ms)提取物(0.5-6mg/ml)组合与7,500个panc-1细胞/孔一起孵育。
[0422]
b.与thc的组合没有改善蘑菇抗癌作用。
[0423]
c.与单独的所有蘑菇相比，与cbd的组合降低了细胞活力。与cbd组合的冬虫夏草m(rm)和灵芝是降低细胞活力的最有效组合。
[0424]
如图10中所示，具有和不具有thc或cbd的蘑菇提取物的组合的协同抗癌性质通过细胞与具有和不具有thc或cbd的蘑菇提取物孵育后panc-1和egl-1癌细胞系的活力来证明。
[0425]
相对于单独的蘑菇提取物，蘑菇提取物与cbd的组合显示出增加的抗癌作用，对于与cbd组合的冬虫夏草m(rm)和灵芝观察到最显著的作用。
[0426]
实例4
[0427]
施用途径：大麻素和药用蘑菇的组合被配制成口服施用、静脉内施用或局部施用。
[0428]
本发明的制剂尤其以非限制性的方式包含另外的成分或药物赋形剂，以进一步开发具有所需浓度、有效剂量、给药方案和治疗时间的制剂。这些成分尤其包括增溶剂、稳定剂、缓冲剂、张力调节剂、填充剂、粘度增强剂/降低剂、表面活性剂、螯合剂和佐剂。
[0429]
本发明的大麻组合物通过抽吸植物来源的香烟或通过口服或静脉内施用来施用。抽吸路线是最常用的一种预制香烟或手卷烟。静脉内途径提供剂量和时间的精确控制。大麻素组合物也通过口腔粘膜途径递送。
[0430]
经鼻施用(通过鼻)可用于局部作用物质，以及用于吹入例如减充血鼻用喷雾剂以沿呼吸道吸收。这样的物质也称为吸入性的，例如吸入性麻醉剂。
[0431]
口服施用口服药物以片剂或胶囊的形式服用。
[0432]
片剂：片剂的溶出度可受到粒度和晶形的显著影响。可以改变溶解时间以获得快速效果(快速溶解)或持续释放(缓慢溶解速率，其延长作用持续时间或避免初始高血浆水平)。
[0433]
胶囊：胶囊是包封活性物质的凝胶状包膜。胶囊可以设计成在摄取后保持完整数小时，以便延迟吸收。它们还可以含有缓慢释放颗粒和快速释放颗粒的混合物，以在相同剂量下产生快速和持续的吸收。
[0434]
口服持续释放：胶囊或片剂中的口服持续释放在非限制性物质中通过以下方式实现：将活性成分包埋在不溶性多孔基质中，使得溶解的药物必须在其可以被吸收之前离开基质，其中基质溶胀以形成药物通过其离开的凝胶的持续释放制剂，或通过渗透控制释放口服递送系统，其中活性化合物包封在一端具有激光钻孔的水可渗透膜中。当水通过膜时，药物通过孔被推出并进入消化道，在消化道中药物可以被吸收。
[0435]
溶液：药物溶液广泛用作口服施用治疗剂的剂型。药物溶液被定义为其中治疗剂和各种赋形剂溶解在在所选择的溶剂体系中的液体制剂。
[0436]
药物溶液是均匀的，即治疗剂和赋形剂溶解在载体中
[0437]
肠胃外施用：肠胃外施用使用静脉内、皮下、肌内和关节内施用进行。药物以液体储存，或者如果不稳定，则以冻干形式储存。
[0438]
局部施用：局部制剂尤其包括乳膏、软膏、糊剂、洗剂或凝胶。
[0439]
透皮递送：透皮递送例如通过透皮贴剂实现。
[0440]
替代的施用途径是栓剂、心室内、肌内、吸入、气溶胶和舌下。