生产大肠杆菌O-抗原多糖的生物缀合物的方法、其组合物及其使用方法与流程

技术特征：
1.一种制备与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o
x
抗原多糖的生物缀合物的方法，所述方法包括：(i)提供包含以下的重组宿主细胞：a. 关于o
x-抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；b. 编码载体蛋白质的核苷酸序列，所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列；和c. 编码寡糖基转移酶pglb
y
的核苷酸序列；和(ii)在用于生物缀合物产生的条件下培养重组宿主细胞，其中：当o
x-抗原为o1a抗原多糖时，pglb
y
包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为葡糖基化o4抗原多糖时，pglb
y
包含氨基酸突变n311v或氨基酸突变y77h和n311v，并且重组宿主细胞进一步包含：编码葡糖基转移酶gtrs的序列，所述葡糖基转移酶gtrs与seq id no: 4具有至少80%同一性，并且能够通过添加葡萄糖来修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；以及编码与seq id no: 7和8分别具有至少80%序列同一性的移位酶gtra和糖基转移酶gtrb的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化；当o
x-抗原为o6a抗原多糖时，pglb
y
包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o8抗原多糖时，pglb
y
不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变；当o
x-抗原为o15抗原多糖时，pglb
y
包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o16抗原多糖时，pglb
y
包含y77h、s80r、q287p、k289r和n311v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o18a抗原多糖时，pglb
y
不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变；和当o
x-抗原为o75抗原多糖时，pglb
y
包含n311v的氨基酸突变，其中在每种情况下，氨基酸突变是相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb，和其中o1a、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a和o75抗原多糖分别具有如表1中所示的式(o1a)、(o4-glc )、(o6a)、(o8)、(o15)、(o16)、(o18a)和(o75)的结构，并且每个n独立地为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。2.权利要求1的方法，其中所述o
x-抗原为葡糖基化o4抗原多糖，并且相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb，所述pglb
y
包含氨基酸突变n311v或氨基酸突变y77h和n311v。3.权利要求2的方法，其中所述重组宿主细胞进一步包含编码具有seq id no: 4的氨基酸序列的gtrs的序列、以及编码分别具有seq id no: 7和8的氨基酸序列的gtra和gtrb的核苷酸序列。4.一种制备与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o
x-抗原多糖的生物缀合物的方法，所述方法包括：(i)提供包含以下的重组宿主细胞：
a. 关于o
x-抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；b. 编码载体蛋白质的核苷酸序列，所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列；和c. 编码寡糖基转移酶pglb
y
的核苷酸序列；和(ii)在用于生物缀合物产生的条件下培养重组宿主细胞，其中相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb，pglb
y
包含氨基酸突变n311v，其中o
x-抗原为o1a抗原多糖、葡糖基化o4抗原多糖、o6a抗原多糖、o15抗原多糖、o16抗原多糖或o75抗原多糖，并且当o
x-抗原为葡糖基化o4抗原多糖时，重组宿主细胞进一步包含：编码葡糖基转移酶gtrs的序列，所述葡糖基转移酶gtrs与seq id no: 4具有至少80%同一性，并且能够通过添加葡萄糖来修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；以及编码与seq id no: 7和8分别具有至少80%序列同一性的移位酶gtra和糖基转移酶gtrb的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化，和其中o1a、葡糖基化o4、o6a、o15、o16和o75抗原多糖分别具有如表1中所示的式(o1a)、(o4-glc )、(o6a)、(o15)、(o16)和(o75)的结构，并且每个n独立地为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。5.权利要求1至4中任一项的方法，其进一步包括从所述重组宿主细胞中分离所述生物缀合物。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d，优选地其中所述载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)，优选地其中所述epa载体蛋白质包含1-10个，优选2-4个，更优选4个糖基化位点，优选地其中每个糖基化位点包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列，优选地其中所述epa载体蛋白质包含seq id no: 3。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌k-12菌株，例如菌株w3110。8.一种生物缀合物，其通过权利要求1-7中任一项的方法产生。9.权利要求8的生物缀合物，其中所述生物缀合物是与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，优选地其中所述载体蛋白质是包含seq id no: 3的epa载体蛋白质，优选地其中所述葡糖基化o4抗原多糖具有如表1中所示的式(o4-glc )的结构，并且n为5至40的整数。10.一种包含权利要求8或9的生物缀合物的组合物，优选进一步包含一种或多种缀合
物，所述缀合物各自包含与载体蛋白质共价偶联的大肠杆菌抗原多糖。11.一种用于制备与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o
x
抗原多糖的生物缀合物的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：a. 关于o
x-抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；b. 编码载体蛋白质的核苷酸序列，所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列；和c. 编码寡糖基转移酶pglb
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的核苷酸序列，其中：当o
x-抗原为o1a抗原多糖时，pglb
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包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为葡糖基化o4抗原多糖时，pglb
y
包含氨基酸突变n311v或氨基酸突变y77h和n311v，并且重组宿主细胞进一步包含：编码葡糖基转移酶gtrs的序列，所述葡糖基转移酶gtrs与seq id no: 4具有至少80%同一性，并且能够通过添加葡萄糖来修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；以及编码与seq id no: 7和8分别具有至少80%序列同一性的移位酶gtra和糖基转移酶gtrb的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化；当o
x-抗原为o6a抗原多糖时，pglb
y
包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o8抗原多糖时，pglb
y
不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变；当o
x-抗原为o15抗原多糖时，pglb
y
包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o16抗原多糖时，pglb
y
包含y77h、s80r、q287p、k289r和n311v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o18a抗原多糖时，pglb
y
不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变；和当o
x-抗原为o75抗原多糖时，pglb
y
包含n311v的氨基酸突变；其中在每种情况下，氨基酸突变是相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb，和其中o1a、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a和o75抗原多糖分别具有如表1中所示的式(o1a)、(o4-glc )、(o6a)、(o8)、(o15)、(o16)、(o18a)和(o75)的结构，并且每个n独立地为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。12.权利要求11的重组宿主细胞，其中所述o
x-抗原为葡糖基化o4抗原多糖，并且相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb，所述pglb
y
包含氨基酸突变n311v或氨基酸突变y77h和n311v。13.权利要求12的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞进一步包含编码具有seq id no: 4的氨基酸序列的gtrs的序列、以及编码分别具有seq id no: 7和8的氨基酸序列的gtra和gtrb的核苷酸序列。14.权利要求11至13中任一项的重组宿主细胞，其中所述载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、
霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d，优选地其中所述载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)，优选地其中所述epa载体蛋白质包含1-10个，优选2-4个，更优选4个糖基化位点，优选地其中每个糖基化位点包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列，优选地其中所述epa载体蛋白质包含seq id no: 3。15.权利要求11至14中任一项的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌k-12菌株，例如菌株w3110。

技术总结
提供的是使用重组宿主细胞，产生与载体蛋白质共价连接的O-抗原多糖的生物缀合物的方法。用于本文所述的方法中的重组宿主细胞编码特定的寡糖基转移酶，取决于待产生的O-抗原多糖生物缀合物。寡糖基转移酶可以是PglB寡糖基转移酶或其变体。还提供的是含有生物缀合物的组合物，以及使用本文所述的生物缀合物和组合物针对肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)给受试者接种疫苗的方法。种疫苗的方法。种疫苗的方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
技术研发日：2020.03.18
技术公布日：2022/1/18