一种共包载siRNA与疏水性药物的纳米载药系统、其制备方法及应用与流程

一种共包载sirna与疏水性药物的纳米载药系统、其制备方法及应用
技术领域：
1.本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种共包载sirna与疏水性药物的纳米载药系统、其制备方法及应用。


背景技术：

2.现阶段肿瘤治疗，仅凭单一的化疗难以满足临床需求，如三阴性乳腺癌 (triple negative breast cancer,tnbc)，作为最具有侵袭性的乳腺癌亚型，约46％的tnbc患者在诊断后的第三年发生肺、骨、脑等器官的远处转移。转移后中位生存其转移仅13.3个月。临床tnbc的主要治疗方法还是传统化疗和外科手术。化疗是唯一可用的全身性治疗方法。用于局部复发性不能手术或转移性tnbc的患者。但常规化疗下患者对细胞毒性药物的反应持续时间短，易产生耐药性，且随后迅速复发。治疗选择的局限性是tnbc患者预后不良的主要因素。因此，将单一化疗药物靶向输送至tnbc部位，难以长期有效遏制tnbc的生长与转移，治疗效果有限。
3.twist作为一种重要的emt诱导剂，在乳腺癌，肺癌等多种肿瘤中过表达，与癌症的发生、癌症干细胞的自我更新、侵袭性、转移、多重耐药性和预后不良密切相关。利用sirna抑制twist可以有效抑制tnbc的侵袭转移。将抗肿瘤药物与sirna联用是现在抗肿瘤治疗的新趋势。如专利号为 zl201810256163.4的专利公开了一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白的 sirna和fty720的纳米载药系统lcp-ii-sibeclin1-fty720。该载药系统为脂质纳米颗粒，表面接有叶酸即fa，fa作为配体可以结合肝癌细胞表面高表达的叶酸受体起到主动靶向的作用。而且该载药系统的磷酸钙核即cap core 遇酸可以反应，起到在肝癌细胞内的酸性环境下释放的目的。另外，该载药系统同时载有靶向自噬蛋白beclin1的sirna和诱导肝癌细胞凋亡的fty720，起到协同诱导肝癌细胞凋亡的目的。
4.天然药物海洋类胡萝卜素岩藻黄质(fucoxanthin,fx)来源于海洋褐藻、大型藻、微藻、硅藻中，相对于化疗药物具备来源广泛，毒副作用小的优势，具有显著的抗氧化、抗肥胖、抗癌活性。fx不仅可以直接杀死肿瘤细胞，还可以防止氧化应激和肥胖引起的癌细胞形成。实验发现fx在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃腺癌、肝癌和膀胱癌中具有显著的抗癌活性。
5.因此，基于以上发现，如何构建一种纳米载体，将疏水性药物fx与sirna 有效共输送至乳腺癌部位，是亟待解决的难题。


技术实现要素：

6.(一)解决的技术问题
7.针对上述背景，本发明的目的在于提供一种共包载sirna与疏水性药物的纳米载药系统、其制备方法及应用，可以对肿瘤靶向共输送疏水性药物fx 及sirna，以此解决现有的fx及sirna难以共同输送至肿瘤部位的问题。
8.(二)技术方案
9.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.本发明公开了一种共包载sirna和疏水性药物的纳米载药系统，包括羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物和载在所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物上的抗肿瘤药物。
11.进一步地，所述的疏水性药物为fx。
12.进一步地，所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物的粒径为100-200纳米，所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物的载药量为2wt％-15wt％。
13.进一步地，所述sirna载药量为1-15wt％。
14.本发明公开的另一个方面，提供了一种两亲性的纳米材料，其中包括所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物，所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物具有以下通式：
[0015][0016]
其中，n在1-1000之间；优选n＝10。
[0017]
进一步地，所述胆固醇在所述羟乙基淀粉上接枝率为0.01-10；优选所述胆固醇在所述羟乙基淀粉上接枝率为0.1。
[0018]
本发明还公开了一种羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0019]
步骤一，将溴丙胺氢溴酸1g与2g羟乙基淀粉共混，加入1-20ml当量浓度为6.17n的氢氧化钠溶液,在4-16℃条件下反应10-70分钟，加入37％浓盐酸将酸碱度值调节至7，得到氨基化羟乙基淀粉溶液，透析除去杂质，再经过冻干得到纯化的氨基化羟乙基淀粉粉末；
[0020]
羟乙基淀粉氨基化的化学式如下：
[0021][0022]
步骤二，将1-6g胆固醇与1-6g丁二酸酐溶解于5-15ml吡啶，将混合物加热至70℃，
并搅拌3-8小时，随后旋转蒸发干燥得到沉淀物，将得到的沉淀物采用乙醇溶解，旋转蒸发得到白色沉淀为羧基化胆固醇；
[0023]
胆固醇羧基化的化学式如下：
[0024][0025]
步骤三，将1-6g丙烯酸与1-6g所述氨基化羟乙基淀粉粉末溶解于2-30ml 二甲基亚砜溶液，随后加入0.5-5g 1-羟基苯并三氮唑与0.5-5g 1-乙基-(3
‑ꢀ
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，将混合物加热至20-80℃反应8-12小时，得到所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物，所得的所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物通过透析除去未反应的杂质，然后将所得的反应物溶液冻干得到所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物粉末，所得的所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物粉末结构通过红外吸收光谱与氢核磁共振谱表征。
[0026]
氨基化羟乙基淀粉与胆固醇偶联的化学式如下：
[0027][0028]
本发明还公开了一种共包载sirna和疏水性药物的纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
[0029]
步骤一，将所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物溶解于水中，在冰浴下超声破碎，同时加入紫杉醇和吲哚菁绿共混的三氯甲烷乳溶液，得到超声后的乳液；
[0030]
步骤二，将上述步骤一得到的乳液置于高压均质机中，在100-2000bar 下均质1-8次，纯化后得到载fx的所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物的纳米载药系统；
[0031]
步骤三，将得到的载fx的所述羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物的纳米载药系统，加入sirna搅拌1-60min,待体系稳定后，将混悬液加入3w分子量超滤管2000-10000rpm转速离心超滤，离心得到上清载药共聚物，收集得到所述共包载sirna和疏水性药物的纳米载药系统。
[0032]
本发明还包括所述共包载sirna和疏水性药物的纳米载药系统在治疗转移性乳腺癌中的应用。
[0033]
(三)有益效果
[0034]
本发明产生的有益效果是：本发明通过偶联生物相容性良好的羟乙基淀粉和胆固醇，制备得到共包载sirna和疏水性药物的纳米粒，该纳米粒具备 ph敏感的fx释药能力，粒径均一，结构稳定，生物相容性好，相对于普通脂质体、胶束等纳米载体，具有载药种类多，稳定性高的特点，可以有效将fx 与sirna靶向输送至乳腺癌部位，抑制乳腺癌生长，并可以抑制乳腺癌的转移，实现fx与sirna的协同治疗三阴性乳腺癌的效果。
附图说明：
[0035]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0036]
图1为本发明所述的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)的氢核磁共振谱及红外图；图中，a为hes-nh2在dmso-d6中的1h-nmr表征；b为琥珀酰胺化胆固醇在dmso-d6中的1h-nmr表征；c为hes-ch在dmso-d6中的 1h-nmr表征；d为hes-nh2及hes-ch的红外表征。
[0037]
图2为本发明所述的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物纳米粒及其载药时的透射电镜图；
[0038]
图3为本发明所得的共包载sirna与fx的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物纳米粒sirna/fx@hes-ch的ph敏感释药图；
[0039]
图中，a为hes-ch纳米粒在不同ph(5.4、6.8、7.2)下，粒径变化图； b为hes-ch纳米粒在不同ph(5.4、6.8、7.2)下，zeta电位变化图；c为 fx@hes-ch纳米粒在不同ph下，fx的ph敏感释放图。
[0040]
图4为本发明所得的共包载sirna与fx的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物纳米粒sirna/fx@hes-ch的体外肿瘤杀伤效果图；
[0041]
图中，a为游离fx的24、48、72小时的细胞杀伤效果；b为sirna/fx@hes-ch 的24、48、72小时的细胞杀伤效果；c为不同组别细胞杀伤结果。
[0042]
图5为本发明所得的共包载sirna与fx的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物纳米粒sirna/fx@hes-ch的体乳腺癌小鼠体内分布图；
[0043]
图中，a为不同材料在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤的分布图；b为不同材料在肿瘤部位蓄积的时间；c为不同材料不同时间点在nsg小鼠肿瘤部位蓄积的小动物成像效果图。
[0044]
图6为本发明所得的共包载sirna与fx的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物纳米粒sirna/fx@hes-ch的抑制乳腺癌药效图；
[0045]
图中，a为三阴性乳腺癌原位模型的建立及给药方式；b不同组别治疗后瘤块拍照；c为不同组别治疗三阴性乳腺癌的药效评价；d为不同组别治疗三阴性乳腺癌的小鼠体重评价。
[0046]
图7为本发明所得的共包载sirna与fx的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物纳米粒sirna/fx@hes-ch的抑制肺癌转移效果图；
[0047]
图中，a为三阴性乳腺癌肺转移治疗机制；b为不同组别治疗后肺部乳腺癌细胞转移拍照评价；c为不同组别治疗后肺部乳腺癌细胞转移h&e染色评价。
具体实施方式：
[0048]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
[0049]
实施例一
[0050]
制备羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)，按照以下步骤合成：
[0051]
步骤一，羟乙基淀粉(hes)氨基化
[0052]
将1g溴丙胺氢溴酸与1g羟乙基淀粉共混，加入2ml当量浓度为3.08n 的氢氧化钠溶液,在4℃条件下反应20分钟，加入37％浓盐酸将酸碱度值调节至7，得到氨基化羟乙基淀粉(hes-nh2)，氨基化羟乙基淀粉(hes-nh2)通过透析除去杂质，再通过冻干得到纯化的氨基化羟乙基淀粉(hes-nh2)粉末。
[0053]
步骤二，将1g胆固醇与1g丁二酸酐溶解于20ml吡啶。将混合物加热至 60℃，并搅拌3小时，随后旋转蒸发干燥得到沉淀物，将得到的沉淀物采用乙醇溶解，旋转蒸发得到白色沉淀为羧基化胆固醇。
[0054]
步骤三，将1g丙烯酸(ch-cooh)与1g氨基化羟乙基淀粉(hes-nh2) 溶解于10ml二甲基亚砜溶液(dmso)，随后加入0.5g 1-羟基苯并三氮唑 (hobt)与0.5g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)，将混合物加热至25℃反应过夜，得到羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)，所得的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)通过透析除去未反应的杂质，所得的反应物溶液冻干得到羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)粉末，所得的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)粉末结构通过红外吸收光谱 (ftir)与氢核磁共振谱(h-nmr)表征。
[0055]
如图1所示，测定了羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)的氢核磁图谱，由图1可知，氨基化羟乙基淀粉在2.5ppm-3ppm间出现了溴丙胺上亚甲基的2重峰，也能在羟乙基淀粉偶联胆固醇上发现胆固醇的多元环上亚甲基的多元峰，核磁图谱证实了羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)的合成，胆固醇在羟乙基淀粉上的接枝率为0.21。
[0056]
另一方面，1h-nmr谱图显示在0-2.5之间的胆固醇中出现了质子峰，表明胆固醇被成功偶联至羟乙基淀粉。
[0057]
红外结果表明，在1731cm-1处出现了c＝o酯键的伸缩振动特征带，1700 cm-1处出现了c＝o伸缩振动特征带以及1533cm-1处的-n-h伸缩振动特征带，表明胆固醇与hes成功结合。
[0058]
实施例二
[0059]
制备羟乙基淀粉偶联胆固醇的纳米载药系统：
[0060]
将已纯化的羟乙基淀粉偶联胆固醇聚合物(hes-ch)溶解至水中，利用超声破碎仪，在冰浴条件下，一边超声一边加入fx的二氯甲烷溶液，超声5 min，超声结束后将乳液加入高压均质机，在500bar下均质2次，最终得到 fx@hes-ch与fx的混悬液，随后5000rpm下离心30min，除去未包载的fx，将部分fx@hes-ch的溶液置于3500da的透析袋中，加入sirna水溶液与 fx@hes-ch共同搅拌0-120min，sirna与fx@hes-ch质量比为0.01：1-100： 1，随后将混悬液加入3-15w分子量的超滤管，在5000rpm-15000rpm条件下离心30min，得到纯化后的共载sirna及fx的纳米粒sirna/fx@hes-ch纳米粒。将sirna/fx@hes-ch称重质量w1，通过紫外分光光度法测得fx质量 w2，icg质量w3,fx载药量公式采用w2/w1*100％计算得到6wt％，
sirna载药量通过western blot测定为5wt％。
[0061]
分别配制1mg/ml的hes-ch、fx@hes-ch、sirna/fx@hes-ch溶解于超纯水中，超声10min，备用。将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，将1mg/ml的纳米粒分散液10μl滴于铜网上，室温下自然干燥，采用透射电镜(h-7000fa, hitachi)观察其形貌，sirna/fx@hes-ch粒径分布采用激光粒度仪测量(nano-zs90，malvern)。
[0062]
图2为本发明制备的sirna/fx@hes-ch的透射电镜tem图，如图2所示，空白的hes-ch纳米粒粒径为118nm，粒径均一，呈球状；单载fx的纳米粒 fx@hes-ch粒径稍大，为136nm，呈均匀球状；共载sirna及fx的纳米粒 sirna/fx@hes-ch粒径为187nm，成日冕状，dls结果与tem结果相吻合。
[0063]
实施例三
[0064]
对hes-ch的ph敏感释药行为进行研究。
[0065]
首先将hes-ch纳米粒1mg/ml分别置于ph 7.4，ph6.8及ph5.4环境中 30min，采用dls分别测量不同ph状态下hes-ch纳米的粒径分布。
[0066]
结果如图3所示，随着ph降低，hes-ch纳米粒的粒径相应增加。利用透析袋法测试fx@hes-ch在不同ph下释放行为，将0.5ml的fx@hes-ch纳米粒(fx浓度2.0mg/ml)的混悬液放置于透析袋(mwco：3500da)，将透析袋放置于50.0ml的不同ph(5.4、6.8、7.4)释放介质中，分别在不同时间点取出1ml的释放介质定量分析，同时再加入1ml的全新介质。
[0067]
fx的释放量采用紫外分光光度计(定量测定波长为449nm)测量fx的浓度。
[0068]
实验结果如图3所示，随着ph降低，hes-ch纳米粒的粒径增加，说明 hes-ch的氨基随着ph降低发生质子化，使纳米粒膨胀，这一性质有利于 fx@hes-ch纳米粒的在肿瘤组织酸性环境下加速释药行为。
[0069]
实施例四
[0070]
采用细胞毒性实验，通过细胞计数试剂盒(cck-8)验证不同浓度 sirna/fx@hes-ch的体外协同治疗效果。
[0071]
将3
×
103 4t1细胞接种在96孔细胞培养板的每孔中，并孵育过夜。然后用不同浓度的fx或sirna/fx@hes-ch处理细胞24、48、72小时。随后，在每孔中加入含有10μl cck-8的新鲜培养基100μl，在黑暗中3h，最后使用酶标仪读取样品在450nm处的吸光度。
[0072]
为了直观地观察各种制剂的细胞毒性，使用了calcein-am/pi双染色试剂盒，将4t1细胞以1
×
105个细胞/孔的密度接种到6孔细胞培养板上，将细胞与不同制剂孵育24小时，然后用pbs洗涤；随后，将细胞与钙黄绿素-乙酰氧基甲基(am)和pi共染色试剂盒在37℃下孵育15分钟，然后用pbs洗涤并用荧光显微镜(奥林巴斯)成像。
[0073]
实验结果如图4所示，游离的fx的24，48，72小时ic50分别为48.79， 20.90，12.76μm(见图4a)，而sirna/fx@hes-ch的ic50分别为21.24， 15.39和10.5μm(见图4b)，相对于游离fx，sirna/fx@hes-ch的ic50显著降低。
[0074]
如图4所示，sirna/fx@hes-ch具备最高的细胞杀伤，这是由于sirna及 fx经过hes-ch共包载后并有效入胞后，sirna增强了fx的细胞毒敏感性，同时实验结果亦提示空载体hes-ch的无毒性。
[0075]
实施例五
[0076]
利用小动物活体成像研究sirna/fx@hes-ch的体内分布。
[0077]
对balb/c小鼠注射皮下瘤，待瘤体积长至100-200mm3,对小鼠分别注射游离dir，dir@hes-ch(dir浓度为1mg/kg)，每组3只。分别于1、6、12、 24、36、48、72、96小时对小鼠拍照，96小时后处死小鼠，取出小鼠心、肝、脾、肺、肾，利用小动物成像仪拍照，确定其体内分布。
[0078]
实验结果如图5所示，随着时间延长，dir@hes-ch逐渐蓄积在小鼠肿瘤部位，72小时蓄积量达到最高值。小鼠的离体组织的荧光结果表明，游离的 dir主要蓄积在肝脏、这是由于网状内皮系统对纳米粒的捕获所致。同时， dir@hes-ch在肿瘤部位的蓄积量显著高于游离的dir。
[0079]
实施例六
[0080]
利用balb/c小鼠原位三阴性乳腺癌模型研究sirna/fx@hes-ch治疗乳腺癌药效。
[0081]
实验方法如下：将4t1细胞注射至小鼠体内，待肿瘤生长至70-100mm3 时，将4t1荷瘤小鼠随机分为游离fx组(10mg/ml)，hes-ch组， sirna/fx@hes-ch组(平均为10g/kg和1mg/kg fx每只老鼠)，分别于0、3、 6、9、12、15、18天对小鼠给药。小鼠体重及肿瘤体积每三天测量一次，肿瘤体积计算方法为体积＝长径*短径2/2。
[0082]
实验结果如图6所示，空白的hes-ch不具备抑瘤效果，单载sirna的纳米粒sirna@hes-ch组无明显抗肿瘤效果。这是由于单用sirna仅可抑制肿瘤转移，对肿瘤生长影响较小所导致，sirna/fx@hes-ch治疗组显示了最强的抗肿瘤生长作用。
[0083]
实施例七
[0084]
利用balb/c小鼠原位三阴性乳腺癌模型研究sirna/fx@hes-ch治疗乳腺癌转移的效果。
[0085]
实验方法如下：将4t1细胞注射至小鼠体内，待肿瘤生长至大约100mm3时，将荷瘤小鼠随机分为6组，分别于第0，3，6，9，12，15天注射游离fx, hes-ch，sirna@hes-ch,fx@hes-ch及sirna/fx@hes-ch，35天后，处死小鼠，将小鼠肺部移除，采用pbs清洗，通过对肺部结节计数判断其对小鼠的治疗效果。
[0086]
实验结果如图7，sirna/fx@hes-ch具有最好的抑制肺癌转移效果，其次为fx@hes-ch及sirna@hes-ch，说明纳米粒对sirna/fx的靶向递送可以有效抑制肺癌转移。
[0087]
综上所述，本发明通过偶联生物相容性良好的羟乙基淀粉和胆固醇，制备得到共包载sirna和疏水性药物的纳米载药系统，可以有效将fx与sirna 靶向输送至乳腺癌部位，抑制乳腺癌生长，并可以抑制乳腺癌的转移，实现 fx与sirna的协同治疗肿瘤的效果。
[0088]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本技术所要求限定的保护范围之内。