AKAP1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的应用及方法与流程

akap1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的应用及方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体是指akap1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的应用及方法。


背景技术：

2.代谢相关疾病是指机体内的脂肪、糖、蛋白质、嘌呤等代谢异常，导致的物质累及或者缺乏所引起的疾病。随着生活水平不断提高，人们的膳食结构发生转变，代谢性疾病的发病率日益升高，且发病呈现低龄化趋势。代谢性疾病及其引发的其他器官系统损害已成为影响人类健康的主要慢性疾病，造成沉重的社会经济负担。目前，全球肥胖症人口约为6亿，糖尿病患病人数为3.82亿，预计至2035年全球糖尿病患病人数将突破至5.92亿。2015年，我国居民营养和慢性疾病调查结果表明，全国18岁及以上成人超重率为30.1％，肥胖率为11.9％，糖尿病患病率高达9.7％，血脂异常率已高达40.4％，患病人数已跃居全球第一。然而现有代谢性疾病治疗效果往往不理想，多数患者病情不断进展，致残致死人数和医疗费用支出日益增加，疾病负担日趋严重。因此迫切需要深入系统的探讨代谢性疾病的发病机制，寻找更有效的诊疗方法，减轻患者痛苦和经济负担。
3.目前研究认为多种因素参与了代谢性疾病的发生发展过程包括遗传因素、肥胖、血浆游离脂肪酸水平增高、炎症因子水平升高、胰岛素抵抗等等，但是，导致代谢性疾病的发病机制并未明确，从而导致代谢性疾病有效的治疗靶点及治疗药物非常有限，缺乏从根本上防治其所致疾病的有效方法，寻找并确认直接导致代谢性疾病的关键分子并进一步拮抗其功能，将为代谢性疾病的治疗提供新的途径。


技术实现要素：

4.针对上述情况，为弥补现有治疗方案的不足，本发明提供了一种akap1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的应用及方法。
5.本发明采取的技术方案如下：本发明一种akap1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的应用，提供了靶向akap1蛋白在治疗代谢相关疾病中的用途，包括下列作用中的一项或多项：1)治疗胰岛素抵抗；2)治疗胰岛素抵抗相关疾病；3)治疗脂肪肝；4)治疗肥胖；5)促进胰岛素介导的糖摄取能力；6)促进胰岛素的降糖作用；7)降低血浆中非酯化脂肪酸的浓度；8)降低血浆中甘油三酯的浓度；9)降低血浆中胆固醇的浓度；10)降低空腹血糖浓度；11)提高糖耐量。
6.进一步地，所述胰岛素抵抗相关疾病为下列疾病中的一种或多种：1)胰岛素抵抗综合征；2)代谢综合征；3)肥胖；4)高血糖；5)糖尿病；6)冠心病；7)高血压；8)高血脂；9)高胆固醇；10)脂代谢紊乱；11)心脑血管疾病；12)高胰岛素血症；13)葡萄糖耐量受损。
7.akap1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的方法，具体包括下列步骤：
8.步骤一：准备敲除akap1蛋白的小鼠和对照野生型(wt)小鼠，并在不同条件下饲养，分别获得高脂饲养组小鼠和正常饮食组的akap1-/-小鼠以及对照野生型(wt)小鼠；
9.步骤二：合成akap1抑制肽
10.设计合成靶向结合目的的akap1蛋白特定序列的肽段，竞争性结合akap1线粒体靶向结构域(mtd)的核心区域(含21个氨基酸残基)，抑制akap1蛋白定位到线粒体外膜中，命名为ap-21；采用fmoc固相合成法合成akap1抑制肽，具体步骤如下：
11.1)缩合：聚苯乙烯树脂溶胀后加入缩合试剂室温下反应，期间检测fmoc保护的氨基酸与树脂的缩合程度，达到反应要求时终止反应，封闭未反应的羟基，此时将第一个氨基酸与树脂连接；
12.2)去保护：利用六氢吡啶与dmf混合液来脱去树脂上的fmoc保护基，fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团；
13.3)激活：利用缩合试剂活化氨基酸的羧基；
14.4)交联：在脱去fmoc保护基的氨基酸溶液中，加入羧基活化、氨基fmoc保护的氨基酸，发生耦连反应延长肽链；
15.5)延长肽链：重复第3、4步，直至目标肽链形成；
16.6)从树脂上分离肽链：利用三氟乙酸盐溶液切下目的肽链，过滤，在滤液中加入醚，沉淀目的肽链，静置5～10min，离心得到目的多肽粗品；
17.7)纯化多肽：通过hplc(250mm 5um)纯化目的多肽粗品，得到多肽纯品，所述多肽纯品的纯度》95％。
18.8)多肽鉴定：通过ms鉴定多肽；
19.9)修饰：为了增加肽段导入脂肪细胞的能力，在肽的n-末端设计了包含6个氨基酸残基的细胞穿膜肽(rrrrrr)，同时在n端乙酰化，c端酰胺化修饰去除多肽电荷；
20.10)制备akap1抑制肽多肽冻干粉末于-20℃条件下保存；
21.步骤三：akap1抑制肽分别作用于高脂饲养组小鼠和正常饮食组的akap1-/-小鼠以及对照野生型(wt)小鼠
22.使用时，将多肽冻干粉末的肽段溶解于生理盐水中，注射于高脂饲养组小鼠和正常饮食组的akap1-/-小鼠以及对照野生型(wt)小鼠肩胛区皮下棕色脂肪组织(2mg/kg/day)，连续注射4周后检测小鼠体重以及葡萄糖耐量。
23.本发明akap1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的应用及方法，通过以敲除akap1蛋白作为药物靶点，敲除akap1表达或抑制其活性可以有效对抗高脂诱导小鼠体重增加，改善葡萄糖耐量，抑制akap1蛋白可以对抗高脂诱导的肥胖，成为治疗代谢相关疾病的良好靶点。因此，akap1蛋白可作为治疗代谢相关疾病的药物靶点，具有重要的应用价值。
附图说明
24.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
25.图1为本发明高脂饲养组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠体重对比图；
26.图2为本发明正常饮食组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠体重对比图；
27.图3为本发明高脂饲养组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠葡萄糖耐受水平对比图；
28.图4为本发明正常饮食组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠葡萄糖耐受水平对
比图；
29.图5为本发明注射akap1抑制肽小鼠和注射生理盐水小鼠的体重对比图；
30.图6为本发明注射akap1抑制肽小鼠和注射生理盐水小鼠的葡萄糖耐受水平对比图。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例：
33.(一)制备akap1基因敲除小鼠的步骤如下：
34.(1)准备c57bl/6n小鼠作为对照野生型(wt)小鼠；
35.(2)使用crispr-cas9方法获得akap1-/-小鼠，具体为：使用crispr工具设计合成sgrna(序列为：5
’-
cttggcgttgcccggaatgc-3’)；将cas9mrna和sgrna微注射到受精卵中，待小鼠出生后，剪取0.5cm鼠尾提取dna，pcr后进行基因型鉴定；通过sanger测序证实小鼠基因型；将上述携带突变等位基因的小鼠与野生型(wt)c57bl/6n小鼠回交5代，然后将小鼠杂交以产生akap1-/-小鼠。
36.由于雌性小鼠脂肪积累受性激素影响，故实验中使用小鼠均为雄性小鼠。
37.(二)不同条件下饲养akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠，获得高脂饲养组小鼠和正常饮食组akap1-/-小鼠以及对照野生型(wt)小鼠：
38.高脂饲养组(high fat diet，hfd)：小鼠断奶后(出生4周后)，开始饲喂高脂饲料(60％能量来自于脂肪，research diets)，饲养期间，小鼠可自由饮水；
39.正常饮食组(normal diet，nd)：小鼠断奶后进行正常饮食(10％能量来源于脂肪)，饲养期间，小鼠可自由饮水。
40.小鼠每2周检测一次体重并记录，28周龄小鼠用于后续实验，高脂饲养组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠体重对比见图1，高脂饲养组akap1-/-小鼠体重明显低于对照野生型(wt)小鼠体重，正常饮食组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠体重对比见图2，正常饮食组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠体重无明显区别。
41.(三)小鼠葡萄糖耐受检测，具体步骤如下：
42.(1)将进行实验的高脂饲养组小鼠和正常饮食组的akap1-/-小鼠以及对照野生型(wt)小鼠禁食12小时；
43.(2)腹腔注射葡萄糖，注射剂量为2g葡萄糖/kg体重；
44.(3)通过尾静脉取血，用血糖检测仪检测全血血糖值，检测时间点位为注射葡萄糖后的0、15、30、60、90min。
45.高脂饲养组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠葡萄糖耐受水平对比见图3，高脂饲养组akap1-/-小鼠与对照野生型(wt)小鼠相比葡萄糖耐受水平改善，正常饮食组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠葡萄糖耐受水平对比见图4，正常饮食组akap1-/-小鼠和对照野生型(wt)小鼠葡萄糖耐受水平无明显区别。
46.akap1蛋白作为治疗代谢相关疾病的药物靶点的方法：
47.设计合成靶向结合目的的akap1蛋白特定序列的肽段，竞争性结合akap1线粒体靶向结构域(mtd)的核心区域(含21个氨基酸残基)，抑制akap1蛋白定位到线粒体外膜中，命名为ap-21；采用fmoc固相合成法合成akap1抑制肽，具体步骤如下：
48.1)缩合：聚苯乙烯树脂溶胀后加入缩合试剂室温下反应，期间检测fmoc保护的氨基酸与树脂的缩合程度，达到反应要求时终止反应，封闭未反应的羟基，此时将第一个氨基酸与树脂连接；
49.2)去保护：利用六氢吡啶与dmf混合液来脱去树脂上的fmoc保护基，fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团；
50.3)激活：利用缩合试剂活化氨基酸的羧基；
51.4)交联：在脱去fmoc保护基的氨基酸溶液中，加入羧基活化、氨基fmoc保护的氨基酸，发生耦连反应延长肽链；
52.5)延长肽链：重复第3、4步，直至目标肽链形成；
53.6)从树脂上分离肽链：利用三氟乙酸盐溶液切下目的肽链，过滤，在滤液中加入醚，沉淀目的肽链，静置5～10min，离心得到目的多肽粗品；
54.7)纯化多肽：通过hplc(250mm 5um)纯化目的多肽粗品，得到多肽纯品，所述多肽纯品的纯度》95％。
55.8)多肽鉴定：通过ms鉴定多肽；
56.9)修饰：为了增加肽段导入脂肪细胞的能力，在肽的n-末端设计了包含6个氨基酸残基的细胞穿膜肽(rrrrrr)，同时在n端乙酰化，c端进行酰胺化修饰去除多肽电荷；
57.10)制备akap1抑制肽多肽冻干粉末于-20℃条件下保存；
58.(四)akap1抑制肽作用于高脂饲养组wt小鼠。
59.使用时，将多肽冻干粉末的肽段溶解于生理盐水中，注射于小鼠肩胛区皮下棕色脂肪组织(2mg/kg/day)，连续注射4周后检测小鼠体重和葡萄糖耐受水平，同时，将生理盐水直接注射于小鼠肩胛区皮下棕色脂肪组织(2mg/kg/day)作为对照组。
60.由图5和图6所示，注射akap1抑制肽的小鼠的体重明显低于注射生理盐水的小鼠的体重，注射akap1抑制肽的小鼠的葡萄糖耐受水平明显优于注射生理盐水的小鼠的葡萄糖耐受水平。
61.综合上述实施例可知，针对akap1对抗高脂饮食引起的异常代谢状态的作用，靶向akap1可能是良好的药物靶点以改善代谢相关疾病。现有的治疗肥胖的药物，主要是通过作用于中枢神经系统抑制食欲，或者作用于消化系统抑制消化吸收，同时还会增加心脏毒性，具有比较严重的副作用，而本发明的实验数据显示正常饮食条件下akap1-/-小鼠与对照野生型(wt)小鼠的体重体脂等未见明显差异，只有在高脂饮食条件akap1-/-小鼠较对照野生型(wt)小鼠具有更低的体重及体脂，且小鼠的运动、精神、消化等情况未见明显异常，而是棕色脂肪组织中的线粒体脂肪酸β氧化增加，导致棕脂产热增加，可能会克服市场上现有治疗肥胖的药物的缺点，成为治疗代谢相关疾病的十分具有前景的靶点。
62.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非
排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。
63.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。