构建原位原发食管癌动物模型的方法与流程

技术特征：
1.一种构建原位原发食管癌动物模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)人或动物食管细胞原代培养；2)将原代细胞培养成类器官；3)对步骤2)所得类器官进行基因编辑；4)将基因编辑成功的类器官注射到动物食管组织内；步骤3)所述基因编辑是指突变抑癌基因，和/或高表达原癌基因。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)之前还包括小鼠食管原代细胞的分离步骤：a.使用终浓度0.25％trypsin和0.1mg/mldnase i消化食管；b.使用含有10％fbs的dmem培养基中和trypsin，筛网过滤获得单个细胞，培养基洗涤、离心以终止酶消化反应；优选地，步骤b所述培养基是dmem/f12培养基。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)包括如下步骤：将小鼠食管原代细胞与蛋白浓度为8-12mg/ml的matrigel混合，待matrigel凝固后，加入类器官培养基进行培养，即可；所述培养基是dmem/f12，加如下细胞因子中的12～13种得到：细胞因子可选的浓度范围细胞因子可选的浓度范围b2750倍稀释egf50～100ng/mlr-spondin 1250～1000ng/mlfgf-10500～1000ng/mly-2763210～50umglutamax100倍稀释gastrin1～5nmn-acetylcysteine1～2mmnoggin100～1000ng/mla83-01200～500nmnicotinamide10～50mmwnt-3a50～100ng/mln2100～400倍稀释其中gastrin、n2和y-27632不可缺少。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述类器官培养基的添加剂为：所述类器官培养基的添加剂为：5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶解的温度是37℃；
和/或，所述酶解的时间为5～10min。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述食管癌是食管鳞癌；步骤3)的基因编辑具体是：突变trp53、pten和smad4基因；高表达cmyc和kras
g12d
基因。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述食管癌是食管腺癌；步骤3)的基因编辑具体是：突变trp53和kmt2d基因，高表达cmyc和kras
g12d
基因。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)的基因编辑还包括对类器官转入荧光标记基因。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)和4)所述动物是小鼠。10.权利要求1～9所述的方法制备得到的动物模型在药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中应用。

技术总结
本发明公开了一种原位原发的食管癌肿瘤模型制备方法，属于肿瘤动物模型领域。本发明通过将小鼠食管细胞以特定培养基培养成类器官，再将类器官进行基因编辑，注射回小鼠食管，使其发展成肿瘤。本发明的方法相比基因工程肿瘤动物模型耗时短，成瘤率高；相比移植瘤动物模型，具有肿瘤发生驱动因素明确，器官微环境更加真实等特点。更加真实等特点。更加真实等特点。


技术研发人员：陈崇 王健 刘玉
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2020.07.15
技术公布日：2022/1/17