一种基于单波长透射式光声显微镜的双组分定量成像法的制作方法

1.本发明涉及一种基于单波长透射式光声显微镜的双组分定量成像法，是一种利用透射模式光声显微镜在单波长单次照射下实现双组分定量成像的方法。


背景技术：

2.对生化样品中不同组分的定量分析和成像具有重要的应用价值。例如，组织中多种发色团浓度的定量信息可以对许多基本的生理和病理现象提供重要的信息；通过血管中氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的定量成像，还能获得的血氧饱和度图像，从而反映组织的氧代谢状况。
3.光声显微镜是一种新兴的基于光声效应的生物医学成像技术。当激光脉冲照射样品时，入射光被样品中的发色团(如血红蛋白、脂类、黑色素、胶原、dna/rna等)吸收，导致局部温度升高和热弹性膨胀，进而产生超声波，这就是光声效应。光声效应产生的超声波又被称为光声信号。光声信号的强度与样品的光吸收系数成正比。由于生物组织中各种生物分子组份具有特定的光吸收特性，因此，光声显微镜可以有效地提供生物组织功能和分子图像。
4.光声显微镜对组织中多种成分的成像显示出巨大潜力。基于双波长激发的光声显微镜已经成功地测量了含氧血红蛋白和脱氧血红蛋白的浓度，并进一步提取血氧饱和度。此外，基于分子弛豫效应的光声显微镜，使用不同强度的激光来区分氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白。然而，这些方法通常都需要多波长激发、多次激发，因此需要多台激光器，或者波长可调谐激光器，从而实现不同波长或不同能量的差异性照射，增加了系统的复杂性和成本。而且，多次照射会降低测量精度和生物安全性。总之，多组分的定量成像仍然是一个十分有吸引力的挑战。


技术实现要素：

5.发明目的：为了克服以往多组分定量成像需要多个激发源的局限性，实现在单波长单次照射条件下的双组分定量成像，本发明提供一种基于单波长透射式光声显微镜的双组分定量成像法，采用单波长透射模式光声显微镜扫描样品，在每点激光激发后，聚焦超声换能器可以同时采集到两个光声信号，这两个信号的幅度与样品的光吸收和光散射特性有关，通过分析这两个信号的强度，并且结合样品中两个组分光吸收和光散射特性的不同，可以实现对样品中双组分的量化并成像。
6.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种基于单波长透射式光声显微镜的双组份定量成像法，包括如下步骤：
8.步骤1：将双组份的目标样本置于样本片上，将样本片安装在单波长透射式光声显微镜上，即先将样本片固定在共聚焦皿底部，再向共聚焦皿内注入耦合液体；球形聚焦超声换能器安置在共聚焦皿上方，物镜安装在共聚焦皿下方，球形聚焦超声换能器与物镜同轴共聚焦对准；脉冲激光通过物镜聚焦在目标样本上，球形聚焦超声换能器表面浸入共聚焦
皿中的耦合液体内，以实现良好的声耦合；
9.步骤2：激光器产生单波长的脉冲激光，脉冲激光通过物镜聚焦在目标样本上；脉冲激光与目标样本相互作用，产生光吸收和光散射；
10.步骤3：由于光吸收和光散射，目标样本吸收部分脉冲激光的能量，该部分能量经光声效应产生光声信号s
ii
；光声信号s
ii
在共聚焦皿中的耦合液体内传播，球形聚焦超声换能器在t
ii
时刻接收到光声信号s
ii
；
11.步骤4：目标样本未吸收的剩余部分脉冲激光能量在共聚焦皿中的耦合液体内传播，于ti时刻在球形聚焦超声换能器表面产生光声信号si，ti时刻早于t
ii
时刻；
12.步骤5：针对目标样本的每个采样点，球形聚焦超声换能器采集到两个在时序上分离的光声信号，将这两个光声信号转换为电信号，经放大、数字化后导入计算机；
13.步骤6：使用二维电移台承载样本片移动，对目标样本进行逐点扫描；
14.步骤7：分析目标样本每个采样点上的两个光声信号，结合目标样本中每种组份的光吸收和光散射特性，定量求解目标样本各组份含量；
15.步骤8：重复步骤7，以各组份浓度为成像参数，可以得到目标样本中各组份含量的分布图像。
16.具体的，脉冲激光经过目标样本的光吸收和光散射后，到达球形聚焦超声换能器表面的脉冲激光被减弱，进而引起光声信号si强度的降低，光声信号si幅度的降低量与目标样本的光吸收和光散射成正比；目标样本中的光吸收体引起光声信号s
ii
强度的增加，光声信号s
ii
幅度的增加量与目标样本的光吸收成正比；因此，通过分析两个光声信号幅度的大小，结合目标样本中两个组份的光吸收和光散射特性，能够对两个组份的含量进行量化，这是单波长单次照射实现双组分定量成像的基本原理；
17.设目标样本的两个组份分别为组份a和组份b，在样本片(x,y)位置处两组组份的含量分别为ma(x,y)和mb(x,y)，组份a和组份b的吸收系数分别是εa和εb，组份a和组份b的散射系数分别是σa和σb；
18.对于光声信号si，令s1表示目标样本导致的光声信号si强度的降低量(即无目标样本区域与有目标样本区域光声信号si的幅度差(如图1(b)所示))，存在如下关系：
19.(εa σa)
·
ma (εb σb)
·
mb＝α1·
s1ꢀꢀꢀ
(1)
20.其中：α1是与脉冲激光强度、系统增益和球形聚焦超声换能器表面的光吸收特性有光的系统参数；
21.对于光声信号s
ii
，令s2表示目标样本导致的光声信号s
ii
强度的增加量(即无目标样本区域与有目标样本区域光声信号s
ii
的幅度差(如图1(b)所示))，存在如下关系：
22.εa·
ma εb·
mb＝α2·
s2ꢀꢀꢀ
(2)
23.其中：α2是与脉冲激光强度、系统增益和球形聚焦超声换能器的响应有关的系统参数；
24.联立方程(1)和(2)，得到如下方程组：
[0025][0026]
其中：k
11
＝(εa σa)/α1，k
12
＝(εb σb)/α1，k
21
＝εa/α2，k
22
＝εb/α2。
[0027]
对于方程(3)中的系数k
11
、k
12
、k
21
、k
22
，可以根据已知样品组份的光吸收和光散射
系数等计算确定；也可以对已知浓度的校准样本进行校准实验，从而确定方程(3)中的系数k
11
、k
12
、k
21
、k
22
，具体包括如下步骤：
[0028]
制备n个校准样本，校准样本与目标样本均为含有组份a和组份b的双组份样本，且校准样本中的各组份含量已知，分别记为m
a(1)
、m
b(1)
、
……
、m
a(n)
、m
b(n)
；m
a(i)
和m
b(i)
分别表示第i个校准样本中组份a和组份b的含量；
[0029]
将校准样本安装在单波长透射式光声显微镜上，s
1(1)
，s
2(1)
，
……
，s
1(n)
，s
2(n)
为从这些校准样检测到的信号；s
1(i)
和s
2(i)
分别表示第i个校准样本中光声信号si强度的降低量和光声信号s
ii
强度的增加量；
[0030]
可得到如下方程：
[0031]
m*k＝s
ꢀꢀꢀ
(4)
[0032]
其中：其中：其中：采用最小二乘法求解方程(4)，从而估计系数k
11
、k
12
、k
21
、k
22
，即k＝(m
t
m)-1mt
s；由于存在四个未知系数，因而至少需要两个校准样本(即n≥2)才能确定四个未知系数。
[0033]
具体的，根据系数k
11
、k
12
、k
21
、k
22
，以及单波长透射式光声显微镜测量获得的信号幅度s1和s2，求解的方程(3)，可得样本中两种组份的含量ma和mb：
[0034][0035]
进一步计算得到样本中各组分的浓度ca和cb：
[0036][0037]
其中：ca和cb分别为样本中组份a和组份b的浓度。
[0038]
有益效果：本发明提供的基于单波长透射式光声显微镜的双组份定量成像法，相对于现有技术，具有如下优势：1、本发明在每次单波长激光单次照射样品后，可以通过同一个球形聚焦超声换能器实现两个光声信号的采集，从而得到混合物中双组分的两幅定量图像；2、本发明对样品中双组分含量进行量化成像的整个过程，无需不同波长或不同能量激光的多次差异性照射，避免了多个激发源和多次激发会引发的许多缺点；3、本发明对双组分含量量化的成像信号由同一个换能器接收，故两幅图像的位置完全匹配度，易于配准叠加。可以通过叠加得到复合图，进一步分析得到更多信息。
附图说明
[0039]
图1(a)为本发明基于单波长透射式光声显微镜的双组分定量成像系统原理图；
[0040]
图1(b)为球形聚焦超声换能器表面接收到的光声信号的信号图，s1表示光声信号
si因为目标样本引起的幅度减小量，s2表示光声信号s
ii
因为目标样本导致的幅度增大量；
[0041]
图2为采用本发明对以血液和牛奶的二元混合物为目标样本的定量成像实验组图：
[0042]
(a)为目标样本的照片，标记为“1”、“2”、“3”、“4”的四个目标样本中，血液与牛奶含量配比分别为1.0:0.0、0.667:0.333、0.333:0.667、0.0:1.0，标记为“5”的目标样本是水，不含有任何血液或牛奶成分；
[0043]
(b)是以光声信号si峰值为成像参量绘制的图像；
[0044]
(c)是以光声信号s
ii
峰值为成像参量绘制的图像；
[0045]
(d)是牛奶含量的定量图像；
[0046]
(e)是血液含量的定量图像；
[0047]
图3(a)为对图2中牛奶含量的实验结果和实际浓度的定量分析，厚度表示目标样本的厚度，目标样本厚度对定量成像结果几乎没有影响；
[0048]
图3(b)为对图2中血液含量的实验结果和实际浓度的定量分析，厚度表示目标样本的厚度，目标样本厚度对定量成像结果几乎没有影响；
[0049]
图4为沿两个发色团边界处的浓度梯度成像组图，各组分在交界处相互扩散、渗透：
[0050]
(a)为牛奶的浓度图像；
[0051]
(b)为目标样本的照片；
[0052]
(c)为血液的浓度图像；
[0053]
(d)为(a)和(c)的复合图，血液和牛奶分别用伪彩色红色和绿色表示；
[0054]
(e)为各组分浓度沿图(d)中垂线的分布；
[0055]
(f)为各组分浓度沿图(d)横线的分布。
具体实施方式
[0056]
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0057]
如图1(a)为基于单波长透射式光声显微镜的双组分定量成像系统，图1(b)为每次激发后，同一换能器接收到的两个信号，样品点和参考点(没有样品的区域)之间的幅度差异用s1和s2量化表示。用具有不同光吸收和光散射特性的二元混合物对成像方法进行验证与应用，下面结合实例对本发明做出进一步的说明。
[0058]
步骤1：实验样品制备。用无菌脱纤维绵羊血和牛奶制备四组二元混合物样品，四组样品中血液和牛奶的体积比分别为3:0、2:1、1:2和0:3，即血液(牛奶)含量为1.0(0.0)、0.667(0.333)、0.333(0.667)、0.0(1.0)。将四组混合物分别注入位于共聚焦皿底、厚度约为0.16mm的四个矩形微管中(图2(a)所示样品1-4)。将水注入最右侧的矩形微管中，作为对照组(图2(a)所示样品5)。共聚焦皿中盛水用作超声耦合。
[0059]
步骤2：波长532nm、脉冲宽度约为8ns、重复频率10khz的脉冲激光，通过共焦皿底下、数值孔径为0.4的物镜聚焦在样品上。光电二极管监测激光强度，并触发采集卡记录信号。聚焦超声换能器安置在共聚焦皿上方，并与下方物镜保持同轴共聚焦。该聚焦超声换能器的中心频率22.72mhz，-6db相对带宽77.36％，有效直径3mm，焦距6.83mm。换能器表面浸入共聚焦皿中的液体内，以实现良好的声耦合。实验装置示意图如图1(a)所示。
[0060]
步骤3：超声换能器接收每个采样点产生的两个在时序上分离的声信号si和s
ii
，转换为电信号，经由小信号放大器以46db的增益放大，并以250mhz的采样频率数字化后，保存到计算机中。
[0061]
步骤4：二维电移台以扫描间隔50μm承载样品移动，进行逐点扫描。
[0062]
步骤5：提取信号s
ii
的峰-峰值。图2(c)给出了以s
ii
峰-峰值作为成像参数的图像。
[0063]
步骤6：提取信号si的峰-峰值。图2(b)给出了以si峰-峰值作为成像参数的图像。
[0064]
步骤7：根据每个采样点检测到的两个信号大小，计算求得到混合物中两个组分(牛奶和血液)的含量，并绘制图像，如图2(d)和(e)所示。
[0065]
步骤71：逐点计算样品s1值。将无样品区域的信号si的幅度减去有样品区域信号si的幅度，两者之差即为样品该点的s1值。
[0066]
步骤72：逐点计算样品s2值。将有样品区域的信号s
ii
的幅度减去无样品区域信号s
ii
的幅度，两者之差即为样品该点的s1值。
[0067]
步骤73：利用两个校准样估计方程组(3)的系数。
[0068]
配比两个校准样，其血液-牛奶体积比已知，分别为0:1和1:0，即m
a(1)
＝0.0，m
b(1)
＝1.0，m
a(2)
＝1.0，m
b(2)
＝0.0。并采用步骤71-72的方法获得两个校准样品的s
1(1)
，s
2(1)
，s
1(2)
，s
2(2)
。代入公式(4)可以求得方程组(3)的系数k
11
、k
12
、k
21
、k
22
。
[0069]
步骤74：目标样品未知的ma和mb可以由公式(6)求得：
[0070][0071]
进一步计算得到样本中各组分的浓度ca和cb：
[0072]
ca＝ma/(ma mb)，cb＝mb/(ma mb)
[0073]
步骤75：采用步骤74-75的方法，逐点计算目标样品的空间每点的各组分浓度值ma(x,y)和mb(x,y)，并分别以牛奶和血液浓度作为成像参数，绘制混合物中两个组分(牛奶和血液)的定量图像。如图2(d)和(e)所示，牛奶的含量从样品1到样品4逐渐增加(图2(d))，而血液的含量在四个混合物样品中逐一减少(图2(e))。此外，图像显示，第五个样品不含任何血液和牛奶。综上，成像结果与5个样品中牛奶和血液的实际含量趋势相符。
[0074]
图3给出了对图像进行定量分析的结果。从图2(d)和(e)中提取每个混合物样品中各组分的平均浓度。四个二元混合物样品中，牛奶浓度分别为-0.094
±
0.143，0.405
±
0.077，0.661
±
0.044，0.950
±
0.020，血液浓度分别为1.094
±
0.143，0.595
±
0.077，0.339
±
0.044，0.050
±
0.02。这些数值与四个样品的实际浓度相符。另外，考虑到实际样品不可能完全均匀，并且样品的厚度会影响成像性能，我们在另外四个厚度加倍的样品上重复上述实验。计算得到牛奶浓度为-0.031
±
0.080，0.398
±
0.070，0.692
±
0.034，0.953
±
0.019，血液浓度为1.031
±
0.080，0.602
±
0.070，0.308
±
0.034，0.047
±
0.019。可以看出，这些值仍然正确地反映了样品的实际浓度。此外，结合上述数据及图3(a)和图3(b)可以看出，不同厚度样品得到的各组分浓度没有显著差异。
[0075]
此外，本发明还可以用于两个发色团边界处的浓度梯度成像，如图4所示，样品中所有组分(牛奶、血液、水)都相互扩散、渗透，在交界处形成了渐变的浓度梯度。所获得的图像准确地反映了这种浓度梯度，进一步验证了所提出方法的实用性。
[0076]
步骤1：将无菌脱纤维绵羊血、牛奶和水分别点样在共聚焦皿底，并用盖玻片盖住。
从图4(b)样品照片中可见，各组分在交界处相互扩散、渗透。
[0077]
步骤2：在新样品上重复案例一种的成像步骤，得到牛奶和血液的浓度图像，绘制图4(a)和(c)。
[0078]
步骤3：将图4(a)和(c)配准后叠加，得到一个复合图，即图4(d)。图4(d)中，血液和牛奶分别用伪彩色红色和绿色表示。
[0079]
步骤4：提取图4(d)中任意垂线和横线上各组分的浓度，分别绘制在图4(e)和(f)中。如图4(e)和(f)所示，样品中各组分的空间分布与实际情况基本一致。
[0080]
以上实验结果均表明，基于单波长透射式光声显微镜的双组分定量成像方法，可以通过分析每次单波长激光照射后，同一个球形聚焦超声换能器采集到的两个光声信号大小，结合样品中两个组分光吸收和光散射特性的差异，进而对样品中双组分含量进行量化并成像。本发明提出的方法只需要单波长激光单次照射即可实现双组分定量成像，避免了以往多组分定量成像需要多个激发源的局限性。因此，本发明方法在单波长激光单次照射的条件下实现了双组分的定量成像，具有较高的易用性和实用性。
[0081]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。