一种石斛标准汤剂质量控制方法与流程

1.本发明涉及中药材质量控制技术领域，尤其涉及一种石斛标准汤剂质量控制方法。


背景技术：

2.流苏石斛(dendrobium fimbriatum hook.)是兰科石斛属植物的新鲜或干燥茎，主产我国西南部至西北部，分布于印度、尼泊尔、锡金、不丹、缅甸、泰国、越南等地。流苏石斛是2010版《中国药典》收载的药用石斛之一，又称马鞭石斛，具有益胃生津和滋阴清热的功效，可用于治疗热病津伤，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明和筋骨痿软。其化学成分主要有多糖、联苄类、菲类、大黄素型蒽醌类、香豆素类、甾体等，其中多糖为主要成分之一。现代药理研究表明，多糖具有增强机体免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化等作用，有较高的药用价值。
3.目前，流苏石斛药材尚未建立相关标准。然而仅采用现有的液相色谱法来检测石斛汤剂是有缺陷的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种石斛标准汤剂质量控制方法是十分必要的，更有利于石斛药材的质量控制。


技术实现要素：

4.本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种石斛标准汤剂质量控制方法，目的是便于有效的评价和控制石斛药材的内在质量。
5.基于上述目的，本发明提供了一种石斛标准汤剂质量控制方法，所述质量控制方法是通过对石斛标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及夏佛塔苷含量测定，拟定标准汤剂的夏佛塔苷含量范围在0.4-1.20mg/g；其中，干浸膏出膏率采用煎煮法测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及夏佛塔苷含量测定均采用液相色谱法测定。
6.所述干浸膏出膏率的限定范围为8.5-15.0％。
7.所述照薄层色谱法包括如下步骤：
8.a1、取石斛汤剂经加甲醇超声处理、过滤、滤液蒸干、残渣加甲醇溶解，得供试品溶液a；
9.a2、取石斛对照药材经甲醇超声处理、过滤、滤液蒸干、残渣加甲醇溶解得对照药材溶液a；
10.a3、设置薄层色谱条件：硅胶g薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a均为10ul；展开剂：石油醚与乙酸乙酯以体积比3:2混合得到；显色：10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
11.所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法中的热浸法测定浸出物不得少于23.5％。
12.所述特征图谱及夏佛塔苷含量测定采用液相色谱法测定的方法包括分别吸取石
斛对照品溶液b及供试品溶液b注入液相色谱仪，测定即得；其中，采用的色谱条件：色谱柱：shim-pack gist；流动相：以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b进行梯度洗脱；流速：0.8ml/min；柱温：40℃；检测波长：340nm。
13.所述供试品溶液b的制备方法是取石斛标准汤剂样品，加入25倍量的50％甲醇，密塞，之后经超声、用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
14.所述特征图谱采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次的供试品注入液相色谱仪，测定，并对制定的共有特征峰进行相似度的评价。
15.所述特征图谱及夏佛塔苷含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次供试品分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定峰形、峰数，并对共有特征峰进行相似度评价，用于测试供试品溶液的稳定性。
16.所述特征图谱及夏佛塔苷含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次供试品连续进样6针测定峰形、峰数，并对共有特征峰进行相似度评价，用于测试色谱仪的精密度是否良好。
17.所述夏佛塔苷含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括称取供试品加入夏佛塔苷对照品溶液进行测试夏佛塔苷平均加样回收率的步骤。
18.本发明的有益效果：
19.1、本发明通过对石斛标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及含量测定进行了研究，能够有效控制石斛标准汤剂的质量。
20.2、石斛经超声提取制得的石斛标准汤剂，夏佛塔苷平均含量为0.74mg/g，测得含量范围为0.537～0.919mg/g，sd为0.13；按均值
±
3sd计算，夏佛塔苷含量允许范围为0.35～1.13mg/g。故拟定本标准汤剂的夏佛塔苷含量范围为：0.40mg/g～1.20mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中夏佛塔苷及其转移率均在允许范围之内，可为石斛(流苏石斛)配方颗粒质量研究提供参考依据。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明本发明15批次标准汤剂tlc图谱；其中，a、阴性对照；s、对照药材；1-15、供试品；
23.图2为夏佛塔苷线性考察图。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
25.需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
26.本发明提供了一种石斛标准汤剂质量控制方法，所述质量控制方法是通过对石斛
标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及夏佛塔苷含量测定，拟定标准汤剂的夏佛塔苷含量范围在0.4-1.20mg/g；其中，干浸膏出膏率采用煎煮法测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及夏佛塔苷含量测定均采用液相色谱法测定。下面通过具体的实例进行说明。
27.制法：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)，固定前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等相关参数进行煎煮，再进行固液分离、浓缩干燥。
[0028]
出膏率：取15批次石斛(流苏石斛)饮片，按以上制法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见下表1)，并计算平均得率为11.23％，按照标准限度允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为7.861％～14.599％，故拟定石斛(流苏石斛)饮片标准汤剂出膏率允许范围为8.5％～15.0％。
[0029]
表1石斛(流苏石斛)饮片标准汤剂出膏率
[0030][0031][0032]
上述结果表明，15批次标准汤剂出膏率为8.9％～14.8％，均符合拟定限度范围8.5％～15.0％。
[0033]
性状：根据15批次标准汤剂的实物性状特征，描述为灰黄色至黄棕色的粉末；气微，味微苦而回甜。
[0034]
薄层鉴别：本发明的产品为单味饮片石斛(流苏石斛)的干燥提取物，参考《中国药典》石斛“鉴别”项下流苏石斛薄层鉴别的方法，用石斛(流苏石斛)对照药材作对照，建立了
本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：
[0035]
试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
[0036]
供试品溶液制备：取本品约0.5g，加甲醇25ml，超声处理45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，即得。
[0037]
对照药材溶液：取穿破石(构棘)对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。
[0038]
薄层色谱条件：薄层板：硅胶g薄层板；点样量：供试品溶液10ul，对照药材溶液10ul；展开剂：石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(3:2)；显色：10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
[0039]
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。15批次标准汤剂tlc图谱如图1所示。
[0040]
浸出物测定：取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果见下表2。
[0041]
表2浸出物测定结果
[0042][0043]
上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为33.44％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于23.5％。15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。
[0044]
特征图谱的测试
[0045]
测定波长的确定：参考查阅文献确定检测波长为340nm。
[0046]
试验方法
[0047]
色谱条件：色谱柱：(shim-pack gist 4.6mm*250mm,5.0um)；流动相：以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱
温：40℃；检测波长：340nm。
[0048]
表3
[0049]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～1010
→
1590
→
8510～18158518～3515
→
1485
→
8635～501486
[0050]
参照物溶液的制备：精密称取石斛对照药材1g，精密加入50％甲醇10ml，称定重量，超声1小时，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液既得。精密称取夏佛塔苷对照品适量，加甲醇制成70ug/ml的溶液，做为参照对照品溶液。
[0051]
供试品溶液的制备：精密取本品1.0g置密塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml,称定重量，超声处理30分钟，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
[0052]
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0053]
方法学考察
[0054]
提取方法的考察：分别以不同的提取方法(超声、回流)制备供试品溶液，按上述特征图谱测试中的试验方法进行测定。结果表明，结果表明，主峰个数一致，样品超声30min，主峰总峰面积较大，故选择样品提取方式为超声。
[0055]
提取时间考察：分别以不同超声时间(20分钟、30分钟、40分钟)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，不同提取时间提取主峰个数一致，提取时间为30min时，主峰总峰面积最大，故确定以30分钟为提取时间。
[0056]
提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂(甲醇、50％甲醇、水)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，主峰总峰面积差别不大，但溶剂为50％甲醇时含量最高，故确定以50％甲醇为提取溶剂。
[0057]
样品取样量考察：分别以样品量(0.5g、1.0g、1.5g)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，样品量为1.0g时，主峰总面积与称样量的比值最大，故确定供试品称样量为1.0g。
[0058]
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：石斛标准汤剂样品约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
[0059]
特征图谱分析方法验证
[0060]
专属性考察：取供试品用溶剂50％甲醇醇10ul，按以上特征图谱测试中的色谱条件进行测定。试验表明：空白溶剂无干扰。
[0061]
重复性试验：取同批样品约0.1g，共6份，按特征图谱测试中的方法进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有4个共有峰，采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度平价，相对保留时间及相对峰面积rsd小于5％(见下表4和表5)，表明该方法重现性良好。
[0062]
表4重复性试验特征图谱相对保留时间
[0063]
峰号s1s2s3s4s5s6rsd(％)
10.7250.7270.7270.7280.7270.7270.13520.7820.7830.7830.7830.7830.7830.0523(s)1111110.00041.5681.5631.5631.5591.5591.5640.217
[0064]
表5重复性试验特征图谱相对峰面积
[0065][0066][0067]
精密度试验：取同批样品约1g，按上述特征图谱测试中的试验方法，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价,相对保留时间及及相对峰面积的rsd均在合格范围内(见下表6和表7)，表明该方法精密度良好。
[0068]
表6精密度试验特征图谱相对保留时间
[0069]
峰号s1s2s3s4s5s6rsd(％)10.7270.7270.7270.7270.7270.7270.00020.7830.7830.7830.7830.7840.7830.0523(s)1111110.00041.5641.5641.5641.5641.5651.5640.026
[0070]
表7精密度试验特征图谱相对峰面积
[0071]
峰号s1s2s3s4s5s6rsd(％)10.7870.7930.7920.7930.8130.8161.50821.2341.2431.2441.2461.2411.2420.3173(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00040.7980.8030.8040.8100.8130.8130.759
[0072]
稳定性试验：取一批样品约1g，按上述特征图谱测试中的试验方法，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，峰形、峰数基本稳定，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价,相对保留时间及保留面积的rsd均在合格范围内(见下表8和表9)，表明供试品溶液在24小时内较稳定。
[0073]
表8稳定性试验特征图谱相对保留时间
[0074]
峰号02h4h8h12h24hrsd(％)10.7250.7260.7280.7270.7270.7270.13020.7820.7820.7830.7830.7830.7830.0603(s)1111110.00041.5681.5651.561.5631.5631.5640.001
[0075]
表9稳定性试验特征图谱相对峰面积
[0076]
峰号0h2h4h8h12h24hrsd(％)10.7090.7290.6960.6960.7280.7452.79321.1511.1771.1731.2221.2341.1952.6453(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00040.7140.7240.7190.7250.7420.7391.560
[0077]
标准汤剂特征图谱表征分析
[0078]
标准汤剂特征图谱测定
[0079]
照上述拟定的特征图谱分析方法，测定15批石斛标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有4个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，其中与夏佛塔苷对照品参照物相对应的峰为峰3，共有峰特征图谱。
[0080]
特征色谱图相似度评价：采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的4个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批石斛饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤剂质量相对稳定。以夏佛塔苷参照物峰相对应的峰(3)为s峰，计算共有峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围见下表10。
[0081]
表10 15批标准汤剂共有峰相对保留时间
[0082][0083][0084]
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，且符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批标准汤剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了4个共有特征峰，其中峰3为夏佛塔苷。以夏佛塔苷参照物相对应的峰为s峰，计算另3个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.72(峰1)、0.78(峰2)、1.57(峰4)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为
±
10％。
[0085]
含量测定：参考2020版《中国药典》中流苏石斛未测定含量，参考霍山石斛特征图谱参照峰为夏佛塔苷。通过试验，发现夏佛塔苷峰形明显，故石斛(流苏石斛)配方颗粒选择夏佛塔苷作为含测成分。
[0086]
试验方法
[0087]
色谱条件：色谱柱：(shim-pack gist 4.6mm*250mm,5.0um)；流动相：以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：40℃；检测波长：340nm。
[0088]
对照品溶液的制备：精密称取夏佛塔苷对照品适量，加甲醇制成70ug/ml的溶液，做为参照对照品溶液。
[0089]
供试品溶液的制备：精密取本品1g置密塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml,称定重量，超声30分钟，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
[0090]
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0091]
方法学考察
[0092]
提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，按上述标准汤剂特征图谱测定中试验方法进行测定。结果表明，样品超声(功率250w,频率25khz)与回流无明显差别，且rsd值为0.153％。(见下表11)，故选择样品提取方式为更便捷的超声处理。
[0093]
表11不同提取方法对比
[0094][0095]
提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述标准汤剂特征图谱测定中试验方法进行测定。结果表明，超声30min的样品含量相对较高(见下表12)，且rsd值为12.462％,故选择超声时间为30min。
[0096]
表12不同提取时间对比
[0097][0098]
提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述标准汤剂特征图谱测定中试验方法进行测定。结果表明，提取溶剂为甲醇时，夏佛塔苷含量最高(见下表13)，且rsd值为12.441％故确定以50％甲醇为提取溶剂。
[0099]
表13不同提取溶剂对比
[0100][0101][0102]
取样量考察：分别以不同称样量(0.5g,1.0g,1.5g)制备供试品溶液，按上述标准汤剂特征图谱测定中试验方法进行测定。结果表明，取样量为1.0g时的样品含量略高(见下
表14)，故样品的取样量为1.0g。
[0103]
表14不同样品取样量对比
[0104][0105]
含量测定方法学验证
[0106]
重复性试验：取同批次标准汤剂样品约1g，共6份，按上述标准汤剂特征图谱测定中试验方法进行测定，测得样品中夏佛塔苷含量平均值分别为0.944mg/g，rsd值为0.93％，试验表明该方法重现性良好(见下表15)。
[0107]
表15重复性试验
[0108][0109]
精密度试验：取标准汤剂特征图谱测定中供试品溶液，连续进样6针，照上述9.1试验方法测定其峰面积，计算样品中夏佛塔苷峰面积的rsd值为0.646％，表明仪器精密度良好(见下表16)。
[0110]
表16精密度试验
[0111][0112]
稳定性试验：取一批汤剂样品约1g，按上述9.1试验方法，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的rsd值为1.416％，试验表明供试品溶液在24
小时内较稳定(见下表17)。
[0113]
表17稳定性试验
[0114][0115]
线性范围试验：取夏佛塔苷对照品溶液(浓度为69.5ug/ml)，分别以不同进样体积进样(1ul、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul)。按上述色谱条件进行测定。以夏佛塔苷峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，
[0116]
夏佛塔苷 方程为：y＝3.0e 6x 11826
[0117]
r2＝1.0000
[0118]
可见夏佛塔苷在0.00695mg/ml～0.17375mg/ml范围内与其峰面积具有良好的线性关系(见下表18与图2)。
[0119]
表18夏佛塔苷线性考察结果
[0120]
供试液进样质量峰面积线性10.0695206254线性20.34751032445线性30.6952082237线性41.04253107439线性51.394110789线性61.73755135836
[0121]
加样回收率试验：精密称取样品(含量为0.994mg/g)约0.5g共6份，各加入已知浓度的夏佛塔苷对照品溶液(0.0695mg/ml)10ml，按上方法制备供试品溶液，并按色谱条件进行测定，计算平均加样回收率为93.66％，rsd为0.54％。
[0122]
表19加样回收率试验
[0123][0124]
标准汤剂及中药材含量测定：石斛药材经产地初加工，经净制后加工成石斛饮片，其夏佛塔苷含量不会发生变化。
[0125]
照上述拟定的含量分析方法，测定15批石斛(流苏石斛)标准汤剂及其制备使用的15批次石斛(流苏石斛)饮片及药材的夏佛塔苷含量，结果见下表20。
[0126]
表20 15批夏佛塔苷药材测定结果
[0127][0128][0129]
表21 15批干石斛饮片测定结果
[0130][0131]
表22 15批石斛标准汤剂测定结果
[0132][0133][0134]
含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备用中药饮片测定结果，计算夏佛塔苷含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。石斛饮片标准汤剂由石斛饮片加水煎煮2次，滤液浓
缩、冷冻干燥制得。其夏佛塔苷含量转移率(见下表23)。
[0135]
表23 15批石斛标准汤剂夏佛塔苷含量转移率
[0136][0137][0138]
由以上数据可知，石斛(流苏石斛)饮片依方案煎煮制得石斛(流苏石斛)饮片标准汤剂，本品夏佛塔苷平均转移率为32.45％，测得转移率范围为23.61％-47.25％，sd为6.57。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，夏佛塔苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为22.72-42.18％；按照
±
3sd来算，为12.74～52.16％。故拟定本标准汤剂的夏佛塔苷含量转移率范围为：12.74～52.16％。结果表明，15批次标准汤剂中夏佛塔苷转移率均在
±
3sd允许范围之内。
[0139]
本品夏佛塔苷平均含量为0.74mg/g，测得含量范围为0.537～0.919mg/g，sd为0.13；按均值
±
3sd计算，夏佛塔苷含量允许范围为0.35～1.13mg/g。故拟定本标准汤剂的夏佛塔苷含量范围为：0.40mg/g～1.20mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中夏佛塔苷及其转移率均在允许范围之内，可为石斛(流苏石斛)配方颗粒质量研究提供参考依据。
[0140]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如
上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0141]
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。