一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法与流程

1.本发明涉及一种提取物的制备方法，特别是一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法。


背景技术：

2.芍药(paeonia lactiflora pall.)是毛茛科、芍药属的多年生草本植物。其提取物中含有丰富的芍药苷、牡丹酚、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等成分，其中，芍药苷具有最高的含量。芍药苷具有优秀的美白、保湿、抗氧化活性，同时还具有抗炎、抗衰老、抗过敏、维持皮肤健康等功效，非常适合作为化妆品原料进行研究。目前，芍药苷主要的生产手段为提取晒干炮制的生长2～4年的芍药根，再进行分离得到芍药苷。传统的芍药生产方法多为分株繁殖。使用分株法生产的芍药生长周期多为2～4年，使用此种方法生产芍药具有生长周期长、产量与质量不稳定、受气候条件制约较大、生态环境恶化等诸多不利因素。
3.愈伤组织(callus)是指原植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。愈伤组织细胞具有全能性，可分化为任一植物器官，其分裂速度快，次生代谢产物含量高，且植物愈伤组织培养不受气候等外界条件影响，因此以植物的叶片、茎段等作为外植体诱导产生愈伤组织，进行组织培养，来提取芍药苷，具有组织培养速度快、不受环境条件限制等优点，因而可大面积推广。
4.然而目前使用传统的植物愈伤组织培养法生产芍药愈伤组织，容易受到外界环境的干扰、细菌的污染，而影响其存活率，导致芍药愈伤组织诱导分化率与产量较低、愈伤组织易褐化的弊端，从而导致提取到的活性物质含量较低的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法。本发明具有诱导率高、褐化及玻璃化率低、活性物质含量高的特点。
6.本发明的技术方案：一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、制备芍药外植体：
8.a、取芍药种子用纯水浸泡，然后用纱布覆盖，直至种子表面出现裂痕，形成萌发状态的种子，为a品；
9.b、取a品洗净后盖上纱布冲洗，冲洗后经两次消毒除菌，得无菌种子，为b品；
10.c、将b品转入萌发培养基进行培养，直至种子萌发出幼苗，切除幼苗根部及茎部，得芍药外植体，为c品；
11.s2、诱导芍药愈伤组织：将c品置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养出新发的愈伤组织，为d品；
12.s3、培养继代芍药愈伤组织：将d品转入继代培养基中进行放大培养，并按期继代培养，培养出长大的愈伤组织，为e品；
13.s4、制备提取物：将e品制成芍药愈伤组织提取物，为成品。
14.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s1的a步骤中，纯水的加入量为浸没至种子高度的一半。
15.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s1的a步骤中，纯水的温度为35-45℃。
16.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s1的b步骤中，第一次消毒为，采用浓度为2-10％的naclo溶液充分浸泡，然后于多功能旋转摇床上旋转震荡消毒20-40min进行消毒除菌，并用无菌水洗净。
17.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s1的b步骤中，第二次消毒为，采用浓度为70-80％的酒精浸泡消毒除菌，浸泡时间为5-10s，浸泡后用无菌水洗净。
18.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s1的c步骤中，萌发培养基采用ms培养基，ms培养基中添加含量为20-40g/l的蔗糖。
19.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s2中的诱导培养基采用添加1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为6-9mmol/l的ca
2
、1-3mg/l的6-ba、0.2-0.6mg/l的naa、0.1-0.3mg/l的2,4-d和0.05-0.2mg/l的mt。
20.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s3中的继代培养基采用1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为0.2-0.8mg/l的naa、0.2-0.8mg/l的tdz、0.05-0.2mg/l的2,4-d和0.05-0.2mg/l的mt。
21.前述的一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法中，所述步骤s4制备提取物具体为，将e品经常规方法制成芍药愈伤组织提取物，或者将e品冻干粉碎后，溶解于体积百分比为40-60％的丁二醇中，愈伤组织粉末和丁二醇的料液比为1g:10-40ml，回流提取，提取温度为40-60℃，提取时间为40-80min。
22.与现有技术相比，本发明在制备芍药外植体时，在芍药的种子发芽阶段即采用无菌培养的培养方法，并在种子萌发状态经过两次消毒处理，实现完全消毒，以保证所得外植体的绝对无菌，因此使用本发明的操作方法可有效降低外植体移入培养基后长菌的问题，是提高诱导率的关键保障。
23.采用特别配置的ms诱导培养基作为愈伤组织诱导培养基，具有高诱导力，可达到100％诱导成功率，其中添加了褪黑素(mt)，比传统的诱导培养基具有更高的诱导能力，降低平均诱导天数，可以有效提高植物细胞培养体系的抗逆性；采用特别配置的ms继代培养基，通过控制naa、tdz、2,4-d和mt的浓度和配比，使其达到了最大的促进效率。tdz及mt的加入具有明显的抗褐化、抗玻璃化的效果，同时加快愈伤组织分裂的速度，促进愈伤组织生长能力，增加次生代谢产物合成。
24.通过将新鲜愈伤组织快速吸干水分进行冻干的工艺，可最大限度的保证愈伤组织中活性物质的活性与结构完整性，可有效的提高提取物中芍药苷的含量与质量，是提高最终产物质量的关键操作。
25.所制备的芍药愈伤组织，诱导率可达到100％，且在培养继代过程中褐化率低于
10％，具有诱导率高、褐化及玻璃化率低的特点，可稳定大量生产。经质量验证，该愈伤组织的收获周期为45d，生产芍药苷的能力略高于芍药药材，愈伤组织提取物中的活性物质含量高且稳定，芍药苷的最终产量应不低于37.14μg/ml。
具体实施方式
26.一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
27.s1、制备芍药外植体：
28.a、选取芍药种子，置于烧杯底部，使用35-45℃纯水浸泡，纯水加至种子高度的一半，然后用纱布覆盖，每24h更换，直至种子表面的硬壳出现裂痕，形成萌发状态的种子，为a品。此步操作为促进种子进入萌发状态，出现裂痕即为种子已做好了萌发准备。
29.b、取萌发状态较好的a品，充分洗净后置于烧杯中，盖上纱布，使用流水长时间冲洗，冲洗后经浓度为2-10％的naclo溶液对a品充分浸泡，然后于多功能旋转摇床上旋转震荡消毒20-40min，处理后用无菌水洗净，进行第一次消毒除菌处理，之后将表面除菌完成的a品置于超净台中，使用浓度为70-80％的酒精浸泡，浸泡时间为5-10s，处理后用无菌水洗净，进行第二次消毒除菌处理，并反复第二次消毒2-5次后，用滤纸吸干种子表面水分，即可得无菌种子，为b品。
30.c、将b品转入萌发培养基进行培养，每15天更换新培养基，以保证充足的营养供给种子萌发，直至种子萌发出幼苗，在超净台中取出整株芍药幼苗，切除幼苗根部及茎部，留下根部与茎部相连的茎段部分，得芍药外植体，为c品；其中萌发培养基采用ms培养基，ms培养基中添加含量为20-40g/l的蔗糖。
31.s2、诱导芍药愈伤组织：将c品置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养出新发的愈伤组织，该愈伤组织为d品；其中，诱导培养基采用添加1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为6-9mmol/l的ca
2
、1-3mg/l的6-ba、0.2-0.6mg/l的naa、0.1-0.3mg/l的2,4-d和0.05-0.2mg/l的mt。
32.s3、培养继代芍药愈伤组织：将d品转入继代培养基中进行芍药愈伤组织的放大培养，并按期继代培养，培养出长大的愈伤组织，为e品；其中，继代培养基采用1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为0.2-0.8mg/l的naa、0.2-0.8mg/l的tdz、0.05-0.2mg/l的2,4-d和0.05-0.2mg/l的mt。
33.s4、制备提取物：将旺盛生长的e品经常规方法制成芍药愈伤组织提取物，例如将e品与多元醇混合后，均质分散得芍药愈伤组织提取物；
34.或者将旺盛生长的e品用滤纸吸干表面水分，并快速冻干处理，冻干完成后使用高通量研磨机将愈伤组织研磨成愈伤组织粉末，溶解于体积百分比为40-60％的丁二醇中，愈伤组织粉末和丁二醇的料液比为1g:10-40ml，回流提取，提取温度为40-60℃，提取时间为40-80min，得到芍药愈伤组织提取物。
35.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
36.实施例1：
37.一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
38.s1、制备芍药外植体：
39.a、选取芍药种子，置于烧杯底部，使用40℃纯水浸泡，纯水加至种子高度的一半，
然后用纱布覆盖，每24h更换，直至种子表面的硬壳出现裂痕，形成萌发状态的种子，为a品。此步操作为促进种子进入萌发状态，出现裂痕即为种子已做好了萌发准备。
40.b、取萌发状态较好的a品，充分洗净后置于烧杯中，盖上纱布，使用流水长时间冲洗，冲洗后经浓度为5％的naclo溶液对a品充分浸泡，然后于多功能旋转摇床上旋转震荡消毒30min处理后用无菌水洗净，进行第一次消毒除菌处理，之后将表面除菌完成的a品置于超净台中，使用浓度为75％的酒精浸泡，浸泡时间为5-10s，处理后用无菌水洗净，进行第二次消毒除菌处理，并反复第二次消毒3次后，用滤纸吸干种子表面水分，即可得无菌种子，为b品。
41.c、将b品转入萌发培养基进行培养，每15天更换新培养基，以保证充足的营养供给种子萌发，直至种子萌发出幼苗，在超净台中取出整株芍药幼苗，切除幼苗根部及茎部，留下根部与茎部相连的茎段部分，得芍药外植体，为c品；其中萌发培养基采用ms培养基，ms培养基中添加含量为30g/l的蔗糖。
42.s2、诱导芍药愈伤组织：将c品置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养出新发的愈伤组织，该愈伤组织为d品；其中，诱导培养基采用添加1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为7mmol/l的ca2 、2.0mg/l的6-ba、0.4mg/l的naa、0.2mg/l的2,4-d和0.1mg/l的mt。
43.s3、培养继代芍药愈伤组织：将d品转入继代培养基中进行芍药愈伤组织的放大培养，并按期继代培养，培养出长大的愈伤组织，为e品；其中，继代培养基采用1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为0.5mg/l的naa、0.5mg/l的tdz、0.1mg/l的2,4-d和0.1mg/l的mt。
44.s4、制备提取物：将旺盛生长的e品与甘油按照1:10(g：ml)的料液比混合后，均质分散得芍药愈伤组织提取物。
45.实施例2：
46.一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
47.s1、制备芍药外植体：
48.a、选取芍药种子，置于烧杯底部，使用40℃纯水浸泡，纯水加至种子高度的一半，然后用纱布覆盖，每24h更换，直至种子表面的硬壳出现裂痕，形成萌发状态的种子，为a品。此步操作为促进种子进入萌发状态，出现裂痕即为种子已做好了萌发准备。
49.b、取萌发状态较好的a品，充分洗净后置于烧杯中，盖上纱布，使用流水长时间冲洗，冲洗后经浓度为5％的naclo溶液对a品充分浸泡，然后于多功能旋转摇床上旋转震荡消毒30min处理后用无菌水洗净，进行第一次消毒除菌处理，之后将表面除菌完成的a品置于超净台中，使用浓度为75％的酒精浸泡，浸泡时间为5-10s，处理后用无菌水洗净，进行第二次消毒除菌处理，并反复第二次消毒3次后，用滤纸吸干种子表面水分，即可得无菌种子，为b品。
50.c、将b品转入萌发培养基进行培养，每15天更换新培养基，以保证充足的营养供给种子萌发，直至种子萌发出幼苗，在超净台中取出整株芍药幼苗，切除幼苗根部及茎部，留下根部与茎部相连的茎段部分，得芍药外植体，为c品；其中萌发培养基采用ms培养基，ms培养基中添加含量为30g/l的蔗糖。
51.s2、诱导芍药愈伤组织：将c品置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养出
新发的愈伤组织，该愈伤组织为d品；其中，诱导培养基采用添加1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为7mmol/l的ca2 、2.0mg/l的6-ba、0.4mg/l的naa、0.2mg/l的2,4-d和0.1mg/l的mt。
52.s3、培养继代芍药愈伤组织：将d品转入继代培养基中进行芍药愈伤组织的放大培养，并按期继代培养，培养出长大的愈伤组织，为e品；其中，继代培养基采用1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为0.5mg/l的naa、0.5mg/l的tdz、0.1mg/l的2,4-d和0.1mg/l的mt。
53.s4、制备提取物：将旺盛生长的e品用滤纸吸干表面水分，并快速转入冻干机进行冻干处理，冻干完成后使用高通量研磨机将愈伤组织研磨成愈伤组织粉末，将愈伤组织粉末溶解于体积百分比为50％的丁二醇中，愈伤组织粉末和丁二醇的料液比为1g:20ml，回流提取，提取温度为50℃，提取时间为60min，得到芍药愈伤组织提取物。
54.实施例3：
55.一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
56.s1、制备芍药外植体：
57.a、选取芍药种子，置于烧杯底部，使用40℃纯水浸泡，纯水加至种子高度的一半，然后用纱布覆盖，每24h更换，直至种子表面的硬壳出现裂痕，形成萌发状态的种子，为a品。此步操作为促进种子进入萌发状态，出现裂痕即为种子已做好了萌发准备。
58.b、取萌发状态较好的a品，充分洗净后置于烧杯中，盖上纱布，使用流水长时间冲洗，冲洗后经浓度为5％的naclo溶液对a品充分浸泡，然后于多功能旋转摇床上旋转震荡消毒20min处理后用无菌水洗净，进行第一次消毒除菌处理，之后将表面除菌完成的a品置于超净台中，使用浓度为75％的酒精浸泡，浸泡时间为5-10s，处理后用无菌水洗净，进行第二次消毒除菌处理，并反复第二次消毒2次后，用滤纸吸干种子表面水分，即可得无菌种子，为b品。
59.c、将b品转入萌发培养基进行培养，每15天更换新培养基，以保证充足的营养供给种子萌发，直至种子萌发出幼苗，在超净台中取出整株芍药幼苗，切除幼苗根部及茎部，留下根部与茎部相连的茎段部分，得芍药外植体，为c品；其中萌发培养基采用ms培养基，ms培养基中添加含量为20g/l的蔗糖。
60.s2、诱导芍药愈伤组织：将c品置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养出新发的愈伤组织，该愈伤组织为d品；其中，诱导培养基采用添加1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为8mmol/l的ca2 、3.0mg/l的6-ba、0.2mg/l的naa、0.1mg/l的2,4-d和0.2mg/l的mt。
61.s3、培养继代芍药愈伤组织：将d品转入继代培养基中进行芍药愈伤组织的放大培养，并按期继代培养，培养出长大的愈伤组织，为e品；其中，继代培养基采用1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为0.2mg/l的naa、0.8mg/l的tdz、0.2mg/l的2,4-d和0.05mg/l的mt。
62.s4、制备提取物：将旺盛生长的e品用滤纸吸干表面水分，并快速转入冻干机进行冻干处理，冻干完成后使用高通量研磨机将愈伤组织研磨成愈伤组织粉末，将愈伤组织粉末溶解于体积百分比为40％的丁二醇中，愈伤组织粉末和丁二醇的料液比为1g:10ml，回流提取，提取温度为40℃，提取时间为80min，得到芍药愈伤组织提取物。
63.实施例4：
64.一种芍药苷含量高的芍药愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
65.s1、制备芍药外植体：
66.a、选取芍药种子，置于烧杯底部，使用40℃纯水浸泡，纯水加至种子高度的一半，然后用纱布覆盖，每24h更换，直至种子表面的硬壳出现裂痕，形成萌发状态的种子，为a品。此步操作为促进种子进入萌发状态，出现裂痕即为种子已做好了萌发准备。
67.b、取萌发状态较好的a品，充分洗净后置于烧杯中，盖上纱布，使用流水长时间冲洗，冲洗后经浓度为2％的naclo溶液对a品充分浸泡，然后于多功能旋转摇床上旋转震荡消毒40min处理后用无菌水洗净，进行第一次消毒除菌处理，之后将表面除菌完成的a品置于超净台中，使用浓度为80％的酒精浸泡，浸泡时间为5-10s，处理后用无菌水洗净，进行第二次消毒除菌处理，并反复第二次消毒5次后，用滤纸吸干种子表面水分，即可得无菌种子，为b品。
68.c、将b品转入萌发培养基进行培养，每15天更换新培养基，以保证充足的营养供给种子萌发，直至种子萌发出幼苗，在超净台中取出整株芍药幼苗，切除幼苗根部及茎部，留下根部与茎部相连的茎段部分，得芍药外植体，为c品；其中萌发培养基采用ms培养基，ms培养基中添加含量为40g/l的蔗糖。
69.s2、诱导芍药愈伤组织：将c品置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养出新发的愈伤组织，该愈伤组织为d品；其中，诱导培养基采用添加1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为9mmol/l的ca
2
、3.0mg/l的6-ba、0.6mg/l的naa、0.3mg/l的2,4-d和0.2mg/l的mt。
70.s3、培养继代芍药愈伤组织：将d品转入继代培养基中进行芍药愈伤组织的放大培养，并按期继代培养，培养出长大的愈伤组织，为e品；其中，继代培养基采用1/2ms培养基，1/2ms培养基中添加含量分别为0.8mg/l的naa、0.2mg/l的tdz、0.05mg/l的2,4-d和0.2mg/l的mt。
71.s4、制备提取物：将旺盛生长的e品用滤纸吸干表面水分，并快速转入冻干机进行冻干处理，冻干完成后使用高通量研磨机将愈伤组织研磨成愈伤组织粉末，将愈伤组织粉末溶解于体积百分比为60％的丁二醇中，愈伤组织粉末和丁二醇的料液比为1g:40ml，回流提取，提取温度为60℃，提取时间为40min，得到芍药愈伤组织提取物。
72.试验检测：
73.将实施例2中的诱导培养基进行替换，替换为1/2ms培养基 2.0mg/l的6-ba 0.4mg/l的naa 0.2mg/l的2,4-d 0.1mg/l的mt作为对比例1；
74.将实施例2中的诱导培养基进行替换，替换为1/2ms培养基 7mmol/l的ca
2
2.0mg/l的6-ba 0.4mg/l的naa 0.2mg/l的2,4-d，作为对比例2；
75.将实施例2中的诱导培养基进行替换，替换为1/2ms培养基 10mmol/l的ca
2
2.0mg/l的6-ba 0.4mg/l的naa 0.2mg/l的2,4-d 0.1mg/l的mt作为对比例3；
76.使用hplc法检测实施例1、实施例2和对比例1-3提取出的芍药愈伤组织提取物中芍药苷的含量。hplc法中采用乙腈和体积浓度为0.1％磷酸的作为流动相，其中乙腈：磷酸的体积比为14:86，流动相的流速为1.0ml/min，进样量为20μl，柱温为25℃，检测波长为230nm。
77.检测结果见表1。
78.表1芍药愈伤组织提取物的检测结果
79.