热休克蛋白90在制备治疗白内障药物中的应用的制作方法

1.本发明属医药领域，具体涉及一种热休克蛋白90在制备治疗白内障药物中的应用。


背景技术：

2.白内障是全球首位致盲眼病，目前尚无有效药物，唯一治疗方式为手术去除混浊晶状体纤维，结合透明人工晶体置换，但术后容易导致多种并发症的产生，如后发性白内障等，再次造成视力障碍。动物实验及临床研究证明，婴幼儿白内障手术后晶状体囊袋残留上皮细胞可再生为晶状体(参见haotian lin，hong ouyang,et al.,lens regeneration using endogenous stem cells with gain of visual function，nature，2016，531(7594):323-328.)。组织再生晶状体是替代人工晶体治疗白内障，避免人工晶体治疗所致并发症的最具前景的新方法。晶状体再生的关键技术问题是提升术后晶状体囊袋残留上皮细胞向晶状体纤维细胞分化。因此，研发具有调控组织再生的关键因子，是推动组织再生晶状体的技术关键。
3.热休克蛋白90(hsp90α)是细胞内重要的蛋白之一，参与多种细胞信号传导。hsp90一直被认为是细胞内蛋白，行使分子伴侣功能。近年研究发现，hsp90能分泌到细胞外，发挥分子伴侣之外的生物学功能，如细胞外hsp90α能促进损伤部位皮肤细胞的迁移能力，促进皮肤愈合。肿瘤细胞分泌hsp90α，参与肿瘤生长、侵袭和转移调控。
4.我们前期研究发现，在白内障手术后导致的并发症-后发性白内障中，抑制晶状体上皮细胞内hsp90α分子伴侣活性能够治疗后发性白内障。但是，本技术意外发现，所述分泌于细胞外的hsp90α(ehsp90)能够直接促进晶状体上皮细胞终末分化为晶状体纤维，即ehsp90是一个新的调控晶状体上皮分化因子，在晶状体再生中发挥重要作用。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明意外发现：hsp90α能够直接促进晶状体上皮细胞终末分化为晶状体纤维，起到促进晶状体再生和治疗白内障的功效。因此，本发明的目的在于提供一种热休克蛋白90的新用途，具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种热休克蛋白90在制备治疗白内障药物中的应用，所述热休克蛋白90的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.第二方面，本发明提供了一种热休克蛋白90在制备促进晶状体上皮细胞终末分化为晶状体纤维药物中的应用，所述热休克蛋白90的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.第三方面，本发明提供了一种热休克蛋白90在制备抑制晶状体上皮细胞间质化药物中的应用，所述热休克蛋白90的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.第四方面，本发明提供了一种热休克蛋白90在制备促进晶状体再生药物中的应用，所述热休克蛋白90的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.优选地，所述热休克蛋白90加入药学上可接受的载体，制成药学上可接受的任一
剂型。
11.第五方面，本发明提供了一种热休克蛋白90截断蛋白在制备治疗白内障药物中的应用，所述热休克蛋白90截断蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
12.第六方面，本发明提供了一种热休克蛋白90截断蛋白在制备促进晶状体上皮细胞终末分化为晶状体纤维药物中的应用，所述热休克蛋白90截断蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
13.第七方面，本发明提供了一种热休克蛋白90截断蛋白在制备抑制晶状体上皮细胞间质化药物中的应用，所述热休克蛋白90截断蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
14.第八方面，本发明提供了一种热休克蛋白90截断蛋白在制备促进晶状体再生药物中的应用，所述热休克蛋白90截断蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
15.优选地，所述热休克蛋白90截断蛋白加入药学上可接受的载体，制成药学上可接受的任一剂型。
16.本发明的有益效果是：
17.(1)本发明发现热休克蛋白90(hsp90α)能够促进晶状体上皮细胞终末分化为晶状体纤维、抑制晶状体上皮细胞间质化、促进晶状体再生、可用于治疗白内障；
18.(2)本发明发现热休克蛋白90截断蛋白(hsp90α氨基酸385-750)能够显著促进晶状体上皮细胞终末分化为晶状体纤维、抑制晶状体上皮细胞间质化、促进晶状体再生、可用于治疗白内障，其效果显著优于热休克蛋白90(hsp90α)；
19.(3)本发明提供了一种不需要植入人工晶体，既可用于治疗白内障的新药物，安全性较高，可以避免后发性白内障等并发症的发展，具有广泛的应用价值。
附图说明
20.图1原核表达人hsp90α及截断体的考染结果；
21.图2晶状体上皮细胞分泌hsp90α；
22.图3hsp90α抑制tgf-β2诱导的上皮间质转化；
23.图4hsp90α诱导晶状体上皮细胞梭形改变；
24.图5hsp90α促进晶状体再生；
25.图6hsp90α截断蛋白(358-750aa)促进晶状体上皮细胞终末分化。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
27.实施例1人hsp90α全长及其截断体蛋白制备
28.提取人hela细胞的rna，通过rt-pcr技术获取热休克蛋白90(hsp90α)基因(seq id no.2所示)。将hsp90α的dna片段和gst标签的原核表达载体pgex-6p-1分别用sma i和xho i进行双酶切，通过连接酶进行连接，得到重组载体pgex-6p-1-hsp90α，并通过测序验证。
29.pgex-6p-1-hsp90α和pgex-6p-1质粒分别转化bl21细菌，涂板过夜后，挑取白色细菌克隆至5毫升lb液体培养基中，220rpm，37℃培养过夜；次日1:100接种至新鲜5毫升lb培养基，继续37℃培养；待细菌od值在0.8左右时，加入终浓度为0.1mm的iptg，30℃，200rpm，
培养5小时；4000rpm/min，离心5分钟，收集细菌沉淀，加入500μl pbs进行超声破碎，8000rpm/min，离心5分钟，收集上清液；通过sds-page胶电泳，考马斯亮蓝染色后，检测蛋白是否表达。
30.取表达蛋白的阳性克隆，进行扩大培养，收集的细菌沉淀通过超声破碎后，用谷胱甘肽预装柱结合akata蛋白纯化仪进行蛋白纯化，透析两天后，30kd超滤管浓缩，triton x-114除内毒素。通过sds-page电泳，考马斯亮蓝染色进行检测。
31.分别设计如下引物对：
32.hsp90α(1-853氨基酸)：正向引物tcccccgggtcccccgtgttcgggcggggac；反向引物cccctcgagttagtctacttcttccatgcgtgatgtgtc；
33.hsp90α-n(1-392氨基酸)：正向引物catgccatggctcccccgtgttcgggcggggac；反向引物cccctcgagttaatccttcttttcttcttcctc；
34.hsp90α-m(357-749氨基酸)：正向引物catgccatggctgaagaaaaggaagacaaagaa；反向引物cccctcgagttacatgtaacccattgttgagtt；
35.hsp90α-c(750-853氨基酸)：正向引物catgccatggctgcagcaaagaaacacctggag；反向引物cccctcgagttagtctacttcttccatgcgtgatgtgtc；
36.hsp90α-δn(357-853氨基酸)：正向引物catgccatggctgaagaaaaggaagacaaagaa；反向引物：cccctcgagttagtctacttcttccatgcgtgatgtgtc。
37.以pgex-6p-1-hsp90α为模板，通过pcr技术获取hsp90α截断体氨基酸1-392，357-749，750-853和357-853的基因，其中，357-749(本发明所述热休克蛋白90截断蛋白)的基因序列如seq id no.4所示；将上述dna片段和his标签的原核表达载体pet-30a( )分别用nco i和xho i进行双酶切，通过连接酶进行连接，分别得到载体pet-30a( )-hsp90α-n(1-392)，pet-30a( )-hsp90α-m(357-749)，pet-30a( )-hsp90α-c(750-853)，pet-30a( )-hsp90α-δn(357-853)，并通过测序验证。结果如图1所示，这些截断体蛋白的表达方法与hsp90α全长蛋白表达方法一样，使用镍柱纯化蛋白。
38.实施例2晶状体上皮细胞分泌hsp90α
39.晶状体囊袋组织体外培养模型构建：wistar大鼠(6-8周，雌雄不限，200-250g)为实验动物，异氟烷吸入麻醉后，取出鼠眼球，用含5％青链霉素的pbs溶液清洗3次后，取出晶状体。将高压灭菌的2％低温琼脂冷却至37℃，倒入无菌模具中。将准备好的晶状体置于琼脂糖中央，吸出多余的琼脂至晶状体赤道部。将模具室温冷却至琼脂凝固。用撕囊镊将晶状体前囊撕开，囊袋内注入乳酸林格氏液进行水分离，使晶状体皮质与囊膜完全分离并脱出眼外。乳酸林格氏液冲洗囊袋，确保无晶状体皮质残留。将含有晶状体的琼脂从模具中取出，并置于24孔板中，在无血清且含非必需氨基酸的m199培养基中培养。晶状体囊袋组织体外培养，无血清培养2天后，换新鲜无血清培养基，按规定时间点收取上清液。
40.体外培养晶状体上皮细胞系人sra01/04和hle-b3，鼠晶状体上皮细胞系mlec。分别收集囊袋组织培养上清液和3中晶状体上皮细胞的上清液，进一步通过tca沉淀方法，得到上清液蛋白。通过免疫印迹检测发现，晶状体上皮细胞分泌hsp90α，结果如图2中a-c所示。
41.后发性白内障模型构建：长耳大白兔(12-16w，雌雄各半，3kg左右)为实验动物，均右眼行晶体囊外摘除术结合人工晶体置换术。3％戊巴比妥钠(1ml/kg)经耳缘静脉进行麻
醉，联合奥布卡因滴眼液表面麻醉。术前20分钟用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，共3次。术前结膜囊内聚维酮碘消毒。在12点位置用1mm宝石刀做约3mm透明角膜切口，透明质酸钠(healon)填充并维持前房，使用撕囊镊行直径约5mm环形撕囊，用vannas剪沿角膜缘将切口扩大至约90
°
，用乳酸林格氏液注入囊下进行水分离，使晶状体皮质与囊膜完全分离并脱出眼外。乳酸钠林格氏液冲洗囊袋及前房，确保无晶状体皮质残留。植入人工晶体后，晶体定位勾调整好人工晶体位置，10-0尼龙线2-3针间断缝合角膜切口，乳酸钠林格氏液置换出healon。2.5微升微量注射器于前房内注射17aag 1mg或等体积的dmso。术毕行球结膜下注射妥布霉素2万单位，地塞米松2.5mg，结膜囊内涂复方妥布霉素眼膏。术后各组每天滴妥布霉素地塞米松滴眼液，每日3次持续至术后7天。于造模后第30天，分别收取术眼(右眼)和正常眼(左眼)的房水，5000rpm/min离心5分钟后，收集上清液。后发性白内障特征为残留晶状体上皮细胞异常增殖、迁移和上皮间质转化(emt)。因此后发性白内障眼房水可以反应晶状体上皮细胞的情况。通过抗hsp90抗体进行免疫沉淀，免疫印迹结果如图2中d所示，后发性白内障的眼房水比正常眼房水含有更高的hsp90α蛋白。
42.实施例3hsp90α抑制tgf-β2诱导的上皮间质转化
43.体外无血清培养晶状体囊袋组织，培养2天后，换新鲜培养基，第一组为含10μg/ml gst的无血清培养基，第二组为含10μg/ml gst-hsp90α的无血清培养基，第三组为含10ng/ml tgf-β2和10μg/ml gst的无血清培养基，第四组为含10ng/ml tgf-β2和10μg/ml gst-hsp90α的无血清培养基。培养36小时，分别提取囊袋组织的rna和蛋白，分别进行rt-qpcr和免疫印迹，检测上皮间质转化(emt)的标志物，α-sma和e-cadherin。
44.结果如图3所示，tgf-β2处理组有大量的emt标志物α-sma表达，上皮细胞标志物e-cadherin表达降低；tgf-β2和gst-hsp90α共处理组α-sma和e-cadherin表达降低，即hsp90α抑制tgf-β2诱导的晶状体上皮细胞emt。
45.实施例4hsp90α促进晶状体再生
46.(1)体外无血清培养晶状体囊袋组织，培养2天后，换新鲜培养基，一组为含10μg/ml gst的无血清培养基，一组为含10μg/ml gst-hsp90α的无血清培养基。培养48小时，分别提取gst和gst-hsp90α组囊袋组织的rna，进行rt-qpcr；培养4-5天，分别提取gst和gst-hsp90α组囊袋组织的蛋白质，进行免疫印迹。
47.结果如图4和图5所示，gst-hsp90α处理组晶状体上皮细胞形态发生梭形改变(图4所示)；且晶状体纤维分化重要转录因子prox1高表达，其下游多种纤维细胞标志物蛋白如cryba1，crybb1，cryga，crygd，bfsp1，mip26均高表达(图5中a-b所示)；晶状体上皮细胞终末分化为纤维细胞时，发生细胞周期停滞，prox1下游抑制细胞周期的p27kip1和p57kip2均高表达(图5中b所示)。
48.(2)为进一步确证细胞外hsp90通过prox1诱导晶状体上皮细胞分化，构建大鼠prox1的shrna，大鼠prox1靶标序列：ggcgaactcgtatgaagatgc和ggcgctcagacaatgagatgt。将shrna序列和plko.1载体通过age i和ecor i进行双酶切，通过连接酶进行连接，得到重组载体plko.1-prox1，并通过测序验证。将plko.1-shlrp1和辅助质粒共转染293t细胞，培养2天后，收集培养上清液，0.45μm滤膜过滤。此上清液培养晶状体囊袋组织2天后，换新鲜无血清培养基培养过夜，然后换含10μg/ml的gst或gst-hsp90α的无血清培养基，培养2天后，其中每组3个囊袋组织提取蛋白质验证shrna敲低效果。3个囊袋组织提取rna，检测晶状
体纤维标志物crybb1、crygb和p27kip1的mrna水平结果如图5中e-g所示，敲低prox1后，抑制hsp90诱导的晶状体纤维标志物蛋白表达。表明，细胞外hsp90α通过prox1促进晶状体上皮细胞终末分化。
49.(3)体外无血清培养大鼠晶状体囊袋组织，培养2天后，换新鲜培养基，一组为无血清培养基，一组为含10μg/ml gst的无血清培养基，一组为含10μg/ml gst-hsp90α的无血清培养基。培养4-5天后，提取蛋白质，通过免疫印迹检测发现，hsp90α处理组akt s473磷酸化水平升高(图5中c-d)，即，hsp90α通过akt信号通路调控prox1高表达。
50.(4)为进一步确证细胞外hsp90α促进晶状体再生，我们体外培养原代晶状体上皮细胞团，分别进行gst-hsp90α和gst处理，检测gst-hsp90α是否促进细胞团晶状体上皮细胞分化。取大鼠晶状体上皮组织，0.125％胰酶进行消化，含10％fbs的m199培养基体外培养大鼠原代晶状体上皮细胞。传至第10代时，进行matrigel胶(bd公司)细胞团培养。原代晶状体上皮细胞，计数后移液器取5
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104个细胞置于1.5毫升ep管，2000g，离心5分钟，制备成细胞团。37度培养箱孵育过夜。次日，预冷24孔板加入300μl matrigel胶，37度静置20分钟后，用移液器将细胞团接种于matrigel胶中，每孔3个细胞团，37度静置1小时，然后分别加入含10μg/ml的gst-hsp90α或gst的m199无血清培养基，共处理4周。细胞团行4％多聚甲醛固定，梯度脱水后，石蜡包埋，制备石蜡切片(4μm)。石蜡切片行he染色，光学显微镜观察细胞团结构。结果如图5中h所示：gst-hsp90α处理组，细胞团内部晶状体上皮细胞发生终末分化，细胞核降解，仅残留少量未完全降解的细胞核(蓝紫色)，细胞团仅见外周有薄层上皮细胞包绕，其细胞核较大；gst处理组，细胞团内部仅部分上皮细胞发生终末分化，内部可见大量未降解蓝紫色细胞核，外周有多层细胞核较大的晶状体上皮细胞包绕。比例尺均为50μm。结果表明，gst-hsp90α能够促进晶状体再生。
51.以上结果表明，hsp90α能够促进晶状体上皮细胞终末分化为纤维细胞，促进晶状体再生，能够用于治疗白内障。
52.实施例5hsp90α-m结构域(氨基酸357-749)促进晶状体上皮细胞终末分化
53.体外无血清培养晶状体囊袋组织，培养2天后，换新鲜培养基，分别加入10μg/ml的gst，gst-hsp90α，his-hsp90α-n，his-hsp90α-m，his-hsp90α-δn和his-hsp90α-c，处理4-5天后，提取蛋白质，观察细胞形态和免疫印迹，结果如图6所示，hsp90α-m和hsp90α-δn截断体促进晶状体上皮细胞形态梭形改变，hsp90α-n和hsp90α-c两种截断体均不影响其形态，因此，hsp90α蛋白促进晶状体上皮细胞终末分化的功能结构域为hsp90α-m。进一步通过免疫印迹确证上述结论，如图6中c所示，hsp90α的三个截断体中hsp90α-m促进晶状体纤维分化关键因子prox1高表达，因此，hsp90α-m结构域(hsp90截断蛋白357-749aa)能够显著促进晶状体上皮细胞终末分化为纤维细胞，可用于治疗白内障。