一种新型免疫激动剂复合物的组成及其在制备防治阿尔茨海默症药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型免疫激动剂复合物的组成、制备方法及其在制备防治阿尔茨海默症及其它神经退行性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默症(alzheimer’s disease,ad),俗称老年痴呆症，目前已成为世界上最重大的疾病之一，美国fda和中国cfda批准的抗阿尔茨海默病药物很少，药物治标不治本，疗效不显著。全球抗阿尔茨海默病药物多数还处于临床阶段，主要作用于神经信号通路和aβ淀粉样蛋白斑。但是，病人众多，药物需求很大。65岁及以上的ad患病率达到4.8％，年龄每增加5岁，患病率增长一倍，85岁以上老人ad患病率达到28.9％。目前世界有ad患者达5000万人。美国、日本等主要国家阿尔茨海默症治疗的市场规模达到100亿美元以上，而且该药物市场逐年增加。
3.阿尔茨海默症是由德国学者alosi alzheimer于1907年首次报道。这是一种常发于老年人群中的中枢神经系统原发性退行性疾病，目前全世界有超过 5000多万ad患者，其临床表现为不同程度的记忆力丧失、语言困难、定向力障碍、认知能力降低、人格及行为和感情活动异常、进行性智力障碍、以至于生活不能自理，完全呆傻，最后全身衰竭，并发感染而亡。目前ad已经成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。ad最典型的病理特征为：大脑皮层和海马组织内出现大量的老年斑(senile plaques,sp)、神经纤维缠结 (neurofibrillary tangles,nfts)、神经元数量减少和颗粒空泡变性。ad的发病机理十分复杂，可能是多种因素相互作用的结果。迄今为止，其确切的发病机理还是一个未解之谜，但在近三十年的研究证据表明，淀粉样多肽(amyloid-betapeptide,aβ)、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,app)、大脑内稳态调节蛋白及其相关的的金属离子内稳态平衡与ad的发生、发展有着密切的联系。
4.另外，大脑消耗人体20％的氧气，而且抗氧化剂和相关酶的浓度相对较低又富含不饱和脂肪酸，易受氧化损伤。正常情况下，细胞可以通过调节内稳态平衡对抗氧化攻击，但随着年龄增长，细胞保持平衡的能力减低，导致自由基积累，线粒体功能失调，神经元损伤。氧化损伤诱发信号传导通路，操纵细胞对压力的反应，这个反应的表现就是ros的增加。当ros的数量超过了神经元细胞对抗的能力时就会发生氧化胁迫，进而导致线粒体机能障碍以及神经元细胞损伤。线粒体中缺乏组蛋白以及线粒体中dna修复功能的减弱都是造成线粒体易产生氧化胁迫的原因。铁、铜离子被认为是ad中氧化胁迫发生的重要原因。在ad 病中，氧化损伤的增加不是最终的结果，而是具有起始作用。ad的初期，神经细胞尽管氧化损伤增加，但实际上仍然是处于内稳态平衡的。随着ad病的发展及相应的ros水平的增加，aβ-金属化合物和过度磷酸化的tau蛋白将不能有效的被去除，导致淀粉样斑块和神经纤维缠结的不可控地增加，而这又会导致反应活性物质的进一步增多，这种恶化的反馈机制最终造成神经元功能丧失。
5.国内外已对ad的神经病理机制进行了大量的研究。70年代中期以来，大量药理学研究集中于提高突触裂隙中的乙酰胆碱水平，发现了一系列乙酰胆碱酯酶的抑制剂类药物。然而，这种治疗仅是缓解症状的治标疗法。80年代中期以来，许多研究围绕aβ的形成、聚集以及清除机制，或aβ的神经毒性机制进行。以aβ为靶标治疗ad病的药物有aβ前体蛋白app分泌酶的抑制剂、抗aβ聚集的金属离子螯合剂和aβ的抗体等。然而，2008年lancet报道，aβ疫苗能有效地清除脑内aβ斑，但并不能阻止痴呆症状的发展。这一报道对围绕aβ斑的治疗研究提出了疑问。这些结果说明，aβ斑本身并不是细胞毒性的主要根源，可能的机制是，aβ斑在形成过程中产生的ros对神经细胞造成毒性。运用同步辐射x-射线荧光分析技术发现老年斑中有高浓度金属离子的聚集，如铜、铁、锌金属离子的含量分别高达1.0、0.4和1.0mm。大脑中这些过渡金属离子异常高浓度聚集及其相关的蛋白质(如aβ、tau蛋白等)异常聚集是多种神经退行性疾病的共有特征。因此，金属离子与神经医学高度关联的这一领域受到科学家和神经医学科学家的极大关注。大量研究报道显示：脑神经中某些过渡金属离子的内稳态失衡是ad病人神经元死亡的主要起因之一；脑中这些过渡金属离子，特别是能够进行单电子氧化还原的cu和fe离子的内稳态调节，以及有关的活性氧物种(ros)水平的调控是治疗ad病的有效策略。因此，研究和探索大脑内过渡金属离子及其相互作用的金属蛋白质内稳态调控机制是理解神经元之间的信号传递和ad病理机制的关键环节，大脑内稳态调控关键蛋白及其有关的金属离子离子和ros内稳态调控是治疗老年痴呆的关键因素。
6.金属硫蛋白-3(metallothionein-3,mt3)，在大脑中特异性表达。mt3由 68个氨基酸组成，其中就包括了20个保守的半胱氨酸。它的两个结构域含有两个金属簇，总共能够结合7个二价的金属离子。n-端beta-结构域中的m3s9和存在于c-端的alpha-结构域的m4s11。两个结构域之间通过kks三个氨基酸连接。大脑中mt3大量分布于神经星形细胞，但是在ad患者脑中，mt3的表达量明显下降约三分之一。mt3表达的受损可能与ad症状的发生或神经功能损伤有关。mt3还可以将no信号转化为锌离子信号。no通过与mt3中结合锌的半胱氨酸直接发生s-亚硝基反应或者与s-亚硝基硫醇发生亚硝基转换反应，将锌离子zn2 从mt3中释放出来。
7.锌离子是大脑中的信使，大脑具有最高的锌含量，最典型的是在灰质中可达到约150μm。大脑中处于自由离子形式的锌大量富集在许多谷氨酸能神经末端 (10-15％)。当锌被释放后进入突触间隙，在突触间隙内离子浓度可上升至毫摩尔数量级。和铜离子一样，释放的锌离子在突触间隙内与神经受体如nmda相互作用，同时也会作用于多种神经元离子通道及转运子来调控神经信号传导。多种锌转运蛋白(znts)以及金属硫蛋白mts等结合胞质中的锌离子，从而阻止游离的锌离子转变为有毒状态。相比于铜离子，血浆中的锌离子含量从出生后逐步下降，且ad患者的血浆中锌离子含量比同龄正常人有进一步的减少。尽管锌离子总含量与大脑年龄的老化没有关系，然后已知一些特定区域含有高浓度的z 锌离子，如高谷氨酸能支配的海马区，随着年龄的增长表现出锌离子含量的降低。现在的多篇文献报道，大脑补锌可能是防治老年痴呆症的有效策略之一。
8.金属硫蛋白mt3是神经元内部锌的主要来源，近期的研究发现，结合于mt3上的锌离子能够同abeta-cu复合物发生金属置换，从而抑制了abeta还原二价铜离子cu2 所产生的氧化损伤。ad脑中锌离子失衡，可能源自锌离子输出的抑制。小鼠动物研究指出，系统性
锌离子的缺失引起了脑中锌离子的滞留，而这种作用是通过抑制胞内锌离子输出蛋白znt1所致。
9.神经突触中，mt3、abeta和铜金属离子可能形成一种动态平衡。在znt3 的作用下，zn2 和谷氨酸同时聚集于前突触囊泡中，zn2 在突触间隙中浓度高达0.3mm，而nmda介导的激活使铜离子在突触后释放，转运到突触间隙，随之铜离子在突触间隙的浓度达到毫摩尔级。反过来铜和锌都可以抑制nmda 受体的应答反应。abeta经淀粉样蛋白前体蛋白app酶切后释放到突触间隙后可以与间隙内的铜发生反应，然后交联形成可溶性的abeta聚集体甚至形成淀粉样沉淀。mt3由邻近的星形胶质细胞释放进入突触间隙，可以缓解这一不利反应的发生。神经金属离子、abeta、mt3在突触间隙形成一个动态平衡，这种平衡可阻止abeta在突触间隙中形成纤维沉淀。适当的神经突触活动可能会促进这一平衡系统，但是过度的或异常的神经活动可能对这一系统有害。调控脑神经内稳态[金属离子-abeta-mt3]形成有益的平衡可能是治疗老年痴呆症的创新思路，对ad病的调控治疗有重要意义。
[0010]
因为ad大脑中稳态调控蛋白mt3的表达量下降至少三分之一，补充mt3 是防治ad的有效策略之一。但是，mt3是一个分子量7000的多肽，很难穿过血脑屏障。本发明运用能够穿过细胞膜和血脑屏障的跨膜肽gh625与mt3重组，制备了融合蛋白gmt3h625，然后经过金属重组而组成zn7mt3gh625。该创新组成的融合金属蛋白再通过与脂质体化学键偶联，脂质体包含天然免疫激动剂，组成新型复合物，由gmt3h625引导该新型复合物能有效通过血脑屏障。
[0011]
德国波恩大学的一项突破性研究发现：阿尔茨海默症是由脑部免疫细胞的炎症所引起。此前人类对于阿尔兹海默症的致病原因及发病机制一直未能完全确定，这一发现无疑是超级重磅。科学家预言，这项新发现为药物研发提供了新思路，人类或可能在未来五年内治愈甚至预防阿尔兹海默症。该研究结果已发表在世界顶级科学类杂志《自然》上。德国波恩大学michaelheneka教授和他的同事认为，有炎症参与阿兹海默症过程，β—淀粉样蛋白斑块是由炎症引起的。他们发现，破坏脑中的小胶质细胞，可以减少阿尔茨海默症形成的β—淀粉样蛋白斑块。因此，他们的研究直接针对引起炎症的小胶质细胞，而不是β—淀粉样蛋白。研究人员发现，当炎症发生时，小胶质细胞会释放出asc微粒蛋白，活化β—淀粉样蛋白，促进淀粉样斑块产生。德国波恩大学的heneka教授说，这个病理过程可能发生在阿尔茨海默氏症的早期阶段。
[0012]
近年来，大规模外显子测序研究发现，很多小胶质细胞基因上的突变与ad 发病风险相关，提示大脑免疫功能紊乱可能与ad的病理进程相关。其中最具代表性的发现是，发现了髓样细胞触发性受体-2(triggering receptor expressed onmyeloid cells 2,trem2)是多个神经退行性疾病的共有风险基因，其编码区r47h 突变增加近3倍罹患ad的风险，同时也显著增加额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化病和帕金森病等的发病风险。trem2在大脑内的小胶质细胞中特异表达，其突变与ad风险的增加高度关联。但是，关于trem2如何参与并影响ad病理进程尚不十分清楚。neuron杂志在线背靠背发表了两篇相似的工作，揭示了 trem2行使其功能的具体细节。其中一篇题为“trem2 is a receptor forb-amyloid that mediates microglial function”的论文由厦门大学神经科学研究所暨福建省神经退行性疾病及衰老研究重点实验室许华曦教授课题组与福建医学大学、美国sanford burnham prebys医学发现研究所、德克萨斯大学休斯顿健康科学中心、梅奥医学中心等单
位合作完成。该研究发现，在大脑免疫细胞中的一种受体trem2能与有毒的β-淀粉样蛋白(aβ)相互作用,并激活神经免疫细胞——小胶质细胞来清除aβ，从而可能延缓ad发病的进程。在小鼠模型中 trem2除了能减少与阿尔茨海默病相关的病理,还能够缓解认知功能上的缺陷。这提示使用大脑现有的免疫机制来清除淀粉样蛋白可以作为一种治疗ad的新策略，可通过上调trem2的表达或激活trem2信号通路实现。我们的研究发现，通过激活天然免疫通路sting可以促进大脑免疫细胞上调trem2的表达或激活 trem2信号通路，消除大脑慢性炎症，减少大脑老年斑。
[0013]
天然免疫通路(sting通路)是i型干扰素基因刺激通路，内质网(er)受体蛋白(sting)对胞质dna的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cgmp-amp二核苷酸合成酶(cgas)在结合dna后的活化条件下，内源性地催化cgamp的合成。cgamp是一种胞质dna传感器，它作为第二信使通过sting 刺激inf-β的感应，介导tbk1和irf-3的活化，进而启动inf-β基因的转录。 cgamp结合sting，使转录因子irf3激活并产生β干扰素。环二核苷酸cgamp，是到目前为止发现的唯一一类既能直接激活鼠源又能激活人源sting蛋白的 sting激动剂。激动剂是指能与细胞上受体或信号转导途径的蛋白分子相结合，并产生天然物质的典型生理效能的化学品或药物。环二核苷酸cgamp，作为 sting的天然激动剂，能够诱导i性干扰素产生(x cai,yh chiu,zjchen,molecular cell,volume 54,issue 2,24april 2014,pages 289
–
296)。
[0014]
ad的发病机理仍然是没有理解清楚，未来5-10年ad药物开发如何发展？最好的治疗模式又是什么？随着对ad了解加深，其治疗有可能通过药物组合或符合药物来实现。综合ad发病机制研究进展，考虑大脑内稳态平衡调控和免疫调节，以补充阿尔茨海默病大脑中缺少的金属稳态平衡调控蛋白、增加神经营养元素锌、增强大脑免疫调控为目的，通过生物基因工程和化学合成相结合的复合方法，制备了zn7mt3gh625重组融合金属蛋白偶联免疫激动剂多功能新型免疫激动剂复合物。在此基础上，运用阿尔茨海默症转基因小鼠模型，研究了该新型免疫激动剂复合物在脑神经中的内稳态调控功能和大脑免疫调控。研究发现，该新型免疫激动剂复合物能有效地调控大脑金属离子内稳态平衡，削减大脑慢性炎症，能改善ad脑认知功能障碍、调控ad脑海马体细胞形态、抑制ad脑内淀粉样蛋白沉积以及抑制脑内神经细胞凋亡，能有效阻止老年痴呆症病情进展。因此，该新型免疫激动剂复合物在防治阿尔茨海默症或其它神经退行性疾病药物方面有广阔的应用前景。


技术实现要素：

[0015]
发明人通过阿尔茨海默症小鼠模型研究，综合研究优化了天然免疫激动剂的免疫调节、脑靶向跨血脑屏障跨膜肽作用、大脑内稳态平衡调控蛋白、神经递质锌和脂质体的作用和优点，提供了一种优化的新型免疫激动剂复合物及其制备方法，该新型复合物能应用于预防或治疗阿尔茨海默症或其它神经退行性疾病，或者应用于阿尔茨海默症(ad)或其它神经退行性疾病的药物开发。
[0016]
该新型免疫激动剂复合物由大脑金属离子内稳态调控蛋白zn7mt3与跨膜肽gh625融合重组蛋白偶联脂质体与天然免疫激动剂构成，免疫激动剂包封于重组蛋白偶联的脂质体中。
[0017]
因此，本发明的一个目的在于提供上述新型免疫激动剂复合物及其衍生物的应
用，将该新型免疫激动剂复合物或其衍生物应用于预防或治疗阿尔茨海默症或其它神经退行性疾病，或者应用于开发、筛选或制备适用于阿尔茨海默症或其它神经退行性疾病的药物。
[0018]
优选的，将该新型免疫激动剂复合物或其衍生物应用于改善ad脑认知功能障碍、抑制ad脑内淀粉样蛋白沉积或抑制脑内神经细胞凋亡、削减大脑慢性验证，阻止老年痴呆症病情进展。
[0019]
优选的：所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂中的至少一种。
[0020]
本发明还有一个目的在于提供一种新型免疫激动剂复合物的制备方法。该新型免疫激动剂复合物由大脑金属离子内稳态调控蛋白与跨膜肽融合重组蛋白 gh625-zn7mt3偶联脂质体与天然免疫激动剂构成，免疫激动剂包封于重组蛋白偶联的脂质体中。
[0021]
优选的，所述gh625包括单纯疱疹病毒的糖蛋白中的一段跨膜序列，该跨膜序列含有23个氨基酸残基，所述mt3包括金属硫蛋白iii，该金属硫蛋白iii含有 68个氨基酸残基。
[0022]
优选的，通过基因工程技术，运用载体，构建含有融合标签的smt3-mt3的基因表达质粒，将gh625的基因序列插入到smt3-mt3基因，组成smt3-gh625-mt3 融合蛋白基因，在大肠杆菌中使smt3-gh625-mt3重组融合蛋白可溶表达，分离纯化获得gh625-mt3重组融合蛋白,进而通过化学重组，使其结合金属锌离子，制得gh625-zn7mt3。
[0023]
该新型免疫激动剂复合物的优化地制备方法包括以下步骤：
[0024]
(1)重组表达、纯化融合蛋白gh625-mt3，将锌离子化学重组进该融合蛋白，制备gh625-zn7mt3；
[0025]
(2)对重组融合蛋白gh625-zn7mt3进行巯基化，得到巯基化融合蛋白；
[0026]
(3)巯基化融合蛋白与脂质体化学键偶合，包封免疫激动剂，得到融合蛋白偶联脂质体包封免疫激动剂的复合物；
[0027]
本文提及天然免疫激动剂环二核苷酸cgamp，如不加特殊说明，均指 c20h22n10o13p2.2nh4,cas号为1441190-66-4。免疫激动剂为天然免疫通路(cgas-sting-cgamp-irf3通路)sting的激动剂或其过渡金属配合物，sting 的激动剂为环二核苷酸2
’3’-
cgamp或其衍生物；
[0028]
本文提及sting，为特定蛋白质名称，如不加说明，均与多数公开文献及 ncbi数据库、欧洲基因数据库一致。其gene名为：tmem173；gene id为： 340061；sting公开的其它命名包括：transmembrane protein 173,eris,mita, mpys,net23,savi,sting,hmita,hsting。
[0029]
本发明研究表明，该新型免疫激动剂复合物能穿越血脑屏障，有效地调控大脑金属离子内稳态平衡，有效抑制活性氧物种的稳态平衡；能有效调节大脑免疫细胞功能，削减大脑慢性炎症；可用于改善ad脑认知功能障碍、调控ad脑海马体细胞形态、抑制ad脑内淀粉样蛋白沉积以及抑制脑内神经细胞凋亡，能有效阻止老年痴呆症病情进展。因此，该新型多功能复合物在防治阿尔茨海默症或其它神经退行性疾病药物方面有广阔的应用前景。
具体实施方式
[0030]
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了
更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
[0031]
实施例1：新型免疫激动剂复合物的制备
[0032]
(1)免疫激动剂的制备
[0033]
免疫激动剂环二核苷酸2
’3’-
cgamp及其衍生物，按文献方法在结合dna 后的活化条件下，由环化cgmp-amp二核苷酸合成酶催化合成，纯度在98％以上(pingwei li，et al.,immunity,2013,39(6),1019-1031)。
[0034]
(2)重组大脑内稳态调控融合蛋白gh625-zn7mt3的制备
[0035]
所有生物化学试剂、试剂盒，除特别说明外，均购自sigama或invitrogen 公司。gh625-mt3融合蛋白氨基酸序列(1-91)：hglastltrw ahynaliraf gggmdpetcp cpsggsctca dsckcegckc tsckksccsc cpaecekcak dcvckggeaa eaeaeksscc q
[0036]
gh625-mt3蛋白的表达与纯化：gh625-mt3蛋白基因表达载体质粒由上海生物基因公司合成制备，表达载体质粒采用pet-22b( )，携带amp 抗性，蛋白序列末端标记smt3-6his标签帮助纯化，用大肠杆菌高效表达体系，蛋白纯化方法用亲和柱ninta纯化，纯度达98％。冻干粉于超低温冰箱保存备用。融合蛋白的纯化过程如下：离心收菌的菌体加tris缓冲液(20mm tris-hcl， 500mm nacl，10％甘油，5mmβ-巯基乙醇，ph＝7.5)悬浮(1ml/g菌体)，加少量溶菌酶、dna酶、1％pmsf，搅拌溶菌并用超声破碎机破菌，然后，用高速离心机离心(12000rpm、离心30min)，取上清液穿流已经平衡好的亲和ni-nta 柱，使得带有his标签的融合蛋白挂柱。用含20mm咪唑的tris缓冲液洗脱杂蛋白，至考马斯亮蓝检测不变色为止。用含200mm咪唑的tris缓冲液洗脱融合蛋白。洗脱的融合蛋白装入透析袋中透析，透析液为tris缓冲液，每次1l，每隔6小时换液，共换三次，之后按1％的比例加入sumo酶酶切6小时，酶切产物穿流已经平衡好的ni-nta柱，共穿流三次除去标签蛋白及sumo酶，再用 superdex-g75凝胶分子筛进一步除去杂蛋白，纯化得到的gh625-mt3蛋白经 15％sds－page胶检测纯度达95％以上。
[0037]
gh625-zn7mt3的金属重组:取2ml gh625-mt3蛋白溶液(5mg/ml)，加入dtt 至终浓度为50mm，4℃还原2小时。加入6m的hci溶液调节ph至l-2，酸化 l小时后，过superdex g-25柱除去杂金属离子，用ph2.0的hci溶液洗脱 gh625-mt3蛋白。流出液用紫外光谱仪检测，收集。脱金属的apo-gh625-mt3 蛋白溶液脱气后立即载入厌氧手套箱中，加入dtt至终浓度为50mm，加20倍于蛋白浓度的zncl2，慢慢滴加2m的tris碱调节ph至8-9，室温下放置过夜，然后透析去除过剩的锌离子，蛋白浓缩后得到gh625-zn7mt3。
[0038]
gh625-zn7mt3金属含量测定：取一定量的重组好的蛋白，加少量浓硝酸于65℃硝化过夜，稀释10倍后在电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)上测定金属 zn的含量。结果显示重组后每摩尔gh625-zn7mt3蛋白含有的zn为7
±
0.2摩尔。
[0039]
gh625-zn7mt3内毒素的去除:gh625-zn7mt3先用10kd的超滤膜截留聚集态的内毒素(lps)，再用polymyxin b亲和柱除去残留的内毒素。
[0040]
(3)新型免疫激动剂复合物的制备
[0041]
首先，对gh625-zn7mt3进行末端巯基化，搅动下滴加巯基化试剂(traut’sreagent，购于sigma公司)，水浴中搅动后，避光孵育1小时，用脱盐柱除去过量巯基化试剂)。用ellman方法测定gh625-zn7mt3蛋白上的巯基，验证 gh625-zn7mt3巯基化成功。
[0042]
将脂质体材料(包括卵磷脂、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-n
-ꢀ
马来酰亚胺-聚乙二醇2000，按摩尔比例57:38:4:1混合)，溶解于甲醇：氯仿(1:9 (v/v))溶剂中，在40℃水浴中真空旋干成膜；在65℃水浴中加入250mm (nh4)2so4水化成空白脂质体。用脂质体挤出器，经过200nm聚碳酸酯微孔滤膜挤出制备成均匀单室空白脂质体。
[0043]
向单室空白脂质体中加入cgamp溶液，60℃孵育1h，加入末端巯基化的 gh625-zn7mt3，室温避光孵育过夜。用30kd的浓缩管，4000rpm，4℃除去未包封免疫激动剂和未连接gh625-zn7mt3。
[0044]
用tem电镜检测所得到的复合物，双层圆形囊泡，形态良好，脂质体直径约为～ 186nm，zeta电位～－22mv。免疫激动剂包封率为78％，4℃冷藏条件下稳定，溶液制成冻干粉冷藏保存。
[0045]
实施例2：新型免疫激动剂复合物对阿尔茨海默症小鼠模型认知功能的调控
[0046]
实验方法：
[0047]
app/ps1转基因阿尔茨海默症(ad)小鼠购自上海南方模式生物中心，5 月龄，体重22-25g。受试药物名称：新型免疫激动剂复合物(含sting激动剂cgamp偶联大脑内稳态调控蛋白和跨膜肽融合蛋白zn7mt3gh625)，对照药物： 2
’3’-
cgamp和zn7mt3gh625。性状：无色粉末。溶媒：生理盐水。配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。给药剂量均为：10mg/kg。给药方式：腹腔注射；给药次数：每天1次，连续60天。
[0048]
morris水迷宫验证阿尔兹海默症小鼠认知能力装置:圆形水池，直径1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水温保持在23
ꢀ±
2℃；池壁上标记四个等距离点n、e、s、w作为试验的起始点，分水池为四个象限，在第三象限中央放置平台(平台与池壁圆心距离相等)；没于水下1cm，使平台不可见。水池周围贴有丰富的参照线索(不同颜色三角形、四方形、圆、菱形置于各个象限)且保持不变，供小鼠用来定位平台。
[0049]
定位航行试验:试验共历时6天，每天定于固定时间段训练4次。训练开始时，将平台置于第一象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从四个不同的起始点(不同象限)放入水中。小鼠找到平台后或90秒内找不到平台(潜伏期记为90秒)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10秒，再进行下一次试验。
[0050]
空间探索试验：定位航行试验结束24h后，撤除站台。然后将鼠由第三象限放入水中，记录鼠在180s内的游泳路径，记录鼠在目标象限(第三象限)的停留时间和穿越原站台所在位置的次数，观察受试鼠的空间定位能力。
[0051]
实验结果：
[0052]
实验结果表明，sting激活剂cgamp、zn7mt3gh625和新型免疫激动剂复合物均对ad模型鼠学习记忆能力有干预改善作用，给药2个月后ad鼠在第三象限停留时间和穿越原站台所在位置的次数几率有都所提高，但是，新型免疫激动剂复合物使ad鼠认知能力改善效果最好、最显著，比单独使用sting激活剂 cgamp或zn7mt3gh625的效果显著提高。说明新型免疫激动剂复合物能有效阻止ad小鼠阿尔茨海默症病情发展。
[0053]
表1、新型免疫激动剂复合物对ad鼠学习记忆能力的影响
[0054][0055]
实施例3：新型免疫激动剂复合物对阿尔兹海默症小鼠脑淀粉样蛋白的影响
[0056]
实验方法：
[0057]
5月龄appswe/psen1de9(app/ps1)二转基因阿尔茨海默症小鼠、对照组 c57bl/6小鼠(22-25g)均购自上海南方模式生物中心。小鼠饲养于25℃左右、 12小时光照与12小时黑暗交替、提供自由食物及饮水的环境中。所有实验操作均遵照实验动物国家标准进行。
[0058]
受试药物：新型免疫激动剂复合物(含sting激动剂cgamp偶联大脑内稳态调控蛋白和跨膜肽融合蛋白zn7mt3gh625)，对照药物：2
’3’-
cgamp, zn7mt3gh625。性状：无色粉末。溶媒：生理盐水。配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。给药剂量均为：10mg/kg。给药方式：腹腔注射；给药次数：每天1次，连续60天。
[0059]
硫黄素s染色实验:实验流程为,取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，tbs洗三次，0.3％硫黄素s(溶于50％乙醇)滴于组织上，室温孵育10min，50％乙醇洗三次，tbs清洗，阴干，封片，激光共聚焦显微镜下观察。
[0060]
酶联免疫吸附测定(elisa)血清中可溶性aβ1-42浓度:在阿尔茨海默症中，a β42的毒性较aβ40强。因此，为测定血清中可溶性aβ1-42浓度，我们选用 elisa法进行检测。其原理为：样品中抗原与固相载体表面抗体结合，抗原抗体复合物与底物产生颜色反应，通过检测吸光度完成对样品中抗原含量的测定。采用眼球取血法获得小鼠全血，室温静置2h，1000rpm离心20min，吸取上层血清，依据cloud clone elisa说明书测定四组小鼠血清中的可溶性aβ1-42浓度。
[0061]
表2、新型免疫激动剂复合物对ad鼠脑组织淀粉样蛋白aβ班的影响
[0062][0063]
表3、新型免疫激动剂复合物对ad鼠外周血清中淀粉样蛋白aβ的影响
[0064][0065]
实验结果：
[0066]
脑部aβ沉积是ad病的一个显著病理特征。硫黄素s荧光染色结果表明，在模型组中，带有绿色荧光的aβ聚集体含量明显较正常组多，且面积较正常组大。而在给药组中，绿色荧光数量和面积都有所减少，新型免疫激动剂复合物组效果最显著，药物效果显著比单独使用免疫激动剂和大脑内稳态调控蛋白显著提高。血清中可溶性aβ含量通过elisa法测定。结果表明ad模型组小鼠血清中可溶性aβ含量显著高于正常组小鼠。与脑部组织染色结果一致，新型免疫激动剂复合物显著降低可溶性aβ含量。以上结果表明新型免疫激动剂复合物能够显著减少脑部不溶性aβ沉积和血清中可溶性aβ含量，这也是ad病情得到缓解的重要特征。
[0067]
实施例4：新型免疫激动剂复合物对阿尔兹海默症小鼠炎症因子的调控
[0068]
实验方法：
[0069]
实验鼠和给药等实验条件、材料等如实施例3所述。为了探索新型复合物对于ad小鼠脑神经炎症的影响。小鼠脑组织中的促炎症因子的含量通过elisa的方法进行测定。我们分别检测了促炎性因子il-1β和tnf-α在小鼠脑组织中的含量。
[0070]
脑组织样品处理方法：取小鼠新鲜脑组织，称重，匀浆后，4℃，12000rpm 离心10min。取上清，作为待测样品。选用cloud clone elisa试剂盒测定脑组织中促炎症因子il-1β和tnf-α的含量。
[0071]
实验结果：
[0072]
表4、新型免疫激动剂复合物对ad鼠脑组织中炎症因子的削减作用
[0073][0074]
如表4所示，相比于正常组，ad模型组小鼠脑组织中促炎性因子il-1β和tnf
-ꢀ
α的含量均有明显上调，这表明在ad模型组小鼠中，的确存在明显的神经炎症。而在给药二个月后，脑组织中的il-1β和tnf-α水平分别下降了。这些结果说明新型免疫激动剂复合物能够显著降低中枢神经系统的促炎性因子，并且新型复合物相比单独使用免疫激活剂或大脑稳
态调控蛋白有更显著的优势效果。这表明新型免疫激动剂复合物能够消除存在于小鼠ad病程中的慢性神经炎症。
[0075]
越来越多的证据表明多种促炎因子的高水平表达与app/ps1二转基因ad小鼠的认知障碍密切相关，说明在ad病程中，一系列的炎症信号通路参与其中最终导致认知能力缺陷。因此，新型免疫激动剂复合物显著引起炎症因子表达下调，从而改善ad小鼠的学习记忆能力，减少脑内aβ沉积，这也与文献报道相符合。
[0076]
实施例5：新型免疫激动剂复合物对阿尔兹海默症小鼠脑神经细胞凋亡的影响
[0077]
实验方法：
[0078]
实验ad鼠和给药等实验条件、材料等如实施例3所述。
[0079]
h&e染色:ad病的显著病理特征之一为脑部海马ca1区神经元的受损变形、丢失和功能丧失。在本研究中，我们通过h&e染色来检测海马ca1区神经元的病理变化情况。h&e染色，即苏木精-伊红(hematoxylin-eosin)染色法。其原理为：碱性苏木精染液可使细胞核内染色质及细胞质内核酸着为蓝紫色，酸性染料伊红则可使细胞质的大部分(蛋白质及胺类)着为红色。
[0080]
具体操作步骤为：小鼠脑组织石蜡切片二甲苯脱蜡两次，每次10min；无水乙醇、 95％、75％、50％乙醇依次脱水3min；水洗5min后苏木精染液染色5min；流水冲洗2min；伊红染液染色2min；水稍洗2s，80％、95％乙醇分别洗3s；无水乙醇洗两次，每次10min；二甲苯洗两次，每次2min；阴干后用中性树脂封片，光学显微镜观察拍照。
[0081]
苏木精染液配方：2g苏木精、50g硫酸铝钾，0.4g碘酸钠，40ml冰醋酸，300 ml甘油，300ml无水乙醇，加ddh2o至1000ml。
[0082]
伊红染色液配方：0.5g伊红溶于少量ddh2o，滴加冰醋酸至浆糊状。将滤纸过滤后的滤渣在烘箱中烤干后溶于100ml 95％乙醇。
[0083]
次10min；二甲苯洗两次，每次2min；阴干后用中性树脂封片，光学显微镜观察拍照。
[0084]
tunel染色:神经元凋亡是阿尔茨海默症的另外一个显著的特征，我们选用 tunel(tdt-mediated dutp nick-end labeling)染色法检测小鼠脑组织中神经细胞的凋亡情况，从而在一定程度上反映阿尔茨海默症的病理进程。tunel染色法的原理为细胞发生凋亡时，基因组dna发生断裂，暴露出oh端，3
’-
oh 会被末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)催化而加上荧光素fitc标记的dutp，从而利用激光共聚焦显微镜对神经元凋亡情况进行观察。
[0085]
具体操作步骤为：小鼠脑组织石蜡切片二甲苯脱蜡两次，每次10min；无水乙醇、 95％、75％、50％乙醇分别脱水3min；水洗5min；滴加20μg/ml不含dnase 的蛋白酶k，25℃孵育20min；pbs洗3min后dapi室温孵育10min；pbs洗三次，每次洗5min；阴干后用中性树脂封片，激光共聚焦显微镜观察拍照。整个实验过程尽量保持在避光环境中。
[0086]
nissl染色：nissl染色为神经病理学家franna nissl创立用于观察神经元中尼氏小体的一种实验方法。尼氏小体由神经元细胞质中的粗面内质网及游离核糖体组成，由于其具有强烈嗜碱性，因此容易被碱性染料焦油紫等染色。在阿尔茨海默症病程中，脑区海马ca3区神经元尼氏体大量缺失为显著特征。具体的染色步骤为：小鼠脑组织石蜡切片二甲苯脱蜡两次，每次10min；无水乙醇、95％、 75％、50％乙醇分别脱水3min；水洗5min；焦油紫37℃染色1min；水洗5min； 80％、95％乙醇分别洗3s；无水乙醇洗两次，每次10min；二甲苯洗
两次，每次2min；阴干后用中性树脂封片，光学显微镜观察拍照。
[0087]
实验结果：
[0088]
h&e染色结果表明，在正常组脑部海马ca1区域，神经元大而饱满，排列整齐紧密；相反，ad模型组小鼠脑部海马ca1区域的神经元有大量缺失，神经元塌陷变形，排列混乱。而在新型免疫激动剂复合物、及分别使用免疫激动剂和大脑金属离子稳态调控蛋白给药两个月后，小鼠脑部海马ca1区神经病理学特征有明显改善。相对于模型组小鼠，新型复合物给药组脑部海马ca1区神经元缺失减少，神经元更大和饱满，排列更加整齐。
[0089]
nissl染色结果表明，相对于正常组，模型区小鼠脑部海马ca3区域神经元中尼氏小体显著减少，神经元的密度和数量都有明显降低。而在新型复合物给药组中，尼氏小体数量有明显增加，神经元密度和数量都较模型组有所恢复。
[0090]
h&e和nissl染色结果表明新型复合物能够显著改善ad小鼠海马ca1和 ca3区域的神经病理学特征，而且，该新型复合物比免疫激动剂或大脑稳态调控蛋白有显著更好的药效作用。另外，我们运用tunel染色法检测神经元的凋亡程度，表5列出了tunel阳性细胞的统计学结果。结果表明，相对于正常组，模型组小鼠神经元可见明显的凋亡现象。而在新型复合物给药组中，神经细胞凋亡显著减少，同时，新型复合物给药组相对免疫激动剂或大脑稳态调控蛋白给药组呈现更少的神经元凋亡。说明新型免疫激动剂复合物能够显著减少小鼠ad病程中的神经元凋亡，并具有明显的药效进步效果。
[0091]
表5、新型免疫激动剂复合物对ad鼠脑组织中神经细胞凋亡调控作用
[0092][0093]
实施例6.新型免疫激动剂复合物对脑部金属离子分布定位调控
[0094]
ad病通常伴随着脑部金属分布失衡，在aβ老年斑中，常有浓度异常高的 cu，zn，fe等金属。因此，我们借助同步辐射微束x荧光(sr-μxrf)来探究新型免疫激动剂复合物对ad病脑部金属分布状况的调控。实验在上海同步辐射光源bl15u线站完成。该线站采用高亮度的波荡器x射线光源，通过单色器、 k-b聚焦镜得微束x射线，入射光光子能量可设置在3.5
–
22.5kev，最小聚焦光斑2
×
2μm；配有单探头si漂移探测器、七元si(li)探测器、电离室及高精度7轴样品台等设备，是高性能的x射线微探针装置。在该实验站，我们利用微束x射线荧光分析(μxrf)，检测了给药前后cu，zn，fe金属在小鼠脑组织微区分布的变化情况。
[0095]
实验方法：实验动物和给药实验条件见实施例2所述。给药60天后，检测分析鼠脑金属离子稳态调控情况。(1)冷冻切片的准备：取小鼠脑组织于液氮中速冻，用oct剂包埋后置于冷冻切片机上以冠状面切割成40μm厚的切片，后粘附于3μm厚的聚碳酸酯薄膜上，室温干燥。(2)同步辐射光源测定金属含量分布：由si(111)双晶单色器发出持续的同步单色微
束x射线。用于激发样品的光子能量为10kev。扫描样品的光线移动范围调整至60
×
60μm2，在 x-和y-轴方向的移动步长为60μm，单点的辐射时间为1秒。借助geopixe 软件(csiro，australia)从能量的发散谱中提取每个像素的金属荧光计数。选择牛肝样品(nist 1577a)作为参照标准品，在正式实验前先进行扫描校准。以xrf光谱中的compton散射作为内参，用于抵消因生物组织切片的局部厚薄不一引起的差异。组织切片上金属浓度的计算是数据矩阵中某一点的值与其对应的 compton散射的值的相对比值。随机选择代表若干目标区域的单点值用于数据统计，并排除异常值，具体为：对于皮质区，选择350～400个点用于统计；对于海马区，选择600～800个点用于统计；对于整个脑部，选择1600～2000个点用于统计。
[0096]
实验结果：
[0097]
本研究中发明人借助同步辐射微束x荧光的手段，直接探测了免疫激动剂及其复合物在app/ps1模型鼠脑部行使金属内稳态调节功能。微探针扫描得出的数据矩阵，经过标准化计算，用geopixe软件转化。由统计结果可见，模型鼠的脑部较正常鼠，存在明显的金属分布差异，主要体现在脑部总体cu和铁的含量有显著升高，而zn的含量明显降低。免疫激动剂及其复合物给药两个月后，一定程度地逆转模型鼠中这样的金属稳态紊乱趋势。首先，从脑部的总体金属含量来看，给药后cu和铁的水平呈现出了显著的降低，而zn的含量则体现出明显的升高。在正常鼠脑部，cu在海马和皮质区的含量处在相似水平，而模型鼠中，cu在皮质的分布却显著高于在海马区的分布。给药使得cu的含量在皮质和海马这两个区域得以重新平衡一致。zn在ad模型鼠脑部皮质区的含量显著高于海马区，而正常鼠这两个区域的含量则没有明显区别。给药后ad模型鼠在海马区的fe含量及由此引起的与皮质区的fe含量平衡一致。这些结果说明了新型免疫激动剂复合物对ad鼠的脑部金属内稳态平衡的确起着显著的的调节作用，而且，新型复合物比免疫激动剂或调控蛋白单独使用调控效果更显著，有明显进步药效作用。鼠脑全脑组织切片金属离子含量(给药两个月后)变化情况见表6。
[0098]
表6、新型免疫激动剂复合物对ad鼠脑组织中金属离子含量调控
[0099][0100]
通过本研究让我们能够清楚地了解到新型免疫激动剂复合物确能够挽救app/ps1模型鼠脑部越发恶化的zn，cu和fe稳态失衡的状况。金属zn对大脑的发育和生理是必须的。许多与zn缺乏有关的神经系统问题，如学习，记忆及情绪稳定，通常都与富含zn的脑部结构密切联系，比如海马，杏仁孔和皮质，其中新皮质区与ad病最相关。我们的实验结果揭示了新型免疫激动剂复合物作为zn的储备库，能够一定程度地补偿ad脑中zn的损失，主要表现在显著地提高了海马区zn的含量。此外，该新型复合物不仅仅是zn的补充剂，它更重要也更令人激动的功能在于减轻ad病脑部金属内稳态失衡的状况，
[0101]
实施例7.新型免疫激动剂急性毒性研究
[0102]
实验方法：
[0103]
icr小鼠20只(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：scxk(沪)2007-0005])，雌雄各半，体重18～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。
[0104]
新型免疫激动剂复合物用生理盐水配制成浓度为200mg/ml的溶液。
[0105]
icr小鼠按体重单次腹腔注射2g/kg的新型复合物给药，观察给药后小鼠 14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次腹腔注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。
[0106]
实验结果：
[0107]
上述急性毒性实验结果表明，腹腔给药最大耐受量mtd不低于2g/kg，说明新型免疫激动剂复合物的急性毒性低。