高载药效率纳米颗粒及其制备与应用的制作方法

1.本发明涉及高分子材料领域，更具体地涉及一种刺激响应性自解聚聚 合物及其纳米组装体系，其能够以较高的载药量和载药效率物理包埋疏水 药物，在肿瘤组织响应刺激发生解聚。在此过程中，聚合物主链转变为小 分子活性物质醌亚甲基，能够实现药物释放、破坏肿瘤细胞抗氧化系统、 提升肿瘤细胞氧化压力和抗肿瘤的效果。


背景技术：

2.目前，利用癌症特异性分子靶点结合有效载体进行肿瘤靶向药物传递 的策略对提高肿瘤的化疗的效果有重要的意义。β-拉帕醌(lap)是一种新型 的从植物提取的抗癌药物黄素蛋白，其细胞毒性受到nqo1的显著增强。 拉帕醌被发现在多种人类癌症(包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌)中 过表达高达20倍(cancer metastasis rev,1993,12(2):103-17.)。当拉帕醌被 摄取到生物体内，在nqo1的催化下诱导参与一种无效循环(futilecycling)，其中拉帕醌在其对苯二酚、半醌和醌结构之间形成循环，在此过 程中消耗细胞内的nad(p)h，导致生成活性氧基团(ros)(j biol chem, 2000,275(8):5416-24)。此外，拉帕醌的治疗导致nqo1依赖性胞质钙离 子增加，最终导致线粒体膜电位的损失、atp消耗、独特的底物蛋白水解、 dna片段化以及细胞凋亡。然而，其作用机制与caspases、p53的状态和 细胞周期无关(clin cancer res,2005,11(8):3055-64)。鉴于nqo1在拉帕 醌介导的细胞毒性中具有至关重要的核心作用，因此利用肿瘤细胞中这种 酶的过表达来治疗癌症是非常有潜力的。
3.虽然拉帕醌被证明是一个非常有前途的抗癌药物，但是从药效学的角 度来看，有几个因素阻碍其临床前评价和临床转化应用。首先，其在生物 体内的非特异性分布可能导致肿瘤富集浓度低和对机体全身的毒性 (cancer biol ther,2005,4(1):95-102)。此外，它的多环结构决定了其疏水 特性，在水相中的溶解度只有0.04g/l(pharm res,2003,20(10):1626-33)。 因此需要构建一种有效的纳米载体，其能够有效地增溶拉帕醌并将其传递 到实体肿瘤部位。传统纳米载体对拉帕醌的载药率低(2.2重量％)，这是由 于拉帕醌的结晶性质引起的。因此，限制拉帕醌纳米制剂的一大阻碍就是 拉帕醌的包封率太低。为了克服这一挑战，有报道一种新型药物前体胶束 策略，通过酯键将拉帕醌修饰为结构上更“软”的分子，可以显著提高 peg-b-pla胶束的载药量(约10％)和效率(95％)(adv healthc mater,2014, 3(8):1210-6)。在近期的报道中，由于拉帕醌不能高效地被常见的聚合物 纳米载体所负载，因此他们合成了侧基为烟酸基团的聚合物，其中疏水性 和芳香性的烟酸部分可以提高拉帕醌在纳米颗粒中的载药量(8.2％)(advmater,2017,29(38))。


技术实现要素：

4.在本发明中，我们发明了一种刺激响应性自解聚聚合物及其纳米组装 体系，其能够以较高的载药量和载药效率物理包埋疏水药物，在肿瘤组织 响应刺激发生解聚。在此过程中，聚合物主链转变为小分子活性物质醌亚 甲基，能够实现药物释放、破坏肿瘤细胞抗
氧化系统、提升肿瘤细胞氧化 压力和抗肿瘤的效果。
5.在一个方面，本发明提供了一种触发式线性自解聚聚合物，其特征在 于：包含苯硼酸酯作为触发基元，六氟异丙醇(hfi)基团作为侧基，具有两 亲性bcp结构。具体如下式所示：
[0006][0007]
其中n为8-15，并且m为8-150(优选22、45或113)。
[0008]
在另一个方面，本发明提供了一种触发式线性自解聚聚合物，其特征 在于：包含苯硼酸酯作为触发基元，六氟异丙醇(hfi)基团作为侧基，具有 两亲性bcp结构，亲水段为聚乙二醇并且共价标记了靶向基团crgd。具 体如下式所示：
[0009][0010]
其中n为8-15，并且m为8-150(优选22、45或113)。
[0011]
在另一个方面，本发明提供了由本发明的自解聚聚合物组装成的纳米 颗粒。本发明的纳米颗粒能够以较高的载药量和载药效率物理包埋疏水药 物(例如拉帕醌)。
[0012]
在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒通过以下方式获得：将聚合物 和疏水药物(例如拉帕醌)以重量比2:1-10:1溶于有机溶剂(例如dmso，四 氢呋喃)，并且将有机溶液一次性快速注入到水中，然后通过透析除去有机 溶剂，获得球状纳米颗粒。其中，纳米颗粒的尺寸范围为50-200nm，透 析后纳米颗粒的浓度为0.01mg/ml～1mg/ml，载药量在30％以上，载药 效率在95％以上。
[0013]
本发明利用侧基含六氟异丙醇的自解聚聚合物组装成纳米颗粒，并且 以较高的载药量和载药效率物理包埋疏水药物拉帕醌，在肿瘤组织内ros 刺激下发生触发式自解聚后，释放出拉帕醌，从而能够在nqo1的催化下， 放大细胞内ros的水平，促进纳米颗粒的进一步解离。解聚的聚合物主 链转变为具有反应活性的醌亚甲基中间体，能够与肿瘤细胞中具有亲核反 应活性的巯基化合物(如gsh等)反应，破坏肿瘤细胞内的抗氧化系统，与 拉帕醌协同提升氧化压力，促使肿瘤细胞凋亡，实现对肿瘤的治疗。例如， 在4t1细胞中，0.02g/l的包埋拉帕醌的纳米颗粒(含药物0.05mm)能够至 少杀死90％肿瘤细胞。
附图说明
[0014]
图1示出了本发明所设计的纳米颗粒对多种药物(图1a)的载药量(图 1b)和载药
效率(图1c)以及包载拉帕醌前后的尺寸(图1d和图1e)。
[0015]
图2示出了本发明所设计的纳米颗粒响应ros触发解聚的结果。
[0016]
图3示出了本发明所设计的纳米颗粒药物载体响应ros触发药物释 放的结果。
[0017]
图4示出了本发明所设计的拉帕醌放大ros触发纳米颗粒解离的结 果。
[0018]
图5示出了本发明所设计的包埋拉帕醌的纳米颗粒在肿瘤细胞中破坏 抗氧化系统和提升氧化压力的结果。图5a：纳米颗粒解离后产生的醌亚甲 基和释放的拉帕醌对细胞氧化压力的提升的示意图。图5b和5c：将肿瘤 细胞4t1分别与bp
pb-hfi纳米颗粒、拉帕醌、包载拉帕醌的lap@bp
pb-hfi 纳米颗粒共同孵育，通过
19
f nmr测试细胞的裂解液，证明包载拉帕醌有 利于纳米颗粒在细胞内的解离。图5d：将肿瘤细胞4t1分别与bp
pb-hfi 纳米颗粒、拉帕醌、包载拉帕醌的lap@bp
pb-hfi纳米颗粒共同孵育，检 测细胞内巯基含量的变化，证明包载拉帕醌的纳米颗粒有利于破坏细胞的 抗氧化系统。图5e-h：将肿瘤细胞4t1分别与bp
pb-hfi纳米颗粒、拉帕 醌、包载拉帕醌的lap@bp
pb-hfi纳米颗粒共同孵育，流式细胞仪和荧光 显微镜检测细胞内ros水平的变化，证明包载拉帕醌的纳米颗粒有利于 提升细胞的ros水平。
[0019]
图6示出了本发明所设计的包埋拉帕醌的纳米颗粒在肿瘤细胞中造成 细胞毒性的结果。图6a：包埋拉帕醌的纳米颗粒在4t1细胞中的浓度依赖 的毒性。图6b：包埋拉帕醌的纳米颗粒在不同细胞中的毒性。图6c：包 埋拉帕醌的纳米颗粒在4t1细胞中导致细胞nad

含量的变化。图6d：包 埋拉帕醌的纳米颗粒在4t1细胞中导致细胞atp含量的变化。
具体实施方式
[0020]
利用本发明的可程序响应性的自解聚聚合物(sip)，集成可被ros触 发氧化、水解断键的苯硼酸酯触发基元以及被聚乙二醇修饰的末端羟基， 形成两亲性嵌段共聚物，并且聚合物的侧基用六氟异丙醇基团功能化修 饰。这种两亲性sip聚合物能够在水相中自组装成胶束纳米颗粒，其具有 疏水的内核和亲水的外壳。因此，可以将疏水的药物如拉帕醌物理包埋到 纳米颗粒的内核中。聚合物主链上的大量氨基甲酸酯键以及侧基上的六氟 异丙醇基团能够给纳米颗粒对疏水药物的物理包埋提供氢键作用的支持， 从而大大提高疏水药物如拉帕醌的载药量。利用构建的负载拉帕醌的自解 聚聚合物纳米颗粒，在正常的微环境中可以保持稳定，而在ros触发下， 随着sip段的解聚，纳米颗粒随之解离，内核里包埋的拉帕醌能够释放出 来。释放出来的拉帕醌能够在nqo1的催化下，消耗nadph，经过无效 循环产生大量ros。这些放大产生的ros又可以触发更多的sip解聚， 这种过程类似一种信号放大的策略。最后，sip解聚会原位产生大量醌亚 甲基(qm)，这些qm能够在细胞内消耗亲核的巯基化合物(如谷胱甘肽 gsh)，破坏细胞的抗氧化体系，提升细胞的氧化压力。这样qm和拉帕 醌能够协同性地通过增加细胞的应激氧化压力来杀死肿瘤细胞，治疗癌 症。
[0021]
本发明合成了具有靶向基团crgd的两亲性sip嵌段聚合物，其中触 发基元为苯硼酸酯基团，侧基为六氟异丙醇基团，亲水段为聚乙二醇。具 体合成路线如下所示：
反应体系浓缩后在10倍体积的甲醇/乙醚(1:1)中沉淀，thf再溶解，溶解
ꢀ-
沉淀重复3次后，真空干燥箱干燥得到白色粉末状固体bp
pb
(100mg，产 率52.3％)。
[0031]
bp
pb
(100mg，烯丙基:0.4mmol)、hfi-sh(327mg,2mmol)、2,2-二甲 氧基苯基苯乙酮(51mg,0.2mmol)和无水thf(1ml)共同加入到带有搅拌 子的封管中，该封管经过冷冻-脱气操作，重复3次后在真空条件下封管。 室温下，用紫外灯(365nm)光照1小时，反应用液氮淬灭，打开封管。反 应体系在10倍体积的冰正己烷中沉淀，thf溶解，溶解-沉淀重复3次后， 真空干燥箱干燥得到黄色胶状固体(150mg，产率：82.2％)，即bp
pb-hfi。
[0032]
制备例2
[0033]
使用纳米闪沉法制备纳米颗粒。以ros触发的自解聚聚合物bp
pb-hfi 作为实例详述自组装过程：将2mg聚合物溶于1ml dmso中，然后快速 加入到9ml快速搅拌的去离子水中。有机溶剂通过透析法除去(mwco： 3kda)，透析8小时。
[0034]
拉帕醌(lap)的负载：将bp
pb
、bp
pb-hfb、bp
pb-hfi分别和lap共同 溶解在dmso中，浓度分别为2g/l和1g/l，混合体系快速加入到9ml 快速搅拌的去离子水中。有机溶剂通过透析法除去(mwco：3kda)，透析 8小时。
[0035]
阿霉素(dox)的负载：将bp
pb-hfi和dox(先用1.5倍当量的tea去 质子化)共同溶解在dmso中，浓度分别为2g/l和1g/l，混合体系快速 加入到9ml快速搅拌的去离子水中。有机溶剂通过透析法除去(mwco： 3kda)，透析8小时。
[0036]
喜树碱(cpt)的负载：将bp
pb-hfi和cpt共同溶解在dmso中，浓 度分别为2g/l和1g/l，混合体系快速加入到9ml快速搅拌的去离子水 中。有机溶剂通过透析法除去(mwco：3kda)，透析8小时。
[0037]
hsp90抑制剂(17-aag)的负载：将bp
pb-hfi和17-aag共同溶解在 dmso中，浓度分别为2g/l和1g/l，混合体系快速加入到9ml快速搅 拌的去离子水中。有机溶剂通过透析法除去(mwco：3kda)，透析8小时。
[0038]
丝裂霉素c(mmc)负载：将bp
pb-hfi和mmc共同溶解在dmso中， 浓度分别为2g/l和1g/l，混合体系快速加入到9ml快速搅拌的去离子 水中。有机溶剂通过透析法除去(mwco：3kda)，透析8小时。
[0039]
吲哚菁绿(icg)的负载：将bp
pb-hfi和icg共同溶解在dmso中，浓 度分别为2g/l和1g/l，混合体系快速加入到9ml快速搅拌的去离子水 中。有机溶剂通过透析法除去(mwco：3kda)，透析8小时。
[0040]
载药量测试：根据药物的溶解性，选择合适的溶剂配置一系列药物的 浓度梯度，通过hplc或紫外光谱仪建立药物的浓度-吸收标准曲线，将 包载了药物的组装体通过滤膜(450nm)，冻干后取样称重，溶解后通过hplc或紫外光谱仪定量药物的浓度。载药量dlc(重量％)＝[(负载药物的 重量)/(负载了药物的纳米颗粒总重量)]
×
100，载药效率dle(重量％)＝[(负 载药物的重量)/(总的投药重量)]
×
100。载药量和载药效率的结果如图1所 示。
[0041]
应用例1：ros触发负载拉帕醌的纳米颗粒解离
[0042]
如图2a所示，ros能够触发纳米颗粒的解离，释放出负载的拉帕醌 药物。以相对bp
pb-hfi聚合物5倍当量的次氯酸作为一种代表性的ros， 触发lap@bp
pb-hfi纳米颗粒的解离，用不同的分析方法跟踪24小时的变 化。图2b示出了dls跟踪纳米颗粒的散射光强的变
化，散射光强的下降 表示纳米颗粒的解离。图2c示出了nanosight颗粒数目分析证明纳米颗粒 的解离，数目减少。图2d示出了通过gpc跟踪纳米颗粒的解离，从分子 水平证明纳米颗粒的解离是聚合物的解聚导致的。
[0043]
应用例2：纳米颗粒药物载体响应ros触发释放拉帕醌。
[0044]
在探究拉帕醌在nqo1催化下放大产生ros之前，需要证明拉帕醌 能够从聚合物纳米颗粒中顺利释放出来。结果在图3中示出，当加入次氯 酸作为典型的ros代表来触发纳米颗粒(包载拉帕醌的lap@bp
pb-hfi纳 米颗粒)解离，通过hplc测出拉帕醌随着时间的增加，累积的释放量也 不断增加，24小时能够达到80％以上。而不加ros触发的对照组，经过 24小时的累积只释放了3％左右。一方面证明拉帕醌能够顺利地响应ros 的触发释放出来，另一方面证明拉帕醌包载纳米颗粒的内核中在24小时 内还是比较稳定，不容易出现之前文献报道的不可控释放的情况。
[0045]
应用例3：nqo1酶催化拉帕醌产生ros触发纳米颗粒解离
[0046]
如图4a所示，在1ml的bp
pb-hfi纳米颗粒水溶液外加3种浓度的拉 帕醌，加入2μg/ml的nqo1和nadh，加入4t1细胞裂解液，通过gpc 跟踪纳米颗粒的解离。如图4b所示，在1ml的lap@bp
pb-hfi纳米颗粒 水溶液外加拉帕醌，加入2μg/ml的nqo1和nadh，加入4t1细胞裂 解液，通过gpc跟踪纳米颗粒的解离。
[0047]
应用例4：物理包埋拉帕醌的纳米颗粒破坏肿瘤细胞抗氧化系统和提 升氧化压力。
[0048]
将不包埋药物的纳米颗粒bp
pb-hfi np、包埋β-拉帕醌的纳米颗粒 lap@bp
pb-hfi np和游离的β-拉帕醌与4t1细胞共同孵育6小时，用
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fnmr跟踪了纳米颗粒被细胞内吞后的信号变化。如图5b和图5d所示， bp
pb-hfi np和4t1细胞育后24小时后，可以检测到
19
f nmr的信号， 而lap@bp
pb-hfi np和4t1细胞孵育后，检测到的
19
f nmr的信号更强。 作为对照，无处理的细胞和拉帕醌处理的细胞均未检测到
19
f nmr的信 号。这是因为细胞内ros的含量可以触发bp
pb-hfi np的降解，但是由于 ros的含量并不足够彻底触发聚合物的降解，而释放出了拉帕醌以后，通 过4t1细胞内过量表达的nqo1催化放大ros，促进了sip的彻底降解。
[0049]
将bp
pb-hfi np、lap@bp
pb-hfi np和拉帕醌与4t1细胞共同孵育6 小时，通过ellman试剂来检测细胞内巯基水平的变化。拉帕醌和ros响 应的bp
pb-hfi np由于降解产生醌亚甲基qm，细胞内的巯基水平有一定 的下降，但是并不太多，可能是由于4t1细胞内的ros浓度并不足以让 bp
pb-hfi np彻底解聚。然而lap@bp
pb-hfi np组细胞的巯基水平下降得 很多，证明释放出了拉帕醌以后，通过4t1细胞内过量表达的nqo1催化 放大ros，一方面能够直接消耗细胞内的抗氧化剂，另一方面促进了sip 的彻底降解，产生qm消耗巯基。
[0050]
因巯基被消耗后，细胞抗氧化系统被破坏，应激氧化压力提升。将 bp
pb-hfi、lap@bp
pb-hfi np和拉帕醌与4t1细胞共同孵育6小时，利用 ros探针dcfh-da来检测ros水平的变化。如图5f-h所示，通过流式 细胞仪的分析和倒置荧光显微镜的直观成像，对比不做处理的细胞，拉帕 醌和ros响应的bp
pb-hfi由于降解产生qm，消耗一定的巯基，但是由 于解聚不够彻底，ros只有部分提升；然而由于lap@bp
pb-hfi np组细 胞的巯基水平下降得很多，因此细胞的抗氧化系统被破坏的较为彻底， ros水平的提升也非常大。
[0051]
应用例5：纳米颗粒在肿瘤细胞中破坏抗氧化系统，提升氧化压力， 造成细胞毒性
[0052]
拉帕醌在nqo1催化下放大ros和sip降解产生的qm消耗了细胞 内抗氧化的巯基化
合物，破坏了细胞的抗氧化系统，提升了细胞内的氧化 压力，这最终会导致细胞的死亡。将一系列浓度梯度的bp
pb-hfi、 lap@bp
pb-hfi np和拉帕醌与hela共同孵育24小时。如图6a所示， lap@bp
pb-hfi np和拉帕醌会对细胞产生较大的毒性，这与预期的结果是 相符合的，因为拉帕醌本身被报道细胞毒性较大，而且lap@bp
pb-hfi np 的毒性相对更大，这是因为被放大的ros触发降解的sip能够产生qm， 对细胞产生额外的毒性。包埋拉帕醌的纳米颗粒在不同细胞中的毒性如图 6b所示。图6c示出了包埋拉帕醌的纳米颗粒在4t1细胞中导致细胞nad

含量的变化。图6d示出了包埋拉帕醌的纳米颗粒在4t1细胞中导致细胞 atp含量的变化。
[0053]
以上已对本发明进行了详细描述，但本发明并不局限于本文所描述具 体实施方式。本领域技术人员理解，在不背离本发明范围的情况下，可以 作出其他更改和变形。本发明的范围由所附权利要求限定。