治疗β-地中海贫血症的方法与流程

治疗
β-地中海贫血症的方法
相关申请案的交叉引用
1.本技术案主张于2019年4月2日提申的美国临时申请案第62/828,182号；于2019年11月5日提申的美国临时申请案第62/930,846号；以及于2019年12月6日提申的美国临时申请案第62/944,626号的权益，其揭示内容以整体引用的方式并入本文。序列表
2.本技术案含有序列表，该序列表已经以ascii格式电子递交，并以整体引用的方式并入本文。该份ascii复本创建于2020年1月10日，名为8328-0194_40_sl.txt，大小为8,701字节。
【技术领域】
3.本发明是关于治疗β-地中海贫血症的方法及基因疗法。【先前技术】
4.β-地中海贫血症是一种遗传性贫血症，特征在于β-球蛋白链合成不存在或有缺陷(higgs&engel(2012)lancet 379(9813):373-83)。这个缺陷导致球蛋白链生成失衡，以及血红素(由两个α-球蛋白链和两个β-球蛋白链组成)减少。球蛋白链失衡的结果是，在红细胞(rbc)或rbc前驱细胞中形成不稳定的α-球蛋白链四聚体，并发生髓内破坏(intramedullary destruction)、细胞凋亡、无效的红细胞生成，铁过负荷和严重贫血(origa,r.(2017)genet med19(6):609-619)。
5.地中海贫血症(β和α)在人类中是最常见的单基因疾病。它们分布广泛，但最常见于南亚、印度亚大陆，中东和地中海地区，与撒哈拉以南的非洲地区(modell et al.(2008)j cardiovasc magn reson.10:42；colah et al.(2010)expert rev hematol 3(1):103-17)。据估计，全球人口约有1.5％是β地中海贫血症突变的携带者(例如，一个在ivs-i的核苷酸5处“ivs-i-5”的g-》c突变；一个在ivs-ii的核苷酸654处“ivs-ii-654”的c》t突变，其中每年约有60,000名有症状者出生(galanello&origa(2010)orphanet j rare dis.5:11)。
6.β-地中海贫血症的临床严重程度是由所产生的正常血红素数量所决定，并定义出三种临床和血液学病况，通常称为轻度β-地中海贫血症，中度β-地中海贫血症和重度β-地中海贫血症。带有β-地中海贫血症的患者少数有轻度贫血或无贫血，且通常是无症状携带者。中度β-地中海贫血症患者有中重度贫血，而可能受惠于输血以改善其生活质量，但稍后会出现输血依赖型表型。重度β-地中海贫血症患者有严重的贫血，终生需要频繁输血。因为贫血导致的疾病包括生长停滞、骨骼畸形、肺高血压、静脉血栓栓塞、肝硬化、心脏衰竭、腿部溃疡，和内分泌功能障碍(vichinsky et al.(2005)pediatrics.116(6):e818-25)。尽管与输血依赖型表型有关的β-球蛋白突变和遗传疾病修饰因子有许多种组合，但该病况在本研究中统称为输血依赖型β-地中海贫血症(tdt)(galanello&origa，同上)。
7.在过去的50年内，随着认识到支持性照护计划的好处，对tdt患者的健康结果已有所增进。支持性照护计划由定期rbc输血构成，从确定诊断和贫血发生就尽早开始。rbc输血
伴有定期铁螯合疗法，以在生命器官内减少因为输血所致的铁过负荷。这项支持性照护计划明显改善tdt的发病率，但即使有这样的计划，受治疗患者仍有20％的预期寿命少于40年(modell et al.(2008)j cardiovasc magn reason 10:42)。此外，该计划耗时且资源密集，其中在2011年，单单一名患者接受治疗持续50年预估花费$1,971,380美元(koren et al.(2014)mediterr j hematol infect dis 6(1):e2014012)。
8.目前，唯一被证明可治愈tdt的方法是同种异体造血干细胞移植(hsct)。同种异体hsct有相当高的长期发病率风险(例如移植物抗宿主病[gvhd])，以及基于5年死亡率的10-15％死亡风险(locatelli et al.(2013)blood122(6):1072-8；baronciani et al.(2016)bone marrow transplant 51(4):536-41)。此外，已发表的报告显示，鉴定出一个配对良好的不相关同种异种供体的概率会受到供体种族所影响；例如，非裔个体中，寻找到合适供体的概率估计只有19％(gragert et al.(2014)n engl j med.371(4):339-48)。因此，许多(如果不是大多数)受赠者将没有同种异体hsct的人类白细胞抗原(hla)配对供体，从而使这种可能的治疗方法无从用起。
[0009]
因此，仍然需要用于治疗及/或预防tdt的组合物和方法。


技术实现要素：

[0010]
本文揭示用于在有需要的个体体内治疗及/或预防β-地中海贫血症的组合物和方法。本揭示内容提供用于基因组编辑及/或基因转移的方法和组合物。本揭示内容还提供用于细胞疗法的方法和组合物，其用于治疗缺乏充分表达β球蛋白的个体(例如β0/β0或非β0/β0个体)。个体体内的异常β球蛋白表达可能是因为任何突变所引起，包括但不限于以下突变中的一或多者：ivs-i-5；ivs-ii-654。在一些实施方案中，本文揭示的方法及组合物用于治疗输血依赖型β-地中海贫血症(tdt)。本揭示内容提供了治疗β-地中海贫血症个体的方法，该方法包含将已经使用工程改造核酸酶修饰的细胞投予给个体，其中该个体为待治疗的。投予给患者的细胞可以是自体细胞(从患者分离，经遗传修饰然后再输注至患者)，或同种异体细胞(例如从健康患者分离并输注至患者)。
[0011]
如本文提供的改变血红素表达的方法(包括用于治疗tdt)，包括在个体体内导致相对于临床实验室血红素分量(成人血红素hba，及胎儿血红素hbf)的基线的变化，关于两者的变化是以公克/dl血浆的变化和总hb的hbf百分比变化来表示。在一些实施方案中，使用本文揭示的治疗方法可导致地中海贫血症相关疾病生物标记的变化。在一些实施方案中，与地中海贫血症相关疾病生物标记的变化可包括，但不限于铁代谢的变化及/或红细胞生成素，血红素结合素(haptoglobin)和铁调素(hepcidin)水平的变化。在一些实施方案中，治疗方法可导致患者的与基线输血疗法有关的铁过负荷相关症状的变化。铁过负荷症状的变化可能包括内分泌器官中由铁沉积引起的内分泌功能障碍减轻。内分泌功能障碍可透过测量若干因素(含量及/或活性)来评估，这些因素包括但不限于：甲状腺素、igf-1、早晨皮质醇、促肾上腺皮质激素(acth)，hba1c及/或维生素d。以上所有因素(包括hba、hbf、红细胞生成素、血红素结合素、铁调素、甲状腺素、igf-1、皮质醇，acth和维生素d)均可透过标准临床实验室规程来进行测量。
[0012]
在一些实施方案中，本文所述用途和治疗方法将在β-地中海贫血症(例如tdt)个体中导致对(使用)rbc输血和输注其它血液制品(包括，但不限于的血小板、静脉内免疫球
蛋白(ivig)，血浆和颗粒球)的需求减少。在经本发明方法和组合物治疗的个体体内，可针对该个体记下使用日志来评估使用rbc和其他血液制品输注的变化。在经本文揭示的组合物输注后，该日志可用于计算红细胞浓厚液(prbc)的年化频率(annualized frequency)和体积，并与个体在治疗前的过往prbc和其他血液制品使用进行比较。
[0013]
在一些实施方案中，如本文所述的治疗方法导致肝脏疾病减少。肝脏疾病和肝肿大是tdt的常见合并症，原因是红细胞(rbc)破坏和髓外红细胞生成增加。红细胞生成速率加快会提高肠道中的饮食铁吸收，从而导致类似于遗传性血色素沉着症中所看到的慢性铁过负荷状态。在肝脏中，铁沉积的变化可透过mri进行评估，其中可使用标准方法来评估肝细胞和库佛氏细胞中的铁沉积，诸如基于r2f的(resonance health)技术(参见，例如st pierre et al.(2013)magn reason med 71(6):2215-23)。
[0014]
在一些实施方案中，本文所述的治疗方法导致心脏异常减少。心脏异常(包括心脏衰竭和致命性心律不整)是tdt的主要并发症，也是常见的死因。终生输血疗法改善了心脏病理学；然而，tdt患者经常因为心肌铁沉积而出现心脏血铁黄素沉着症(he et al.(2008)magn reason med60(5):1082-1089)。心脏异常的变化可以透过mri进行评估，因为在标准的心肌t2*(t2星)磁共振技术中可以看到心肌中的铁沉积和过负荷。
[0015]
在一些实施方案中，本文所述的治疗方法导致骨质疏松症减少和骨折减少，这两者是tdt的常见并发症(vogiatzi et al.(2009)j bone miner res24(3):543-57)。因为本文揭示的方法所致的骨矿物质密度变化，骨质疏松症和骨折风险的变化，可以使用标准dxa骨密度测定扫描来进行评估(双能x射线吸收测量法dxa，参见例如blake and fogelman(2007)postgrad med j83(982):509-517)。
[0016]
在一些实施方案中，就类红细胞前驱细胞的形态学及/类型而言，本文所述治疗方法导致基线红细胞生成的变化(例如，减少或增加)。tdt会造成严重的类红细胞过度增生，并伴有高度未成熟细胞和常常形态异常的类红细胞前驱细胞。本发明的方法和组合物可以导致出现较少的未成熟细胞及/或减少具有非典型形态的细胞的数量。可以透过标准骨髓抽吸术来评估红细胞生成的变化，而骨髓抽吸术是表征造血作用的惯用临床程序。
[0017]
在一些实施方案中，本文所述的治疗方法导致f细胞的数目和百分比相对于基线改变。f细胞是含有可测得的hbf量的rbc。评估f细胞的变化作为治疗方法的结果是可以透过本技艺中已知的方法来进行测量(参见，例如wood et al.(1975)blood 46(5):671)。在某些实施方案中，相较于未受治疗的个体，如本文所述受治疗个体的f细胞数量及/或百分比增加。
[0018]
本文揭示包含一或多个mrna的组合物，该mrna编码一或多个切割内源性bcl11a序列(例如，内源性bcl11a增强子序列)的zfn。在某些实施方案中，该一或多个mrna包含sb-mrenh1 mrna及/或sb-mrenh2mrna(如seq id no：15和seq id no：16中所示)。还揭示了包含一或多个相同或不同mrna的药物组合物，其包括包含sb-mrenh1和sb-mrenh2mrna的组合物。
[0019]
还提供了包含一或多个mrna的经分离细胞及经分离细胞群体及/或包含这些mrna的一或多种药物组合物。也描述了包含经遗传修饰细胞和其后代的细胞的组合物，包括但不限于经遗传修饰细胞之后代。经遗传修饰后代细胞可以通过活体外方法(经遗传修饰细胞的培养物)及/或活体内向个体投予经遗传修饰细胞之后获得。因此，经遗传修饰后代细
胞可包括经遗传修饰细胞的完全分化或部分分化之后代。在某些实施方案中，经遗传修饰细胞组合物包含经遗传修饰造血干细胞(也称为造血祖干细胞(hpsc)或造血干细胞/前驱细胞(hsc/pc))及/或自其繁衍或产生的经遗传修饰细胞，与未经遗传修饰细胞相比，包括细胞中的bcl11a序列经切割且血红素(例如hbf及/或hba)水平增加(例如3至4倍或更多)的经遗传修饰细胞。本文所述的细胞群体及细胞组合物的经遗传修饰细胞中之一些，全部或没有一者可包含一或多个mrna及/或包含这些mrna的药物组合物。因此，本文描述了细胞，细胞群体和包含这些细胞的组合物，该等细胞，细胞群体和组合物包含经遗传修饰细胞及其后代，该等经遗传修饰细胞包含本文所述的mrna。该等细胞，细胞群体和包含这些细胞与细胞群体的组合物可以包含自体细胞及/或同种异体细胞。还提供包含如本文所述的经遗传修饰细胞(例如，与未修饰细胞相比，展现出球蛋白表达增加的类红细胞前驱细胞，诸如hpsc)的药物组合物。
[0020]
进一步提供制造(做出)经遗传修饰的经分离细胞(或细胞群体或包含经遗传修饰细胞和其后代的组合物)的方法，包括制造经遗传修饰细胞群体的方法，其中bcl11a序列(例如增强子序列)经遗传修饰，以使得与未经修饰细胞相比，经遗传修饰细胞中的血红素(例如，hbf及/或hba)水平增加(例如两倍或更多倍)。在某些实施方案中，该等方法包含将如本文所述的一或多个mrna (或包含一或多个mrna的药物组合物)投予给细胞(例如经由转染)。该等细胞可以是自体的及/或同种异体的，并且可以是hspc。在某些实施方案中，该等方法进一步包含培养经遗传修饰细胞，以产生包含展现出球蛋白生产增加的经遗传修饰细胞(例如，hpsc细胞)及/或其经遗传修饰细胞后代(例如，其他类红细胞前驱细胞及/或成熟类红细胞细胞，诸如rbc)群体的组合物。该等组合物可包含含有mrna的经遗传修饰细胞及/或衍生自不再包含mrna但保有遗传修饰(bcl11a特异性修饰)的此类细胞的经遗传修饰细胞后代。还提供了包含经遗传修饰细胞群体及/或其后代细胞的药物组合物。
[0021]
因此，在一些实施方案中，本文揭示的方法和组合物涉及用已经过离体(exo vivo)修饰的细胞来治疗个体。在一些实施方案中，从该名个体分离细胞、进行离体修饰，然后送回该个体。在其他实施方案中，从健康供体分离细胞、进行离体修饰，然后用于治疗个体。在进一步的实施方案中，从健康供体分离的细胞被进一步离体修饰以除去自身标记(例如hla复合物)，避免受到个体的细胞所排斥。在一些实施方案中，分离的细胞是干细胞。在进一步的实施方案中，干细胞是造血干细胞/前驱(progenitor)细胞(例如cd34 hsc/pc)。在一些实施方案中，通过用一或多剂颗粒球群落刺激因子(g-csf)处理来动员每位个体体内的cd34 hsc/pc。在一些实施方案中，所使用的g-csf的剂量为约10μg/kg/天。在一些实施方案中，将一或多剂g-csf与一或多剂普乐沙福(plerixafor)组合。在一些实施方案中，所使用的普乐沙福剂量为约240μg/kg/天。在进一步的实施方案中，通过一或多回血细胞分离术收取受到动员的细胞。
[0022]
可以通过血细胞分离术从健康个体或β-地中海贫血症个体收集受到动员的人类cd34 hspc，并且在投予(转染)如本文所述的一或多个mrna (或包含一或多个mrna的药物组合物)之前予以纯化。在某些实施方案中，用zfn mrnasb-mrenh1和sbmrenh2(seq id no：15和seq id no：16)转染经纯化的hspc。经转染的经遗传修饰cd34 hspc(“st-400”)可以进行培养，收取及/或冷冻以供使用。在收取后，如本文所述包含经遗传修饰细胞(如与其他遗传基因座相比，至少50％，优选至少70％或更多，甚至更佳至少75-80％或更多的细胞在
mrna投予之后受到遗传修饰，优选地在bcl11a增强子序列处经特异地修饰)(“st-400”)的组合物可包括hspc以及其后代细胞，例如分化成所有造血谱系的hspc，包括类红细胞前驱细胞(cfu-e和bfu-e)、颗粒球/巨噬细胞前驱细胞(cfu-g/m/gm)和多潜能前驱细胞(cfu-gemm)。在某些实施方案中，细胞组合物(群体)之一些，没有一者或全部经遗传修饰细胞包含一或多个mrna。
[0023]
在本文所述的任一种方法或用途中，个体带有经确诊的β-地中海贫血症分子遗传学；临床经确诊β-地中海贫血症(例如，tdt)；是β0/β0或非β0/β0；及/或18岁和40岁之间临床诊断为β-地中海贫血症(例如tdt)，其中前两年期间以年化为基础，每年≤8次有记载的prbc输血事件。在某些实施方案中，经遗传修饰cd34 hspc从得自个体的细胞产生(自体的)。在某些实施方案中，使用g-csf和普乐沙福处理在每名个体体内动员cd34 hspc。在动员后一或多天(例如3、4、5、6，7天或更多天)，通过血细胞分离术从每名个体收集经动员的cd34 hspc，直至收集到足够的细胞为止。在某些实施方案中，收集至少约1
×
104至1
×
107(例如25
×
106)个cd34 hspc/kg。如果需要的话，可以在第一回后的1、2、3周或更多周进行第二回动员(mobilization)和血细胞分离术。在某些实施方案中，如所描述的，对收集之一部份细胞进行遗传修饰，并且在指示对该名个体进行挽救治疗的情况下，保留其余部分(例如冷冻保存)。
[0024]
在一些实施方案中，从个体取出细胞(自体)，并用靶向牵涉到调节胎儿血红素(hbf)产生的基因的核酸酶进行处理。在一些实施方案中，该基因是hbf产生的抑制子。在一些实施方案中，该基因是bcl11a基因。在一些实施方案中，该核酸酶靶向并切割bcl11a基因的类红细胞特异性增强子区域。在一些实施方案中，该核酸酶作为mrna被递送至细胞。在一些实施方案中，类红细胞特异性增强子区域的切割会造成切割位点受到细胞修复机制的易错修复，使得类红细胞转录因子gata1的某个结合位点遭到破坏(参见vierstra et al.(2015)nat methods 12(10):927-30；canver et al.(2015)nature 527(7577):192-7)。在一些实施方案中，该核酸酶靶向bcl11a基因的类红细胞特异性增强子区域，使得其在造血干细胞中不表达。被靶向的增强子区域可能在编码区域的内或的外，包括但不限于内源性bcl11a的内含子2内 58， 55及/或 62区域(其是基于距离bcl11a转录起始位点的千碱基距离来进行编号)，那些增强子区域的长度大约为350( 55)；550( 58)；以及350( 62)个核苷酸。参见例如bauer et al.(2013)science 343:253-25；美国专利第9,963,715号；第10,072,066号；与美国专利公开案第2015/0132269号和第2018/0362926号。在一些实施方案中，在送回个体之前评估经修饰的hsc/pc。在一些实施方案中，针对在bcl11a增强子区域中核酸酶诱导的突变的存在和类型来评估经修饰细胞。在一些实施方案中，突变可以是核苷酸插入，核苷酸缺失或两者(“插入缺失(indel)”)。在一些实施方案中，透过核酸酶评估细胞的脱靶切割。在一些实施方案中，在核酸酶切割后评估细胞的分子易位及/或核型分析细胞染色体。在一些实施方案中，评估细胞的脱靶转录活性。在一些实施方案中，评估细胞的内毒素负荷。在一些实施方案中，可以针对一或多种上述特征来评估细胞。
[0025]
在一些实施方案中，将经修饰cd34 hsc/pc以使得hbf产生增加且β-地中海贫血症的临床症状减少的剂量送回个体。在一些实施方案中，在输注经修饰cd34 hsc/pc前，以一或多种骨髓净除式调理剂(myeloablative condition agent)处理个体。在一些实施方案中，骨髓净除剂是白消安(busulfan)。在进一步的实施方案中，白消安与其他药剂(诸如环
磷酰胺)一起使用。
[0026]
在一些实施方案中，将剂量约3
×
106个细胞/kg至约20
×
106个细胞/kg(或其间的任何值)的经遗传修饰细胞(例如经由静脉内输注)投予给个体。在一些实施方案中，将细胞调配在含有10％dmso的可输注的(infusible)冷冻介质中。在一些实施方案中，以约1
×
107个细胞/ml的浓度用每袋约1.0-2.0
×
108个细胞来调配。在本文所述的任一种方法中，可以将细胞剂量确定为总细胞剂量或cd34 细胞剂量，其可计算如下：cd34 剂量＝[总细胞剂量]x[cd34 ％]。参见，例如表b，其在第2列显示总细胞剂量并在第3列显示cd34 ％。在一些实施方案中，在输注之后，针对植入经修饰细胞并且评估经修饰细胞群体的异质性来监控接受经修饰hspc的个体。在一些实施方案中，可以针对在bcl11a基因中存在插入缺失来分别评估周边血液，骨髓及/或不同的细胞群。在一些实施方案中，从经处理个体的细胞分离基因组dna，并扩增包含bcl11a靶序列的区域。在进一步的实施方案中，确定细胞群体内的经修饰细胞百分比，并在给药后随时间推移重新测试，以评估经修饰细胞群体与受治疗个体的稳定性。
[0027]
在一些实施方案中，评估修饰数据以产生一个插入缺失概况。在进一步的实施方案中，随时间监控插入缺失概况，以确定任何一种特定细胞类型(插入缺失概况)异常过度生长群体的概率。
[0028]
本文揭示用于治疗带有β-地中海贫血症的个体的组合物和方法，其包含已经经过两个编码锌指核酸酶的半配偶体(又称为“成对zfn”或“左和右zfn”)的多核苷酸处理的细胞。视情况，编码核酸酶的多核苷酸进一步包含编码小肽的序列(包括但不限于肽标签与核定位序列)，及/或包含在一或多个dna结合结构域区域(例如锌指蛋白的骨架)中的突变，及/或一或多个在foki核酸酶切割结构域或切割半结构域中的突变。该等多核苷酸可视情况包含arca帽(美国专利第7,074,596号)。当这些多核苷酸组分单独或以任何组合使用时(例如，诸如flag、nls、wpre，arca及/或聚a信号的肽序列，呈任何组合)，本发明的方法和组合物提供令人惊讶且出乎意料的人工核酸酶表达增加且效率增加(例如，与没有本文所述序列/修饰的核酸酶相比，有2、3、4、5、6、10，20或更多倍切割)，及/或靶向特异性。在某些实施方案中，本文所述为一种组合物，其包含在bcl11a基因座处受到如本文所述的mrna特异性修饰的经遗传修饰细胞，其包括其中小于10％(0至10％或其间的任何值)，优选地小于5％(0至5％或其间的任何值)，甚至更佳小于1％细胞(0至1％或其间的任何值)，且甚至更佳小于0.5％(0至1％或其间的任何值)的经遗传修饰细胞在bcl11a基因座以外包括由mrna做出的遗传修饰(但可包括额外的修饰，例如hla标记的不活化)。在进一步的实施方案中，编码锌指核酸酶的多核苷酸可以包含已知为sb63014的左zfn(参见，美国专利第10,563,184号和美国专利公开案第2018/0087072号)，由mrna sb-mrenh1所编码。在一些实施方案中，右zfn是sb65722(参见，美国专利第10,563,184号和美国专利公开案第2018/0087072号)，由mrna sb-mrenh2所编码。
[0029]
本文还描述包含如本文所述的zfn及/或多核苷酸(例如，mrna)的宿主细胞，包括经分离的造血干细胞(hspc，例如cd34 )。可以从健康个体分离细胞，或者，替代地，是从有待治疗病况(例如tdt)的个体中获得，并使用标准技术纯化的自体细胞。zfn在切割后经由插入及/或缺失以遗传的方式来修饰细胞。随后，经扩增的(培养的)细胞可能不再包括zfn(或编码这些zfn的多核苷酸)，而是在培养时保有遗传修饰(例如，bcl11a中的插入及/或缺
失)。在某些实施方案中，遗传修饰是在切割后由nhej做出的插入及/或缺失(“插入缺失”)。与未经处理的(未经遗传修饰的)细胞相比，如本文所述的经遗传细胞展现出不同比例的球蛋白(α-，β-和γ-球蛋白水平)。在某些实施方案中，与未经处理的(未经转染的)hspc相比，γ-球蛋白与β-球蛋白的比率和γ-球蛋白与α-球蛋白的比率增加约2至5倍或更多，包括3至4倍。此外，本文所述的经遗传修饰细胞分化成所有造血谱系，包括类红细胞前驱细胞(cfu-e和bfu-e)、颗粒球/巨噬细胞前驱细胞(cfu-g/m/gm)和多潜能前驱细胞(cfu-gemm)，并展现出正常的核型与形态，这指出造血重建。
[0030]
在某些方面中，描述了使用如本文所述的经遗传修饰细胞以供tdt的离体疗法。在某些实施方案中，经遗传修饰细胞是获自待治疗的个体的自体细胞，然后如本文所述遗传修饰这些细胞并投予给同一个体。可以在用g-csf及/或普乐沙福处理的个体体内动员从个体获得的细胞。参见图5。在本文所述的任一种方法中，可动员任何数量的细胞，例如在个体体内约5x105、约10x105、约15x105、约20x105、约5x106、约10
×
106、约15
×
106、约20
×
106，约25
×
106个cd34 hspc/kg可被动员供用于遗传修饰。如本文所述对自体细胞进行遗传修饰，并根据标准技术将其冷冻保存(例如，使用控制速率的冷冻器)，每个等分试样(例如，输液袋)的总细胞计数为约1.0x108至2.0x108个细胞并可以在生产设施处储存于气相液态氮(《-150℃)中，直到准备将其运送到临床研究中心为止。
[0031]
在本文所述的任一种方法中，个体可以在用经遗传修饰细胞进行离体疗法之前接受调理疗法，例如使用有效剂量和方案经由静脉内(iv)投予白消安。根据标准程序，例如，白消安以约0.5至5mg/kg(或其间的任何值)给药。在某些实施方案中，个体将接受白消安的骨髓净除式方案(约3.2mg/kg/天；经由中央静脉导管iv)持续至多4天(输注前总剂量约12.8mg/kg)，例如在第0天输注经修饰hspc之前第-6天至第-3天。根据研究中心实务或指南，iv白消安可以每日给药一次(共4剂)或每6小时给药一次(共16剂)。首次给药后，将根据药物动力学取样和研究中心实务来调整iv白消安剂量，以达到曲线下面积(auc)为4,000-5,000mmol*min(每日给药)或auc为1,000-1,250mmol*min(每6小时给药)，总方案目标auc为16,000-20,000mmol*min。对于随后的个体，可以修改iv白消安的药物动力学目标。视情况，对治疗性药物进行监控以确定白消安在给药4天后完全清除。
[0032]
在某些方面中，离体疗法包括解冻经遗传修饰的冷冻hspc，并且优选地在解冻的约15至约45分钟内将细胞输注至个体。所投予的经修饰冷冻hspc的体积是依据个体体重来决定。在输注之前和之后监控生命征象(血压、温度、心率，呼吸频率和脉搏血氧饱和度)。在某些实施方案中，个体是使用血液检查以及hbf水平分析(hbf分量的基线水平(a和f，以g/dl计)来进行监控，而hbf百分比是基于首次投予iv白消安的日当天或之后基于最后评估，内分泌功能及/或进行mri以评估铁负荷来确定hbf百分比。在某些实施方案中，离体疗法于输注约两周至四周内在tdt个体体内导致嗜中性粒细胞和血小板回复至正常水平。hspc输注后，个体也可以接受prbc输注0次，1次或更多次。在某些实施方案中，按照输注经修饰hspc之后的周数(例如2、3、4、5、6，7或更多周)，总血红素含量在个体体内维持稳定或持续上升。
[0033]
输注后，可以在患者体内监控经修饰hspc，以确定植入效率及/或修饰异质性。例如，这可以透过确定遗传修饰(“插入缺失”)概况来完成。可以从周边血液，骨髓抽吸物或其他组织样品纯化细胞样品(优选约5
×
104至1
×
107个细胞)，并进行基因组dna分离以供评
估。可以在各个时间点(包括大约6-9个月的时间)采集骨髓抽吸物或其他组织样品。
[0034]
在一些实施方案中，与尚未经本文揭示的方法和组合物处理的个体相比，本文提供了减少，延迟及/或消除额外治疗程序的治疗方法，例如其中将有效量的经修饰hsc/pc投予给有需要的个体，其中该个体在治疗后减少，延迟及/或消除了对额外治疗程序的需要。在一些实施方案中，额外治疗程序可以包括，但不限于骨髓移植、prbc及/或其他血液组分输血，以及与铁螯合疗法有关的治疗。
[0035]
在一些实施方案中，可用于本文揭示的组合物和方法中的zfn(例如，zfn，其为zfn对(左和右)的成员是通过两个个别mrna递送)包括被称为sb-mrenh1和sb-mrenh2的mrna。在一些实施方案中，经由电穿孔(例如向hsc/pc)递送bcl11特异性对中的zfn，例如其中一个aav包含左zfn(例如sb-mrenh1)而另一者包含右zfn(例如sb-mrenh2)。
[0036]
因此，本文描述用于改变血红素表达以供治疗及/或预防β-地中海贫血症(例如tdt)的方法。在某些实施方案中，包含第一和第二(左和右)zfn的zfn对，即包含命名为63014的zfp的六指zfn(其包含表1中所示的识别螺旋区)(例如，由mrna sb-mrenh1编码)；和包含命名为65722的zfp的5指zfn(其包含表1中所示的识别螺旋区)(例如，由mrna sb-mrenh2编码)被用于改变个体的经分离细胞或细胞中的血红素含量，包括用于治疗tdt。zfn对在人类基因组grch38/hg38装配体中的位置chr2：60,495,250-60,495,290处结合至人类bcl11a基因的类红细胞特异性增强子中的33个碱基对(合并的)靶位点。在某些实施方案中，一个mrna编码该对的两个zfn。或者，采用各自编码一对中之一个zfn的个别mrna。在某些实施方案中，mrna序列显示在实施方案1中(seq id no：15和seq id no：16)。
[0037]
视情况，编码核酸酶的多核苷酸进一步包含编码小肽(包括但不限于肽标签和核定位序列)的序列，及/或包含在一或多个dna结合结构域区域(例如锌指蛋白的骨架)中的突变，及/或一或多个在foki核酸酶切割结构域或切割半结构域中的突变。当这些多核苷酸组分单独或以任何组合使用时(例如，诸如flag、nls、wpre，arca及/或聚a信号的肽序列，呈任何组合)，本发明的方法和组合物提供令人惊讶且出乎意料的人工核酸酶表达增加且效率增加(例如，与没有本文所述序列/修饰的核酸酶相比，有2、3、4、5、6、10，20或更多倍切割)，及/或靶向特异性。因此，依据某些实施方案，本文所述细胞(细胞群体以及包含这些细胞与细胞群体的组合物)在bcl11a基因座处受到mrna特异地遗传修饰，其中小于10％(其间的任何值的0至10％)，优选地小于5％(0至5％或其间的任何值)，甚至更佳小于1％细胞(0至1％或其间的任何值)，且甚至更佳小于0.5％(0至1％或其间的任何值)的经遗传修饰细胞在bcl11a基因座以外包括由mrna做出的遗传修饰(但可包括额外的修饰，例如hla标记的不活化)。在一些实施方案中，核酸酶由mrna编码，且mrna视情况包含用于增加转录和翻译效率的要素。
[0038]
本发明的方法和组合物还可包括在识别靶序列的核苷酸的残基的外的dna结合结构域内的一或多个氨基酸突变(例如，“zfp骨架”的一或多个突变(在dna识别螺旋区以外))，其可与dna骨架上的磷酸根非特异地交互作用。因此，在一些实施方案中，本文揭示的方法和组合物包括zfp骨架中阳离子性氨基酸残基的突变，其对于核苷酸标靶特异性不是必需的。在一些实施方案中，zfp骨架中的这些突变包含将阳离子性氨基酸残基突变成中性或阴离子性氨基酸残基。在一些实施方案中，zfp骨架中的这些突变包含将极性氨基酸残基突变成中性或非极性氨基酸残基。在一些实施方案中，在相对于dna结合螺旋的位置(-5)，
(-9)及/或位置(-14)处做出突变。在一些实施方案中，锌指可在(-5)，(-9)及/或(-14)处包含一或多个突变。在一些实施方案中，多指锌指蛋白中的一或多个锌指可包含(-5)，(-9)及/或(-14)中的突变。在一些实施方案中，在(-5)，(-9)及/或(-14)处的氨基酸(例如精氨酸(r)或离氨酸(k))突变成丙氨酸(a)、白氨酸(l)、ser(s)、asp(n)、glu(e)，tyr(y)及/或麸酰氨酸(q)。参见，例如美国专利公开案第2018/0087072号。
[0039]
在一些方面中，本发明的方法和组合物包括使用编码融合至真核转基因序列的外源性肽序列的序列。在一些实施方案中，外源性肽在转译后融合至蛋白质序列，而在其他实施方案中，编码外源性肽的序列在框内(3'及/或5')连接至编码人工核酸酶的序列(例如，融合蛋白)。在优选实施方案中，使用编码3个flag序列的序列(3x flag肽)(参见，美国专利案第6,379,903号)，其中氨基酸序列为n端dykdhdg-dykdhdi-dykddddk(seq id no：1)。与不具有该肽序列的核酸酶相比，纳入一或多个这样的肽序列(例如3x flag)可使核酸酶(切割)活性增加2、3、4、5、6、7、8、9、10、11倍或更多倍。
[0040]
在一些方面中，编码人工核酸酶的mrna包含核定位肽序列(nls)。在一些实施方案中，nls包含来自sv40病毒大t基因的序列pkkkrkv(seq id no：2)(参见kalderon et al.(1984)nature311(5981):33-8)。与不具有该肽序列的核酸酶相比，如本文所述纳入一或多个nls序列可使核酸酶(切割)活性增加2、3、4、5、6、7、8、9、10、11倍或更多倍。
[0041]
在一些实施方案中，本文揭示的方法和组合物包含例如经由周边静脉导管给予本发明组合物(例如，经修饰hsc/pc)。在一些实施方案中，组合物被投予给个体，然后接着投予生理食盐水(ns)或磷酸盐缓冲食盐水(pbs)。在一些实施方案中，个体接受总剂量为约3.0
×
106个细胞/kg与约20
×
106个细胞/kg之间(或其间的任何值)的经修饰细胞。可使用范围约3.0
×
106至约20
×
106个细胞/kg之间的任何剂量。
[0042]
在一些实施方案中，在接受总剂量约3.0
×
106至约20
×
106个细胞/kg之后，个体已延迟，减少或消除(例如)对于额外治疗程序的需求。
[0043]
在另一个方面中，本文揭示一种于β-地中海贫血症个体体内，与用本发明方法及组合物治疗之前的个体相比，在用该等方法及组合物治疗之后减少、延迟或消除地中海贫血症相关疾病生物标记的方法。可以透过标准临床实验室规程来测量以测定地中海贫血症相关生物标记(包括hba、hbf、红细胞生成素、血红素结合素、铁调素、甲状腺素、igf-1、皮质醇，acth和维生素d)，该方法包含，例如向该个体投予有效量的经修饰hsc/pc，其中该个体在治疗后具有减少，延迟或消除的地中海贫血症相关疾病生物标记。在一些实施方案中，在通过本文揭示的方法治疗之后，hbf水平增加约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％，400％或更多(或其间的任何值)。
[0044]
在另一个方面中，本文揭示一种于β-地中海贫血症个体体内，与未用本发明方法及组合物治疗的个体相比，在用该等方法及组合物治疗之后减少，延迟或消除使用prbc输血和其它血液制品输注，包括但不限于血小板、静脉内免疫球蛋白(ivig)，血浆以及颗粒球。在一些实施方案中，相较于接受治疗之前的个体，在用本文揭示的方法治疗的个体中，prbc及/或其他血液制品的使用减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，100％或其间的任何值。在一些实施方案中，消除了prbc及/或其他血液制品输注的使用。
[0045]
在另一方面中，本文揭示一种减少，延迟或消除β地中海贫血症个体体内与铁过负
荷有关的症状的方法。在一些实施方案中，与治疗前的标记水平相比，在用本发明方法和组合物治疗后，个体体内由于铁沉积在内分泌器官中而引起内分泌功能障碍的标记(例如，甲状腺标记、igf-1、早晨皮质醇，hba1c和维生素d)变得正常。在一些实施方案中，与治疗前的个体相比，在用本文揭示的方法和组合物治疗的个体体内，肝脏和心脏中的铁过负荷减少。铁过负荷可透过标准mri程序进行评估。在一些实施方案中，与接受治疗前的个体相比，在用本文揭示的方法治疗的个体体内，透过mri检测到肝脏及/或心脏中的铁过负荷降低约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，100％或其间的任何值。
[0046]
在另一个方面中，本文揭示一种减少，延迟或消除β-地中海贫血症个体体内与骨质疏松症及/或骨折相关的症状的方法。在一些实施方案中，与治疗前的个体相比，在用本文揭示的方法及组合物治疗的个体体内骨密度增加。在一些实施方案中，与治疗前的个体相比，在用本文揭示的方法和组合物治疗的个体体内，骨质疏松症和骨折减少或消除。在一些实施方案中，与接受治疗前的个体相比，用本文揭示的方法治疗的个体体内，骨质疏松症及/或骨折改善约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，100％或其间的任何值。
[0047]
在另一个方面中，本文揭示一种与治疗前的tdt个体相比，在用本文揭示的方法及组合物治疗之后，该个体体内减少，延迟或消除骨髓中的类红细胞过度增生，未成熟细胞和类红细胞前驱细胞。
[0048]
在另一个方面中，本文提供一种制品，其包含包装(例如，袋子)，该包装包含含有如本文所述经遗传修饰的自体hsc/pc的组合物。该制品(例如袋子)可以被调配用于冷冻保存，例如在含有10％dmso的cs-10冷冻介质(sigmaaldrich)中。每个袋子可以容纳任何浓度的细胞。在某些实施方案中，每个袋子含有浓度约1x107个细胞/ml的每袋约1.0-2.0x108个细胞。
[0049]
在另一个方面中，本文描述了监控如本文所述的经遗传修饰细胞群体的修饰概况(例如，在切割后产生的插入及/或缺失的数量及/或类型，通常是由nhej切割的序列)的方法。监控可以在投予给个体之前及/或之后进行，以确定某一种类型的修饰(纯系(clone))是否在群体中占优势，因为这种累积可能导致特定纯系群体不乐见的增殖。在某些实施方案中，使用标准技术(诸如定序或类似者)监控经遗传修饰细胞群体的修饰类型(插入及/或缺失，也称为“插入缺失/概况”)。在某些实施方案中，在投予前分析细胞群体以确定修饰模式(插入缺失概况)的基线，然后在输注后进行监控以确定植入细胞的插入缺失概况得以维持，这样就不会出现某一个纯系细胞群体异常生长。监控可以在输注之前及/或之后随时间进行(多次)。因此，本文所述的方法可进一步包含在输注之前及/或之后监控经遗传修饰细胞群体，以确定插入缺失概况随时间推移而维持不变。
[0050]
根据本文的说明，将理解到，本揭示内容含括多个实施方案，这些实施方案包括但不限于以下：
[0051]
包含红细胞(rbc)前驱细胞的经遗传修饰细胞，其包含sb-mrenh1 mrna以及sb-mrenh2 mrna，其中mrna编码zfn对；以及在受到zfn对切割后做出的基因组修饰，其中该修饰在内源性bcl11a增强子序列内，使得bcl11a基因在细胞中不活化。还包括其后代细胞。
[0052]
一种在有需要的个体体内治疗β-地中海贫血症(β-地中海贫血症)的离体方法，该方法包含：向该个体投予如本文所述实施方案中任一者的组合物，以使在个体体内的胎儿
血红素(hbf)产生增加，且β-地中海贫血症的一或多种临床症状得以减少，改善或消除。
[0053]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中β-地中海贫血症是输血依赖型β-地中海贫血症。
[0054]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在个体体内达到了相对于临床实验室血红素分量的基线的变化，关于该变化是以公克/dl血浆及/或总血红素(hb)的hbf百分比来表示。
[0055]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中血红素分量是成人血红素(hba)及/或胎儿血红素(hbf)。
[0056]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中该个体是β0/β0或β0/β

。
[0057]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中地中海贫血症相关疾病生物标记的水平在治疗后有所改变。
[0058]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中该等生物标记是铁代谢的变化；及/或红细胞生成素，血红素结合素及/或铁调素(hepcidin)水平的变化。
[0059]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中与铁过负荷有关或与基线输血疗法有关的临床症状获得改善或消除。
[0060]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中通过测定甲状腺素、igf-1、早晨皮质醇，促肾上腺皮质激素(acth)，hba1c及/或维生素d水平的水平及/或活性来分析个体体内的分泌功能障碍减少。
[0061]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中减少或消除个体对rbc输血和输注血小板输血、静脉内免疫球蛋白(ivig)输血，血浆输血及/或颗粒球输血的需求。
[0062]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在该个体体内减少或消除的临床症状是肝脏疾病。
[0063]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在该个体体内减少或消除的临床症状是心脏异常。
[0064]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在该个体体内减少或消除的临床症状是骨质疏松症及/或骨折。
[0065]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在投予组合物后改变个体的基线红细胞生成。
[0066]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在投予组合物后，个体体内的过度增生减少或消除。
[0067]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在个体体内未成熟细胞及/或具有非典型形态的细胞的数量减少。
[0068]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在投予组合物后，个体体内f细胞的数量和百分比改变。
[0069]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中经遗传修饰细胞是自体的或同种异体的。
[0070]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中bcl11a经遗传修饰的细胞进一步包含一或多个额外遗传修饰。
[0071]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中经遗传修饰细胞是同种异体
细胞，并且该一或多种额外遗传修饰包含一或多个自身标记或抗原的不活化。
[0072]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中经遗传修饰细胞是从该个体分离的造血干细胞。
[0073]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中造血干细胞是cd34 造血干细胞或前驱细胞(hsc/pc)，并且在分离之前，在通过用一或多剂g-csf及/或一剂或多剂普乐沙福(plerixafor)处理的个体体内动员cd34 hsc/pc。
[0074]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在个体体内动员至少25
×
106个cd34 hspc/kg，并且通过一或多回血细胞分离术来收取动员的细胞。
[0075]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其进一步包含在向个体投予包含经遗传修饰细胞的组合物之前，并评估该组合物的细胞在bcl11a内的插入及/或缺失。
[0076]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其进一步包含在投予包含经遗传修饰细胞的组合物之前，向个体投予一或多种骨髓净除式调理剂一或多次。
[0077]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中该骨髓净除剂包含白消安，而且进一步其中：静脉内(iv)投予0.5至5mg/kg白消安持续一或多次；iv投予的白消安为3.2mg/kg/天；于第0天输注包含经遗传修饰细胞的组合物前，在第-6天至第-3天输注之前，经由中央静脉导管iv总剂量为12.8mg/kg持续4天；或者每天一次或每6小时iv投予白消安。
[0078]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中投予给个体的经遗传修饰细胞的剂量为3
×
106个细胞/kg至20
×
106个细胞/kg。
[0079]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中投予给个体的经遗传修饰细胞系以约1
×
107个细胞/ml的浓度用每袋约1.0-2.0
×
108个细胞来调配。
[0080]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中经遗传修饰的细胞在投予之前被冷冻保存，并在解冻约15分钟内被投予给该个体。
[0081]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其进一步包含在投予经遗传修饰细胞之前，期间及/或之后监控个体的生命征象。
[0082]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其进一步包含在投予经遗传修饰细胞之前评估个体的血红素，嗜中性粒细胞及/或血小板水平，以确定个体体内的血红素基线水平。
[0083]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在投予经遗传修饰细胞之后，个体体内的血红素，嗜中性粒细胞及/或血小板水平与基线水平相比在投予之后增加或维持稳定持续数周或数月。
[0084]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在投予经遗传修饰细胞之前及/或之后，个体接受一或多次红细胞浓厚液(packed red blood cells；prbc)输血。
[0085]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中个体对额外疗法(诸如骨髓移植，血液组分及/或铁螯合疗法prbc输血)的需求减少或消除。
[0086]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在投予经遗传修饰细胞1-20天内，对额外疗法的需求减少或消除。
[0087]
如本文所述前述实施方案中任一者的离体方法，其中在投予后随时间监控个体，以确定从外围血液样品，骨髓抽吸物或其他组织来源分离的细胞的插入缺失概况，与输注细胞的插入缺失概况相比较来监控植入物在个体体内的稳定性。
et al.(2009)hum mol genet 18(r2):r216-23)，其中hbf水平通常与tdt症状的减弱程度成正比(musallam et al.(2012)blood 119(2):364-7)。此外，还有在移植排斥的tdt患者中同种异体hsct失败的病例报告，偶然产生了持续性高hbf水平，在此之后，回报患者为输血不依赖型(ferster et al.(1995)br.j haematol 90(4):804-8；paciaroni&lucarelli(2012)blood119(4):1091-2)。hbf的产生因为羟基脲而增加(walker et al.(2011)blood118(20):5664-70)。然而，羟基脲在β-地中海贫血症仅有不同程度的效用，在中度β-地中海贫血症中比tdt功效更高(charache et al.(1995)n engl j med332(20):1317-22；ansari et al.(2011)j pediatr hematol oncol 33(5):339-43；singer et al.(2008)am j hematol 83(11):842-5)。此外，羟基脲的作用是舒缓的，但其使用需要定时监控细胞减少症和其他毒性。
[0102]
bcl11a是在发育和造血中扮演多种角色的转录因子。在细胞和动物模型中，全基因组关联性和功能性追踪研究已证明，bcl11a是hbf表达的重要缄默子(silencer)。在一项开创性研究中，在镰状细胞病(scd)的转基因人类化小鼠模型中，类红细胞特异性条件性基因剔除破坏bcl11a，导致血红素转换失败，维持高水平的hbf并在与scd相关的血液学和病理学特征方面有显着改善(xu et al.(2011)science 334(6058):993-6)。因此，抑制bcl11a似乎是治疗人类β-球蛋白病症(诸如tdt和scd)之一项潜在有效策略。然而，靶向bcl11a基因的治疗方法有挑战，因为bcl11a在发育和造血方面的重要作用(brendel et al.(2016)j clin invest 126(10:3868-3878)。一个替代策略靶向类红细胞特异性增强子(ese)要素，该要素位于bcl11a的第二个内含子中且在类红细胞细胞而非其他谱系中是bcl11a表达所必要的。增强子要素被发现含有一个与hbf水平较高有关的共同遗传变异(bauer et al.(2013)science 342(6155):253-7)。因此，假设对bcl11a基因的类红细胞特异性增强子进行修饰可以在类红细胞细胞中增强内源性hbf水平，却不会对整体bcl11a功能产生有害影响(hardison&blobel(2013)science342(6155):206-7)。
[0103]
在用经修饰hspc治疗后，个体的安全性最为重要。因此，在本文所述任一种方法中，可以在输注之后监控经修饰hspc，以评估经修饰细胞是否随时间而保留在个体体内。另外，核酸酶切割后，nhej导致包括不同插入及/或缺失(又称为插入缺失概况)的细胞群体。插入及/或缺失(插入缺失)可为任何长度，并且可以是插入和缺失的任何组合，包括但不限于缺失0至10kb核苷酸；插入0至10kb核苷酸；缺失0至10kb核苷酸加上插入1至10kb核苷酸；及/或缺失1至10kb核苷酸加上插入0至10kb核苷酸。患者间的插入缺失概况有很大的不同。例如，如图7a至图7c关于患者1、2和3所示，显示了每名患者的10个最常见插入缺失的插入缺失概况，其中“i”是指插入；“d”是指缺失；第一个数字是指从参考碱基对起插入缺失的起始位置(“*”是指侧接插入缺失的核苷酸，可以与插入缺失的两侧对齐)；而冒号后面的数字是指插入或缺失的碱基对的数目。如所示，最常见的插入缺失在1至28个核苷酸之间变化，并始于参考碱基对的约50至70(在任一侧)之间。此外，在所有患者中，“所有其他插入缺失”占所评估插入缺失的40％以上。另外，如所示，插入缺失概况可随时间改变。
[0104]
本文还描述了监控经遗传修饰hspc以确定其插入缺失概况的方法。在某些实施方案中，在输注之前确定经离体遗传修饰细胞的插入缺失概况，并在投予给个体后随时间进行监控。这样的监控确保了植入细胞中插入缺失的分布模式得以维持，并且没有一个纯系细胞群体异常生长，这种现象也被称为中乐透，其中一个纯系群体的生长速度快于其他纯
系群体(参见，例如heddle(1999)mutagenesis 14(3):257-260)，这可能导致衍生自该经修饰hspc的细胞类型相对于体内hspc的正常细胞稳态而言不乐见的过度生长。可以使用任何标准技术进行插入缺失概况的监控，例如透过定序或其他方法。
[0105]
因此，本文提供经遗传修饰细胞(例如红细胞(rbc)前驱细胞，诸如cd34 造血干细胞或类红细胞前驱细胞)，其包含(
ⅰ
)sb-mrenh1mrna和sb-mrenh2 mrna (如seq id no：15和seq id no：16中所示)，该等mrna编码zfn对；以及(
ⅱ
)透过zfn切割之后作出的基因组修饰，其中该修饰是在内源性bcl11a增强子序列内，使得bcl11a基因在细胞中不活化。还提供了包含这些经遗传修饰细胞的细胞群体；自其衍生的经基因修饰细胞；包含经遗传修饰细胞以及自其衍生的细胞的细胞群；以及包含经遗传修饰细胞及/或自其衍生的细胞的组合物。本文所述的细胞、细胞群体，和组合物可以是(来自个体的)自体细胞及/或同种异体细胞。此外，经遗传修饰细胞可以包括一或多个额外遗传修饰，包括但不限于其中一或多种自身标记或抗原不活化(基因剔除)的细胞。
[0106]
也提供使用这些细胞群体及/或组合物的离体细胞疗法，例如，通过向个体投予如本文所述包含经遗传修饰细胞(及/或自其衍生的细胞)的组合物来治疗患有β-地中海贫血症(β-地中海贫血症)的个体的离体方法，使得个体体内的胎儿血红素(hbf)产生(例如β0/β0或β0/β

)增加，且β-地中海贫血症的一或多种临床症状(例如，输血依赖型β-地中海贫血症)得以减少，改善或消除。在某些实施方案中，在个体体内达到相对于临床实验室血红素分量(成人和胎人血红素)基线的变化(以公克/dl血浆为单位及/或总血红素(hb)的hbf百分比)。在其他实施方案中，在治疗(投予经遗传修饰细胞)后，改变了地中海贫血症相关疾病生物标记水平(例如铁代谢的改变；及/或红细胞生成素，血红素结合素及/或铁调素水平的改变)。可以减少，改善或消除的临床症状包括但不限于：与铁过负荷有关或基线输血疗法有关的临床症状(例如，透过确定甲状腺素、igf-1、早晨皮质醇，促肾上腺皮质激素(acth)，hba1c及/或维生素d水平的水平及/或活性来分析个体的内分泌功能障碍的减少)；对rbc输注和输注血小板输血、静脉内免疫球蛋白(ivig)输血、血浆输血，及/或颗粒球输注的需求；肝脏疾病；心脏异常；骨质疏松症及/或骨折。如本文所述的离体方法还可在投予组合物后在个体体内导致基线红细胞生成方面的改变，包括但不限于减少或消除过度增生；减少未成熟及/或具有非典型形态的细胞的数量；及/或个体体内f细胞的数量和百分比的变化(修饰)。
[0107]
在本文所述任一种方法中，经遗传修饰细胞是从个体分离的造血干细胞(例如cd34 hsc/pc)，视情况其中在分离之前于每位个体体内通过用一或多剂g-csf及/或一或多剂普乐沙福处理来动员cd34 hspc/pc(例如至少25x106个cd34 hspc/kg)，并且通过一或多回血细胞分离术来收取经动员细胞。此外，可以评估包含经遗传修饰细胞的组合物在bcl11a (中靶修饰)及/或其他非bcl11a区域(脱靶修饰)内的插入及/或缺失。投予包含经遗传修饰细胞的组合物之前，个体可以用(投予)一或多种骨髓净除式调理剂处理一或多次，例如，投予白消安：以0.5至5mg/kg静脉内(iv)持续一或多次；以3.2mg/kg/天iv；于第0天输注包含经遗传修饰细胞的组合物前，在第-6天至第-3天输注前，经由中央静脉导管iv总剂量为12.8mg/kg持续4天；或者每天一次或每6小时iv。可以使用任何剂量的经遗传修饰细胞，例如，3x106个细胞/kg和20x106个细胞/kg之间(例如，以约1
×
107个细胞/ml的浓度用每袋约1.0-2.0
×
108个细胞来调配细胞)。可以在投予之前将经遗传修饰细胞冷冻保存，并
且可以在解冻后的任何时间，包括但不限于解冻的约15分钟至约45分钟内。该等方法可以进一步包含在投予经遗传修饰细胞之前，期间及/或之后监控个体的生命征象；及/或在投予经遗传修饰细胞之前评估个体的血红素，嗜中性粒细胞及/或血小板水平，以确定个体的血红素基线水平。在某些实施方案中，与投予后数周或数月的基线水平相比，个体在投予经遗传修饰细胞后的血红素，嗜中性粒细胞及/或血小板水平增加或维持稳定。视情况，个体可以在投予经遗传修饰细胞之前及/或之后接受一或多次prbc输血。在本文所述任一种方法中，在将组合物投予给个体后，在例如大约1到30天或更多天内(包括1-20天)，减少或消除了个体对其他疗法(诸如骨髓移植、血液组分，铁螯合及/或prbc输血疗法)的需求。还可以在投予之前及/和之后监控细胞和个体，例如以确定从周边血液样品，骨髓抽吸物或其他组织来源中分离而来的细胞的插入缺失概况而与输注细胞的插入缺失概况相比较，以便监控植入物在个体体内的稳定性。一般性
[0108]
除非另有说明，否则实施本文揭示的方法，以及组合物的制备和使用采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养，重组dna和本领域技术人员所知的相关领域中的常规技术。这些技术在文献中已得到充分解释。参见例如，sambrook et al.molecular cloning:a laboratory manual,second edition,cold spring harbor laboratory press,1989and third edition,2001；ausubel et al.,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,new york,1987and periodic updates；the series methods in enzymology,academic press,san diego；wolffe,chromatin structure and function,third edition,academic press,san diego,1998；methods in enzymology,vol.304,“chromatin”(p.m.wassarman and a.p.wolffe,eds.),academic press,san diego,1999；以及methods in molecular biology,vol.119,“chromatin protocols”(p.b.becker,ed.)humana press,totowa,1999。定义
[0109]
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交替使用，并且是指线性或环状构型，以及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本揭示内容的目的，这些术语不应解释为对聚合物长度的限制。该等术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基，糖及/或磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯骨架)中经修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；亦即a的类似物将与t碱基配对。
[0110]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可交替使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于其中一或多个氨基酸为对应天然氨基酸的化学类似物或经修饰衍生物的氨基酸聚合物。
[0111]“结合”是指巨分子之间(例如，蛋白质与核酸之间)的序列特异性，非共价交互作用。并非结合交互作用的所有组分都是序列特异性所必要的(例如，与dna骨架中的磷酸根残基接触)，只要整个交互作用具有序列特异性即可。这种交互作用的特征通常在于解离常数(kd)为10-6
m-1
或更低。“亲和力”是指结合强度：结合亲和力的增加与较低的kd相关联。
[0112]“结合蛋白”是一种蛋白质，其能够非共价结合至另一个分子。结合蛋白可以结合至例如dna分子(dna结合蛋白)，rna分子(rna结合蛋白)及/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况下，它可以结合至自身(形成同二聚体，同三聚体等)及/或可
以结合不同蛋白质之一个或多个分子。结合蛋白可以具有超过一种的结合活性。例如，锌指蛋白具有dna结合，rna结合和蛋白质结合活性。
[0113]“锌指(zinc finger)dna结合蛋白”(或结合结构域)是一种蛋白质，或一个较大蛋白质内的结构域，其透过一个或多个锌指以序列特异性的方式结合dna，它们是结合结构域中的氨基酸序列区域，其结构是透过锌离子的配位得以稳定。术语“锌指dna结合蛋白”通常缩写为锌指蛋白或zfp。术语“锌指核酸酶”包括一个zfn以及一对zfn(该对中的成员称为“左与右”或“第一与第二”或“一对”)，其二聚化以切割标靶基因。
[0114]“tale dna结合结构域”或“tale”是包含一或多个tale重复序列结构域/单元的多肽。重复序列结构域参与tale与其同源标靶dna序列的结合。单个“重复单元”(也称为“重复序列”)的长度通常为33-35个氨基酸，并且与天然tale蛋白内的其他tale重复序列具有至少一些序列同源性。参见，例如美国专利第8,586,526号和第9,458,205号。术语“talen”包括一个talen以及一对talen(该对中的成员称为“左与右”或“第一与第二”或“一对”)，其二聚化以切割标靶基因。锌指和tale结合结构域可以例如经由工程改造天然锌指或tale蛋白的识别螺旋区(改变一或多个氨基酸)，而被“改造”成结合至预定核苷酸序列。因此，经工程改造的dna结合蛋白(锌指或tale)是非天然的蛋白质。用于工程改造dna结合蛋白的方法的非限制性实施方案是设计和选择。经设计的dna结合蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要来自合理标准。设计的合理标准包括应用替换规则和计算器算法，以供处理数据库中储存现有zfp及/或tale设计的信息以及结合数据的信息。参见，例如，美国专利第8,568,526号；第6,140,081号；第6,453,242号；和第6,534,261号；也参见国际专利公开案第wo 98/53058号；第wo 98/53059号；第wo 98/53060号；第wo 02/016536号；和第wo 03/016496号。
[0115]“选定”的锌指蛋白或tale本质上是其主要从实验过程(诸如噬菌体展示，交互作用捕获或杂交筛选)生产未发现到的蛋白质。参见例如，美国专利案第8,586,526号；第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,200,759号；和国际专利公开案第wo 95/19431号；第wo 96/06166号；第wo 98/53057号；第wo 98/54311号；第wo 00/27878号；第wo 01/60970号；第wo 01/88197号和第wo 02/099084号。
[0116]“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。出于本揭示内容的目的，“同源重组(hr)”是指这种交换的特殊形式，其发生在例如经由同源性定点修复机制在细胞中修复双链断裂期间。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子对“标靶”分子(即经历双链断裂的分子)进行模板修复，因此被称为“非交叉基因转换”或“短道基因转换”，因为它导致遗传信息从供体转移到标靶。在不希望受到任何特定理论囿限的情况下，这种转移可能涉及在断裂标靶和供体之间形成的异源双链dna的错配校正，及/或“合成依赖型股贴合”，其中供体被用于重新合成，将成为标靶及/或相关过程一部分的遗传信息。这种特化hr通常导致标靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸的部分或全部序列被并入到标靶多核苷酸中。
[0117]
在本揭示内容的方法中，如本文所述的一或多个靶向核酸酶在预定位点处的表靶序列(例如，细胞染色质)中产生双链断裂，并且可将与断裂区域中的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸引入细胞。已经显示双链断裂的存在促进供体序列并入。供体序列可以是物理并入的，或者供体多核苷酸用作修复断裂的范本经由同源重组，在供体进入细胞
染色质的时引入全部或部分核苷酸序列。因此，可以改变细胞染色质中的第一序列，并且在某些实施方案中，可以将其转换成供体多核苷酸中存在的序列。因此，使用术语“替换(replace或replacement)”可以理解为表示一个核苷酸序列被另一个核苷酸序列替换(即，替换在信息股中的序列)，并且不一定需要在物理或化学上用另一个核苷酸置换一个多核苷酸。
[0118]
在本文所述任一种方法中，其他锌指或talen蛋白对可以用于细胞内的其他标靶位点的额外双链切割。
[0119]
在细胞染色质的感兴趣区域中靶向重组及/或替换及/或改变序列的方法的某些实施方案中，透过与外源性“供体”核苷酸序列的同源重组来改变染色体序列。如果存在与断裂区域同源的序列，则透过在细胞染色质中存在双链断裂来刺激这种同源重组。
[0120]
在本文所述任一种方法中，第一核苷酸序列(“供体序列”)可含有与感兴趣区域中的基因组序列同源但不相同的序列，从而刺激同源重组以在感兴趣区域中插入非一致序列。因此，在某些实施方案中，与感兴趣区域中的序列同源的部分供体序列与被置换的基因组序列表达出约80至99％(或其间的任何整数)序列同一性。在其他实施方案中，供体和基因组序列之间的同源性高于99％，例如，如果超过100个连续碱基对的供体和基因组序列之间只有1个核苷酸不同。在某些情况下，供体序列的非同源部分可含有不存在于感兴趣区域中的序列，从而将新的序列引入感兴趣区域。在这些情况下，非同源序列通常侧接与感兴趣区域中的序列同源或相同的50-1,000个碱基对(或其间的任何整数值)或大于1,000个碱基对中任一数值的序列。在其他实施方案中，供体序列与第一序列非同源，并且透过非同源重组机制被插入到基因组中。
[0121]
本文所述任一种方法可通过靶向合并破坏感兴趣基因表达的供体序列而用于在细胞中部分或完全不活化一或多个标靶序列。还提供了具有部分或完全不活化基因的细胞株。
[0122]
此外，如本文所述的靶向合并方法也可用于并入一或多个外源性序列。外源性核酸序列可包含例如一或多个基因或cdna分子，或任何类型的编码或非编码序列，以及一或多个控制要素(例如，启动子)。另外，外源性核酸序列可以产生一或多个rna分子(例如，小发夹rna (shrna)、抑制性rna (rnai)、微rna(mirna)等)。
[0123]“切割”是指dna分子的共价骨架断裂。切割可透过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可行的，并且是由于两个不同的单链切割事件的结果，可能发生双链切割。dna切割可导致产生钝端或交错端。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链dna切割。
[0124]“切割半结构域”是指一种多肽序列，其与第二多肽(相同或不同)接合形成具有切割活性(优选双链切割活性)的复合物。术语“第一和第二切割半结构域”；“ 和-切割半结构域”与“右和左切割半结构域”可以交替使用，是指二聚化的切割半结构域。
[0125]“经工程改造的切割半结构域”是一个已被修饰，以便与另一个切割半结构域(例如，另一个经工程改造的切割半结构域)形成绝对异二聚体的切割半结构域。参见，美国专利第7,888,121号；第7,914,796号；第8,034,598号；和第8,823,618号，其以整体引用的方式并入本文。
[0126]
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，可以是dna或rna；可以是线性，环状或分
支的，且可以是单链或双链的。术语“供体序列”是指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可以具有任何长度，例如长度在2至10,000个核苷酸之间(或其间或以上的任何整数值)，优选地长度在约100至1,000个核苷酸之间(或其间的任何整数)，更佳地长度在约200至500个核苷酸之间。
[0127]“疾病相关基因”是指是在单基因疾病中以某种方式缺损的基因。单基因疾病的非限制性实施方案包括重度联合免疫缺乏症、囊肿纤维化、溶胞体贮积症(例如，高歇氏病(gaucher’s)、hurler氏病、亨特氏病(hunter’s)、fabry氏病、尼曼-匹克二氏病(neimann-pick)、泰-沙二氏病(tay-sach’s)等等)、镰状细胞贫血症，和地中海贫血症。
[0128]“血脑障壁”是一种高度选择性渗透屏障，分隔循环血液与中枢神经系统的脑部。血脑障壁是由脑部内皮细胞形成，这些脑部内皮细胞通过cns血管中的紧密接合而相互连接，从而限制了血液溶质通过。长期以来，人们一直认为血脑障壁可以阻止大分子疗法的吸收，并可以阻止大多数小分子疗法的吸收(pardridge(2005)neurorx 2(1):3-14)。
[0129]“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要是dna)和蛋白质，蛋白质包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白质。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包含约150个碱基对的dna，dna与八聚体缔合，该八聚体包含组蛋白h2a、h2b，h3和h4中每一种各两个；以及连接符dna(长度可变，取决于生物体)在核小体核心之间延伸。组蛋白h1分子通常与连接符dna缔合。出于本揭示内容的目的，术语“染色质”是指涵盖原核和真核的所有类型细胞核蛋白。细胞染色质包括染色体和游离型染色质。
[0130]“染色体”是染色体复合物，包含细胞的全部或部分基因组。细胞的基因组通常以其核型为特征，核型是构成细胞基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可以包含一或多个染色体。
[0131]“游离基因组”(episome)是一种复制核酸，核蛋白复合物或其它含有核酸不是细胞的染色体核型一部分的结构。游离基因组的实施方案包括质体和某些病毒基因组。
[0132]“标靶位点”或“标靶序列”是核酸序列，其定义了核酸之一部分，其为结合分子将结合的部分，提供有关于结合存在的充分条件。
[0133]“外源性”分子是一种在细胞中并非正常存在的，但可以透过一或多种遗传，生物化学或其它方法引入细胞中的分子。“在细胞中正常存在”是就细胞的特定发育阶段和环境条件来决定。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子相对于成年肌肉细胞是外源性分子。类似地，相对于非热休克细胞，由热休克诱导的分子是外源性分子。外源性分子可包含例如功能失常的内源性分子的具功能形式或功能正常的内源性分子的功能失调形式。
[0134]
外源性分子尤其可以是诸如通过组合化学过程产生的小分子，或者是诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物，或包含一或多种上述分子的任何复合物的巨分子。核酸包括dna和rna，可以是单链或双链；可以是线性，分支或环状；并且可具任何长度。核酸包括那些能够形成双螺旋体者，以及形成三螺旋体者。参见，例如美国专利第5,176,996号和第5,422,251号。蛋白质包括但不限于dna结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化dna结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓朴异构酶，旋转酶和解旋酶。
[0135]
外源性分子可以是与内源性分子相同类型的分子，例如外源性蛋白质或核酸。例
如，外源性核酸可包含感染性病毒基因组、被引入细胞中的质体或游离基因组，或细胞中通常不存在的染色体。将外源性分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的那些，并且包括，但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击(bombardment)、磷酸钙共沉淀，deae-葡聚糖媒介的转移和病毒载体媒介的转移。外源性分子也可以是与内源性分子相同类型的分子，但其来源不同于细胞来源。例如，可以将人类核酸序列引入最初源自小鼠或仓鼠的细胞株。
[0136]
相对而言，“内源性”分子是一种在特定环境条件下在特定发育阶段时通常存在于特定细胞中的分子。例如，内源性核酸可包含染色体、粒线体，叶绿体或其他胞器的基因组，或天然存在的游离型(episomal)核酸。其他内源性分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。
[0137]“融合”分子是其中两个或更多个次单位分子(优选地共价)连接在一起的分子。次单位分子可以是相同化学类型的分子，也可以是不同化学类型的分子。融合分子的实施方案包括，但不限于融合蛋白(例如，蛋白dna结合结构域与切割结构域之间的融合)、与切割结构域可操作地缔合的多核苷酸dna结合结构域之间的融合(例如sgrna)，以及融合核酸(例如，编码融合蛋白的核酸)。
[0138]
融合蛋白在细胞中的表达可以由将融合蛋白递送至细胞或透过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞而产生，其中转录多核苷酸，并转译转录本以产生融合蛋白。反式剪接，多肽切割和多肽连接也可能涉及蛋白质在细胞中的表达。用于将多核苷酸和多肽递送至细胞的方法在本揭示内容的他处提出。
[0139]“基因”出于本揭示内容的目的，包括编码基因产物的dna区域(见下文)，以及调节基因产物产生的所有dna区域，无论此类调节序列与编码及/或转录序列是否相邻。因此，基因包括，但不限于启动子序列、终止子，转译调节序列(诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、缄默子、绝缘子、边界要素、复制起点，基质附着位点和基因座控制区域。
[0140]“基因表达”是指将基因中包含的信息转换成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mrna、trna、rrna、反义rna、核酶、结构rna或任何其他类型的rna)，或通过mrna转译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽(capping)、聚腺苷酸化，甲基化和编辑的过程修饰的rna，以及通过例如甲基化、乙酰基化、磷酸化、泛素化、adp-核糖基化，肉荳蔻化和糖基化修饰的蛋白质。
[0141]
基因表达的“调控”是指基因活性的变化。表达的调控可包括，但不限于基因活化和基因压抑。基因组编辑(例如，切割、改变、不活化、随机突变)可用于调控表达。基因不活化是指与不包括如本文所述的zfp或talen的细胞相比，基因表达的任何降低。因此，基因不活化可以是部分或完全的。
[0142]“感兴趣区域”是细胞染色质的任何区域，诸如，例如基因内或相邻的非编码序列，在其中期望结合外源性分子。结合可以出于靶向dna切割及/或靶向重组为目的。例如，感兴趣区域可以存在于染色体、游离基因组、胞器基因组(例如粒线体，叶绿体)或感染性病毒基因组中。感兴趣区域可以在基因的编码区域内、在转录非编码区域内(诸如，例如前导序列，尾部序列或内含子)，或在非转录区域内(在编码区域的上游或下游)。感兴趣区域的长度可以小至单个核苷酸对，或多至2,000个核苷酸对，或者任何整数核苷酸对。
[0143]“真核”细胞包括但不限于，真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、动物细胞，哺乳动物细胞和人类细胞(例如，干细胞或前驱细胞)。术语“干细胞”或“前驱细胞”是指多能(pluripotent)和多能(multipotent)干细胞，包括但不限于造血干细胞，也称为造血先驱细胞(hpsc)或造血干细胞/前驱细胞(hsc)/pc)。
[0144]“红细胞”(rbc)或红细胞是衍生自造血干细胞的最终分化细胞。它们缺乏核酸酶和大部分细胞胞器。rbc含有血红素，将氧从肺部携带到周边组织。实际上，单独一个rbc中有33％是血红素。它们还将代谢期间由细胞产生的二氧化碳带出组织，并返回肺部以在呼气时释放。rbc会对血液缺氧做出反应而在骨髓中生成，而这是由肾脏释放红细胞生成素(epo)媒介的。epo导致前红细胞母细胞的数量增加，并缩短了rbc完全成熟所需的时间。大约120天后，因为rbc不包含细胞核或任何其他再生能力，细胞会在肝脏，脾脏和淋巴结中被巨噬细胞的吞噬活动或通过在血浆中的溶血作用而从循环中被移除。巨噬细胞吞噬后，由于溶酶体酶的作用，rbc的化学组分在巨噬细胞的液泡内分解。
[0145]“分泌组织”是那些在动物体内将产物从单个细胞分泌到某些类型的管腔中的组织，这些管腔通常源自上皮。定位于胃肠道的分泌组织实施方案包括衬于肠，胰脏和胆囊的细胞。其他分泌组织包括肝脏，与眼睛相关的组织和黏膜，诸如唾液腺、乳腺、前列腺，脑下腺和内分泌系统的其他成员。另外，分泌组织包括能够分泌的组织类型的单个细胞。
[0146]
关于两个或更多个组分(例如序列要素)的并置，术语“可操作连接”和“可操作地连接(operatively linked)”(或“可操作地连接(operably linked)”)可交替使用，其中该等组件被排列成使得这两个组分正常地发挥作用，并允许至少一个组分能够媒介被施加在该等组分的至少一者上的功能。举例来说，如果转录调节序列对一或多个转录调节因子的存在或不存在做出反应来控制编码序列的转录程度，则转录调节序列(例如启动子)为可操作地连接至编码序列。转录调节序列通常与编码序列以顺式的方式可操作地连接，但是不必然直接相邻。例如，增强子是与编码序列可操作地连接的转录调节序列，即使它们不是相邻的。
[0147]
关于融合多肽，术语“可操作地连接”可以指，也就是如果没有这样连接的话，每个组分在与另一个组分的连接时执行相同的功能。例如，对于其中zfp或tale dna结合结构域与活化结构域融合的融合多肽来说，如果在融合多肽中，zfp或tale dna结合结构域部分和活化结构域是可操作连接，则zfp或tale dna结合域部分能够结合其标靶位点及/或其结合位点，而活化结构域则能够上调基因表达。当融合多肽的zfp或tale dna结合结构域融合至切割结构域，如果在融合多肽中，zfp或tale dna结合结构域和切割结构域是可操作连接，则zfp或tale dna-结合结构域部分能够结合其标靶位点及/或其结合位点，而切割结构域能够在标靶位点附近切割dna。
[0148]“功能性”蛋白质，多肽或核酸包括提供与野生型蛋白质、多肽或核酸相同功能的任何蛋白质，多肽或核酸。蛋白质，多肽或核酸的“功能性片段”是蛋白质，多肽或核酸，其序列与全长蛋白质，多肽或核酸的序列不同，但仍保有与全长蛋白质，多肽或核酸相同的功能。功能性片段可具有与对应天然分子相比更多，更少或相同数目的残基，及/或可含有一或多个氨基酸或核苷酸取代。用以确定核酸功能(例如，编码功能，与另一个核酸杂交的能力)的方法是本技艺中周知的。类似地，用以确定蛋白质功能的方法是周知的。例如，可以透过例如滤膜结合、电泳迁移率改变或免疫沉淀分析来确定多肽的dna结合功能。dna切割可
以透过凝胶电泳来进行分析。参见ausubel et al.，同上。一个蛋白质与另一个蛋白质交互作用的能力可以例如透过遗传和生物化学的共免疫沉淀，双杂交分析或互补来确定。参见，例如fields et al.(1989)nature 340:245-246；美国专利第5,585,245号与国际专利公开案第wo 98/44350号。
[0149]“载体”能将基因序列转移到标靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够引导感兴趣基因表达并且可以将基因序列转移至标靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括选殖和表达载体(vehicle)，以及整合载体。
[0150]“报导基因”或“报导序列”是指产生一种容易测定的蛋白产物的任何序列，优选地尽管不必以常规分析来测定。合适的报导基因包括，但不限于编码媒介抗生素抗性(例如胺芐青霉素抗性、新霉素抗性、g418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列，编码有色或荧光或发光蛋白(例如绿色荧光蛋白，增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)的序列，和媒介增强细胞生长及/或基因扩增的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)。表位标签包括例如flag、his、myc、tap，ha或任何可检测的氨基酸序列的一或多个复本。“表达标签”包括编码可以可操作地连接至所需基因序列以监控感兴趣基因表达的报导子的序列。
[0151]
术语“个体”和“患者”可交替使用，并且指哺乳动物(诸如人类个体和非人类灵长类动物)，以及实验动物(诸如兔、狗、猫、大鼠、小鼠，和其他动物)。因此，术语“个体”或“患者”在此用于表示任何哺乳动物个体或患者，以将本发明的经改变细胞及/或由本发明经改变细胞产生的蛋白质投予至其。本发明的个体包括那些患有β-地中海贫血症的个体。
[0152]
通常，个体是有资格接受β-地中海贫血症治疗的个体。出于本文的目的，这种符合资格的个体是正在经历，已经经历或可能经历一或多种β-地中海贫血症的征象，症状或其他适应症的个体；已被诊断患有β-地中海贫血症(例如是否新近诊断及/或有发生β-地中海贫血症风险)的个体。患有β-地中海贫血症或有罹患β-地中海贫血症风险者可视情况被鉴定为经筛选在其血液或血浆中有异常低水平血红素者。
[0153]
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是一种用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下一或多者：减少由疾病引起的一或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或推迟疾病的恶化)、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态，减少治疗该疾病所需的一或多种其他药物的剂量及/或提高生活质量。
[0154]
如本文所用，“延迟”或“减缓”β-地中海贫血症的进展表示预防、推迟、阻碍、减缓、推迟，稳定及/或推延疾病的发展。取决于疾病的病史及/或要被治疗的个体，该延迟可以具有不同的时间长度。
[0155]
如本文所用，“在开始治疗的时”是指在第一次暴露于β-地中海贫血症治疗组合物(诸如本发明的组合物)的时或之前的时间段。在一些实施方案中，“在开始治疗的时”是在β-地中海贫血症药物之前约一年、九个月、六个月、三个月，第二个月或一个月中的任一者。在一些实施方案中，“在开始治疗的时”是正好在第一次暴露于β-地中海贫血症治疗组合物之前。
[0156]
如本文所用，“基于”包括(1)评估，测定或测量如本文所述的个体特征(并且优选地选出适于接受治疗的个体；以及(2)如本文所述投予治疗。
[0157]
β-地中海贫血症的“症状”是任何现象或在结构，功能或感觉上偏离个体所体验到
者，并表示β-地中海贫血症。
[0158]“输血依赖型β-地中海贫血症”(tdt)个体需要定期输注(输血)prbc和其他血液制品，以维持血红素水平》9至10g/dl。tdt是一种严重的，进行性β-地中海贫血症，与一般群体相比，特征在于具有严重贫血症、终身依赖输血、不可避免的铁过负荷，严重的合并症和寿命较短。tdt患者需要终生支持性照护，并定期输血(通常每2至5周进行一次输血)，以减轻贫血症并实现生存。治疗水平(包括减少或消除对输血的需求的水平)可以高于2-10g/dl或更高(包括2、3、5、6、7、8、9、10或更高g/dl)，视情况对于输血非依赖性至少约5至7或更高g/dl。
[0159]
长期(chronic)输血导致不可避免的铁过负荷，其可对重要器官造成重大损害。因此，患有tdt的患者需要持续并严格地监控铁负担，并且必须定期服用药物以移除多余的铁，一个被称为铁螯合的过程。
[0160]
术语“支持性手术”是指可以对个体执行以减轻可能与疾病有关的症状的手术程序。
[0161]
如本文所用，关于辅助疗法的术语“免疫抑制剂”是指发挥抑制或掩蔽本文所治疗的哺乳动物免疫系统的作用的物质。这可能包括抑制细胞介素产生，下调或抑制自身抗原表达或掩蔽mhc抗原的物质。这类试剂的实施方案包括2-氨基-6-芳基-5-经取代的嘧啶(参见，美国专利案第4,665,077号)；非类固醇消炎药(nsaidua)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质素(诸如皮质醇或醛固酮)、消炎剂(诸如环加氧酶抑制剂、5-脂氧合酶抑制剂，或白三烯受体拮抗剂)；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤或霉酚酸酯(mmf)；烷基化剂，例如环磷酰胺；溴隐碱(bromocryptine)；达那唑(danazol)；二胺苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩蔽mhc抗原，如在美国专利第4,120,649号中所述)；mhc抗原和mhc片段的抗个体基因型抗体；环孢菌素a；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质素类似物(例如，普赖松(prednisone)、甲基培尼皮质醇(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone))；二氢叶酸还原酶抑制剂，例如甲胺蝶呤(口服或皮下)；羟基氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞介素或细胞介素受体拮抗剂，包括抗干扰素-α，-β或-γ抗体，抗肿瘤坏死因数-α抗体(英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))、抗tnf-α免疫曙红(immunoahesin)(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因数-β抗体，抗介白素-2抗体和抗il-2受体抗体；抗lfa-1抗体，包括抗cd11a和抗cd18抗体；抗l3t4抗体；异源性抗淋巴球球蛋白；泛-t抗体，优选抗cd3或抗cd4/cd4a抗体；含有lfa-3结合结构域的可溶性肽(国际专利公开案第wo 90/08187号，于7/26/90公开)；链激酶；tgf-β；链霉烯酶(streptodornase)；来自宿主的rna或dna；fk506；rs-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；t细胞受体(cohen et al.，美国专利第5,114,721号)；t细胞受体片段(offner et al.(1991)science 251:430-432；国际专利公开案第wo 90/11294号；janeway(1989)nature 341:482；与国际专利公开案第wo 91/01133号)；t细胞受体抗体，诸如t10b9。
[0162]“皮质类固醇”是指数种合成或天然物质中任一者，其具有类固醇的模拟或增强天然皮质类固醇的作用的通用化学结构。合成皮质类固醇的实施方案包括普赖松、培尼皮质醇(包括甲基培尼皮质醇)、地塞米松，糖皮质素和倍他米松。
[0163]“铁螯合”是从体内移除过量铁的一种疗法。输血中提供的每单位血液包含约250
scei、i-ceui、pi-pspi、pi-sce、i-sceiv、i-csmi、i-pani、i-sceii、i-ppoi、i-sceiii、i-crei、i-tevi，i-tevii以及i-teviii为已知的。亦参见美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；belfort et al.(1997)nucleic acids res.25:3379-3388；dujon et al.(1989)gene 82:115-118；perler et al.(1994)nucleic acids res.22:1125-1127；jasin(1996)trends genet.12:224-228；gimble et al.(1996)j.mol.biol.263:163-180；argast et al.(1998)j.mol.biol.280:345-353和新英格兰生物实验室目录。另外，归巢核酸内切酶和巨核酸酶的dna结合特异性可以经工程改造以结合非天然标靶位点。参见，例如chevalier et al.(2002)molec.cell 10:895-905；epinat et al.(2003)nucleic acids res.31:2952-2962；ashworth et al.(2006)nature 441:656-659；paques et al.(2007)current gene therapy 7:49-66；美国专利公开案第2007/0117128号。归巢核酸内切酶和巨核酸酶的dna结合结构域可在在核酸酶中以一个整体被改变(即，使得该核酸酶包括同源切割结构域)，或者可融合至异源性切割结构域。
[0170]
在其他实施方案中，用于本文所述方法和组合物中的一或多种核酸酶的dna结合结构域包含天然或经工程改造的(非天然)tal效应子dna结合结构域。参见例如美国专利第8,586,526号，其以全文引用的方式并入。已知黄单胞菌属(the genus xanthomonas)的植物致病菌在重要的农作物中引起许多疾病。黄单胞菌的致病性取决于保守第iii型分泌(t3s)系统，该系统将超过25种不同效应子蛋白注入植物细胞中。这些注射蛋白质为转录活化因子样(tal)效应子，其模拟植物转录活化因子并操纵植物转录体(参见kay et al.(2007)science 318:648-651)。这些蛋白质含有dna结合结构域和转录活化结构域。xanthomonas campestgris pv vesicatoria最为充分特征鉴定的tal效应子之一为avrbs3。(参见bonas et al.(1989)mol gen genet 218:127-136以及国际专利公开案第wo 2010/079430号)。tal效应子含有一个串联重复序列的集中结构域，每个重复序列含有约34个氨基酸，这是这些蛋白质的dna结合特异性的关键。此外，它们含有核定位序列和酸性转录活化结构域(关于综述参见schornack et al.(2006)j plant physiol 163(3):256-272)。再者，在植物病原菌青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)中，两个基因(称为brg11和hpx17)已经被发现与青枯雷尔氏菌生物变型1菌株gmi1000和在生物变型4菌株rs1000的黄单胞菌avrbs3科同源(参见，heuer et al.(2007)appl and envir micro 73(13):4379-4384)。这些基因在核苷酸序列上彼此具有98.9％的同一性，但在hpx17的重复结构域中缺失了1,575bp。然而，两种基因产物与黄单胞菌的avrbs3家族蛋白具有少于40％的序列同一性。参见例如美国专利第8,586,526号，其以整体引用的方式并入。
[0171]
这些tal效应子的特异性取决于在串联重复序列中所发现到的序列。重复序列包含约102bp且重复序列彼此通常为91-100％同源性(bonas et al.，同上)。重复序列的多态性通常位于位置12和13处，且在位置12和13处的高度变异二残基(rvd)的特性与tal效应子的标靶序列中的连续核苷酸特性间似乎有一比一对应性(参见moscou and bogdanove(2009)science326:1501与boch et al.(2009)science 326:1509-1512)。在实验上，已确定了这些tal效应子的dna识别的天然密码子，使得位置12和13处的hd序列导致结合至胞嘧啶(c)、ng结合至t、ni结合至a、c、g或t，nn结合至a或g，而ing结合至t。这些dna结合重复序列已被组装成具有新的重复序列组合和数量的蛋白质，以做出能够与新序列交互作用并活化在植物细胞中的非内源性报导基因表达的人工转录因子(boch et al.，同上)。经工程改
造的tal蛋白已与foki切割半结构域连接，以产生tal效应子结构域核酸酶融合(talen)，其在酵母报导分析(基于质体的标靶)中展现出活性。参见，例如美国专利第8,586,526号；christian et al.(2010)genetics epub10.1534/genetics.110.120717)。
[0172]
在某些实施方案中，用于细胞基因组的活体内切割及/或靶向切割的一或多种核酸酶的dna结合结构域包含锌指蛋白。优选地，锌指蛋白是非天然的，因为其被工程改造成结合至选定的标靶位点。参见例如beerli et al.(2002)nature biotechnol.20:135-141；pabo et al.(2001)ann.rev.biochem.70:313-340；isalan et al.(2001)nature biotechnol.19:656-660；segal et al.(2001)curr.opin.biotechnol.12:632-637；choo et al.(2000)curr.opin.struct.biol.10:411-416；美国专利第6,453,242号；第6,534,261号；第6,599,692号；第6,503,717号；第6,689,558号；第7,030,215号；第6,794,136号；第7,067,317号；第7,262,054号；第7,070,934号；第7,361,635号；第7,253,273号；与美国专利公开案第2005/0064474号；第2007/0218528号；及第2005/0267061号，其以整体引用的方式并入本文。
[0173]
与天然的锌指蛋白相比，经工程改造的锌指结合结构域可以具有新的结合特异性。工程改造方法包括但不限于合理设计和各类型选择。合理的设计包括，例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一或多个氨基酸序列有关。参见，例如共同拥有的美国专利第6,453,242号和第6,534,261号，其以整体引用的方式并入本文。
[0174]
在美国专利第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,410,248号；第6,140,466号；第6,200,759号；和第6,242,568号；以及国际专利公开案第wo 98/37186号；第wo 98/53057号；第wo 00/27878号；与第wo 01/88197号中揭示了例示性选择方法，包括噬菌体展示和双杂交系统。另外，例如在共同拥有的国际专利公开案第wo 02/077227号中已描述了增强锌指结合域的结合特异性。
[0175]
此外，如在这些和其他参考文献中所揭示，锌指结构域及/或多指锌指蛋白可以使用任何合适连接符序列(包括例如，长度为5个或更多个氨基酸的连接符)连接在一起。关于例示性连接符序列，亦参见美国专利第8,772,453号；第6,479,626号；第6,903,185号；和第7,153,949号。本文所述的蛋白质可以包括蛋白质的单独锌指间的合适连接符的任何组合。
[0176]
选择标靶位点；用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的zfp和方法是本领域技术人员已知的，并且详述于下列中：美国专利第6,140,081号；第5,789,538号；第6,453,242号；第6,534,261号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；和第6,200,759号；国际专利公开案第wo 95/19431号；第wo 96/06166号；第wo 98/53057号；第wo 98/54311号；第wo 00/27878号；第wo 01/60970号；第wo 01/88197号；第wo 02/099084号；第wo 98/53058号；第wo 98/53059号；第wo 98/53060号；第wo 02/016536号；与第wo 03/016496号。
[0177]
另外，如在这些和其他参考文献中所揭示，锌指结构域及/或多指锌指蛋白可以使用任何合适连接符序列(包括例如，长度为5个或更多个氨基酸的连接符)连接在一起。关于长度为6个或更多个氨基酸的例示性连接符序列，亦参见美国专利第6,479,626号；第6,903,185号；和第7,153,949号。本文所述的蛋白质可以包括蛋白质的单独锌指间的合适连接符的任何组合。
[0178]
锌指核酸酶可包含一个zfn对(包含左和右zfn)，其中每个zfn对包含核酸酶(切割结构域)和一个靶向bcl11a的zfp。参见，例如，美国专利第9,963,715号；第9,650,648号；美国专利公开案第2015/0132269号和第2018/0111975号。在某些实施方案中，与任何其他基因座(脱靶)相比及/或与其他bcl11a靶向核酸酶相比(例如，没有对骨架修饰的zfn，该修饰描述于美国专利第10,563,184号)相比，mrna的zfn对特异地修饰bcl11a(例如， 58增强子区域)。因此，使用本文所述的mrna产生的细胞在bcl11a基因座处经特异地修饰，包括其中少于10％(其间的任何值的0至10％)，优选少于5％(0至5％或其间的任何值)，甚至更佳小于1％(0至1％或其间的任何值)且甚至更佳地小于0.5％(0至1％或其间的任何值)的经遗传修饰细胞包括bcl11a基因座外由mrna所做出的遗传修饰。参见例如美国专利第10,563,184号。这些细胞可能包含其他修饰，例如hla基因不活化。
[0179]
在某些实施方案中，核酸酶的dna结合结构域是crispr/cas核酸酶系统之一部分，包括例如单一引导rna(sgrna)。参见，例如美国专利第8,697,359号和美国专利公开案第2015/0056705号。crispr(规律间隔成簇短回文重复序列)基因座(编码该系统的rna组分)，以及cas(crispr相关)基因座(其编码蛋白质)(jansen et al.(2002)mol.microbiol.43:1565-1575；makarova et al.(2002)nucleic acids res.30:482-496；makarova et al.(2006)biol.direct 1:7；haft et al.(2005)plos comput.biol.1:e600)构成crispr/cas核酸酶系统的基因序列。微生物宿主中的crispr基因座包含crispr相关(cas)基因以及能够程序化crispr媒介的核酸切割特异性的非编码rna要素的组合。
[0180]
第ii型crispr是特征鉴定最为充分的系统之一，并以四个连续步骤进行靶向dna双链断裂。首先，从crispr基因座转录两个非编码rna，即前-crrna数组和tracrrna。其次，tracrrna与前-crrna的重复序列区域杂交，并媒介前-crrna加工成含有单个间隔子序列的成熟crrna。第三，成熟的crrna：tracrrna复合物经由crrna上之间隔子和标靶dna上与原间隔子相邻基序(pam)相邻的原间隔子之间的华生-克立克碱基配对将cas9引导至标靶dna，pam为标靶识别的额外要件。最后，cas9媒介标靶dna的切割，从而在原间隔子内产生一个双链断裂。crispr/cas系统的活性包括三个步骤：(i)将外来dna序列插入crispr数组中，以防止将来的攻击，在称为“适应”的过程中；(ii)相关蛋白的表达以及数组的表达和加工处理；接着(iii)使用外来核酸进行rna媒介的干扰。因此，在细菌细胞中，一些所谓的“cas”蛋白参与crispr/cas系统的天然功能，并在诸如插入外来dna等功能中发挥作用。
[0181]
在一些实施方案中，使用了crispr-cpf1系统。已在弗朗西斯杆菌属(francisella spp)中鉴定crispr-cpf1系统，其为第2类crispr-cas系统，在人类细胞中媒介强大的dna干扰。虽然在功能上是保守的，但cpf1和cas9在许多方面(包括在其引导rna和底物特异性)不同(参见，fagerlund et al.(2015)genom bio 16:251)。cas9和cpf1蛋白之间的主要区别在于cpf1不利用tracrrna，因此仅需要crrna。fncpf1 crrna长度为42-44个核苷酸(19个核苷酸重复序列和23
–
25个核苷酸间隔子)，并含有一个单独茎环，可以耐受保留二级结构的序列变化。此外，cpf1 crrna明显短于cas9所需的个核苷酸工程改造的sgrna，且fncpfl的pam要求是置换股上的5'-ttn-3'和5'-cta-3'。尽管cas9和cpf1都在标靶dna中产生双链断裂，但是cas9使用其ruvc-和hnh样结构域在引导rna的种子序列内产生钝端切口，而cpf1使用ruvc样结构域在种子外产生交错切口。由于cpf1远离关键种子区域产生交错切口，nhej将不会破坏标靶位点，故确保cpf1可以继续切割同一位点，直到发生所需的hdr重
组事件为止。因此，在本文所述的方法和组合物中，应理解，术语“cas”包括cas9和cfp1蛋白。因此，如本文所用，“crispr/cas系统”是指crispr/cas及/或crispr/cfp1系统，包括核酸酶，切口酶及/或转录因子系统。
[0182]
在一些实施方案中，可以使用其他cas蛋白。一些例示性cas蛋白包括cas9、cpf1(也称为cas12a)、c2c1、c2c2(也称为cas13a)、c2c3、cas1、cas2、cas4，casx和casy；并且包括其工程改造和天然变体(burstein et al.(2017)nature 542:237-241)，例如hf1/spcas9(kleinstiver et al.(2016)nature529:490-495；cebrian-serrano and davies(2017)mamm genome(2017)28(7):247-261)；拆分cas9系统(zetsche et al.(2015)nat biotechnol33(2):139-142)；基于内含肽-外显肽系统的反式剪接cas9(troung et al.(2015)nucl acid res 43(13):6450-8)；mini-sacas9(ma et al.(2018)acs synth biol7(4):978-985)。因此，在本文所述的方法和组合物中，应理解术语“cas”包括所有cas变体蛋白，天然的和经工程改造的。
[0183]
在某些实施方案中，cas蛋白可以是天然的cas蛋白的“功能衍生物”。天然序列多肽的“功能衍生物”是具有与原有序列多肽共有的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于原有序列的片段和原有序列多肽的衍生物及其片段，只要它们具有与对应原有序列多肽共有的生物学活性即可。本文预想的生物学活性是功能衍生物将dna底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体，共价修饰及其融合体。cas多肽或其片段的合适衍生物包括，但不限于cas蛋白或其片段的突变体、融合体、共价修饰。包括cas蛋白或其片段，以及cas蛋白或其片段的衍生物的cas蛋白可以从细胞获得或透过化学方法合成或透过这两种程序的组合而获得。该细胞可以是天然产生cas蛋白的细胞，或者是天然产生cas蛋白并经遗传工程改造以产生表达水平较高的内源性cas蛋白或由外源引入核酸产生cas蛋白的细胞，其编码与内源性cas相同或不同的cas。在某些情况下，细胞不会自然产生cas蛋白，而是经过遗传工程改造成产生cas蛋白。除了cas蛋白以外及/或取代cas蛋白，可用的rna引导核酸酶的其他非限制性实施方案包括第2类crispr蛋白，诸如cpf1。参见，例如zetsche et al.(2015)cell163:1-13。
[0184]
在一些实施方案中，dna结合结构域是ttago系统之一部分(参见，swarts et al.(2014)nature 507(7491):258-261；swarts et al.(2012)plos one 7(4):e35888与sheng et al.(2014)proc.natl.acad.sci.u.s.a.111(2):652-657)。在真核生物中，基因缄默化是由argonaute(ago)蛋白家族所媒介。在这个范例中，ago结合至小(19-31个核苷酸)rna。这个蛋白质-rna缄默化复合物经由小rna与标靶之间的华生-克立克碱基配对来识别标靶rna，并以核酸内切酶切割标靶rna(vogel(2014)science344:972-973)。相对来说，原核生物ago蛋白结合至小单链dna片段，并可能发挥检测和移除外来(通常是病毒)dna的作用(yuan et al.(2005)mol.cell19:405；olovnikov et al.(2013)mol.cell 51:594；swarts et al.，同上)。例示性原核生物ago蛋白包括来自aquifex aeolicus、球形红细菌(rhodobacter sphaeroides)和thermus thermophilus的ago蛋白。
[0185]
特征被鉴定最为充分的原核生物ago蛋白之一是来是t.thermophiles(ttago；swarts et al.，同上)者。ttago与具有5'磷酸根基团的15个核苷酸或13-25个核苷酸的单链dna片段缔合。这个“引导dna”受到ttago结合，以在第三方dna分子中引导蛋白质-dna复合物结合至华生-克立克互补dna序列。一旦这些引导dna中的序列信息允许鉴定标靶dna，
则ttago引导dna复合物就会切割标靶dna。当与标靶dna结合时，ttago-引导dna复合物的结构也支持这种机制(sheng et al.，同上)。来自球形红细菌的ago(rsago)具有相似的性质(olovnikov et al.，同上)。
[0186]
可以将任意dna序列的外源性引导dna装载到ttago蛋白上(swarts et al.，同上)。由于ttago切割的特异性是由引导dna指引的，与外源性的由研究人员指定的引导dna形成的ttago-dna复合物将引导靶向dna切割的ttago到研究人员指定的互补标靶dna。以此方式，可以在dna中产生靶向的双链断裂。使用ttago-引导dna系统(或来自其他生物的异种同源ago-引导dna系统)可以在细胞内靶向切割基因组dna。这种切割可以是单链或双链的。为了切割哺乳动物基因组dna，优选使用为了在哺乳动物细胞中表达而优化的ttago密码子形式。另外，可能更佳用活体外形成的ttago-dna复合物处理细胞，其中ttago蛋白与细胞穿透肽融合。另外，可能更佳使用经诱变而改变之一种ttago蛋白形式，以在37℃下具有改善的活性。使用在本技艺中关于利用dna断裂的标准技术，ttago-rna媒介的dna切割可被用于影响全部结果，包括基因剔除、靶向基因添加、基因修正、靶向基因缺失。
[0187]
因此，核酸酶包含dna结合结构域，其中特异地结合至希望将供体(转基因)插入其中的任何基因中的标靶位点。
[0188]
在某些实施方案中，dna结合结构域结合至白蛋白，例如命名为sbs-47171和sbs-47898的zfp的dna结合结构域。参见，例如美国专利公开案第2015/0159172号。b.切割结构域
[0189]
任何合适的切割结构域可与dna结合结构域缔合(例如，可操作地连接)以形成核酸酶。例如，zfp dna结合结构域已融合至核酸酶结构域而形成zfn，zfn是一种功能性实体，其能够透过其工程改造的(zfp)dna结合结构域识别其预期的核酸标靶，并导致dna在zfp结合位点附近经由核酸酶活化被切开。参见，例如kim et al.(1996)proc natl acad sci usa93(3):1156-1160。最近，zfn已用于多种不同生物的基因组修饰。参见，例如美国专利公开案第2003/0232410号；第2005/0208489号；第2005/0026157号；第2005/0064474号；第2006/0188987号；第2006/0063231号；和国际专利公开案第wo 07/014275号。同样，tale dna结合结构域已与核酸酶结构域融合而形成talen。参见，例如美国专利第8,586,526号。还描述过包含结合至dna并与切割结构域(例如cas结构域)缔合以诱导靶向切割的单一引导rna(sgrna)的crispr/cas核酸酶系统。参见，例如美国专利第8,697,359号和第8,932,814号，及美国专利公开案第2015/0056705号。
[0190]
如上所述，切割结构域可以与dna结合结构域为异源的，例如锌指dna结合结构域和来自核酸酶的切割结构域，或talen dna结合结构域和来自核酸酶的切割结构域；sgrna dna结合结构域和来自核酸酶的切割结构域(crispr/cas)；及/或来自不同核酸酶的巨核酸酶dna结合结构域和切割结构域。异源性切割结构域可获自任何核酸内切酶或核酸外切酶。可以从其衍生切割结构域的例示性核酸内切酶包括，但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如2002-2003目录，新英格兰生物实验室，beverly,ma；以及belfort et al.(1997)nucleic acids res.25:3379-3388。切割dna的其他酶是已知的(例如，s1核酸酶；绿豆核酸酶；胰脏dnase i；微球菌核酸酶；酵母ho核酸内切酶；还参见linn et al.(eds.)nucleases,cold spring harbor laboratory press,1993)。这些酶中的一或多者(或其功能片段)可以用作切割结构域和切割半结构域的来源。
[0191]
类似地，切割半结构域可衍生自如上文所述的任何核酸酶或其部分，就切割活性来说其需要二聚化。通常，如果融合蛋白包含切割半结构域，则需要两个融合蛋白进行切割。或者，可以使用包含两个切割半结构域的单一蛋白质。两个切割半结构域可以衍生自相同核酸内切酶(或其功能片段)，或者每个切割半结构域可衍生自不同核酸内切酶(或其功能片段)。另外，两个融合蛋白的标靶位点优选地相对于彼此配置，使得两个融合蛋白与它们各自标靶位点的结合令切割半结构域彼此在空间方向上以允许切割半结构域形成功能性切割结构域(例如通过二聚化)的方式形成。因此，在某些实施方案中，标靶位点的邻近边缘被5-8个核苷酸或15-18个核苷酸隔开。但是，任何整数个核苷酸或核苷酸对都可以插入两个标靶位点之间(例如2至50个核苷酸对或更多)。通常，切割位点位于标靶位点之间。
[0192]
限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，且能够特异性结合至dna(在识别位点处)，并能够在结合位点处或结合位点附近切割dna。某些限制酶(例如第iis型)在从识别位点移除的位点处切割dna，并具有可分离的结合结构域和切割结构域。例如，第iis型酶foki在一股上距其识别位点9个核苷酸处和另一股距其识别位点13个核苷酸处催化dna的双链切割。参见，例如美国专利第5,356,802号；第5,436,150号和第5,487,994号；以及li et al.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:4275-4279；li et al.(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:2764-2768；kim et al.(1994a)proc.natl.acad.sci.usa 91:883-887；kim et al.(1994b)j.biol.chem.269:31,978-31,982。因而，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种第iis型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)，及一或多个可被工程改造或可不被工程改造的锌指结合结构域。
[0193]
其切割结构域可与结合结构域分离的例示性第iis型限制酶为foki。这个特定的酶作为二聚体时具有活性。bitinaite et al.(1998)proc.natl.acad.sci.usa 95:10,570-10,575。因此，出于本揭示内容的目的，在所揭示的融合蛋白中使用的foki酶部分被认为是切割半结构域。是以，对于使用锌指-foki融合体的靶向双链切割及/或靶向置换细胞序列，可以使用各自包含foki切割半结构域的两个融合蛋白来重建催化活性切割结构域。或者，也可以使用含有锌指结合结构域和两个foki切割半结构域的单个多肽分子。使用锌指-foki融合物进行靶向切割和靶向序列改变的参数提供于本揭示内容的他处。
[0194]
切割结构域或切割半结构域可以是蛋白质的任何部分，其保有切割活性，或保留多聚化(例如，二聚化)的能力以形成功能性切割结构域。
[0195]
例示性第iis型限制酶描述于美国专利第7,888,121号中，其以整体并入本文。其他限制酶也含有可分离的结合结构域和切割结构域，并为本揭示内容所预见。参见，例如roberts et al.(2003)nucleic acids res.31:418-420。
[0196]
在某些实施方案中，切割结构域包含最小化或防止同二聚化的一或多个经工程改造切割半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，例如，在美国专利第8,772,453号；第8,623,618号；第8,409,861号；第8,034,598号；第7,914,796号；与第7,888,121号中所述，其整体内容全部以引用的方式并入本文。在foki的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538处的氨基酸残基都是影响foki切割半结构域二聚化的目标。
[0197]
形成必要异二聚体的foki的例示性工程改造切割半结构域包括一对，其中第一切割半结构域包括在foki的位置490和538处的氨基酸残基突变，而第二切割半结构域包括在
位置486和499处的氨基酸残基突变。
[0198]
因此，在一个实施方案中，在490处用lys(k)取代glu(e)的突变；在538处用lys(k)取代iso(i)的突变；在486处用glu(e)取代gln(q)的突变；及在位置499处用lys(k)取代iso(i)的突变。具体而言，本文所述的经工程改造的切割半结构域是经由在一个切割半结构域的位置490(e
→
k)与538(i
→
k)突变，以产生称为“e490k:i538k”的工程改造切割半结构域；以及经由在另一个切割半结构域的位置486(q
→
e)与499(i
→
l)突变，以产生称为“q486e:i499l”的工程改造切割半结构域。本文所述的工程改造切割半结构域是必要异二聚体突变体，其中异常切割被最小化或被消除。美国专利第7,914,796号和第8,034,598号，其揭示内容以整体引用的方式并入本文。在某些实施方案中，经工程改造切割半结构域包含在位置486、499和496处的突变(相对于野生型foki编号)，例如在位置486处用glu(e)残基取代野生型gln(q)残基的突变、在位置499处用leu(l)残基取代的野生型iso(i)残基的突变，以及在位置496处用asp(d)或glu(e)残基取代野生型asn(n)的突变(也分别称为“eld”和“ele”结构域)。在其他实施方案中，经工程改造切割半结构域包含在位置490、538和537处的突变(相对于野生型foki编号)，例如在位置490处用lys(k)残基取代野生型glu(e)残基、在位置538处用lys(k)残基取代野生型iso(i)残基，以及在位置537处用lys(k)残基或arg(r)残基取代野生型his(h)残基(分别也称为“kkk”和“kkr”结构域)。在其他实施方案中，经工程改造切割半结构域包含在位置490和537处的突变(相对于野生型foki编号)，例如在位置490处用lys(k)残基取代野生型glu(e)，以及在位置537处用lys(k)残基或arg(r)残基取代野生型his(h)残基(也分别称为“kik”和“kir”结构域)。参见例如美国专利第8,772,453号。在其它实施方案中，经工程改造切割半结构域包括所述“sharkey”及/或“sharkey突变”(参见，guo et al.(2010)j.mol.biol.400(1):96-107)。
[0199]
本文所述的经工程改造切割半结构域可以使用任何合适的方法来制备，例如通过野生型切割半结构域的定点诱变(foki)，如美国专利第7,888,121号；第7,914,796号；第8,034,598号；和第8,623,618号中所述。
[0200]
或者，核酸酶可以使用所谓的“分裂酶”技术在活体内被组装于核酸标靶位点处(参见，例如，美国专利公开案第2009/0068164号)。此类分裂酶的组分可以在单独的表达构建体上表达，或者可以连接在一个开放阅读框中，在该阅读框中，各个成分是分开的，例如通过自切割2a肽或ires序列。组分可以是单独的锌指结合结构域或巨核酸酶核酸结合结构域的结构域。
[0201]
核酸酶可在使用前进行活性筛选，例如在美国专利第8,563,314号中所述的基于酵母的染色体系统中。核酸酶的表达可以受到组成型启动子或诱导型启动子控制，例如在棉子糖及/或半乳糖存在下被活化(去抑制)并在葡萄糖存在下被抑制的半乳糖激酶启动子。
[0202]
cas9相关的crispr/cas系统包含两个rna非编码组分：一个tracrrna和一个前-crrna数组，该数组含有被相同的直接重复序列(dr)分隔开的核酸酶引导序列(间隔子)。要使用crispr/cas系统来完成基因组工程改造，这些rna的两种功能必须存在(参见，cong et al.(2013)sciencexpress1/10.1126/science 1231143)。在一些实施方案中，tracrrna和前-crrna是经由个别的表达构建体或以个别的rna提供。在其他实施方案中，构建嵌合rna，其中将经工程改造的成熟crrna (赋予标靶特异性)融合至tracrrna(提供与cas9的交互作
用)，以产生嵌合crrna-tracrrna杂交体(也称为单一引导rna)。(参见，jjinek et al.(2012)science 337:816-821、jinek et al.(2013)elife 2:e00471和cong，同上)。
[0203]
本文所述的核酸酶可以在标靶位点中做出一或多个双链及/或单链切割。在某些实施方案中，核酸酶包含催化不活化的切割结构域(例如，foki及/或cas蛋白)。参见，例如美国专利第9,200,266号；第8,703,489号和guillinger et al.(2014)nature biotech.32(6):577-582。在催化上不活化的切割结构域可以与催化活化结构域组合，用作切口酶以形成单链切割。因此，可以组合使用两种切口酶以在特定区域中做出双链切口。其他切口酶在本技艺中也是已知的，例如mccaffery et al.(2016)nucleic acids res.44(2):e11.doi:10.1093/nar/gkv878.epub 2015oct 19。
[0204]
因此，可以使用包含dna结合结构域和切割结构域的任何核酸酶。在某些实施方案中，核酸酶包含由第一和第二zfn(也称为左zfn和右zfn)组成的zfn，例如包含第一zfn以及第二zfn的zfn，该第一zfn包含命名为sbs-63014的zfp和切割结构域，该第二zfn包含命名为sbs-65722的zfp和切割结构域。在某些实施方案中，zfn的左和右(第一和第二)zfn被携带在同一个载体上，而在其他实施方案中，zfn的成对组分被携带在不同载体上，例如两个mrna载体，如实施方案1中所示，一个命名为sb-mrenh1 mrna(编码包含zfp的zfn的mrna，该zfp命名为63014)，另一个命名为sb-mrenh2 mrna(编码包含zfp的zfn的mrna，该zfp命名为65722)。标靶位点
[0205]
如上所详述，可以对dna结构域进行工程改造，使其结合至基因座中的任何选定序列，例如白蛋白或其他安全停泊基因。与天然dna结合结构域相比，经工程改造的dna结合结构域可以具有新的结合特异性。工程改造方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理的设计包括，例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单独(例如锌指)氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的dna结合结构域的一或多个氨基酸序列缔合。参见，例如共同拥有的美国专利第6,453,242号和第6,534,261号，其以整体引用的方式并入本文。也可以执行tal-效应子结构域的合理设计。参见例如美国专利公开案第2011/0301073号。
[0206]
适用于dna结合结构域的例示性选择方法包括噬菌体展示和双杂交系统，揭示于美国专利第5,789,538号；第5,925,523号；第6,007,988号；第6,013,453号；第6,410,248号；第6,140,466号；第6,200,759号；与第6,242,568号；以及国际专利公开案第wo 98/37186号；第wo 98/53057号；第wo00/27878号；和第wo 01/88197号和gb 2,338,237。
[0207]
选择标靶位点；核酸酶与用于设计和构建融合蛋白(以及编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的，并且详述于以下中：美国专利公开案第2005/0064474号和第2006/0188987号，其以全文引用的方式并入本文。
[0208]
另外，如在这些和其他参考文献中所揭示，dna结合结构域(例如多指锌指蛋白)可以使用任何合适连接符序列(包括例如，长度为5个或更多个氨基酸的连接符)连接在一起。关于长度为6个或更多个氨基酸的例示性连接符序列，参见例如美国专利第6,479,626号；第6,903,185号；和第7,153,949号。本文所述的蛋白质可以包括蛋白质的个别dna结合结构域之间的合适连接符的任何组合。亦参见美国专利第8,586,526号。
[0209]
在某些实施方案中，用于dna结合结构域的标靶位点在bcl11a基因内。参见，例如
美国专利第10,563,184号；第9,963,715号；第9,650,648号；美国专利公开案第2015/0132269号；第2018/0111975号；和第2019/0177709号。本发明的组合物/系统
[0210]
本文描述经修饰的自体hsc/pc，其被递送到个体以实施依据某些实施方案的方法。编码右与左zfn配偶体的两个mrna被递送到收取的hsc/pc，其靶向bcl11a类红细胞增强子序列。在某些实施方案中，mrna包括sb-mrenh1和sb-mrenh2。在本文所述任一种方法中，通过在分离之前用一或多剂g-csf及/或一或多剂普乐沙福处理个体而在个体体内进行动员后，收取(例如，血细胞分离术)cd34 hsc/pc和受动员的细胞。在某些实施方案中，在整个或每回血细胞分离术中收取至少约25
×
106个cd34 hspc/kg，并且可以培养任何时间长度。培养所得到的经遗传修饰细胞及其后代将包括特定bcl11a遗传修饰(例如，少于1％的细胞具有脱靶(非bcl11a)修饰)，但不一定是mrna。
[0211]
包含bcl11剔除的细胞被输注到个体。可在特定bcl11a经遗传修饰的细胞中进行额外修饰，例如hla基因不活化。细胞
[0212]
本文还提供了经遗传修饰的细胞，例如hsc/pc，其包含bcl11a类红细胞增强子的靶向剔除。通过用编码左与右zfn配偶体的mrna处理收取的hsc/pc来产生基因剔除，其中在转译后将产生活性zfn。zfn切割bcl11a类红细胞增强子，使得dna中出现双链断裂。细胞机制使用易错非同源末端连接(nhej)来修复双链断裂，这会导致切割位点周围核苷酸的插入与缺失(插入缺失)。
[0213]
自体(例如个体衍生的)和同种异体(健康供体衍生的)hsc/pc都可以用于实施该方法。
[0214]
如本文所述的细胞可用于细胞疗法中，以治疗及/或预防患有β-地中海贫血症的个体的病症。在经修饰干细胞的情况下，于输注入个体后，这些前驱细胞在活体内分化成表达功能蛋白的细胞(来自插入的供体)。
[0215]
还提供了包含如本文所述的细胞的药物组合物。另外，可以在投予给个体之前将细胞冷冻保存。
[0216]
本文所述的细胞群体(和组合物)包含在bcl11a基因座处经特异性遗传修饰的细胞，包括经遗传修饰的细胞群体，其中小于10％(其间的任何值的0至10％)，优选小于5％(0至5％或其间的任何值)，甚至更佳小于1％的细胞(0至1％或其间的任何值)，以及更佳小于0.5％(0至1％或其间的任何值)的细胞包括在bcl11a基因座以外的遗传修饰(但可能包括其他修饰，例如hla标记的不活化)。递送
[0217]
核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸，供体多核苷酸以及包含本文所述蛋白质及/或多核苷酸的组合物的离体(ex vivo)递送可以通过任何合适的方式被递送至收取的hsc/pc。
[0218]
如本文中所述递送核酸酶的方法描述于例如美国专利第6,453,242号；第6,503,717号；第6,534,261号；第6,599,692号；第6,607,882号；第6,689,558号；第6,824,978号；第6,933,113号；第6,979,539号；第7,013,219号；和第7,163,824号，其全部揭示内容以整体引用的方式并入本文。
[0219]
如本文所述的核酸酶及/或供体构建体也可以使用含有编码锌指，tal效应子结构域及/或cas蛋白中的一或多者的序列的载体来递送。可以使用任何载体系统，包括但不限于质体载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。也参见美国专利第6,534,261号；第6,607,882号；第6,824,978号；第6,933,113号；第6,979,539号；第7,013,219号；与第7,163,824号，其以整体引用的方式并入本文。
[0220]
惯用的基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于将编码核酸酶与供体构建体的核酸引入细胞(例如，哺乳动物细胞)和标靶组织。非病毒载体递送系统包括dna质体、裸核酸，以及与递送载体(诸如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸。病毒载体递送系统包括dna和rna病毒，它们在递送至细胞后具有游离型基因组或并入基因组。关于基因治疗程序的综述，参见anderson(1992)science 256:808-813；nabel&felgner(1993)tibtech11:211-217；mitani&caskey(1993)tibtech 11:162-166；dillon(1993)tibtech 11:167-175；miller(1992)nature 357:455-460；van brunt(1988)biotechnology 6(10):1149-1154；vigne(1995)restorative neurology and neuroscience 8:35-36；kremer&perricaudet(1995)british medical bulletin51(1):31-44；haddada et al.,in current topics in microbiology and immunology doerfler and(eds.)(1995)；以及yu et al.(1994)gene therapy 1:13-26。
[0221]
非病毒递送核酸的方法包括电穿孔、脂质转染、显微注射、生物枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸接合物、裸dna、人工病毒体，与增强dna吸收的试剂。也可以使用音波穿孔用于递送核酸，其使用例如sonitron 2000系统(rich-mar)。其他例示性核酸递送系统包括由下列提供者：amaxa biosystems(cologne,germany)、maxcyte,inc.(rockville,maryland)、btx molecular delivery systems(holliston,ma)与copernicus therapeutics inc,(参见，例如美国专利第6,008,336号)。脂质转染描述于，例如美国专利第5,049,386号；第4,946,787号；与第4,897,355号)以及商业上贩卖的脂质转染试剂(例如transfectam
tm
与lipofectin
tm
)。适于多核苷酸的有效率受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括felgner的那些，国际专利公开案第wo 91/17424号、第wo 91/16024号。
[0223]
脂质：核酸复合物的制备，包括靶向脂质体(诸如免疫脂质复合物)是本领域技术人员周知的(参见，例如crystal(1995)science 270:404-410；blaese et al.(1995)cancer gene ther.2:291-297；behr et al.(1994)bioconjugate chem.5:382-389；remy et al.(1994)bioconjugate chem.5:647-654；gao et al.(1995)gene therapy 2:710-722；ahmad et al.(1992)cancer res.52:4817-4820；美国专利第4,186,183号；第4,217,344号；第4,235,871号；第4,261,975号；第4,485,054号；第4,501,728号；第4,774,085号；第4,837,028号；与第4,946,787号)。
[0224]
递送的其他方法包括使用将待递送的核酸打包到engeneic递送载体(edv)中。使用双特异性抗体将这些edv特异性地递送至标靶组织，其中抗体之一个臂对标靶组织具有特异性，而另一个臂对edv具有特异性。抗体将edv带到标靶细胞表面，然后通过内吞作用将edv带入细胞。一旦在细胞中，内容物便被释放(参见，macdiarmid et al.(2009)nature biotechnology27(7):643)。
[0225]
使用以rna或dna病毒为主的系统以供递送编码经工程改造zfp的核酸系利用高度进化过程，以便在体内将病毒靶向特定细胞并将病毒有效负载(payload)运输至细胞核。病
毒载体可用于在活体外处理细胞，并将经修饰的细胞投予给个体(离体)。用于递送zfp的基于病毒的习知系统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒，牛痘病毒和单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒，慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可以并入宿主基因组中，通常会导致被插入的转基因长期表达。另外，已经在许多不同的细胞类型和标靶组织中测到了高转导效率。
[0226]
重组腺相关病毒载体(raav)是一种基于有缺陷但非致病性小病毒腺相关病毒第2型的有前途替代性基因递送系统。所有载体均衍生自仅保有侧接转基因表达匣的aav 145bp反向末端重复序列的质体。由于并入到经转导细胞的基因组中，有效率的基因转移和稳定的转基因递送是这个载体系统的关键特征。(wagner et al.(1998)lancet 351(9117):1702-3；kearns et al.(1996)gene ther.9:748-55)。也可以根据本发明来使用其他aav血清型，包括作为非限制性实施方案，aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav8、aav 8.2，aav9和aav rh10与假型aav(诸如aav2/8，aav2/5和aav2/6)。在一些实施方案中，使用能够穿过血脑障壁的aav血清型。
[0227]
复制缺陷型重组腺病毒载体(ad)可在高力价(titer)下生产并容易感染许多不同的细胞类型。大多数腺病毒载体经过工程改造，以使得转基因取代ad e1a，e1b及/或e3基因；随后复制缺陷型载体在人类293细胞中增殖，从而提供反式缺失的基因功能。ad载体可以在活体内转导多种类型的组织，包括非分裂的已分化细胞，诸如在肝脏，肾脏和肌肉中发现的细胞。惯用ad载体的承载能力大。在临床试验中使用ad载体的实施方案包括多核苷酸疗法，用于肌肉内注射进行抗肿瘤免疫(sterman et al.(1998)hum.gene ther.7:1083-9)。在临床试验中使用腺病毒载体进行基因转移的其他实施方案包括rosenecker et al.(1996)infection 24(1):5-10；sterman et al.(1998)hum.gene ther.9(7):1083-1089；welsh et al.(1995)hum.gene ther.2:205-18；alvarez et al.(1997)hum.gene ther.5:597-613；topf et al.(1998)gene ther.5:507-513；sterman et al.(1998)hum.gene ther.7:1083-1089。
[0228]
打包细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这样的细胞包括打包腺病毒的293细胞，和打包逆转录病毒的ψ2细胞或pa317细胞。基因治疗中使用的病毒载体通常由生产者细胞株产生，该生产者细胞株系将核酸载体打包到病毒颗粒中。载体通常含有打包和随后并入宿主(如果适用的话)所需的最小病毒序列，其他病毒序列被编码要表达的蛋白质的表达匣所取代。缺失的病毒功能由打包细胞株以反式提供。例如，用于基因治疗的aav载体通常仅具有来自aav基因组的反向末端重复(itr)序列，其是打包和并入到宿主基因组中所需要的。病毒dna打包在细胞株中，该细胞株含有编码其他aav基因(即rep和cap)但缺少itr序列的辅助质体。该细胞株还被作为辅助的腺病毒感染。辅助病毒可促进aav载体复制并由辅助质体表达aav基因。由于缺少itr序列，因此没有大量辅助质体被打包。可以透过例如腺病毒比aav对热处理更敏感来减少腺病毒的污染。
[0229]
包含本文所述的经遗传修饰细胞的组合物可以以任何合适的方式被递送至个体，包括通过输注。在投予包括经遗传修饰细胞的组合物之前，个体可以用(施用)一或多种骨髓净除式调理剂处理一或多次，例如，投予白消安：以0.5至5mg/kg静脉内(iv)持续一或多次；以约3.2mg/kg/天iv；于第0天输注包含经遗传修饰细胞的组合物前，在第-6天至第-3天输注前，经由中央静脉导管iv总剂量为约12.8mg/kg持续4天；或者每天一次或每6小时iv。
[0230]
可以使用任何剂量的经遗传修饰细胞，例如，在约3x106个细胞/kg和约20x106个细胞/kg之间(例如，以约1
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107个细胞/ml的浓度用每袋约1.0-2.0
×
108个细胞来调配细胞)。
[0231]
药物上可接受的载体部分取决于所投予的特定组合物以及用于投予该组合物的特定方法。因此，如下述有多种药物组合物的合适调配物(参见，例如remington’s pharmaceutical sciences,17th ed.,1989)。
[0232]
用于离体和活体内投予的调配物包括呈液体或乳化液体的悬浮液。通常将活性成分与药物上可接受的并且与活性成分兼容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水、食盐水、右旋糖、甘油，乙醇或类似物，及其组合。另外，该组合物可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂，稳定剂或增强药物组合物有效性的其他试剂。应用
[0233]
本发明的方法预想治疗及/或预防β-地中海贫血症。治疗可以包含在细胞中剔除bcl11a增强子序列，以阻断bcl11a蛋白的表达。已知bcl11a蛋白会抑制胎儿球蛋白的表达，因此剔除bcl11a会导致缺乏hbf基因的抑制。本发明的方法和组合物也可用于需要在造血干细胞中剔除bcl11a类红细胞增强子的任何情况下，以使衍生自这些细胞的成熟细胞(例如rbc)含有治疗性剔除。这些干细胞可以在活体外或活体内分化，并且可以衍生自可用于所有个体的通用供体类型的细胞。另外，细胞可以包含跨膜蛋白以在体内运输细胞。治疗还可以包括使用含有治疗性转基因的个体细胞，其中该等细胞离体发育然后被引回至个体。例如，可以经由自体骨髓移植将含有bcl11a类红细胞增强子剔除的hsc/pc插入个体。
[0234]
因此，这个技术可以用于个体在其b球蛋白基因有突变或其表达有缺陷的情况下。编码血红素链的序列中的遗传缺陷可能导致一群称为血红素病变的疾病，其包括镰状细胞贫血症和β地中海贫血症。在轻度地中海贫血症中，β球蛋白对偶基因中只有一者带有突变。个体将患有小红细胞性贫血症，且检测通常涉及低于正常平均的红细胞体积(《80fl)。带有轻度地中海贫血症的个体的对偶基因是β /β或β0/β(其中“β ”是指允许形成一定数量的β链的对偶基因，“β”是指野生型β球蛋白对偶基因，而“β0”是指与β-球蛋白表达完全不存在相关的β球蛋白突变)。中度地中海贫血症个体通常可以过正常生活，但有时需要输血，尤其是在生病或怀孕时，取决于其贫血症的严重程度。这些患者的对偶基因可能是β /β 或β0/β 。当两个对偶基因都有地中海贫血症突变(β0/β0)时，发生重度地中海贫血症。这是严重小红细胞性贫血症和低色素性贫血症。未经治疗会导致贫血症，脾肿大和严重骨骼畸形，并在20岁之前进展至死亡。治疗由定期输血；用于脾肿大的脾切除术，和输血引起的铁过负荷的螯合组成。如果可以找到合适的供体，那么骨髓移植也可以用于治疗重度地中海贫血症的人，但是这种程序可能会有很大的风险。在大多数患有血红素病变的患者中，仍然存在编码γ球蛋白的基因，但由于分娩前后发生正常的基因抑制，因此表达相对较低。
[0235]
在一些应用中，本文提供一种在β-地中海贫血症(例如，重度β-地中海贫血症(tdt)或轻度β-地中海贫血症)的人类个体体内，与未用本发明的方法和组合物治疗的个体相比，改善或维持(减缓下降)与地中海贫血症相关疾病生物标记的方法。在其他应用中，本文提供了一种在β地中海贫血症的个体体内，与用本发明的方法和组合物治疗之前的个体相比，降低对prbc或其他血液制品输注的需求(剂量水平或频率)的方法。在另一方面中，本文提供一种在β-地中海贫血症患者体内，减少因为长期血液制品输注而发生铁过负荷的方法。
[0236]
因此，本文提供通过向有需要的个体投予(例如通过输注)其中bcl11a在细胞中不活化的经遗传修饰细胞，而在该个体体内治疗β-地中海贫血症(例如，tdt)的方法，使得个体的hbf产生增加且β-地中海贫血症的一或多种临床症状减少。经处理的tdt个体可以展现出下列一或多者：(1)相对临床实验室血红素分量(成人血红素hba，与胎儿血红素hbf)的基线的变化，单位为公克/dl血浆及/或总hb的hbf百分比；(2)地中海贫血症相关的疾病生物标记(诸如铁代谢的生物标记)；及/或红细胞生成素，红细胞结合素及/或铁调素的水平的变化(例如，达到或接近正常水平)；(3)在个体体内减轻或消除与基线输血疗法有关的铁过负荷相关症状，视情况其中通过测量个体的甲状腺素、igf-1、早晨皮质醇、促肾上腺皮质激素(acth)、hba1c、维生素d、hba、hbf、红细胞生成素、红细胞结合素、铁调素、甲状腺素、igf-1、皮质醇，acth及/或维生素d的水平及/或活性来分析内分泌功能障碍的减少；(4)减少或消除对血液制品输注的需求，血液制品输注包括prbc输血、血小板输注、ivig，血浆输血及/或颗粒球输血；(5)减少或消除肝脏疾病；(6)减少或消除心脏异常；(7)减少及/或消除骨质疏松症及/或骨折及/或骨矿物质密度相对于基线的变化；(8)减少或消除非典型形态(例如，过度增生)及/或未成熟类红细胞细胞的数量；及/或(9)在f细胞的数量和百分比方面相对于基线(治疗前水平)的变化。
[0237]
卡诺夫斯基日常活动功能量表(karnofsky performance scale)是一种广为接受用于评估患者功能障碍的简单工具。使用卡诺夫斯基日常活动功能量表定义评分标准对指定访视的每名个体进行评估和评分。筛选访视时，卡诺夫斯基日常活动功能量表≤60没有资格参加此项研究。评估相对于基线的变化。
[0238]
经遗传修饰的细胞可以是干细胞(例如，cd34 hsc/pc，st-400)，并且可以是自体的或同种异体的(例如，从健康供体分离)，并且同种异体细胞可以被进一步修饰(例如，除了bcl11a不活化以外)，例如，从同种异体细胞移除一或多个自身抗原(例如，hla复合物)。参见，例如，美国专利第8,945,868号；第10,072,062号；美国专利公开案第2018/0362926号。在离体修饰之前，通过用一或多剂g-csf及/或一或多剂普乐沙福处理个体，可以在个体体内动员自体细胞，并通过一或多回血细胞分离术来收集受动员的细胞。视情况地，在个体体内动员至少约25
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106cd34 hspc/kg。该等细胞可以经遗传修饰以使用一或多种核酸酶来不活化bcl11a，例如其中核酸酶以如本文揭示的mrna引入细胞(seq id no：15和seq id no：16)。在离体遗传修饰之后，可以评估细胞在bcl11a中的插入及/或缺失。
[0239]
待治疗的个体还可以在投予经遗传修饰细胞之前(例如治疗前10至1天)经一或多个骨髓净除剂预处理，例如以介于0.5至5mg/kg(或其间的任何值)静脉内(iv)投予白消安持续一或多次；以约3.2mg/kg/天iv投予白消安；于第0天输注经修饰hspc前，在第-6天至第-3天输注前，经由中央静脉导管iv总剂量为约12.8mg/kg持续4天；或者每天一次(例如4剂)或每6小时(总共16剂)iv投予白消安。可以使用任何剂量的经修饰细胞，包括但不限于约3x106个细胞/kg和约20x106个细胞/kg之间，视情况其中将细胞调配于含有10％dmso的难溶性冷冻介质中。可以在任何合适的容器或包装中(例如在输液袋中)调配细胞(例如，以约1
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107个细胞/ml的浓度包含每袋约1.0-2.0
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108个细胞)。
[0240]
如本文所用，应用于一个或多个感兴趣值的术语“大约”或“约”是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中可以明显看出，否则该术语指的是在任一方向上(大于或小于)落入所述参考值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、
2％、1％或更少范围内的值。
[0241]
以下实施方案是关于本揭示内容的例示性实施方案，其中核酸酶包含锌指核酸酶(zfn)或talen。将理解的是，这仅出于例示为目的，并且可以使用其他核酸酶或核酸酶系统，例如具有经工程改造dna结合结构域的归巢核酸内切酶(巨核酸酶)及/或天然经工程改造归巢核酸内切酶(巨核酸酶)dna结合结构域和异源性切割结构域及/或包含工程改造的单一引导rnacrispr/cas系统的融合体。
实施例
实施例1：zfn设计
[0242]
zfn对是由6指zfn(由mrna sb-mrenh1编码)和5指zfn(由mrna sb-mrenh2编码)组成，其结合至人类bcl11a基因的类红细胞特异性增强子的33个碱基对(合并的)标靶位点，该标靶位点是在人类基因组grch38/hg38装配体中的位置chr2:60,495,250-60,495,290处。如下制备zfn和编码它们的多核苷酸：在活体外通过技艺中已知的方法制造sb-mrenh1与sb-mrenh2 mrna。mrna包含编码zfn配偶体的序列，并且还包含诸如核定位序列和肽的部分。表1显示与每个配偶体zfn缔合的螺旋(参见美国专利第10,563184号；美国专利公开案第2018/0087072号)：表1：zfn设计zfn设计
[0243]
sb-mrenh1 mrna的完整核苷酸序列(1725个核苷酸)显示于下：5’gggagacaagcuuugaauuacaagcuugcuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggcagaucgaauucgccauggacuacaaagaccaugacggugauuauaaagaucaugacaucgauuacaaggaugacgaugacaagauggcccccaagaagaagaggaaggucggcauccacgggguacccgccgcuauggcugagaggcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagugaccaguccaaccugcgcgcccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccgcaacuucucccugaccaugcauaccaagau
acacacgggcagccaaaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucaguuccaccggcaaccugaccaaccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugccaccuccggcucccugacccgccauaccaagauacacacgcacccgcgcgccccgaucccgaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagugaccaguccaaccugcgcgcccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugccgcccaguguugucuguuccaccauaccaagauacaccugcggggauccaucagcagagccagaccacugaacccgcacccggagcuggaggagaagaaguccgagcugcggcacaagcugaaguacgugccccacgaguacaucgagcugaucgagaucgccaggaacagcacccaggaccgcauccuggagaugaaggugauggaguucuucaugaagguguacggcuacaggggaaagcaccugggcggaagcagaaagccugacggcgccaucuauacagugggcagccccaucgauuacggcgugaucguggacacaaaggccuacagcggcggcuacaaucugccuaucggccaggccgacgagauggagagauacguggaggagaaccagacccgggauaagcaccucaaccccaacgagugguggaagguguacccuagcagcgugaccgaguucaaguuccuguucgugagcggccacuucaagggcaacuacaaggcccagcugaccaggcugaaccacaucaccaacugcaauggcgccgugcugagcguggaggagcugcugaucggcggcgagaugaucaaagccggcacccugacacuggaggaggugcggcgcaaguucaacaacggcgagaucaacuucagaucuugauaacucgagucuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgcuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgggacauucuuaauuaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacuag(seq id no:15)
[0244]
此外，sb-mrenh2 mrna的完整核苷酸序列(1680个核苷酸)显示于下：5’gggagacaagcuugaauacaagcuugcuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggcagaucgaauucgccuagagaucuggcggcggagagggcagaggaagucuucuaaccugcggugacguggaggagaaucccggcccuaggaccauggacuacaaagaccaugacggugauuauaaagaucaugacaucgauuacaaggaugacgaugacaagauggcccccaagaagaagaggaaggucggcauucaugggguacccgccgcuauggcugagaggcccuuccagugucgaaucugcaugcagaaguuugcccgcaacgaccaccgcaccacccauaccaagauacacacgggcgagaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagucagaaggcccaccugauccgccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccagaagggcacccugggcgagcauaccaagauacacacgggaucucagaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagucgcggccgcgaccugucccgccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccgccgcgacaaccugcacucccauaccaagauacaccugcggggaucccagcuggugaagagcgagcuggaggagaagaaguccgagcugcggcacaagcugaaguacgugccccacgaguacaucgagcugaucgagaucgccaggaacagcacccaggaccgcauccuggagaugaaggugauggaguucuucaugaagguguacggcuacaggggaaagcaccugggcggaagcagaaagccugacggcgccaucuauacagugggcagccccaucgauuacggcgugaucguggacacaaaggccuacagcggcggcuacaaucugccuaucggccaggccgacgagaugcagagauacgugaaggagaaccagacccggaauaagcacaucaaccccaacgagugguggaagguguacccuagcagcgugaccgaguucaaguuccuguucgugagcggccacuucagcggcaacuacaaggcccagcugaccaggcugaaccgcaaaaccaacugcaauggcgccgugcugagcguggaggagcugcugaucggcggcgagaugaucaaagccggcacccugacacuggaggaggugcggcgcaaguucaacaacggcgagaucaacuucugauaacucgagucuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaau
aaaaaacauuuauuuucauugcugcgcuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgggacauucuuaauuaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacuag(seq id no:16)。实施例2：细胞修饰方法开发
[0245]
活体外研究：通过血细胞分离术从健康个体中收集被动员的人类cd34 hspc，并予以纯化。用zfn mrna sb-mrenh1和sbmrenh2转染经纯化的hspc。来自相同个体的未转染cd34 hspc用作对照。转染后48小时，收取经转染cd34 hspc(“st-400”)并冷冻以用于活体外研究。
[0246]
为了分析zfn媒介基因编辑bcl11a基因的人类类红细胞特异性增强子的效果，将来自上文的经修饰细胞置于称为“crbc汇集分化(crbc pooled differentiation)”(giarratana et al.(2011)blood 118(19):5071)的活体外红细胞生成模型中，其必须在具有前类红细胞细胞介素的3步骤液体培养物中历时培养21天。bcl11a增强子基因修饰是在st-400中通过miseq深度定序，于转染后2天、在活体外分化开始的时与活体外分化第14天、大部分类红细胞细胞去核之前所收取的dna样品中进行测定。在临床材料产生期间所预期的范围内，经转染细胞中bcl11a增强子基因座的修饰包括约75％插入缺失。在未转染的对照hspc中，基因修饰水平≤0.2％。
[0247]
在类红细胞分化过程中监控细胞生长(扩增)。在第21天确认去核，其为类红细胞成熟的一种量度。经转染hspc的扩增范围是约2500-至9000倍，比未经转染hspc低约2倍，反映出转染程序对早期细胞生长的影响。在经转染和未经转染的细胞之间，去核细胞的百分比没有差异(在两种情况下均约为59-62％)。
[0248]
在第21天(类红细胞分化终点)所分离的蛋白质样品的逆相uplc用于测量经转染hspc的类红细胞后代中的α-，β-和γ-球蛋白水平。
[0249]
如图2中所示，与未经转染hspc相比，γ球蛋白与β-球蛋白和γ-球蛋白与α-球蛋白的比率在st400类红细胞后代中增加大约3至4倍。这个调查结果证明一个结果，靶向基因修饰会导致γ-球蛋白蛋白升高，其在tdt患者类红细胞细胞中增加hbf水平。在γ-球蛋白水平方面所观察到的增加类似于那些靶向bcl11a的其他方法所公开者(wilber et al.(2011)blood117(10):2817-26)和那些在带有bcl11a单倍体不足的患者中所检测到的(basak et al.(2015)j clin invest 125(6):2363-8；funnell et al.(2015)blood126(1):89-93)。
[0250]
为了评估经修饰hspc的功能潜力(评估为增殖和分化成造血谱系)，在cfu分析中使用由固定数目的输入细胞所形成的群落数目和形态。衍生自相同个体的未经转染cd34 hspc用作阴性对照。使用标准程序进行cfu分析。简言之，将每个具有100或300个细胞的培养物以三重复铺在6孔盘中，并培育持续14天，在这个时间点对培养物的群落计数和群落类型进行评分。解冻后的生存力是相同的(在经转染hspc中约72％至83％；在未经转染hspc中约96％)。经转染hspc的铺盘效力百分比范围为15.7％至45.7％，相比的下，未经转染hspc为37.3％至75.0％。st-400的铺盘效率在使用经基因修饰细胞的其他研究所报导的范围内(dever et al.(2016)nature539(7629):384-389；wu et al.(2001)gene ther 8(5):384-90)，并且由于电穿孔和基因修饰的影响，与未经转染hspc相比效率较低。
[0251]
如表2中所示，经修饰hspc分化成所有造血谱系，包括类红细胞前驱细胞(cfu-e和bfu-e)、颗粒球/巨噬细胞前驱细胞(cfu-g/m/gm)和多能前驱细胞(cfu-gemm)。衍生自经修饰hspc的cfu-e百分比类似于那些未经转染hspc，而cfu-g/m/gm和cfu-gemm的百分比仅有最小程度差异。因此，用zfn mrna sb-mrenh1和sb-mrenh2转染和遗传修饰对经修饰hspc分化潜能的影响很小或没有影响。表2：cd34 hspc的造血分化
[0252]
经st-400-转染的纤维母细胞在软琼脂中的群落形成：为了评估转形/致瘤潜力，在软琼脂转形分析中评估用zfn mrna sb-mrenh1-和sb-mrenh2转染的人类wi-38纤维母细胞的锚定非依赖型生长。在经遗传修饰的wi-38细胞中，测得的基因修饰水平为插入缺失，而相较于在未经转染wi-38细胞中则为在任何时间点均未观察到经转染和未经转染的wi-38细胞的锚定非依赖型生长。结果显示，用zfn mrna sb-mrenh1和sb-mrenh2转染，并在wi-38细胞中的bcl11a基因的类红细胞特异性增强子处所产生的zfn媒介破坏，并不会促进致瘤性。
[0253]
经修饰cd34 hspc的核型分析(karyotyping)：用经修饰hspc进行核型分析。zfn被设计成在指定的标靶基因座处诱导基因组中的dsb。鉴于其作用机制，zfn的脱靶活性可能会导致计划外的遗传变化。目视检查单个细胞中摊开的染色体(核型分析)可以提供遗传整体性的全局视图，并检测遗传异常，包括更有针对性的其他检测可能漏掉的大规模结构或数值染色体变化。
[0254]
为了评估总体染色体形态，对衍生自3名健康个体的经修饰hspc进行了核型分析。来自相同个体的未经转染cd34 hspc用作对照。miseq深度定序显示，在经转染hspc中，bcl11a基因的类红细胞特异性增强子处的基因修饰为77％至79％插入缺失，而未经转染hspc中相比为《0.1％插入缺失。核型分析显示，所有细胞都是人类来源的，没有一个细胞具有明显的染色体异常。经修饰hspc的细胞遗传学分析显示，没有与处理相关的总体结构或数值染色体异常。
[0255]
经修饰hspc中的双链断裂：在p53结合蛋白1(53bp1)分析中测试经修饰hspc，以通过免疫组织化学来评估zfn活性在7天内的持续时间和特异性。转染后第1天和第2天评估基因修饰水平。53bp1在它们发生后的24小时内被募集到dsb的位点，并经由nhej参与dsb修复，这是zfn诱导的dsb修复的主要途径。使用针对53bp1的抗体，利用免疫荧光显微镜，修复
位点显现为固定细胞核内染色强烈且明显有别的焦点。使用这个方法对dsb进行评估，可提供净zfn作用的无偏差时间量度(中靶和脱靶两者)。评估了经修饰hspc中的dsb，而结果指出当53bp1免疫染色水平降低时，基因修饰水平仍维持着高，证实53bp1信号的下降不是因为经转染细胞随时间流失所致(图3a至图3c)。转染后1-2天发现到最高水平的53bp1焦点/细胞。此外，约50％的细胞在转染后1天显示1个53bp1焦点/细胞(1个dsb/细胞)，在转染后7天则为约8％细胞(与未经转染细胞所看到的背景水平相似)。转染后第1天和第2天，bcl11a增强子标靶处的基因修饰为73.5％和78.5％。
[0256]
在经修饰hspc中的易位分析。用经修饰hspc进行了分子易位分析，以评估可能的易位事件。量化发生在中靶基因座(bcl11a增强子)和所有已知的脱靶切割位点之间的易位事件频率(先前鉴定出19个)。经由基于miseq的候选脱靶位点标准深度定序而鉴定了其中的十二个，并产生了范围约0.01％至约0.1％的插入缺失水平。经由使用超深度定序nextseq平台过抽样来对较小的基因座组进行更深入的评估，从而鉴定出其余七个位点，并产生了范围约0.001％至约0.01％的较低插入缺失率。这是一种高度灵敏的方法，可以检测接近105个查询基因组之一的易位事件频率；它用于查询bcl11a类红细胞增强子中预期的切割标靶与每个先前鉴定出的脱靶位点之间是否有相互易位和水平。
[0257]
因此，st-400zfn对就bcl11a基因的类红细胞特异性增强子来说具有高度特异性，并且具有可检测到的脱靶活性量最少。特别是，miseq深度dna定序显示脱靶切割的水平非常低，为0.15％或更低，而nextseq分析显示脱靶切割的水平极低，少于0.01％。相比的下，bcl11a基因的靶向类红细胞特异性增强子的插入缺失水平范围约79％至86％。这些全基因组分析指出，bcl11a中靶基因座处的插入缺失水平超过所有鉴定出的脱靶位点处的修饰水平合计超过300倍。此外，生物信息学分析与鉴定出脱靶基因座的文献回顾显示，并没有对涉及关键造血功能的基因编码区域进行修饰的证据，未导致已知与人类造血恶性病相关的修饰。
[0258]
st-400zfn对在类红细胞后代中的脱靶转录效用：为了评估优化的st-400zfn对的脱靶转录活性，使用miseq深度定序分析bcla11a基因两侧的11个基因的表达概况。在第14天从经转染cd34 hspc收集rna，与对照相比，bcl11a基因的类红细胞特异性增强子处的基因修饰水平在此时间点被量化为》50％。经转染cd34 hspc中的γ-球蛋白mrna水平增加约2倍(相对于18s rna标准化)，反映出bcl11a表达降低是由于bcl11a基因的类红细胞特异性增强子中的gata1结合位点的中靶清除所致。相反地，在bcl11a基因两侧的11个基因的表达水平与对照细胞中11个基因的表达水平相似。受到gata1调节的其他4个基因(klf1、scl4a1，zfpm1和alas2)的表达水平也未受到影响。这些结果证实，zfn mrna sb-mrenh1和sb-mrenh2的活性仅限于抑制bcl11a基因转录及其下游效用。
[0259]
用于检测易位事件的方法，是一种用于dna定量的标准taqman分析的修改形式(holland et al.(1991)proc natl acad sci u.s.a.8(16):7276-7280)，其中聚合酶链反应(pcr)与探针结合进行，该探针在贴合至dna并随后被dna聚合酶降解后会释放出荧光团。在完整的探针中，荧光团信号经由与共价附接的抑制剂交互作用而受到压抑。该探针被设计成贴合在pcr引子扩增的区域内。因此，检测到的荧光信号与样品中存在的扩增子数量成正比。taqman引子的长度设计成20个碱基，可产生横跨约200个碱基对(bp)的扩增子。合成引子并使用标准去盐法予以纯化。荧光探针的长度设计成横跨20bp，且gc含量为60％。该探
针含有5'hex报导染料、3'爱荷华黑fq抑制剂，和额外内部“zen”抑制剂，以进一步减少背景信号。探针经hplc纯化。
[0260]
由于在原有人类基因组中未发现有疑问的易位序列，因此需要针对19个脱靶基因座中的每一者来设计含括预测的易位接合的合成dna片段，以产生标准曲线并评估分析灵敏度。这些试剂以及对应引子和探针试剂的示意图提供在图4中。要注意的是，在疑似污染的情况下，bcl11a和脱靶衍生片段之间的每个阳性对照模板中均插入了一个独特的21bp序列，以能够基于序列识别出真正的易位产物。以gblock的形式购买合成双链dna片段，其中dna片段的长度在287到434bp范围之间。在图4中，上图描绘了含括bcl11a增强子中靶位点(绿色)和脱靶位点(橙色)的染色体区段。下图描绘了用于检测对应易位产物的阳性对照试剂(gblock)。还显示了taqman分析中使用的近似引子和探针位置。每个gblock中的孤立(maroon)区段是插入到每个对照试剂中的独特序列，以将其与真正的易位产物加以区别，并允许监控潜在的交叉污染。在片段的bcl11a区域中探测到产物1gblock。在片段的脱靶区域中探测到产物2gblock。
[0261]
针对每个有疑义易位(产物1或产物2，参见图4)，在来自未经转染细胞的cd34 基因组dna(gdna)的100,000个单倍体基因组中，产生包含10000、1000、100、10、3、1，0.1或0.01个合成gblock dna复本的标准曲线。预期标准曲线上最低的两个点(0.1和0.01个复本)会产生阴性讯号，并产生这些讯号以提供对对照dna定量和分析稳健性的进一步验证。纳入三个复本点，以提供更高的分辨率和该分析预期的检测极限范围内的其他数据点。用qiagen dneasy血液和组织套组(qiagen)的ae缓冲液(10mm tris-cl和0.5mm edta ph 9.0)(含有5ng/ul k562细胞的gdna)做为载剂进行十倍稀释，然后转移到含有100,000个cd34 gdna基因组的管内。
[0262]
按照制造商的方案使用bio-rad ddpcr 2x supermix(bio-rad；hercules,ca)来制备反应，其中含有pcr缓冲液，dntp和dna聚合酶。生成用于标准曲线的dna模板(gblock)。ntc(无模板对照)样品缺少加入gblock，但包括来自未经转染cd34 细胞的330ng的gdna。每个反应含有0.5μm引子和0.25μm探针。从三批st-400中每一批的基因组dna使用qiagen dneasy血液和组织套组纯化。针对每个测试样品，将来自指定批次的100,000个单倍体基因组(330ng)dna添加到每个反应中，以匹配用于生成标准曲线的条件。所有样品和标准品均进行三次。根据制造商的说明书，taqman分析是在bio-rad cfx 96实时pcr检测系统上进行。使用的pcr程序如下：95℃持续10分钟，然后进行94℃持续30秒和59℃持续1分钟的50个循环。
[0263]
进行taqman分析来检验经zfn处理的cd34 细胞的基因组dna，以寻找bcl11a中靶位点与经由miseq分析鉴定的12个脱靶基因座之间易位的证据。为此，使用临床条件进行rna转染和表达，用st-400zfn处理受动员周边血液中的cd34 细胞。两天后，分离出gdna并提交相互易位评估(产物1和产物2)。结果总结在表3中，揭示了七个脱靶位点的易位讯号非常低，频率范围为每104至106个单倍体基因组有一次易位。其余位点显示没有易位的证据。表3：检测到的易位
实施例3：经修饰hspc的临床研究
[0264]
在人类中进行了一项研究以测试使用经修饰hspc治疗tdt的安全性。另外，对经修饰hspc的功效估算进行评估。探索性目的也包括评估在用经修饰细胞处理之后，于bcl11a的类红细胞特异性增强子处评估基因修饰特性(％和耐久性)，以及估算经修饰细胞在与β-地中海贫血症和hsct相关的生物化学、成象、功能，以及骨髓上的影响。
[0265]
研究纳入标准包括六名受试者(β0/β0或非β0/β0)，年龄介于18与40岁，在研究筛选之前两年内临床诊断为tdt，以年化基础每年有≤8次有纪录的prbc输血事件。还需要确认β-地中海贫血症的分子遗传学诊断。受试者包括愿意使用节育措施的男性和女性。
[0266]
研究受试者的关键排除标准包括：先前有自体或同种异体人类干细胞移植或实体器官移植的历史；与氧亲和力临床上显着改变有关的γ-球蛋白对偶基因变体(实施方案包括，但不限于hb f-poole、hb f-m osaka、hb f-la grange、hb f-cincinnati和大缺失，诸如γβ-地中海贫血症或εγδβ-地中海贫血症)；血细胞分离术的医学禁忌症；大规模脾肿大和嗜中性粒细胞绝对计数(anc)≤1,000/μl；如通过血清肌酸酐≥2.0mg/dl定义的肾功能障碍；基于肝脏生检，在过去12个月或筛选时有桥状纤维化、肝硬化，或活动性肝炎；在过去30天内用违禁药物治疗；具有临床意义的活跃细菌、病毒，真菌或寄生虫感染；基于筛选实验室检验，诊断为hiv，或hbv或hcv活性感染的证据；卡诺夫斯基日常活动功能量表≤60；经校正dlco≤50％预测的或临床显着限制性；基于筛选肺功能测试(pft)的肺脏疾病；充血性心脏衰竭(nyha第iii或iv级)；不稳定心绞痛，失控性心律不整或左心室射血分数(lvef)《40％、根据筛选时ecg的qtcf》500msec、根据筛选时mri的心脏t2*mri《10msec；重大出血病史；目前诊断为失控癫痫；过去5年有活动性恶性病病史(允许非黑色素瘤皮肤癌或原位子宫颈癌)；在研究候选者中，没有阴性检查结果的任何血液学恶性病病史，或癌症易感症候群的家族史；有可能干扰研究顺从性的活跃酒精或物质滥用的病史；不顺从治疗的历史；目前正在参加使用研究药物的另一项临床试验，或在筛选访视前90天内或小于研究产品的5个半衰期内参加此样之一项试验；使用基因疗法的先前治疗；对白消安或研究药物赋形剂(人类血清白蛋白，dmso和聚葡糖40)有过敏或过敏反应；或任何其他可能使受试者不适合
加入研究的原因。研究设计
[0267]
对带有输血依赖型β-地中海贫血症(tdt)的受试者进行研究。完成登记后，符合资格的受试者接受血细胞分离术以便收集自体cd34 hspc。通过用zfn mrna sb-mrenh1和sb-mrenh2转染来离体处理cd34 hspc，以制造研究药物。在输注经修饰hspc之前，受试者接受静脉内(iv)白消安的调理疗法。使用g-csf和普乐沙福处理而在每位受试者体内动员cd34 hspc。在动员第5天和第6天(如果需要确保挽救治疗，则在 /-第7天)通过血细胞分离术从每位受试者收集受动员的cd34 hspc。在g-csf(在动员第1-6天)和普乐沙福(在动员第4、5与6天)投予之后，每名受试者体内的cd34 hspc受到动员(参见图5)。连续两天(例如，第5天和第6天)通过血细胞分离术从每位受试者收集被动员的cd34 hspc，并在第三天(例如，为了确保挽救治疗的第7天)收集未受操纵的备用移植物，目标是25x106cd34 hspc/kg总量，尽管可以接受较小的产量。如果需要的话，≥2周后进行第二次动员和第二回血细胞分离术。
[0268]
每名受试者所收集的细胞被分成2个部分，一部分用于经修饰hspc药物制造，而另一个部分待用于在指示为挽救治疗的事件时。
[0269]
挽救治疗部包含最少2.5
×
106cd34 hspc/公斤。挽救治疗部分以未经修饰的形式被冷冻保存并储存在该研究中心，以供在延迟造血重建或发育不全与移植失败的情况下可用。如果第一回血细胞分离术没有动员经修饰hspc药物制造和挽救治疗所需的最小数量cd34 hspc，则可以重复动员程序。第二次血细胞分离术的时间点选择是根据研究人员的决定，基于受试者的临床状态，但在不早于最初血细胞分离术后的2周(≥2周)。
[0270]
在挽救治疗的调动和储存之后，受试者的其余受动员和收取细胞是透过快递员发送到gmp制造设施。筛选出cd34 细胞，接着执行用zfn mrna sb-mrenh1和sb-mrenh2转染以破坏bcl11a基因的类红细胞特异性增强子，以产生经修饰hspc研究药物。经修饰hspc进行冷冻保存和储存，直到所有的临床方案部门加入并完成纳入基线访视程序，与受试者准备好输注。使用控制速率冷冻器，将经修饰hspc冷冻保存在50ml冷冻袋(填充约10至20ml的体积；总细胞计数约1.0
×
108至2.0
×
108个细胞)。如果细胞产量超过单个袋子的容量，则使用多个冷冻袋子。输液袋在生产设施处储存在气相液态氮(《-150℃)中，直到准备好运送到临床研究中心为止。
[0271]
在释出经修饰hspc供临床使用之后，受试者被接纳到医院在专门移植单位中开始iv白消安。受试者接受白消安骨髓净除方案(3.2mg/kg/天；经由中央静脉导管iv)持续4天(总剂量为12.8mg/kg，这被认为是用于自体移植的标准照护)，在于第0天输注经修饰hspc之前第-6天至第-3天。根据研究中心实务或指南，iv白消安可以每天给药一次(共4剂)或每6小时给药(共16剂)。第一剂后，基于药物动力学采样和研究中心实务来调整iv白消安的剂量，以每天给药的曲线下面积(auc)为4,000-5,000mmol*min，或每6小时给药的auc为1,000-1,250mmol*min为目标，总方案目标auc为16,000-20,000mmol*min。在与安全监控委员会(smc)讨论后，可以根据先前受试者的经验修改后续受试者的iv白消安药物动力学目标。监控治疗药物，以确定白消安在给药4天后不需要清除，而是可以根据研究中心实务在研究人员的决定下来实施(参见图5)。
[0272]
经修饰hspc输注：用静脉内白消安进行骨髓净除性调理后(总方案目标暴露＝16,
000至20,000μmol*min，如基于药物动力学采样所确认及/或调整)，患者经由中央静脉导管输液接受了解冻的cd34 hspc(“st-400”)产品(图5)。将冷冻的经修饰hspc解冻并输注，使得解冻和输注的整个过程在约15分钟内结束。冷冻的经修饰hspc体积是根据受试者的体重来决定。在输注之前和之后监控生命征象(血压、体温、心率，呼吸频率和脉搏血氧饱和度)。
[0273]
在投予研究药物后，监控受试者来进行常规实验室作业。此外，也将完成任何不良事件的评估，并且针对基因修饰来分析细胞。还将评估hbf水平、分析内分泌功能，并进行mri以评估铁负荷。将评估造血重建的动力学和成功、调理后的住院持续时间、筛检造血恶性病的可能发展、依据简短表格健康状况调查(sf-36调查)的生活质量、由卡诺夫斯基日常活动功能量表的整体功能、血细胞分离术程序的效率，st-400产品的插入缺失％与st-400输注后在骨髓和血液中检测到的插入缺失％之间的差异。
[0274]
ae是在人类中与使用药物相关的任何不乐见医学事件，无论是否被认为与药物有关。ae可以包括在这个研究期间发生或严重程度增加的任何下列事件：在本质、严重程度，或频率方面相比于基线状态(即，筛选前)有恶化的任何征象、症状或身体检查结果，无论是否被认为与正在研究的条件相关或不相关；任何临床显着实验室异常或需要用药或住院的实验室异常。异常实验室结果将基于不良事件一般术语标准(ctcae)5.0标准来分级，第1级或第2级临床实验室异常只有当它被研究人员认为是临床上显着时应回报为ae，如果与已在crf所回报的诊断不相关的话(与使用治疗有关的所有事件，包括那些因为过量、滥用、撤回现象、对治疗敏感性或毒性、伴随疾病，损伤或意外而发生者)，则表示严重程度相对于基线有增加的第3级和第4级临床实验室异常应回报为ae。
[0275]
sae是导致以下结果中任一者的任何ae：死亡，危及生命的威胁事件(即，使受试者处于立即性死亡风险中的事件)；但是，这不包括以下事件：如果事件以更严重的形式发生，则可能导致死亡、住院病患住院或住院延长、持续或严重丧失能力或严重破坏正常生活功能的能力、暴露受试者之后代的先天性异常/出生缺陷，或医学上重要的事件。
[0276]
继发性和探索性事件的评估：在第一次投予iv白消安的日期当天或之前，将基于在最后一次评估来决定hbf分量的基线水平(a与f，以g/dl表示)，和hbf百分比。hbf水平和相对于基线的变化将透过研究访视进行汇总。
[0277]
基线频率和prbc输血的体积是以筛选之前2年期间为基准。输血的频率和体积是按照研究期和整体予以年化，并且将描述性地与基线值相比。
[0278]
输注后监控经修饰hspc异质性：输注后，可在患者体内监控经修饰hspc，以确定植入效率和修饰异质性，如通过插入缺失概况所评估。可以从周边血液，骨髓抽吸物或其他组织样品中纯化受试者细胞样品(优选约5
×
104至1
×
107个细胞)，并进行基因组dna分离。然后通过pcr在标准条件下扩增切割位点周围区域。接着进行第二轮pcr以添加衔接子(adapter)，从而可以使用miseq(illumina)分析反应。将来自受试者细胞的定序数据与标准曲线进行比较，以确定插入缺失百分比。
[0279]
规程指示，患者2和3不能开始化疗调节，直到前一个患者证明有嗜中性粒细胞和血小板植入；在患者3成功植入之后，患者4-6可开始进行化疗调理。监控患者的安全性和功效。这项研究涵盖追踪持续3年，之后提议患者参加长期安全性随访研究。
[0280]
依据不良事件(ae)和严重ae(sae)的发生率来评估安全性和耐受性。造血重建的成功和动力学是通过嗜中性粒细胞(anc≥500个细胞/μl)和血小板(≥20,000个细胞/μl，
不受输血支持)移植来评估。随着时间推移在分子水平上追踪中靶插入/缺失模式，以监督新出现的造血纯系。st-400输注后，监控患者的造血细胞内中靶插入缺失的存在、胎儿血红素水平以及输血需求；移植后血红素的输注阈值是遵照临床中心的标准实务(患者1和2：《8g/dl；患者3：《7g/dl)。结果
[0281]
迄今，已经为6位患者中的5位制造了自体st-400产品，其中3位已经接受st-400(表a)。这些患者的安全性和功效资料；不良事件、胎儿血红素产生、插入缺失标记和prbc输血需求将随着时间而形成，可能持续12个月或更久。表a：患者人口统计以及疾病特征β0，不存在β-球蛋白产生：β ，β-球蛋白产生减少；β
wt
，野生型(正常β-球蛋白产生)；prbc，红细胞浓厚液输血。
[0282]
在第1/2期研究中，第一例经st-400治疗的患者(患者1)具有最严重的输血依赖型β-地中海贫血症(β0/β0)。在研究中进行治疗之前的两年内，这名患者每隔一周接受红细胞浓厚液(prbc)输血。在st-400输注期间，患者1经历了短暂的过敏反应，认为与产品中存在的冷冻保护剂有关。此后，移植后的临床过程是平淡的，且患者分别在输注两周和四周内表达出嗜中性粒细胞和血小板恢复。
[0283]
患者1在经修饰hspc输注后两周接受了prbc输注，并且在随后的6周期间不再需要prbc输注。用经修饰hspc输注后七周的时，总血红素水平保持稳定在大约9g/dl，且胎儿血红素水平持续上升(总血红素从在输注时的约1％至31％(参见图6a和图6b))。在循环白细胞中已经检测到插入缺失(在标靶dna序列处做出的插入或缺失)，指出成功编辑bcl11a基因并破坏bcl11a类红细胞特异性增强子，其欲上调红细胞中的内源性胎儿血红素产生。
[0284]
在患者1中证实了嗜中性粒细胞和血小板移植之后，患者2和3如上所述进行治疗。患者1、2和3均有严重的β地中海贫血症基因型：β0/β0，严重β ivs-i-5(g》c)突变(患者1和3)的同型合子；或β0/β 基因型，具有严重ivs-ii-654(c》t)突变(患者2)。
[0285]
患者1和患者2经历了迅速的造血重建。患者1的胎儿血红素(hbf)分量增加，这有助于稳定总血红素。无prbc输血持续总计6周后，患者1接着需要间歇性输血。病人2在输注
后90天观察到hbf水平升高。就患者1和2来说，循环白细胞中存在有中靶插入和缺失(indel)。患者3刚完成st-400制造，将在输注后测定hbf水平。
[0286]
患者1在st-400输注期间经历过敏反应的严重不良事件(sae)，研究人员认为该事件与产品有关。该事件已利用治疗获得解决。未回报有其他与st-400相关的sae。没有观察到纯系造血作用。
[0287]
随着时间推移(例如12个月或更多个月)进行定期随访(评估造血重建、胎儿血红素水平、循环白细胞中的插入缺失等)，因未经修饰干细胞重新住入骨髓内并驱动造血，患者体内的hbf水平升高且对输血的需求减少或消除。动员与血细胞分离术结果
[0288]
每日血细胞分离术之前，外围血液cd34 计数于25至118个细胞/μl间变化。由于在第一批st-400中的细胞剂量与cfu效力低，患者1经历2回动员与血细胞分离术。从第一回开始将备用移植物冷冻保存。患者2、3、4和5分别经历一回动员和血细胞分离术，从中制造出其st-400批次，并冷冻保存备用移植物。产品特征与造血重建
[0289]
st-400产品中的中靶插入缺失范围为23-80％，如下文表b中所示。表b：st-400产品特征与造血重建a带有插入缺失的所有bcl11a ese对偶基因百分比；这不等于带有至少一个经编辑bcl11a ese对偶基因的所有细胞百分比。b嗜中性粒细胞植入定义为在头一个连续3天时，发生患者的嗜中性粒细胞计数≥500个细胞/μl。c血小板植入定义为在横跨最少3天的头一个3次连续测量时(在前7天没有血小板输注)，发生患者的血小板计数为≥20,000细胞/μl。d患者1和2从第 5天至嗜中性粒细胞植入按照中心的标准操作程序接受g-csf。e患者1经历了2回血细胞分离术和st-400制造；未显示批次的中靶插入缺失百分比为26％。所有其他患者仅经历了一回血细胞分离术和制造。f患者3从第 21天至嗜中性粒细胞植入按照中心的标准操作程序接受g-csf。
[0290]
如所示，在患者1中看到最低的插入缺失值，在两个分开制造的批次中，其编辑效
率接近25％。在临床规模上使用相同的制程，有效率地编辑了来自12位健康供体的cd34 细胞：中位中靶插入缺失，71％；范围，59％至83％。st-400有核活细胞的剂量为4.5-11.4x106个细胞/kg。患者在14-22天内证明有嗜中性粒细胞植入，并在22-35天内证明有血小板植入。安全性
[0291]
在3位给药的患者中，依据插入缺失概况分析随着时间监控中靶插入缺失模式，未观察到新出现的纯系造血。参见图7a至7c。
[0292]
透过在患者1体内于第9个月的观察结果；患者2于第6个月的观察结果；以及患者3于第56天的观察结果，在任何时间点，独特插入缺失的最大频率分别为检测到所有插入缺失的16％，16％和14％。
[0293]
表c中显示了受治疗患者所回报的严重不良事件(sae)。表c：严重不良事件患者严重不良事件与st-400有关1过敏反应a有关2无-3肺炎b无关4无-5无-a
发生在输注st-400期间，并利用医疗处置迅速解决；被认为与dmso冷冻保护剂有关。b肺炎发生在血细胞分离术程序和开始化疗调理之间的时间期。
[0294]
如所示，回报仅有一种归因于st-400药物产品的sae；这个过敏反应的sae发生在st-400输注期间，且在输注结束时获得解决，并被认为与产品冷冻保护剂dmso有关。
[0295]
此外，报导的ae与动员、血细胞分离术和骨髓净除性白消安调理的已知毒性相符。输注之后的变化
[0296]
如上所述，在st-400移植后，于所有3名患者中的胎儿血红素水平与基线相比有增加(图8)，其中患者1和3显示出比患者2诱导更多，这与患者2接受细胞剂量和cfu效力最低的st-400产品相符。
[0297]
在患者1中，插入缺失在外围白细胞中一直持续到第9个月，且在第90天未区分骨髓细胞显示出6％插入缺失。在最初的6周无输血期后，这名患者已恢复间歇性prbc输血，在植入起约8个月时，计划的年化prbc单位输血减少33％。
[0298]
在患者2中，插入缺失一直在外围白细胞中直至第6个月，并且第90天未区分骨髓细胞显示出32％插入缺失。该患者正在接受间歇性prbc输血。
[0299]
在患者3中，插入缺失一直在外围白细胞中直到第56天。尚不能在第90天时评估骨髓抽吸物样品。在最初的7周无输血期后，患者从输注后62天开始接受了两次prbc输血。患者1至3的概述
[0300]
下文汇总患者1至3的治疗和结果。就每个患者来说，cd34 细胞剂量计算如下：cd34 剂量＝[总细胞剂量]x[cd34 ％]。参见，例如表b，在第2列显示总细胞剂量，而在第3列显示cd34 ％。
患者1
[0301]
患者1具有β0/β0基因型，tdt最为严重的形式，并且在加入研究之前具有27次年化红细胞浓厚液(prbc)事件。由于在第一回中达到的细胞剂量低且效力低，患者经历了第二回动员和血细胞分离术。在两个st-400批次中，编辑效率为约25％，低于其他加入这个研究的患者，还有以临床规模制造的12个试验运行批次(中值编辑效率71％)。
[0302]
经输注st-400产物中的中靶插入缺失为23％，且cd34 细胞剂量为5.4
×
106个细胞/kg。在90天时，插入缺失存在于未区分骨髓细胞中，并一直持续在外围白细胞中到第9个月。在st-400输注后，于第56天胎儿血红素水平增加至约2.7g/dl，在第39周时0.9g/dl与基线相比仍维持升高，这是ash资料截止时的最新测量值。在最初的6周无输血持续时间后，患者恢复了间歇性prbc输血，自植入以来，输血的年化prbc单位整体减少了33％。患者2
[0303]
患者2是严重β ivs-i-5(g》c)突变的同型合子，并且在加入研究之前有18次年化prbc事件。st-400产品中的中靶插入缺失为73％，cd34 细胞剂量为3.9x106个细胞/kg，这在5名入选患者所制造的st-400批次中最低的。在90天时，插入缺失存在于未区分骨髓细胞中，并一直存在于外围白细胞中直到第6个月。st-400输注后，胎儿血红素水平与基线相比有所增加，但为《1g/dl直到26周，是迄今为止在三名接受治疗的患者中观察到诱导水平中最低的。该患者目前正在接受间歇性prbc输血。患者3
[0304]
患者3具有β0/β 基因型，其包括严重ivs-ii-654(c》t)突变，并且在加入研究之前具有15次年度化prbc事件。st-400产品中的中靶插入缺失率为54％，cd34 细胞剂量为10.3x106个细胞/kg。在ash的数据截止时，插入缺失一直存在于外围白细胞中直到第56天。st-400输注后，胎儿血红素水平与基线相比有所增加，并且在第90天最新测量值2.8g/dl以来持续上升。在最初的7周无输血期后，患者于输注后62天开始接受两次prbc输血。
[0305]
这些研究以及对其他患者和患者1-3的进一步研究证明，如本文所述，在投予(输注)经遗传修饰细胞(st-400)之后，实现了tdt的治疗，包括免除了对额外疗法(诸如prbc)的需求。
[0306]
本文中提及的所有专利，专利申请案和出版物均以全文引用的方式并入。
[0307]
尽管出于清楚理解的目的，通过例示和实施方案详细提供了揭示内容，但是对于那些本领域技术人员来说显而易见的是，在不偏离本揭示内容的精神或范畴的情况下，可以进行各种改变和修改。因此，前面说明和实施方案不应解释为限制性的。