用于qPCR的纸基微流控芯片及其制作方法与流程

用于qpcr的纸基微流控芯片及其制作方法
技术领域
1.本发明属于纸基微流控芯片技术领域，尤其涉及一种用于qpcr的纸基微流控芯片及其制作方法。


背景技术：

2.纸基微流控芯片于2007年首次提出，这是一种以图案化的微流控纸基为主要成分的分析装置。其结构非常简单，既可以看作是传统微流控的纸质版变体，也可以看成是经典试纸的进阶版本。滤纸纤维中液体的输送完全靠毛细作用流动，因此不需要外部泵加压，此外，纤维素的化学成分及纸的高比表面积能维持反应所需的环境和对试剂进行物理固定，这些功能可以不用其他高科技材料而直接又简单地实现。
3.常规的纸基微流控芯片在面对非常温或变温的反应，如lamp或pcr等，这类反应通常本身耗时长，所需试剂量小，一旦达到反应条件便会蒸发溶剂，因此无法维持其反应体系的稳定。


技术实现要素：

4.有鉴于此，为了填补现有技术的空白，本发明遵循低成本、一次性、简单易用的理念，目的在于提供一种用于qpcr的纸基微流控芯片及其制作方法，可应用于非常温或变温状态下的核酸检测领域，如pcr、lamp等。该芯片结构包括石英玻璃衬底、定位疏水保持架、强度定位保持架、纸基反应单元、密封覆膜和进样-检测栅等，上述组成部分除了衬底外均可通过激光雕刻机一次性加工完成。其中的定位疏水保持架和进样-检测栅可以由经过激光处理pvc防水不干胶得到；强度定位保持架加工形状与定位疏水保持架相同，主要材质可以是高透明pet双面胶；纸基反应单元可以使用纤维素定性滤纸提供反应体系；密封覆膜则采用3c(0.03mm)过塑膜封装芯片整体。该方法不用对初始材质作任何表面处理改性，就能实现蒸发冷凝为一体的封闭区域，和基于该体系的检测。
5.本发明具体采用以下技术方案：一种用于qpcr的纸基微流控芯片，其特征在于：依次由石英玻璃衬底、定位疏水保持架、强度定位保持架、纸基反应单元、密封覆膜和进样-检测栅构成；除衬底外均采用柔性可切割材料，经加工得到目标图案后，按照自下而上的顺序依次粘合嵌套拼装形成芯片。
6.进一步地，所述粘合嵌套拼装具体为：依次利用压敏胶自身性质或热敏胶过塑处理进行层叠。
7.进一步地，所述纸基反应单元的材质为纤维素定性滤纸，形状为不对称哑铃，小头一端为进样区域，大头一端为检测区域。
8.进一步地，所述纸基反应单元设置在定位疏水保持架和强度定位保持架上形成的凹槽中；所述密封覆膜在进样区域的对应位置开设有进样口；所述进样-检测栅分别在进样口和检测区域设置有开口。
9.进一步地，所述定位疏水保持架包括一层或多层带有单面压敏胶的pvc板；所述强
度定位保持架为带有双面压敏胶的pet板；所述密封覆膜为pet热敏胶膜；所述进样-检测栅为带有单面压敏胶的pvc板。
10.进一步地，所述定位疏水保持架的厚度根据纸基反应单元的厚度确定。
11.进一步地，每颗芯片上设置有多个所述纸基反应单元。
12.以及，以上用于qpcr的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤s1：确定并绘制定位疏水保持架、强度定位保持架、纸基反应单元、密封覆膜和进样-检测栅的图案，将其导入激光雕刻机上位机软件中进行切割加工；步骤s2：按顺序在衬底上依次利用压敏胶自身性质或热敏胶过塑处理进行层叠完成芯片的制备。
13.进一步地，在步骤s2中，对于压敏胶，被贴侧用无尘纸擦拭，用镊子将有胶面对齐贴附在其上，待各区域受压稳定后完成粘附；对于热敏胶，拭去3-强度定位保持架上的离型膜后，迅速将带胶面对齐并贴附，待各区域受压均匀后，用镊子夹住推入过塑机辊压柱间，完成封装；对于纸基单元，需要再次擦拭并确认玻璃基底上没有杂物，再将其嵌入。
14.进一步地，在芯片制备完成后，通过进样口直接用移液器将反应溶液滴在裸露滤纸的上方，待溶液充分扩散浸润纸基后，采用pi或pmma胶带封住；已由密封覆膜密封的检测区域则用于检测。
15.与现有技术相比，本发明及其优选方案具有以下有益效果：原料易获取、制备简单，便于规模化生产；能够不用任何化学涂层使纸基微流控芯片具有疏水边界，且提供了一种不影响检测效果并同时具备可多次密封进样区域的封装方式；能够在内部的相变转换的同时维持其反应体系的稳定，有效解决了核酸检测相关反应中蒸发溶剂的问题。
附图说明
16.下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明：图1为本发明实施例提供的用于qpcr的纸基微流控芯片结构示意图；图2为本发明实施例芯片图案俯视示意图；图3为本发明实施例经过pcr实验的芯片照片；图4为本发明实施例芯片上进行的pcr荧光信号与循环数之间的关系图。
17.图中：1-石英玻璃衬底；2-定位疏水保持架；3-强度定位保持架；4-纸基反应单元；5-密封覆膜；6-进样-检测栅。
具体实施方式
18.为让本专利的特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明如下：如图1、图2所示，本实施例提供的纸基微流控芯片由石英玻璃衬底1、定位疏水保持架2、强度定位保持架3、纸基反应单元4、密封覆膜5和进样-检测栅6组成。
19.其中，衬底以外所述的均为柔性可切割材料；每种材料经加工得到目标图案后，可按照自下而上的顺序依次粘合嵌套拼装，除了必要的加工工具之外，不用借助外部耗材的辅助。
20.其中，石英玻璃衬底1的厚度为1mm，长宽均为20mm，基于其良好的导热性和生物亲和性，用以快速响应温度变化与维持纸基结构的稳定。
21.定位疏水保持架2本身材质是基于pvc的压敏胶，和离型膜一起由激光雕刻机切割出有凹槽的图案。其作用在于给纸基反应单元的进样区域和检测区域定位，根据其厚度可以由适当层数堆叠，以防止在之后的过塑中破坏纸基纤维结构。pvc定位疏水保持架是单面胶，使其有胶面朝下粘合住石英玻璃衬底，其余定位疏水保持架用同样的方式粘附在下一层之上。
22.强度定位保持架3本身材质是基于pet的压敏胶，加工方法和加工图案同上。其作用是加强变温状态下密封覆膜与定位疏水保持架之间的粘合强度，并增强表面能减少气相附着。pet强度定位保持架是双面胶，使其通过双重胶面将定位疏水保持架和密封覆膜粘合在一起，避免热敏胶直接覆膜。
23.纸基反应单元4使用具有良好化学惰性的纤维素定性滤纸，加工方法同上，图案形状正好填充定位疏水保持架凹槽，构成芯片的亲水通道。其图案类似不对称哑铃，小头一端为进样区域，大头一端为检测区域。纸基反应单元直接镶嵌进保持架堆叠出的凹槽，与石英玻璃衬底接触，周围空间均疏水。
24.密封覆膜5本身材质是基于pet的热敏胶，其厚度约为3c(0.03mm)，用激光雕刻机切割出只有进样口大小的区域。在剥离强度定位保持架上层离型膜后，对齐进样口后压敏粘合，再将整个芯片经过办公过塑机后热敏粘合，形成只有进样口暴露且高温灭菌的封装芯片。pet密封覆膜是热敏胶，与强度定位保持架的上含胶面定位粘合，再通过办公过塑机二次热熔粘合，充分覆盖芯片区域。
25.进样-检测栅6材质与定位疏水保持架相同，用激光雕刻机切割出进样口和检测区域的小圆和大圆即可。其外观可以为黑色，用以突出检测区、隐藏芯片非功能区和避免进样后封口胶与纸基直接接触。pvc进样-检测栅为单面胶，附在pet密封覆膜上，用以检测时遮挡无关背景，为使用时提供便利。
26.关于制备方法，在本实施例中，首先利用电脑二维绘图软件绘制定位疏水保持架、强度定位保持架、纸基反应单元、密封覆膜和进样-检测栅的图案，然后将其导入激光雕刻机上位机软件中进行切割加工。其中，不同材质所需的功率会有所不同，针对单面胶的pvc，可以不用切割透离型膜，而滤纸、pet过塑膜和双面胶则需要将整个型材切割穿透。
27.在本实施例中，保证制备环境洁净。对于压敏胶，被贴侧用无尘纸擦拭，用镊子将有胶面对齐贴附在其上，待各区域受压稳定后完成粘附；对于热敏胶，拭去3-强度定位保持架上的离型膜后，迅速将带胶面对齐并贴附，待各区域受压均匀后，用镊子夹住推入过塑机辊压柱间，即可完成封装；对于纸基单元，要再次擦拭并确认玻璃基底上没有杂物，再将其嵌入。
28.制作完成的芯片如图2~3所示，小圆的区域用于进样，直接用移液器将反应溶液滴在裸露滤纸的上方，待溶液充分扩散浸润纸基后，可用pi或pmma胶带封住；大圆区域用于检测，上方已被超薄过塑膜密封。
29.在本实施例中，每个芯片有四个纸基反应单元，也就是可以一次进行四次组内对照检测。一般地，可以设置一组阴性ntc对照、一组阳性pc对照、一组超纯水对照和一组待检测样本对照。在图3中强阳性pc组(左上)在反应结束后产物最多，待测样本组(左下)也有检测出目标模板的样本，而纯水对照(右上)和阴性ntc对照(右下)则无法观察到产物的产生。
30.该芯片针对dna病毒和rna病毒的pcr核酸检测同样有效，既可像方式二中做终端
定性，也能做实时半定量检测。
31.如图4所示，在本实施例中，以非洲猪瘟病毒(asfv)为例，将不同初始模板浓度的dna样本与预混液混合后置于芯片中，然后在qpcr仪器中进行热循环并读取荧光强度信号，并绘制出其与循环周期数的函数。可以明显看出，不同初始浓度的样本呈现出的扩增曲线时间趋势不一致，由此可根据某已知浓度判断待测样品的未知浓度。
32.本专利不局限于上述最佳实施方式，任何人在本专利的启示下都可以得出其它各种形式的用于qpcr的纸基微流控芯片及其制作方法，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本专利的涵盖范围。