一种工程蓝藻及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种工程蓝藻及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，dr)是糖尿病患者最常见的微血管并发症。在糖尿病患者中的发病率较高，而且发病后严重影响患者生活质量，是继白内障、青光眼之后第三大致盲疾病。据不完全统计，dr在糖尿病罹患人群中的患病率为24.7％至37.5％。
3.糖尿病疾病后期会导致眼底缺氧，产生微血管瘤、新生血管等，临床上以是否出现新生血管为标志，将dr分为没有视网膜新生血管出现的非增值性糖尿病视网膜病变(no proliferative diabetic retinopathy，npdr)；以及有视网膜新生血管出现的增值性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，pdr)。
4.目前临床上治疗糖尿病视网膜病变的常用方法是激光光凝、玻璃体切除和抗血管生成药物的眼内注射。但由于不同患者的疾病进程都不相同，采用单一治疗方式往往达不到很好的治疗效果。激光光凝通常会分为三到四次进行，增加了手术风险。抗血管生成药物由于代谢较快，需要多次注射使其具有一定的局限性。因此，需要寻找一种能够有效缓解糖尿病视网膜病变病理进程并且无需多次注射、安全性高的治疗手段。
5.蓝藻体内具有天然的叶绿素a，由于能够吸收太阳光中的蓝紫光进行光合作用自主产氧，近年来已经被用于心肌细胞的缺氧供氧、肿瘤缺氧治疗、感染治疗等。相比传统材料供氧能力差、携氧效率低的弊端，蓝藻产氧不仅能够实现高效产氧、还具有良好的生物相容性，是一种廉价、安全的供氧材料，目前已在材料学领域得到了广泛的关注。
6.但是，现有技术中用于心肌细胞的缺氧供氧、肿瘤缺氧治疗、感染治疗等的蓝藻，其仅具有供氧功能，但糖尿病视网膜病变是缺氧、高糖环境，仅具有供氧能力的蓝藻并不能从根本上解决糖尿病视网膜病变。


技术实现要素：

7.因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的蓝藻仅具有供氧功能不具有降糖功能等缺陷，从而提供一种工程蓝藻及其制备方法和应用。
8.为此，本发明提供如下技术方案：
9.本发明提供一种工程蓝藻，包括蓝藻以及吸附在蓝藻表面的纳米颗粒，所述纳米颗粒为纳米金颗粒和具有过氧化氢酶活性的纳米颗粒。
10.可选的，每107个蓝藻上吸附纳米金颗粒的量为20μg-80μg；
11.每107个蓝藻上吸附所述具有过氧化氢酶活性的纳米颗粒的量为10μg-100μg。
12.可选的，所述具有过氧化氢酶活性的纳米颗粒为铱纳米颗粒、铂纳米颗粒、铜纳米颗粒、二氧化锰纳米颗粒、四氧化三铁纳米颗粒中的至少一种。
13.本发明提供一种上述的工程蓝藻的制备方法，包括以下步骤：
14.将纳米金采用修饰剂进行修饰处理，得到表面正电性的纳米金颗粒；
15.将所得纳米金颗粒、具有过氧化氢酶活性的纳米颗粒加入到含蓝藻培养液中，吸附，固液分离，将所得固体分散在超纯水中，得到所述工程蓝藻。
16.可选的，所述吸附步骤在20-25℃，20-200rpm/min下匀速搅拌30-90min直至充分吸附。以3000rpm/min，离心5min得到深绿色沉淀，将沉淀重新溶解在超纯水中，得到所述工程蓝藻。
17.可选的，所述修饰剂为巯基乙胺、l-半胱胺酸、聚乙烯亚胺、十六烷基三甲基溴化铵其中的至少一种；
18.可选的，所述修饰剂的浓度为0.01wt％
–
0.5wt％；
19.可选的，所述修饰剂中的溶剂为超纯水。
20.可选的，本发明所述纳米金颗粒和具有过氧化氢酶活性的纳米颗粒的制备方法为本领域的常规技术，具体的，所述纳米金的制备方法为，以氯金酸为原料采用还原剂进行还原反应得到纳米金；可选的，所述还原反应的温度为90-120℃，时间为30-60min。例如，所述具有过氧化氢酶活性的纳米颗粒的制备方法参照dual-enzyme characteristics of polyvinylpyrrolidone-capped iridium nanoparticles and their cellular protective effect against h2o2-induced oxidative damage.acs appl mater interfaces.2015apr 22；7(15):8233-42.doi:10.1021/acsami.5b01271.epub 2015 apr 9.pmid:25826467.
21.可选的，所述还原剂为柠檬酸钠、柠檬酸钠-鞣酸、甲醛、丙醛、甲酸、抗坏血酸、硼氢化钠、盐酸羟胺之中的至少一种；
22.可选的，所述还原剂的浓度为10mmol/l-100mmol/l。
23.可选的，所述含蓝藻培养液中，蓝藻浓度为10
5-108cells/ml；
24.可选的，所述吸附步骤的时间为30-90min；
25.可选的，所述工程蓝藻中蓝藻的浓度为10
5-109cells/ml。
26.本发明还提供一种上述工程蓝藻或上述的制备方法制备得到的工程蓝藻在降糖、产氧方面的应用。
27.本发明还提供一种上述工程蓝藻或上述的制备方法制备得到的工程蓝藻在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
28.所述含蓝藻培养液中的溶剂为磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，pbs)，超纯水，蓝藻培养基(bg-11medium for blue green algae)的任意一种。
29.本发明技术方案，具有如下优点：
30.本发明提供的工程蓝藻，包括蓝藻以及吸附在蓝藻表面的纳米颗粒，所述纳米颗粒为纳米金颗粒和具有过氧化氢酶活性的纳米颗粒。本发明提供的工程蓝藻是一种具有产氧、局部降糖双重功能，兼具良好生物相容性的新型工程蓝藻，该材料原料绿色环保，能够安全应用于眼内，注射后视网膜结构未发生变化，未出现视网膜脱落、出血等现象，并可在体内充分代谢，快速改善和缓解相关症状；通过材料的局部供氧与降糖功能，在眼后段利用该材料将有利于减少糖尿病视网膜病变引起的眼底渗漏。
31.本发明提供的工程蓝藻的制备方法，包括以下步骤：将纳米金采用修饰剂对纳米金进行修饰处理，得到表面正电性的纳米金颗粒；将所得纳米金颗粒、具有过氧化氢酶活性
的纳米颗粒加入到含蓝藻培养液中，吸附，得到所述工程蓝藻。该方法材料制备简单，能够在普通环境下通过简单的步骤合成。通过静电吸附的方式将材料组装，可实现工程化蓝藻的简单制备；修饰后的纳米粒子增强了自身稳定性、降低了毒性，可以改善纳米粒子与蓝藻两者的生物相容性、使材料兼具供氧与耗糖的功能。
32.本发明提供的工程蓝藻的应用，针对糖尿病视网膜病变的缺氧、高糖环境，我们发明了一种改善糖尿病视网膜病变微环境的新型蓝藻。该材料由蓝藻和两种纳米酶组成，由于眼睛具有良好的透光性，材料注射后蓝藻能够在普通光照条件下实现眼内产生氧气，有效缓解视网膜下缺氧。此外，蓝藻表面负载的两种纳米酶具有级联效果，首先催化降解高糖环境中的过量葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，但是过氧化氢作为活性氧代谢的副产物会引起体内多项不良反应，而负载的另外一种酶能够降解过氧化氢生成无毒的水和氧气。具有级联反应的纳米酶对于葡萄糖的降解使得对高糖环境起到一定的缓解作用。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1是本发明实施例1提供的工程蓝藻的制备流程图。
具体实施方式
35.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
36.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
37.实施例1
38.本实施例提供一种工程蓝藻，其制备流程如图1所示，具体的制备方法为：
39.首先，将5ml柠檬酸钠溶液(4mmol/l)和45ml氯金酸溶液(20mmol/l)，混合，磁力加热搅拌器上140℃油浴加热搅拌，反应30min得到直径在10nm的纳米金，在探头超声条件下加入10ml浓度为0.05wt％的聚乙烯亚胺，超声30min。将反应后的溶液10000rpm，30min得到粉紫色沉淀，用超纯水洗涤数次，烘干沉淀得到改性后的纳米金颗粒粉末。
40.将40ml氯化铱溶液(8.4mmol/l)与186ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(186mmol/l)混合。在室温下利用磁力搅拌器搅拌12h得到澄清的淡黄色溶液后，升温至120℃冷凝回流6h，溶液变为棕色。加热蒸发完全除去溶剂，变为黑色固体，用超纯水离心洗涤沉淀3次，烘干沉淀得到铱纳米颗粒粉末。
41.将两种纳米粒子离心后，分别取4mg纳米金粉末与1mg纳米铱粉末，与100ml蓝藻溶液混合(4
×
107cells/ml，溶剂为超纯水)混合，20-200rpm/min，匀速搅拌60min直至溶液颜
色由浅绿色变为深绿色，待纳米颗粒与蓝藻充分吸附后，离心3000rpm，5min得到深绿色沉淀。取上清液，利用电感耦合等离子发射光谱仪(icp-oes)，测得上清液不存在金元素及铱元素，即表明材料已经完全吸附。将沉淀重新溶解到100ml超纯水中，得到一种能够改善糖尿病视网膜病变微环境的新型工程蓝藻溶液。
42.通过对上述新型工程蓝藻进行测试表征，场发射扫描电镜测试显示两种纳米材料为规则圆球状，元素分析显示两种材料已经成功吸附到蓝藻表面。
43.将合成后的工程蓝黑暗放置12h以去除溶液中的溶解氧，利用12w的普通白炽灯作为稳定光源照射蓝藻，将调零后的溶氧仪探头伸入溶液内，记录10min内溶解氧增量。溶氧仪测试该材料能够在光照条件下持续稳定产生氧气。
44.将5ml(108cell/ml)工程蓝藻与5ml(100mm)葡萄糖溶液共孵育180min，离心后取上清液，验证葡萄糖酸的产生。葡萄糖酸、羟胺和三氯化铁之间的显色反应生成红色化合物，在505nm处有葡萄糖酸的紫外吸收峰出现，同时利用ph计测反应过程中溶液ph持续降低，都证明了葡萄糖酸的生成，证明了材料的葡萄糖氧化酶活性。同时利用溶氧仪测得溶液中溶解氧持续上升，是葡萄糖降解后生成的过氧化氢被降解为水和氧气，证明了材料的过氧化氢酶活性。以上实验都表明，工程蓝藻具有良好的葡萄糖氧化酶活性和过氧化氢酶活性。
45.在细胞实验中验证了材料的生物相容性。将90μl rpe(视网膜色素上皮细胞)与10μl工程蓝藻(5
×
108cell/ml)共同孵育24h，利用cck-8试剂盒(cell counting kit-8)和细胞死活染色实验，细胞存活率90％。在流式细胞实验中，测得材料与细胞共同孵育24h后，细胞的凋亡率在8％。都证明了工程蓝藻具有较低的生物毒性和良好的生物相容性。
46.实施例2
47.本实施例提供一种工程蓝藻，其制备方法为：
48.首先，将5ml硼氢化钠溶液(2mmol/l)和45ml氯金酸溶液(20mmol/l)，300rpm搅拌加热1min，待溶液变成亮红色后加入l-半胱胺酸(0.1mmol/l)，磁力搅拌器搅拌加热至100℃反应1h，得到改性后的纳米金颗粒。
49.将5ml氯铂酸(5mmol/l)和45ml硼氢化钠(1mmol/l)混合，磁力搅拌器上搅拌加热至50℃反应6h，得到铂纳米颗粒。
50.将两种纳米粒子离心后，分别取4mg纳米金粉末与1mg纳米铂粉末，与100ml蓝藻溶液混合(4
×
107cells/ml，溶剂为超纯水)混合，20-200rpm/min，匀速搅拌60min直至溶液颜色由浅绿色变为深绿色，待纳米颗粒与蓝藻充分吸附后，离心3000rpm，5min得到深绿色沉淀。取上清液，利用电感耦合等离子发射光谱仪(icp-oes),测得上清液不存在金元素及铂元素，即表明材料已经完全吸附。将沉淀重新溶解到100ml超纯水中，得到一种能够改善糖尿病视网膜病变微环境的新型工程蓝藻溶液。
51.通过对上述新型工程蓝藻进行测试表征，场发射扫描电镜测试显示两种纳米材料为规则圆球状，元素分析显示两种材料已经成功吸附到蓝藻表面。
52.将5ml(108cell/ml)工程蓝藻与5ml(100mm)葡萄糖共孵育180min，离心后取上清液，验证葡萄糖酸的产生。葡萄糖酸、羟胺和三氯化铁之间的显色反应生成红色化合物，在505nm处有葡萄糖酸的紫外吸收峰出现，同时利用ph计测反应过程中溶液ph持续降低，都证明了葡萄糖酸的生成。但材料催化效率与实施例1相比，催化活性降低。同时利用溶氧仪测
得溶液中溶解氧持续上升较缓。材料具有一定的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶活性，但活性相对较低。
53.在细胞实验中验证了材料的生物相容性。将90μl rpe(视网膜色素上皮细胞)，与10μl工程蓝藻(5
×
108cell/ml)共同孵育24h，利用cck-8试剂盒(cell counting kit-8)和细胞死活染色实验，细胞存活率85％。在流式细胞实验中，测得材料与细胞共同孵育24h后，细胞的凋亡率15％。
54.实施例3
55.本实施例提供一种工程蓝藻，其制备方法为：
56.首先，将40ml抗坏血酸(4mmol/l)和20ml氯金酸溶液(20mmol/l)混合，磁力加热搅拌器上140℃油浴加热搅拌，反应30min得到直径在25nm左右的纳米金，在探头超声条件下加入5ml浓度为0.05wt％的巯基乙胺，超声30min，得到改性纳米金颗粒。
57.将20ml高锰酸钾溶液(0.1mol/l)与30ml无水醋酸锰(0.2mol/l)按照2：3混合。在室温下利用磁力搅拌器搅拌12h后加热120℃，冷凝回流6h得到二氧化锰纳米颗粒。加热蒸发完全除去溶剂，变为黑色固体，用超纯水离心洗涤沉淀3次，烘干沉淀得到二氧化锰纳米颗粒粉末。
58.将两种纳米粒子离心后，分别取4mg纳米金粉末与1mg纳米二氧化锰粉末，与100ml蓝藻溶液混合(4
×
107cells/ml，溶剂为超纯水)混合，20-200rpm/min，匀速搅拌60min直至溶液颜色由浅绿色变为深绿色，待纳米颗粒与蓝藻充分吸附后，离心3000rpm，5min得到深绿色沉淀。取上清液，利用电感耦合等离子发射光谱仪(icp-oes),测得上清液不存在金元素及锰元素，即表明材料已经完全吸附。将沉淀重新溶解到100ml超纯水中，得到一种能够改善糖尿病视网膜病变微环境的新型工程蓝藻溶液。
59.通过对上述新型工程蓝藻进行测试表征，场发射扫描电镜测试显示两种纳米材料为规则圆球状，元素分析显示两种材料已经成功吸附到蓝藻表面。
60.将5ml(108cell/ml)工程蓝藻与5ml(100mm)葡萄糖共孵育180min，离心后取上清液，验证葡萄糖酸的产生。葡萄糖酸、羟胺和三氯化铁之间的显色反应生成红色化合物，在505nm处有葡萄糖酸的紫外吸收峰出现，同时利用ph计测反应过程中溶液ph持续降低，都证明了葡萄糖酸的生成。但材料催化效率与实施例1相比，催化活性降低。同时利用溶氧仪测得溶液中溶解氧持续上升较缓。材料具有一定的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶活性，但活性相对较低。
61.在细胞实验中验证了材料的生物相容性。将90μl rpe(视网膜色素上皮细胞)，与10μl工程蓝藻(5
×
108cell/ml)共同孵育24h，利用cck-8试剂盒和细胞死活染色实验，细胞的存活率75％，流式细胞实验中测得材料与细胞共同孵育24h后，细胞的凋亡率在20％。
62.实施例4
63.本实施例提供一种工程蓝藻，其制备方法为：
64.首先，将40ml抗坏血酸(4mmol/l)和20ml氯金酸溶液(20mmol/l)混合，磁力加热搅拌器上140℃油浴加热搅拌，反应30min得到直径在25nm左右的纳米金，在探头超声条件下加入5ml浓度为0.05wt％的巯基乙胺，超声30min，得到改性纳米金颗粒。
65.将40ml抗坏血酸(4mmol/l)和20ml氯化铜溶液(20mmol/l)混合，磁力加热搅拌器上80℃油浴加热搅拌，反应30min得到直径在25nm左右的纳米铜。
66.将两种纳米粒子离心后，分别取4mg纳米金粉末与1mg纳米铜粉末，与100ml蓝藻溶液混合(4
×
107cells/ml，溶剂为超纯水)混合，20-200rpm/min，匀速搅拌60min直至溶液颜色由浅绿色变为深绿色，待纳米颗粒与蓝藻充分吸附后，离心3000rpm，5min得到深绿色沉淀。取上清液，利用电感耦合等离子发射光谱仪(icp-oes),测得上清液不存在金元素及铜元素，即表明材料已经完全吸附。将沉淀重新溶解到100ml超纯水中，得到一种能够改善糖尿病视网膜病变微环境的新型工程蓝藻溶液。
67.将5ml(108cell/ml)工程蓝藻与5ml(100mm)葡萄糖溶液共孵育180min，离心后取上清液，验证葡萄糖酸的产生。葡萄糖酸、羟胺和三氯化铁之间的显色反应生成红色化合物，在505nm处有葡萄糖酸的紫外吸收峰出现，同时利用ph计测反应过程中溶液ph持续降低，都证明了葡萄糖酸的生成。但材料催化效率与实施例1相比，催化活性降低。同时利用溶氧仪测得溶液中溶解氧持续上升较缓。材料具有一定的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶活性，但活性相对较低。
68.在细胞实验中验证了材料的生物相容性。将90μl rpe(视网膜色素上皮细胞)，与10μl工程蓝藻(5
×
108cell/ml)共同孵育24h，利用cck-8试剂盒(cell counting kit-8)和细胞死活染色实验，细胞存活率80％。在流式细胞实验中，测得材料与细胞共同孵育24h后，细胞的凋亡率15％。
69.实施例5
70.本实施例提供一种工程蓝藻，其制备方法为：
71.首先，将40ml抗坏血酸(4mmol/l)和20ml氯金酸溶液(20mmol/l)混合，磁力加热搅拌器上140℃油浴加热搅拌，反应30min得到直径在25nm左右的纳米金，在探头超声条件下加入5ml浓度为0.05wt％的巯基乙胺，超声30min，得到改性纳米金颗粒。
72.将相同浓度的fe
2
的盐溶液与30ml fe
3
的盐溶液混合加热至50℃，加入peg 20,000(聚乙二醇20,000)作为表面活性剂，并加入氨水作为沉淀剂，将反应溶液的ph调至11，得到四氧化三铁纳米颗粒。
73.将两种纳米粒子离心后，分别取4mg纳米金粉末与1mg纳米四氧化三铁粉末，与100ml蓝藻溶液混合(4
×
107cells/ml，溶剂为超纯水)混合，20-200rpm/min，匀速搅拌60min直至溶液颜色由浅绿色变为深绿色，待纳米颗粒与蓝藻充分吸附后，离心3000rpm，5min得到深绿色沉淀。取上清液，利用电感耦合等离子发射光谱仪(icp-oes),测得上清液不存在金元素及铁元素，即表明材料已经完全吸附。将沉淀重新溶解到100ml超纯水中，得到一种能够改善糖尿病视网膜病变微环境的新型工程蓝藻溶液。
74.将5ml(108cell/ml)工程蓝藻与5ml(100mm)葡萄糖溶液共孵育180min，离心后取上清液，验证葡萄糖酸的产生。葡萄糖酸、羟胺和三氯化铁之间的显色反应生成红色化合物，在505nm处有葡萄糖酸的紫外吸收峰出现，同时利用ph计测反应过程中溶液ph持续降低，都证明了葡萄糖酸的生成。但材料催化效率与实施例1相比，催化活性降低。同时利用溶氧仪测得溶液中溶解氧持续上升较缓。材料具有一定的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶活性，但活性相对较低。
75.在细胞实验中验证了材料的生物相容性。将90μl rpe(视网膜色素上皮细胞)，与10μl工程蓝藻(5
×
108cell/ml)共同孵育24h，利用cck-8试剂盒(cell counting kit-8)和细胞死活染色实验，细胞存活率80％。在流式细胞实验中，测得材料与细胞共同孵育24h后，
细胞的凋亡率20％。
76.对比例1
77.本对比例提供一种工程蓝藻，其制备方法为：
78.首先，将40ml抗坏血酸(4mmol/l)和20ml氯金酸溶液(20mmol/l)混合，磁力加热搅拌器上140℃油浴加热搅拌，反应30min得到直径在25nm左右的纳米金，在探头超声条件下加入5ml浓度为0.05wt％的巯基乙胺，超声30min，得到改性纳米金颗粒。
79.将纳米粒子离心后，取5mg纳米金颗粒与100ml含蓝藻培养液(5
×
105cells/ml，溶剂为超纯水)混合，20-200rpm/min，匀速搅拌60min直至溶液颜色由浅绿色变为深绿色，待纳米颗粒与蓝藻充分吸附后，离心3000rpm，5min得到深绿色沉淀。取上清液，利用电感耦合等离子发射光谱仪(icp-oes),测得上清液不存在金元素，即表明材料已经完全吸附。将沉淀重新溶解到100ml超纯水中，得到工程蓝藻溶液。
80.将5ml(108cell/ml)工程蓝藻与5ml(100mm)葡萄糖溶液共孵育180min，离心后取上清液，验证葡萄糖酸的产生。葡萄糖酸、羟胺和三氯化铁之间的显色反应生成红色化合物，在505nm处有葡萄糖酸的紫外吸收峰出现，同时利用ph计测反应过程中溶液ph持续降低。但环境中过氧化氢含量持续上升，表示葡萄糖降解过程中生成的过氧化氢未被催化，材料不具有过氧化氢酶活性。
81.对比例2
82.本对比例提供一种工程蓝藻，其制备方法为：
83.将20ml高锰酸钾溶液(0.1mol/l)与30ml无水醋酸锰(0.2mol/l)按照2：3混合。在室温下利用磁力搅拌器搅拌12h后加热120℃，冷凝回流6h得到二氧化锰纳米颗粒。加热蒸发完全除去溶剂，变为黑色固体，用超纯水离心洗涤沉淀3次，烘干沉淀得到二氧化锰纳米颗粒粉末。
84.将纳米粒子离心后，取5mg纳米二氧化锰粉末与100ml蓝藻溶液混合(4
×
107cells/ml，溶剂为超纯水)混合，20-200rpm/min，匀速搅拌60min直至溶液颜色由浅绿色变为深绿色，待纳米颗粒与蓝藻充分吸附后，离心3000rpm，5min得到深绿色沉淀。取上清液，利用电感耦合等离子发射光谱仪(icp-oes),测得上清液不存在锰元素，即表明材料已经完全吸附。将沉淀重新溶解到100ml超纯水中，得到工程蓝藻溶液。
85.将5ml(108cell/ml)工程蓝藻与5ml(100mm)葡萄糖溶液共孵育180min，离心后取上清液，验证葡萄糖酸的产生。在505nm未出现明显的葡萄糖酸紫外吸收峰，ph计测得反应过程中溶液ph无明显变化，说明材料无明显葡萄糖氧化酶活性。
86.动物试验
87.利用stz(链脲佐菌素)构造糖尿病小鼠模型。本研究中统一购买5周龄c57bl/6j(b6)雄性小鼠，每组十只，正常饲养，自由饮食，国家标准混合饲料和过滤自来水，饲养室温度保持在22-28℃，相对湿度维持在40-60％，昼夜明暗交替的时间为12/12h。stz以6mg/ml的浓度溶于超纯水中，按55mg/kg剂量给予小鼠腹腔注射，连续注射一周。stz造模的ⅰ型糖尿病小鼠，血糖》16.5mmol/l。
88.每隔两周进行眼底荧光造影，观察视网膜情况。在小鼠患糖尿病七周时发生眼底渗漏情况，此时对小鼠进行视网膜下注射材料(本发明各实施例得到的工程蓝藻)治疗，视网膜下注射量为每只眼球1μl。在注射工程蓝藻后的第二周进行眼底荧光造影，注射工程蓝
藻的实验组，渗漏面积明显减少，表示渗漏情况得到了有效的改善。而对照组(注射相同体积的生理盐水)小鼠的渗漏面积增大，表明渗漏情况进一步恶化。在第九周时，各组小鼠均未发现眼底出血情况。取上述小鼠眼球切片后进行免疫染色，可观察到小鼠视网膜结构均完整，未出现视网膜脱落的情况。
89.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。