椎间盘退变的治疗的制作方法

椎间盘退变的治疗
1.发明背景
技术领域：
2.本发明涉及预防或延迟椎间盘退变。本技术还涉及通过预防或延迟椎间盘退变来治疗退变的椎间盘。本发明还涉及使用软骨细胞来引入损伤的椎间盘区域和预防或延迟椎间盘退变的方法。本发明还涉及将至少一个编码转化生长因子β超家族的成员的基因引入至少一种哺乳动物细胞以用于预防或延迟哺乳动物宿主的椎间盘退变的方法。本发明还涉及使用含有编码转化生长因子β超家族的成员的基因的软骨细胞和哺乳动物细胞的混合物来引入损伤的椎间盘区域和预防或延迟椎间盘退变的方法。


技术实现要素：

3.在一个方面，本发明是涉及用于预防或延迟椎间盘缺陷部位处的椎间盘退变的方法，其包括将哺乳动物结缔组织细胞注入椎间盘缺陷部位中。所述方法优选地不使用针对细胞的支架或任何支撑性结构。优选地，使用未转染的软骨细胞或成纤维细胞，且受试者优选地是人类。如果正在使用软骨细胞，那么软骨细胞优选地是非椎间盘软骨细胞或幼年软骨细胞，意味着细胞是从小于两岁的儿童分离的。在其它方面，软骨细胞可以是致敏的软骨细胞。特定来说，结缔组织细胞相对于寻求治疗的哺乳动物受试者可能是同种异体的。
4.如上所讨论的转染的哺乳动物细胞可以包括上皮细胞，优选地人上皮细胞或人胚胎肾293细胞，也被称为hek 293、hek-293或293细胞。
5.在一个方面，本发明涉及使用同种异体幼年软骨细胞或同种异体非椎间盘软骨细胞来引入损伤的椎间盘区域和预防或延迟椎间盘退变的方法。
6.在一个方面，本发明用于预防或延迟椎间盘中已损伤、撕裂或突出的区域的进一步退变。
7.在另一方面，本发明是涉及一种用于预防或延迟哺乳动物的椎间盘缺陷部位的椎间盘退变的方法，所述方法包括：a)将编码具有椎间盘再生功能的蛋白质的基因插入哺乳动物细胞，和b)将所述哺乳动物细胞移植到椎间盘缺陷部位中。所述方法优选地不使用针对细胞的支架或任何支撑性结构。在这种方法中，基因可以属于tgf-β超家族，如tgf-β，且优选地tgf-β1。
8.如上所讨论的转染的哺乳动物细胞可以包括上皮细胞，优选地人上皮细胞或人胚胎肾293细胞，也被称为hek 293、hek-293或293细胞。
9.在又另一方面，本发明是涉及用于预防或延迟哺乳动物的椎间盘缺陷部位处的椎间盘退变的方法，其包括：a)将编码具有椎间盘再生功能的蛋白质的基因插入第一哺乳动物细胞中，和b)将a)的哺乳动物细胞和未修饰的第二哺乳动物结缔组织细胞的混合物移植到椎间盘缺陷部位中。所述方法优选地不使用针对细胞的支架或任何支撑性结构。在这种方法中，基因可以属于tgf-β超家族，如tgf-β，且优选地tgf-β1。
10.如上所讨论的第一转染的哺乳动物细胞可以包括上皮细胞，优选地人上皮细胞或
人胚胎肾293细胞，也被称为hek 293、hek-293或293细胞。
11.第二哺乳动物结缔组织细胞可以是软骨细胞或成纤维细胞。在软骨细胞的情况下，软骨细胞可以是非椎间盘软骨细胞或幼年软骨细胞。特定来说，第二哺乳动物结缔组织的软骨细胞可以是致敏的软骨细胞。在另一方面，第一或第二结缔组织细胞中的任一个或两个相对于哺乳动物受试者或彼此是同种异体的。
附图说明
12.图1a-1f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处未看见穿刺和治疗，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。特定来说，混合型细胞治疗具有椎间抗退变效果。
13.图2a-2f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处未看见穿刺和治疗，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。特定来说，混合型细胞治疗具有椎间抗退变效果。
14.图3a-3d显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。特定来说，混合型细胞治疗具有椎间抗退变效果。
15.图4a-4d显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。特定来说，产生tgf-β1的293细胞治疗具有椎间抗退变效果。
16.图5a-5d显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。特定来说，产生tgf-β1的293细胞治疗和混合型细胞治疗具有椎间抗退变效果。
17.图6a-6d显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。未转导的软骨细胞治疗具有椎间抗退变效果。
18.图7a-7f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。未转导的软骨细胞治疗具有椎间抗退变效果。
19.图8a-8f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在t12/l1处的椎间盘已被针穿刺损伤且无注入，(ii)在脊柱位置l1/2处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l2/3处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向t12/l1和l2/3椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在t12/l1处的椎间盘已被针穿
刺损伤且无注入，(ii)在脊柱位置l1/2处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l2/3处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向t12/l1和l2/3椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。未转导的软骨细胞治疗具有椎间抗退变效果。
20.图9a-9d显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l2/3处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l3/4处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l4/5处的椎间盘已损伤且注入致敏的软骨细胞；箭头指向l2/3和l4/5椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。致敏的软骨细胞治疗具有椎间抗退变效果。
具体实施方式
21.如本文所用，关于核酸、蛋白质、蛋白质片段或其衍生物的术语“生物活性”定义为核酸或氨基酸序列模拟由核酸或蛋白质的野生型形式引起的已知生物学功能的能力。
22.如本文所用，关于转染或转导细胞的术语“哺乳动物细胞”包括所有类型的哺乳动物细胞，特定来说人细胞，包括但不限于结缔组织细胞，如成纤维细胞或软骨细胞、或干细胞，且特定来说人胚胎肾细胞(且进一步特定来说人胚胎肾293细胞)或上皮细胞。
23.如本文所用，术语“结缔组织”是连接且支持其它组织或器官的任何组织，且包括但不限于哺乳动物宿主的韧带、软骨、腱、骨骼和滑膜。
24.如本文所用，术语"结缔组织细胞"或"结缔组织的细胞"包括结缔组织中存在的细胞，如成纤维细胞、软骨细胞(cartilage cell/chondrocyte)和骨细胞(bone cell/osteoblast/osteocyte)，其分泌胶原胞外基质以及脂肪细胞(fat cell/adipocyte)和平滑肌细胞。优选地，结缔组织细胞是成纤维细胞、软骨细胞或骨细胞。更优选地，结缔组织细胞是软骨细胞。将认识到，本发明可以用结缔组织细胞的混合培养物以及单一类型的细胞来实践。优选地，在注入宿主生物体时，结缔组织细胞不引起负免疫应答。应理解，在这一点上可以使用同种异体细胞，以及对于细胞介导的基因疗法或体细胞疗法可使用自体细胞。
25.如本文所用，“结缔组织细胞系”包括多种来源于共同亲代细胞的结缔组织细胞。
26.如本文所用，“透明软骨”是指覆盖关节表面的结缔组织。仅举例来说，透明软骨包括但不限于关节软骨、肋软骨和鼻软骨。
27.特定来说，已知透明软骨是自我更新的，对于改变作出反应，且提供摩擦较小的稳定移动。即使在同一关节或不同关节中存在的透明软骨的厚度、细胞密度、基质组成和机制特性不同，但保留相同的一般结构和功能。透明软骨的一些功能包括令人惊讶的压缩刚度、弹性和出色的分配重量负荷的能力、最小化软骨下骨骼上的峰值应力的能力以及极大的耐久性。
28.大体上和组织学上，透明软骨呈现为抵抗变形的光滑坚固的表面。软骨的胞外基质包含软骨细胞，但缺少血管、淋巴管或神经。维持软骨细胞与基质之间的相互作用的复杂
morphogenetic protein，bmp，如bmp-2、3、4、5、6和7、成骨素、op-1)，其可重新诱导软骨和骨骼形成(sampath等人,j.biol.chem.,265:13198,1990)。tgf-β基因产物可影响多种分化过程，包括脂肪生成、肌生成、软骨生成、造血作用和上皮细胞分化(对于综述，参见massague,cell 49:437,1987)，其通过全文引用的方式并入本文中。
39.tgf-β家族的蛋白质最初合成为大的前体蛋白，其随后在距c端的大约110-140个氨基酸的碱性残基簇处经历蛋白质水解裂解。蛋白质的c端区域全部均是结构相关的，且不同的家族成员可基于其同源性程度而分类为不同的亚组。尽管特定亚组内的同源性在70％至90％氨基酸序列同一性的范围内，但亚组之间的同源性显著更低，一般在仅20％至50％的范围内。在每一种情况下，活性物质呈现为c端片段的二硫键连接的二聚体。对于已经研究的大部分家族成员来说，发现同型二聚物质是生物活性的，但对于如抑制素(ung等人,nature,321:779,1986)和tgf-β(cheifetz等人,cell,48:409,1987)的其它家族成员来说，也检测到异二聚体，且这些似乎具有与相应同型二聚体不同的生物特性。
40.tgf-β基因超家族的成员包括tgf-β3、tgf-β2、tgf-β4(鸡)、tgf-β1、tgf-β5(非洲爪蟾)、bmp-2、bmp-4、果蝇dpp、bmp-5、bmp-6、vgr1、op-1/bmp-7、果蝇60a、gdf-1、非洲爪蟾vgf、bmp-3、抑制素-βa、抑制素-βb、抑制素-α和mis。这些基因论述于massague,ann.rev.biochem.67:753-791,1998中，其通过全文引用的方式并入本文中。
41.优选地，tgf-β基因超家族的成员是tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6或bmp-7。
42.椎间盘
43.椎间盘构成脊柱长度的四分之一。在第一颈椎(c1)、第二颈椎(c2)和尾骨之间无椎间盘。椎间盘不是血管的且因此依赖于终板来扩散所需的营养。终板的软骨层将椎间盘锚定在适当的位置中。
44.椎间盘是纤维软骨垫，充当脊柱的减震系统，其保护椎骨、脑和其它结构(即，神经)。椎间盘允许一定的椎骨运动：伸展和弯曲。单个椎间盘移动是非常有限的——然而，当数个椎间盘合力时，相当大的运动是可能的。
45.椎间盘由纤维环和髓核构成。纤维环是一种由薄层构成的强劲的放射状环样结构，所述薄层是连接到椎骨终板的胶原纤维同心层。所述层以不同的角度定位。纤维环围住髓核。
46.尽管纤维环和髓核均由水、胶原和蛋白聚糖(pg)构成，但流体(水和pg)的量在髓核中最高。pg分子是非常重要的，这是因为其吸引和保留水。髓核含有抵抗压缩的水合凝胶样物质。取决于活动，核中的水量全天变化。随着人们年龄的增长，髓核开始脱水，这限制其吸收冲击的能力。纤维环随着年龄增长而变弱且开始撕裂。虽然这在一些人群中不导致疼痛，但在其他人或这两种人群中可能导致慢性疼痛。
47.由于髓核脱水不能吸收冲击所致的疼痛称为轴向疼痛或椎间盘间隙疼痛。人们通常将髓核的逐渐脱水称为退变性椎间盘疾病。当纤维环由于损伤或衰老过程而撕裂时，髓核可能开始通过撕裂挤出。这称为椎间盘突出。每一个椎间盘的后侧附近，全部均沿着脊柱，主要的脊柱神经延伸到不同的器官、组织、四肢等。对于突出的椎间盘来说非常常见的是压迫这些神经(压紧的神经)，导致放射痛、麻木、麻刺感以及力量和/或运动范围减弱。此外，含有发炎性蛋白的内核凝胶与神经的接触也可导致明显的疼痛。神经相关疼痛称为神
经根疼痛。
48.突出的椎间盘有许多名词，且这些对于不同的医疗专业人员可能意指不同的事物。椎间盘膨出(slipped disc)、椎间盘破裂(ruptured disc)或椎间盘膨隆(bulging disc)全部均可指相同的医学疾患。椎间盘突出到相邻的椎骨中称为许莫式结节(schmorl's nodes)。
49.致敏细胞疗法
50.本发明涵盖向哺乳动物的椎间盘区域施用致敏的细胞以通过预防或延迟椎间盘退变来治疗损伤的椎间盘。致敏的细胞通常是结缔组织细胞，且包括软骨细胞或成纤维细胞。
51.举例来说，当原代软骨细胞群体传代约3到4次时，其形态学通常变为成纤维细胞性软骨细胞。随着原代软骨细胞传代，其开始丢失一些其软骨细胞特征且开始具有成纤维细胞性软骨细胞的特征。当这些成纤维细胞性软骨细胞与细胞因子，如来自tgf-β超家族的蛋白质一起孵育或“致敏”时，细胞恢复其软骨细胞特征，所述特征包括产生胶原。
52.这类致敏的细胞包括成纤维细胞性软骨细胞，其已与tgfβ1一起孵育，且因此已恢复为产生胶原的软骨细胞。在延迟椎间盘退变中使用致敏的细胞的优点是易于产生可用的软骨细胞来引入椎间盘中以产生胶原和其它情况维持软骨基质。
53.所述细胞可包括但不限于原代细胞或已进行约一次至二十次传代的细胞。所述细胞可以是结缔组织细胞。所述细胞可包括已经历形态学变化的细胞，其中致敏引起恢复到原始细胞的特征。所述细胞可包括但不限于软骨细胞、成纤维细胞或成纤维细胞性软骨细胞。致敏可通过以下方式来进行：将细胞与细胞因子孵育至少40小时，或1至40小时、2至30小时、3至25小时、4至20小时、5至20、6至18小时、7至17小时、8至15小时或9至14小时的时间段，且随后任选地将细胞因子与细胞分离，并且将致敏的细胞注入所关注的软骨缺陷部位，以便使软骨，优选地透明软骨再生。在一个方面，细胞因子可以是tgf-β超家族的成员。特定来说，细胞因子可以是tgf-β，且特定来说是tgf-β1。
54.细胞因子可以足以将软骨细胞“致敏”为在椎间盘治疗方法中有用的量存在于致敏孵育混合物中。在这个方面，致敏孵育混合物可含有至少约1ng/ml的细胞因子。特定来说，混合物可含有约1至1000ng/ml、约1至750ng/ml、约1至500ng/ml、约1至400ng/ml、约1至300ng/ml、约1至250ng/ml、约1至200ng/ml、约1至150ng/ml、约1至100ng/ml、约1至75ng/ml、约1至50ng/ml、约10至500ng/ml、约10至400ng/ml、约10至300ng/ml、约10至250ng/ml、约10至200ng/ml、约10至150ng/ml、约10至100ng/ml、约10至75ng/ml、约10至50ng/ml、约15至500ng/ml、约15至400ng/ml、约15至300ng/ml、约15至250ng/ml、约15至200ng/ml、约15至150ng/ml、约15至100ng/ml、约15至75ng/ml、约15至50ng/ml、约20至500ng/ml、约20至400ng/ml、约20至300ng/ml、约20至250ng/ml、约20至200ng/ml、约20至150ng/ml、约20至100ng/ml、约20至75ng/ml、约20至50ng/ml、约25至500ng/ml、约25至400ng/ml、约25至300ng/ml、约25至250ng/ml、约25至200ng/ml、约25至150ng/ml、约25至100ng/ml、约25至75ng/ml、约25至50ng/ml、约30至500ng/ml、约30至400ng/ml、约30至300ng/ml、约30至250ng/ml、约30至200ng/ml、约30至150ng/ml、约30至100ng/ml、约30至75ng/ml、约30至50ng/ml、约35至500ng/ml、约35至400ng/ml、约35至300ng/ml、约35至250ng/ml、约35至200ng/ml、约35至150ng/ml、约35至100ng/ml、约35至75ng/ml、约35至50ng/ml、约40至
500ng/ml、约40至400ng/ml、约40至300ng/ml、约40至250ng/ml、约40至200ng/ml、约40至150ng/ml、约40至100ng/ml、约40至75ng/ml或约40至50ng/ml。
55.实践本发明的一种方法可包括将细胞与细胞因子孵育一定时间长度来产生致敏的细胞和任选地将细胞因子与细胞分离，且将致敏的细胞注入椎间盘中或其附近的所关注部位中。替代地，可将细胞与所关注的细胞因子孵育一定时间，且可向缺陷部位施用所述组合而无需分离出细胞因子。
56.应理解，虽然在本发明的致敏细胞疗法方案中，如支架或框架以及各种外来组织的物质有可能一起移植，但在本发明的注射系统中也有可能不包含这类支架或组织。在优选的实施方案中，在本发明的体细胞疗法中，本发明涉及将致敏的结缔组织细胞群体注入椎间盘间隙中的简单方法。
57.所属领域的一般技术人员应理解，用于治疗人患者的细胞来源可以是患者自身的细胞，但是在不考虑细胞的组织相容性的情况下，也可使用同种异体细胞以及异种细胞。替代地，在本发明的一个实施方案中，可使用与哺乳动物宿主具有匹配的组织相容性的同种异体细胞。为了进一步详细描述，确定供体和患者的组织相容性，以使得向哺乳动物宿主施用组织相容的细胞。此外，也可同种异体地使用幼年软骨细胞而无需确定供体和患者的组织相容性。
58.基因递送
59.在一个方面，本发明公开用于将所关注dna序列递送到哺乳动物宿主的结缔组织细胞中的离体和体内技术。所述离体技术涉及培养目标哺乳动物细胞，将所关注的dna序列、dna载体或其它递送运载体体内转染到哺乳动物细胞中，随后将经修饰的哺乳动物细胞移植到哺乳动物宿主的目标区域中，以便影响所关注基因产物的体内表达。
60.应理解，虽然在本发明的方案中，如支架或框架以及各种外来组织的物质有可能一起移植，但优选的是，在本发明的注射系统中不包含这类支架或组织。在一个实施方案中，本发明涉及以下简单方法：将tgf超家族蛋白质或培养的未转染/未转导的结缔组织细胞或转染/转导的哺乳动物细胞群体或其混合物注入椎间盘间隙中，以使得外源tgf超家族蛋白质在间隙中表达或在其中是活性的。
61.所属领域的一般技术人员应理解，用于治疗人患者的一种细胞来源是患者自身的细胞。在不考虑细胞与寻求治疗的患者的组织相容性的情况下，另一种细胞来源包括同种异体细胞。
62.更具体来说，这种方法包括采用基因产物或其生物活性衍生物或片段，所述基因产物是转化生长因子β超家族的成员或其生物活性衍生物或片段。
63.在本发明的另一实施方案中，提供一种用于以治疗有效量向患者肠胃外施用的化合物，其含有tgf-β超家族蛋白质和适合的药物载剂。
64.本发明的另一实施方案提供一种以预防有效量向患者肠胃外施用的化合物，其包含tgf-β超家族蛋白质和适合的药物载剂。
65.在治疗应用中，tgf-β蛋白可以被配制成用于局部施用。技术和配制物一般可见于remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.最新版中。为tgf蛋白的活性成分一般与载剂组合，所述载剂如赋形剂的稀释液，取决于施用模式性质和剂型，其可包含填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、可侵蚀聚合物或润滑
剂。典型的剂型包含粉剂、包括悬浮液、乳液和溶液的液体制剂、粒剂和胶囊。
66.本发明的tgf蛋白也可与药物可接受的载剂组合以用于向受试者施用。适合的药物载剂的实例为各种阳离子脂质，包括但不限于n-(1-2,3-二油烯基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)。脂质体也是本发明的tgf蛋白分子的适合载剂。另一适合的载剂是包含tgf蛋白分子的缓释凝胶或聚合物。
67.tgfβ蛋白可与一定量的生理学上可接受的载剂或稀释剂，如盐水溶液或其它适合的液体混合。tgf蛋白分子也可与其它载剂工具组合来保护tgf蛋白和其生物活性形式免于降解直到其到达其目标和/或促进tgf蛋白或其生物活性形式移动跨过组织屏障。
68.本发明的其它实施方案包括在转移细胞之前存储细胞。所属领域的技术人员应了解，细胞可冷冻存储在液氮中的10％dmso中。
69.在本技术中，提供一种通过注射用编码转化生长因子β(tgf-β)超家族的成员，包括但不限于bmp-2和tgf-β1、2和3的基因转染或转导的适当哺乳动物细胞来延迟或预防椎间盘退变的方法。
70.在本技术的另一实施方案中，提供一种通过注射未用编码转化生长因子β(tgf-β)超家族的成员的基因转染或转导的适当结缔组织细胞来预防或延迟椎间盘退变的方法。在另一方面，本发明涉及通过使用上文描述的方法来预防或延迟椎间盘退变而治疗损伤或退变的椎间盘。
71.在本技术的另一实施方案中，提供一种通过注射用编码转化生长因子β(tgf-β)超家族的成员的基因转染或转导的适当哺乳动物细胞来预防或延迟椎间盘退变的方法。在另一方面，本发明涉及通过使用上文描述的方法来预防或延迟椎间盘退变而治疗损伤或退变的椎间盘。
72.在本发明的另一实施方案中，提供一种通过注射用编码转化生长因子β(tgf-β)超家族的成员的基因转染或转导的适当哺乳动物细胞和未用编码转化生长因子β(tgf-β)超家族的成员的基因转染或转导的适当结缔组织细胞的组合或混合物来预防或延迟椎间盘退变的方法。在另一方面，本发明涉及通过使用上文描述的方法来预防或延迟椎间盘退变而治疗损伤或退变的椎间盘。
73.在本发明的实施方案中，应理解，可将细胞注入如下区域中，在所述区域中椎间盘退变将通过使用上文描述的细胞组合物在有或没有支架物质或任何其它辅助材料，如外来细胞或其它生物相容的载剂的情况下来预防或延迟。即，可将单独的经修饰的细胞、单独的未经修饰的细胞或其混合物或组合注入如下区域中，在所述区域中椎间盘退变将被预防或延迟。
74.以下实施例以说明本发明的方式而提供，而不是以限制方式提供。
75.实施例
76.实施例i-材料和方法
77.质粒构建
78.质粒pmtmlvβ1是通过以下方式来产生：将含有tgf-β1编码序列和在3’端的生长激素poly a位点的1.2-kb bgl ii片段亚克隆到pmtmlv的bam hi位点中。pmtmlv载体是通过缺失整个gag和env序列以及ψ包装序列的一些而来源于逆转录病毒载体mfg。
79.细胞培养和转导-分别将克隆到逆转录病毒载体中的tgf-βcdna转导到293细胞中
(293-tgf-β1)。在具有10％浓度的胎牛血清的dulbecco改良的eagle培养基(gibco-brl,rockville,md)中培养这些细胞。
80.为了选择具有转导的基因序列的细胞，向培养基中添加新霉素(300μg/ml)。有时将具有tgf-β1表达的细胞存储在液氮中，且恰好在注射之前进行培养。
81.椎间盘高度的放射线照片分析
82.在穿刺后以不同的周间隔施用盐酸氯胺酮(ketamine)(25mg/kg)和rompun(1mg/kg)之后获取放射线照片。必须极其小心以维持在各动物放射线照片期间和在获得类似程度的肌肉放松的各时间时一致的麻醉水平，这可影响椎间盘高度。因此，术前放射线照片始终用作基线测量。也努力将脊柱保持在稍微弯曲的位置。为了减少脊柱的轴旋转和光束发散的误差，各动物侧卧位的放射线照片至少重复两次，其中光束集中在距兔髂嵴的4cm处。放射线照片使用图像捕捉软件进行数字扫描且数字存储。
83.图像分析
84.使用数字化的放射线照片，使用公共领域图像分析来分析测量值，包含椎骨体高度和ivd高度。将数据传输到excel软件，且使用lu等人“effects of chondroitinase abc and chymopapain on spinal motion segment biomechanics.an in vivo biomechanical,radiologic,and histologic canine study”,spine 1997；22:1828
–
34中的方法，将ivd高度表示为dhi。通过对获自ivd的前、中和后部分的测量值求平均值且将其除以相邻椎骨体高度的平均值来计算平均ivd高度(dhi)。损伤的椎间盘的dhi的变化表示为dhi百分比，且标准化为测量的术前ivd高度(dhi百分比＝术后dhi/术前dhi
×
100)。使用以下等式来计算受试者内标准差(sw)：
85.√(∑(x1–
x2)2/2n)
86.其中x1是第一测量值，x2是第二测量值，且n＝450。百分比变异系数(百分比cv)计算为(sw/所有测量的平均值
×
100)。dhi测量的观察者内误差估计为最小的(sw：0.001800316；百分比cv：3.13)。观察者间误差也报道为小的(sw：0.003227；百分比cv：9.6)
87.mri评估
88.使用具有正交末端线圈接收器的0.3-t成像器(airis ii,版本4.0a；hitachi medical system america,inc.)，对于研究中的所有兔进行mri检查。在处死之后，分离脊柱与周围软组织且对其进行mri分析。在以下情况中获得矢状面中的t2加权切片：快速自旋回波序列，其中tr(重复时间)为4000毫秒，且te(回波时间)为120毫秒；256(h)
×
128(v)矩阵；视野为260；和4个激励。切片厚度是2mm与0-mm间隙。盲目观察者使用改良的汤普森分类(thompson classification)，基于1至4级(1＝正常，2＝信号强度极小降低但高信号区域明显变窄，3＝信号强度中等降低，和4＝信号强度严重降低)的信号强度程度和区域的变化来评价mri。基于2个评价的mri分级的观察者内和观察者间可靠性相关系数非常好(k＝0.98、0.90，分别的)，如通过cohen kappa相关系数所测定。
89.实施例ii
–
实验方法和结果
90.预防损伤的椎间盘的退化
91.使用新西兰雄性白兔(new zealand white male rabbit)。使用开放手术技术。作为各动物的对照来实验性地处理或观察腰椎中的三个椎间水平：l2-3、l3-4、l4-5。以平衡的方式将处理分配到各水平，其中每只兔观察多个部位/椎间盘。在主题设计内，手术前后
比较、椎间盘水平间的变化用作对照。
92.实施例iii
93.使用单独的未转导的软骨细胞、单独的产生tgf-β1的293细胞或用混合型细胞(人软骨细胞和产生tgf-β1的293细胞)注入兔中来预防损伤的椎间盘的退变
94.实施例i-v中使用的所有软骨细胞均是非椎间盘软骨细胞且是幼年软骨细胞，其获自小于两岁儿童的手指的透明软骨部分。
95.在腰椎的椎间盘中进行针穿刺。在这个针穿刺后，注射产生tgf-β1的293细胞、原代未转导的人软骨细胞、产生tgf-β1的293细胞和原代未转导的人软骨细胞的混合物、致敏的未转导的人软骨细胞或载剂/培养基。使用数种对照。实验条件列于下表i中。
96.表i
[0097][0098][0099]
简言之，在兔或猪的腰椎椎间盘中进行针穿刺损伤。在这个针穿刺之后，使兔恢复4周。随后在第二手术程序中，注射包含产生tgf-β1的293细胞和/或原代未转导的人软骨细胞(约5
×
105)的实验处理组合物或观察到对照条件(表i)。
[0100]
在如通过施用盐酸氯胺酮和实现气管内插管和全身麻醉之后，将动物置于仰卧位。以约(5ml/kg/h)使用乳酸化的ringers。切口区域以常见的无菌方式，交替地用碘伏擦洗和酒精擦拭(》三次)来剃光且准备好以及进行遮盖。将温和的眼膏置于眼睛上。使用左腹膜后路径来暴露来自l2-l5的椎间盘的右前方(兔具有6至7个腰椎骨)。使用多种准备方案且将处理模式应用于各椎间盘水平。对于椎间盘的
‘
针穿刺’准备来说，使用18号针在椎间盘中在5mm的深度进行穿刺(aoki等人,“nerve fiber ingrowth into scar tissue formed following nucleus pulposus extrusion in the rabbit anular-puncture disc degeneration model:effects of depth of puncture.”spine.2006；31
(21):e774-80)。在穿刺之后，注射表i中所列的测试材料。将处理组合物应用于各兔的l1-2、l2-3、l3-4、l4-5区域中的任一个。
[0101]
使用每月一次放射线照片来监测任何椎间盘变化。在手术后2、8和24周处死动物。
[0102]
放射线照片/mri。通过与在其它椎间盘水平处的椎间盘比较，相对于在基线(手术前)处的相同椎间盘的椎间盘高度增加的可检测的放射线照片变化指示治愈。其它椎间盘仅比较针穿刺前后，且无针穿刺前后的椎间盘随着时间推移产生正常退变指数。
[0103]
逆转录pcr。进行逆转录pcr以测定存活的转染的软骨细胞的相对数量。
[0104]
组织学。还使用组织学来确认i型和ii型胶原的特征以及重新软骨细胞的总体外观和评价。
[0105]
蛋白质印迹分析和或elisa。i型和ii型胶原的定量表达，和蛋白聚糖浓度、smad 2/3、sox-9。此外，使用elisa来评价tgfβ-1、bmp2、bmp7、gdf5和其中存在可用抗体的其它相关生长因子。
[0106]
通过观察capase-3的表达来检查椎间盘的其它组织结构中的细胞凋亡。
[0107]
实施例iv
[0108]
结果
[0109]
结果显示于各图和本技术的图的描述中。用单独的未转导的软骨细胞、单独的转导的293细胞、单独的致敏的软骨细胞或转导的293细胞和未转导的软骨细胞的混合物治疗的已穿刺椎间盘显示，相较于媒介物对照，在预防或延迟椎间盘退变方面具有有益效果。
[0110]
实施例iv-1-兔中已穿刺的椎间盘的混合型细胞(转导的293细胞和未转导的软骨细胞)治疗
[0111]
混合型细胞治疗在对兔进行测试时具有椎间抗退变效果。所述效果见于图1-4中的多个实验中。图1a-1f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处未看见穿刺和治疗，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0112]
图2a-2f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱
位置l2/3处未看见穿刺和治疗，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0113]
图3a-3d显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0114]
实施例iv-2-兔中已穿刺的椎间盘的转导的293细胞治疗
[0115]
产生tgf-β1的293细胞治疗具有椎间抗退变效果。所述效果见于图4a-4d中，其显示减缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0116]
实施例iv-3-兔中已穿刺的椎间盘的转导的293细胞治疗和混合型细胞治疗
[0117]
产生tgf-β1的293细胞治疗和混合型细胞治疗具有椎间抗退变效果。所述效果见于图5a-5d中，其显示减缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且以1:3比率注入产生tgf-β1的293细胞和未转导的人软骨细胞的混合物，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入产生tgf-β1的293细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0118]
实施例iv-4-兔中已穿刺椎间盘的未转导的软骨细胞治疗
[0119]
未转导的软骨细胞治疗具有椎间抗退变效果。所述效果见于图6-8中的多个实验中。图6a-6d显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的
椎间盘高度指数。
[0120]
图7a-7f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l1/2处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l2/3处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l3/4处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向l1/2和l3/4椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0121]
图8a-8f显示延缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后四(4)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在t12/l1处的椎间盘已被针穿刺损伤且无注入，(ii)在脊柱位置l1/2处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l2/3处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向t12/l1和l2/3椎间盘区域。(c)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在t12/l1处的椎间盘已被针穿刺损伤且无注入，(ii)在脊柱位置l1/2处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l2/3处的椎间盘已损伤且注入未转导的软骨细胞；箭头指向t12/l1和l2/3椎间盘区域。(d)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(e)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。(f)显示上文(c)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0122]
实施例iv-5-兔中已穿刺椎间盘的未转导的致敏的软骨细胞治疗
[0123]
致敏的软骨细胞治疗具有椎间抗退变效果。所述效果见于图9a-9d中，其显示减缓、延迟或预防损伤的椎间盘的退变。(a)显示手术前的兔脊柱的mri放射线照片；(b)显示在手术后八(8)周的兔脊柱的mri放射线照片，其中(i)在l2/3处的椎间盘已损伤且注入细胞培养基dmem，(ii)在脊柱位置l3/4处无穿刺和治疗控制，和(iii)在l4/5处的椎间盘已损伤且注入致敏的软骨细胞；箭头指向l2/3和l4/5椎间盘区域。(c)显示上文(a)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数以测量其形态、其退变或再生水平。(d)显示上文(b)中所描述的兔的x射线照片，其用于获得椎间盘的椎间盘高度指数。
[0124]
实施例v
[0125]
人软骨细胞的来源
[0126]
致敏的人软骨细胞由获自一岁女性人供体的多指手术切除的软骨组织生长而来。在手术室中收集多指组织。在生物安全柜中进行以下的软骨分离程序。用酒精擦拭含有软骨组织的塑料瓶，且使用移液管用无菌pbs(1x)洗涤软骨组织。通过将7mg的胶原酶(gibco brl)溶解于10ml dmem(含有10％fbs)中且通过0.2μm注射器过滤器(corning)过滤，来制备胶原酶溶液。将经洗涤的软骨组织在37℃振荡培育箱中用胶原酶溶液处理17至18小时。在第二天，用酒精将瓶子消毒。将胶原酶处理的材料上下吸移数次以将松散的细胞与组织块分离。在吸移之后，通过70μm尼龙细胞滤网(falcon)过滤上清液。已丧失完整性的胶原酶处理的组织(例如松散的细胞)能够通过过滤器。将细胞滤液收集于50ml管(falcon)中，且随
后以1,500rpm离心5分钟。丢弃三分之二的上清液，且用10ml无菌pbs(1x)洗涤沉淀(pellet)。以1,500rpm再次离心重悬浮的细胞5分钟，且在去除三分之二的上清液之后，用10ml无菌pbs(1x)洗涤。以1,500rpm再次离心细胞5分钟，且随后重悬浮于dmem(含有10％fbs)中。随后，将重悬浮的细胞转移到四个未涂覆的25cm2烧瓶中，且在37℃与5％co2下培养四天。随后，将细胞转移到两个未涂覆的185cm2烧瓶中。培养细胞两周，且随后收集、洗涤且重悬浮于具有5:4:1比率的dmem、fbs和dmso的冷冻保存培养基中。将细胞等分到含有在4
×
105个细胞/毫升的1ml细胞悬浮液的冷冻小瓶中。将细胞保持在气相液氮存储中。