一种检测银杏叶提取物中20种重要活性成分的方法与流程

1.本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种采用液相色谱质谱联用技术对银杏叶提取物中20种重要活性成分进行定量分析的方法。


背景技术：

2.我国银杏资源占世界的70％以上，是银杏叶的主产地。银杏叶提取物被广泛应用于保健食品、化妆品和药品等领域。其保健功能主要有辅助降血脂、辅助降血压、增强免疫力、辅助保护肝损伤、提高缺氧耐受力、抗氧化、保护胃黏膜、改善记忆力等。银杏叶的功效组分研究主要集中在黄酮及其苷类、双黄酮类和萜内酯类的研究上，其它成分如有机酸、黄烷醇类等在保健功效上都有很强活性，且功效组分间存在协同增效作用。
3.目前对银杏叶提取物中功效成分含量检测多采用hplc、hplc-rid、hplc-elsd等方法，但上述方法有一定的缺陷，分析时间较长，稳定性差，灵敏度较低，且只能借助标准物质来定性分析，严重滞后于研究需求及生产实践。uplc-ms/ms法可以同时用于定量检测和利用谱图匹配进行定性分析，其灵敏度高，专属性强，可靠性高，已经在某些研究中得到了一定范围的应用，但这些研究往往仅针对银杏叶片中的某几种重要活性成分或者某一类物质，缺乏更为全面的活性物质检测。因此，目前的基础研究及生产实践都亟需建立银杏叶中各类活性物质同时定量定性的分析方法。


技术实现要素：

4.本发明针对现有方法的不足以及生产实践的需要，采用液相色谱-质谱联用技术手段，开发出一种具备准确且能够同时检测银杏叶片中20种化合物的方法，该20种化合物覆盖银杏叶片中最重要的5类活性成分，其中包括6种黄酮及其苷类化合物，4种双黄酮类化合物，5种萜内酯类化合物，2种有机酸类化合物，3种黄烷醇类化合物，该方法具有高精度、前处理简单、灵敏度高等优点。
5.本发明采用的技术路线如下：
6.一种检测银杏叶提取物中20种重要活性成分的方法，其先对银杏叶进行浸提提取，收集提取液，并对提取液进行液相色谱质谱联用检测，然后提取质谱数据信息与公共数据库中数据信息进行比对鉴定，并进行分析计算，从而准确定量地分析出银杏叶提取物中的20种有效成分。
7.根据以上方案，所述的对银杏叶进行浸提提取是指：对新鲜采摘的银杏叶进行液氮研磨成粉末，称取银杏叶粉末并加入70％甲醇水溶液，涡旋混匀，60℃下超声波水浴浸提，浸提结束后在4℃下，14000g离心，取离心后的上清液于进样瓶中，待测。
8.根据以上方案，所述的液相色谱质谱联用检测中，质谱条件如下：
9.esi离子源，负离子模式：喷雾电压(spray voltage):-3000；shealth gas:45；辅助气(aux gas):20；毛细管温度(capillary temperature):320；探头加热器温度(probe heater temp):370，采用dda模式检测，扫描范围(scan range):90～1300m/z，全ms分辨率
(full ms resolution):60000；dd-ms2分辨率(dd-ms2 resolution):15000，topn:10。
10.根据以上方案，所述的液相色谱质谱联用检测中，液相色谱条件如下：
11.vanquish flex uhplc超高效液相色谱仪；acquity uplc hss t3色谱柱，1.8μm,2.1mm
×
100mm；柱温40℃；流速为400μl/min；进样量2μl；
12.流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％乙腈溶液；
13.液相梯度：流动相a 流动相b＝100％；0-3min，b液从5％线性变化到20％；3-4.3min，b液维持在20％；4.3-9min，b液从20％线性变化到45％；9-11min，b液从45％线性变化到98％；11-15min，b液维持在98％；15-15.1min，b液从98％线性变化到5％；15.1-18min，b液维持在5％。
14.根据以上方案，所述的提取质谱数据信息是指采用thermo xcalibur 3.1.66.10软件提取ms2谱图信息。
15.根据以上方案，所述的进行分析计算是指用xcms软件来进行峰识别与定量积分计算。
16.根据以上方案，所述的20种有效成分是指：芦丁、芹菜素、山柰酚、3-o-β-d吡喃葡糖基异鼠李素、apigenin 7-o-beta-d-glucoside、吡喃鼠李糖-槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏素、银杏素、金松双黄酮、银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯j、白果内酯、银杏内酯c、咖啡因、奎尼酸、表没食子儿茶素、表儿茶素和儿茶素。
附图说明
17.图1为银杏叶提取物ms检测结果的bpc图谱。
18.图2为芦丁在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
19.图3为芹菜素在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
20.图4为山柰酚在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
21.图5为3-o-β-d吡喃葡糖基异鼠李素在mona数据库中的二级谱图比对结果图。
22.图6为apigenin 7-o-beta-d-glucoside在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
23.图7为吡喃鼠李糖-槲皮素在mona数据库中的二级谱图比对结果图。
24.图8为穗花杉双黄酮在massbank数据库中的二级谱图比对结果图。
25.图9为异银杏素在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
26.图10为银杏素在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
27.图11为金松双黄酮在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
28.图12为银杏内酯a在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
29.图13为银杏内酯b在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
30.图14为银杏内酯j在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
31.图15为白果内酯在respect数据库中的二级谱图比对结果图。
32.图16为银杏内酯c在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
33.图17为咖啡因在mona数据库中的二级谱图比对结果图。
34.图18为奎尼酸在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
35.图19为表没食子儿茶素在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
36.图20为表儿茶素在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
37.图21为儿茶素在otcml数据库中的二级谱图比对结果图。
38.附图均为检测分析结果图，为实施例中的结果展示，图中文字均为结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
39.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步阐述，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
40.主要实验仪器与试剂：
41.实验仪器：
42.vanquish flex uhplc超高效液相色谱仪(thermo scientific)；q-exactive hf-x系列质谱仪(thermo scientific)；色谱柱为waters hss t3，型号为2.1
×
100mm，1.8μm，货号186003539；低温高速离心机(eppendorf 5430r)。
43.实验所用试剂列表：
[0044][0045][0046]
一种检测银杏叶提取物中20种重要活性成分的方法，其先对银杏叶进行浸提提取，收集提取液，并对提取液进行液相色谱质谱联用检测，然后提取质谱数据信息与公共数据库中数据信息进行比对鉴定，并进行分析计算，从而准确定量地分析出银杏叶提取物中的20种有效成分，具体包括以下步骤：
[0047]
步骤s1，样品制备：采摘新鲜银杏叶片，使用液氮配合将银杏叶研磨成粉末，准确称取100mg银杏叶片粉末，加入1800μl 70％的甲醇水，涡旋混匀，60℃下超声波水浴浸提1.5小时，浸提结束后在4℃下，14000g离心20min，取离心后的上清溶液于液相进样瓶内，待测。
[0048]
步骤s2，液相色谱分离：
[0049]
acquity uplc hss t3色谱柱(1.8μm,2.1mm
×
100mm，waters，usa)样本置于4℃自动进样器中，柱温40℃，流速为400μl/min，进样量2μl。
[0050]
流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％乙腈溶液；
[0051]
液相梯度如下：(流动相a 流动相b＝100％)
[0052]
0～3min，流动相b从5％线性变化到20％；
[0053]
3～4.3min，流动相b维持在20％；
[0054]
4.3～9min，流动相b从20％线性变化到45％；
[0055]
9～11min，流动相b从45％线性变化到98％；
[0056]
11～15min，流动相b维持在98％；
[0057]
15～15.1min，流动相b从98％线性变化到5％；
[0058]
15.1～18min，流动相b维持在5％。
[0059]
步骤s3，质谱检测：
[0060]
esi离子源，负离子模式：喷雾电压(spray voltage):-3000；shealth gas:45；辅助气(aux gas):20；毛细管温度(capillary temperature):320；探头加热器温度(probe heater temp):370，采用dda模式检测，扫描范围(scan range):90～1300m/z，全ms分辨率(full ms resolution):60000；dd-ms2分辨率(dd-ms2 resolution):15000，topn:10。
[0061]
步骤s4，将质谱数据采用thermo xcalibur 3.1.66.10软件提取ms2谱图信息用于在公共数据库中进行比对鉴定，并用xcms软件来进行峰识别与定量积分。
[0062]
步骤s5，在各个公共数据库中进行谱图比对的方式进行鉴定，一共准确鉴定到了20种银杏叶提取物中的重要活性物质。
[0063]
步骤s6，计算20种银杏叶提取物中的重要活性物质的相对含量。
[0064]
实验结果：
[0065]
银杏叶片负离子模式下的bpc图谱：
[0066]
如图1所示，是本实施例的检测结果的质谱bpc谱图，时间梯度为18min，色谱峰型分离度较好，基线正常，质谱响应较好。
[0067]
银杏叶片提取物中5类活性成分共20个化合物的谱图匹配结果：
[0068]
将本实施例检测结果的质谱图在otcml、respect、mona和massbank 4个公共数据库中进行检索，20个化合物均能正确匹配，且相似度得分(similarity score)均大于0.7，鉴定结果可靠，具体每种化合物的质谱图匹配结果见图2～21。
[0069]
银杏叶提取物中20种化合物的相对定量结果：
[0070][0071][0072]
检测结果表明，银杏叶提取物中的20种活性成分在质谱中的响应良好，峰面积积分值均大于5e7，表明该实验方法提取物质全面，色谱分离良好，灵敏度高，方法稳定可靠。
[0073]
本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。