一种新型冠状病毒IgG抗体水平检测试剂盒的制作方法

一种新型冠状病毒igg抗体水平检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，涉及一种新型冠状病毒igg抗体水平检测试剂盒，特别涉及一种新型冠状病毒igg抗体水平检测试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)常见体征有发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，而部分患者症状轻微，甚至存在无临床症状的患者，具备人传人的特点，一般潜伏期1-14天，且潜伏期具有传染性，而无症状感染者也可能成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。新冠病毒疫情目前致死率2％左右，无症状感染者40-45％左右，病毒流行率高，传播快，防控难度大，由新冠病毒流行引发的疫情已严重影响到各行各业。面对流行范围大、传播率高的新冠病毒，有效的疫苗接种是防疫的关键方法。
3.目前，常见的新冠病毒抗体的检测试剂盒采用全病毒包被，特异性较弱，假阳性概率较高，因此，想要提供一种特异性强、灵敏度高的新型冠状病毒igg抗体水平检测试剂盒。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供一种新型冠状病毒igg抗体水平检测试剂盒和检测方法，本发明提供的试剂盒对实验环境要求低，检测效率高，特异性强，灵敏度高，能够代替中和抗体检测。
5.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒igg抗体水平检测试剂盒，所述试剂盒的组成成分包括包被有重组rbd蛋白的酶标板。
7.本发明提供的试剂盒采用重组rbd蛋白作为包被物，rbd蛋白作为产生中和抗体的特异区域，可以使本发明提供的检测试剂盒所检测的igg抗体与中和抗体具有较好的相关性，能作为中和抗体的替代手段，并且可以大大提高检测时效。
8.同时，相较于全病毒包被，重组rbd蛋白的特异性更强，且实验背景干净，可降低实验的假阳性概率，获得更加准确的抗体效价结果。
9.作为本发明的一种优选技术方案，所述重组rbd蛋白的制备方法包括：
10.(a)构建含有rbd蛋白基因序列的质粒；
11.(b)将步骤(a)得到的质粒使用293f细胞进行蛋白表达，然后进行纯化，得到所述重组rbd蛋白。
12.本发明所述的rbd蛋白基因在gen bank里的编号是qhd43416.1。
13.作为本发明的一种优选技术方案，所述包被有重组rbd蛋白的酶标板的制备方法包括：
14.(a)将重组rbd蛋白与包被液混匀置于酶标板的孔中进行孵育，然后洗板；
15.(b)步骤(a)得到的酶标板各孔利用封闭液进行封闭，然后洗板、干燥，得到所述包被有重组rbd蛋白的酶标板。
16.作为本发明的一种优选技术方案，所述包被液为0.01m的磷酸缓冲盐溶液。
17.作为本发明的一种优选技术方案，所述封闭液为含10％小牛血清或含10％牛血清白蛋白的0.01m的磷酸缓冲盐溶液。
18.作为本发明的一种优选技术方案，所述洗板使用的洗液为含吐温20的磷酸缓冲盐溶液。
19.作为本发明的一种优选技术方案，所述重组rbd蛋白与包被液混匀后的溶液浓度为0.5-2μg/ml，例如0.6μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml、1.2μg/ml、1.5μg/ml、1.8μg/ml等。
20.作为本发明的一种具体实施方式，本发明的包被有重组rbd蛋白的酶标板的制备方法包括：
21.(a)将重组rbd蛋白与0.01m pbs按照0.5-2μg/ml的终浓度进行稀释，混匀后加入96孔酶标板，100μl/孔，2-8℃孵育16-20h或者37℃孵育3h，利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板三次，拍干；
22.(b)步骤(a)得到的酶标板各孔利用含10％小牛血清的0.01m的磷酸缓冲盐溶液37℃封闭1-3h，然后利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板三次，拍干，得到所述包被有重组rbd蛋白的酶标板。
23.作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒还包括羊抗人igg的hrp标记抗体、酶稀释剂、阴性对照、样品稀释剂、显色液和终止液。
24.作为本发明的一种优选技术方案，所述酶稀释剂为含小牛血清与酪蛋白的洗液。
25.作为本发明的一种优选技术方案，所述阴性对照为样品稀释液。
26.作为本发明的一种优选技术方案，所述样品稀释剂为含小牛血清或含牛血清白蛋白的0.01m的磷酸缓冲盐溶液。
27.作为本发明的一种优选技术方案，所述终止液为2m的硫酸溶液。
28.作为本发明的一种具体实施方式，本发明所述的试剂盒包括如下组分：
29.i.包被有重组rbd蛋白的酶标板，规格96孔板；
30.ii.羊抗人igg的hrp标记抗体，；
31.iii.酶稀释剂：含10％小牛血清与1％酪蛋白的洗液；
32.iv.阴性对照：样品稀释液；
33.v.样品稀释剂：含10％小牛血清或含10％牛血清白蛋白的0.01m的磷酸缓冲盐溶液；
34.vi.显色液：市售a/b液；
35.vii.终止液：2m的硫酸溶液。
36.第二方面，本发明提供了一种新型冠状病毒igg抗体水平检测方法，所述检测方法包括：
37.(1)制备包被有重组rbd蛋白的酶标板；
38.(2)将待检样品稀释，然后置于步骤(1)得到的酶标板各孔中进行孵育；
39.(3)步骤(2)得到的酶标板各孔中加入羊抗人igg的hrp标记抗体进行孵育；
40.(4)步骤(3)得到的酶标板各孔中加入显色液进行显色，然后加入终止液终止反应；
41.(5)利用酶标仪测定酶标板各孔在波长450nm处的od值(630nm为参比波长)。
42.作为本发明的一种具体实施方式，本发明所述检测方法包括如下步骤：
43.(1)将重组rbd蛋白与0.01m pbs按照0.5-2μg/ml的终浓度进行稀释，混匀后加入96孔酶标板，100μl/孔，2-8℃孵育16-20h或者37℃孵育3h，利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板三次，拍干；
44.(2)步骤(1)得到的酶标板各孔利用含10％小牛血清的0.01m的磷酸缓冲盐溶液37℃封闭1-3h，然后利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板三次，拍干，得到所述包被有重组rbd蛋白的酶标板。
45.(3)将待检血清利用样品稀释液进行稀释，新型冠状病毒疫苗免疫前血清按照1:40、1:80、1:160稀释，免疫后血清按照1:160、1：320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120等6-8个梯度稀释，然后置于包被有重组rbd蛋白的酶标板的各孔中进行37℃孵育0.5-2h，然后利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板3次，拍干；
46.(4)步骤(3)得到的酶标板各孔中加入羊抗人igg的hrp标记抗体稀释液进行孵育0.5-2h，然后利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板5次，拍干；
47.(5)步骤(4)得到的酶标板各孔中加入显色液a、b液各50μl，室温显色15min，然后加入终止液50μl终止反应；
48.(6)利用酶标仪测定酶标板各孔在波长450nm处的od值，630nm作为参比。
49.在测试od值结果中，阴性对照孔(样品稀释液)od值不高于0.05，按照阴性对照孔od值的2.1倍作为cutoff值，单个稀释倍数阳性的判定标准为od值≥0.105，待检样品的效价为达到阳转的最高稀释倍数。
50.新型冠状病毒由四种蛋白组成：刺突蛋白s、膜蛋白m、包膜蛋白e与核衣壳蛋白n组成，其中刺突蛋白s中包含的受体结合域(receptor binding domain,rbd)是与靶向细胞结合的关键位点。
51.疫苗接种作为防疫的关键手段之一，其有效性的评价指标为抗体水平，常见的sars-cov-2抗体检测方法有胶体金法、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)、化学发光免疫分析法(chemiluminescent immunoassays,clia)、中和效价检测等。中和抗体效价为常见的病毒性疫苗的评价指标，新冠病毒具有高致病性、高传染性的特点，其相关的中和抗体检测需要在p3级以上实验室采用活毒进行，这对检测环境、实验人员操作具有较高要求，检测条件的高要求对临床血清的评价存在一定的限制。相对于胶体金法，elisa法可以定量检测。相对于clia方法，elisa成本较低，无需专门的化学发光检测仪器。相比于中和效价而言，elisa抗体的检测无需接触活毒，无需p3实验室，实验条件容易实现。此外，中和效价检测的周期为4-7天，elisa抗体检测周期为3-5小时。
52.本发明所述的试剂盒采用重组新冠病毒rbd蛋白作为包被物来检测igg抗体，且本发明发现所检测到的igg抗体与全病毒疫苗免疫所产生的中和抗体具有较好的相关性，能作为中和抗体的替代手段，并大大提高了检测时效。本发明提供的检测方法中采用的包被物重组rbd蛋白，其特异性更强，且实验背景干净，可降低实验的假阳性概率，获得更加准确的抗体效价结果。而且，本发明采用一步间接法，方法简单、快速。
具体实施方式
53.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明
了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
54.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
55.本发明下述实施例中采用的原料来源如下：
56.重组rbd蛋白由北京科兴中维生物技术有限公司(以下简称“科兴中维”)提供，制备方法见实施例1；
57.实验用试剂由科兴中维实验室配制，包被液为0.01m的磷酸缓冲盐溶液，样品稀释剂和封闭液为含有10％小牛血清的0.01m的硫酸缓冲盐溶液，洗液为pbst
20
，终止液为2m的硫酸溶液，酶稀释剂为含10％小牛血清与1％酪蛋白的洗液；
58.显色液为市售a/b液，购自勤邦生物科技有限公司；
59.96孔酶标板购自深圳金灿华实业有限公司；
60.小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；
61.羊抗人igg的hrp二抗购自sino biological inc(lot：ssa002，ho13ap1001)；
62.所测血清来自科兴中维生产的新型冠状病毒灭活疫苗(vero细胞)免疫的志愿者。
63.实施例1.
64.本实施例提供了一种重组rbd蛋白的制备方法，如下：
65.(a)构建含有rbd蛋白基因序列的质粒；
66.(b)将步骤(a)得到的质粒使用293f细胞进行蛋白表达，培养3-5天后，采用亲和层析进行纯化，得到所述重组rbd蛋白。
67.实施例2.
68.本实施例采用了实施例1中制备的重组rbd蛋白，来检测样品中的新型冠状病毒igg抗体水平，方法如下：
69.(1)将重组rbd蛋白与0.01m pbs按照1μg/ml的终浓度进行稀释，混匀后加入96孔酶标板，100μl/孔，5℃孵育18h利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板三次，拍干；
70.(2)步骤(1)得到的酶标板各孔利用含10％小牛血清的0.01m的磷酸缓冲盐溶液37℃封闭2h，然后利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板三次，拍干，得到所述包被有重组rbd蛋白的酶标板。
71.(3)将待检血清利用样品稀释液进行稀释，新型冠状病毒疫苗免疫前血清按照1:40、1:80、1:160稀释，免疫后血清按照1:160、1：320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120梯度稀释，置于包被有重组rbd蛋白的酶标板的各孔中进行37℃孵育1h，然后利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板3次，拍干；
72.(4)步骤(3)得到的酶标板各孔中加入羊抗人igg的hrp标记抗体稀释液进行孵育1h，然后利用含吐温20的磷酸缓冲盐溶液洗板5次，拍干；
73.(5)步骤(4)得到的酶标板各孔中加入显色液a、b液各50μl，室温显色15min，然后加入终止液50μl终止反应；
74.(6)利用酶标仪测定酶标板各孔在波长450nm处的od值，630nm作为参比。
75.在测试od值结果中，阴性对照孔(样品稀释液)od值不高于0.05，按照阴性对照孔od值的2.1倍作为cutoff值，单个稀释倍数阳性的判定标准为od值≥0.105，待检样品的效价为达到阳转的最高稀释倍数。
76.采用实施例2提供的检测方法检测10名志愿者新冠疫苗免疫前后的血清rbd igg抗体效价，结果分别见表1和表2：
77.表1
[0078][0079]
表2
[0080][0081]
[0082]
由表1和表2可知，采用本发明所建立的方法，可检测新冠疫苗免疫前及免疫后血清的igg抗体效价，免疫后血清效价与免疫前相比较，出现4倍增长，即为阳转。免疫前血清的igg抗体效价为小于40，故免疫后血清的igg效价大于等于160为阳转。
[0083]
对比例1
[0084]
本对比例提供了一种利用病毒悬液检测中和抗体的方法，如下：
[0085]
从疫苗免疫志愿者采集的血清样品在56℃下灭活0.5h，用细胞培养基分两步连续稀释血清样品。将稀释后的血清与100ccid
50
的病毒悬液在96孔板中以1:1的比例混合，在36.5℃的5％co2培养箱中孵育2小时。将(1-2)
×
104个vero细胞加入血清病毒混合物中，在5％co2培养箱中，36.5℃下孵育5天。显微镜下记录样品的细胞病变效应，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。
[0086]
对新冠疫苗免疫前后的血清分别采用实施例2和对比例1提供的方法进行检测，比较两种方法的特异性和灵敏度。
[0087]
其中，测试30位志愿者血清，在30位新冠疫苗志愿者血清中，有10人安慰剂组，20人为疫苗组。
[0088]
采用实施例2和对比例1的方法，检测到的免疫前后中和抗体与rbd igg抗体的效价分别见表3和表4；
[0089]
表3
[0090]
[0091][0092]
表4
[0093]
[0094][0095]
由表3和表4统计一面组不同时间点的中和抗体与igg抗体的阳转率，结果见表5；
[0096]
表5
[0097][0098][0099]
由表3-5可知，30人新冠疫苗志愿者血清中，共有10人安慰剂组，20人为疫苗组，安
慰剂组中和抗体与igg抗体均为阴性；疫苗组免疫前血清，中和抗体与igg抗体均为阴性，本发明提供的检测方法特异性为100％。从疫苗免疫后两种抗体阳转的样本来看，本发明提供的检测方法在0天免疫28天的灵敏度为56％，0,28天免疫第35天采血的灵敏度为85％，0,28天免疫第42天与第56天的灵敏度均为100％。
[0100]
统计疫苗免疫前与免疫后各时间点中和抗体与igg抗体的阳转率，各时间点两种抗体的阳转率均较为一致，相差均在10％以内，表明本发明提供的检测方法与中和抗体检测方法吻合较好，能够替代中和抗体检测，作为一种高效率的新冠疫苗抗体评价方法。
[0101]
依据实施例2提供的方法，将包被有重组rbd蛋白的酶标板封闭干燥后作成干板，试剂分装为独立的试剂检测盒，对比研究检测方法和试剂盒的差异性，见实施例3.
[0102]
实施例3.本发明的重组rbd蛋白制备的湿板和干板检测试剂盒的比较
[0103]
本实施例采用了实施例2制备的重组rbd蛋白制作了新型冠状病毒igg抗体水平检测试剂盒，由如下组分组成：
[0104]
i.包被有重组rbd蛋白的酶标板(实施例2步骤(2)得到的酶标板)，规格96孔板；
[0105]
ii.羊抗人hrp标记抗体；
[0106]
iii.酶稀释液：含10％小牛血清与1％酪蛋白的洗液；
[0107]
iv.阴性对照：样品稀释液；
[0108]
v.样品稀释剂：含10％小牛血清或含10％牛血清白蛋白的0.01m的磷酸缓冲盐溶液；
[0109]
vi.显色液：市售a/b液；
[0110]
vii.终止液：2m的硫酸溶液。
[0111]
测试结果见表6；
[0112]
表6
[0113]
[0114]
由表6可知，本发明所述的方法制备成检测试剂盒(干板)后，依旧不影响检测的灵敏度，实施例2和实施例3的检测结果完全一致。
[0115]
由实施例和性能测试结果可知，本发明提供的检测方法和检测试剂盒耗时短，3-4小时出结果，对实验环境要求低，可在开放实验室操作，对人员的操作培训简单。
[0116]
采用本发明所述的检测方法和试剂盒检测新冠病毒rbd igg抗体，抗体阳转率与中和抗体阳转率接近，方法特异性达到100％，疫苗免疫2周后血清检测的灵敏度为100％。
[0117]
本发明的检测方法和检测试剂盒能够高效率地应用于新冠疫苗免疫后血清抗体的评价，同时可应用于临床上新冠病毒感染后血清学的筛查。
[0118]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。