透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法及系统与流程

1.本公开属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法及系统。


背景技术：

2.本部分的陈述仅仅是提供了与本公开相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。
3.受激辐射损耗(stimulated emission depletion,sted)显微镜具有超分辨率成像能力，能够将视野扩展到纳米量级，突破衍射极限对光学显微镜的分辨率的限制，实现超分辨显微成像，在生物成像中得到广泛的应用。
4.与共聚焦成像技术相比，sted显微成像技术利用一对在空间和时间上重叠的焦点构成激光照明光束，这个巧妙设计是实现超分辨成像的关键。其中，一个焦点是作为激发光束的高斯聚焦点，用来实现荧光分子的激发；另一个焦点是面包圈光束，它被称为sted光束，用于受激辐射耗尽荧光。尽管这两种激光焦点是衍射受限的，但是将后者从前者中减去就会产生一个亚衍射的荧光焦点，用这个点在样品上扫描就能得到亚衍射级的图像。因此，要实现sted成像的首要的条件是生成其所需的照明光束。自从sted显微镜被发明以来，它通常被用来对生物体外折射率分布均匀环境中的样品进行超分辨成像，由于动物活体内部环境复杂，体外的实验不能确切地模拟体内的环境。然而当要实现对动物活体内部的sted成像时，由于像生物组织这样的强散射介质会扰乱入射光束的波前，从而抑制激发焦点和sted焦点的形成，进而使得sted成像无法进行。当sted成像中所需的结构照明光束通过强散射介质(如生物组织)时，光在介质中发生的多重散射会撕碎结构照明光束的波前，从而抑制sted成像。
5.目前，透过非均匀介质实现sted成像已经取得了许多成果。对于对光扰动比较弱的标本，如视网膜切片或果蝇大脑，波前受到的扰动较小，一般发生倾斜、离焦等，这些因素只会对聚焦点的形成引入很小的偏移。在这些情况中，运用自适应光学中泽尼克多项式修正的方法，可以实现对sted显微镜中两个聚焦点的像差校正。为了增加sted的成像深度，一方面，可把双光子激发技术引入到sted显微镜，因为这些实验中使用的光子具有较长的波长，通常在近红外波段，这个波段的光子可以穿透更深的散射组织。另一方面，也可以使用具有自修复能力的光针用于荧光的激发和损耗。然而,当想把sted成像应用于强散射介质后面或者内部时，例如：厚的生物组织，上述方法都会失效。在强散射介质条件下，多重散射将会扰乱入射的激发光束和sted光束的波前，产生随机的强度散斑图。事实上，多重散射可以看作是一个线性的和确定性的过程，其中输入场和散射场可以通过传输矩阵(transmission matrix，tm)相互关联。基于传输矩阵，人们已经提出了很多种透过强散射介质实现波前调制的技术。这些技术为深度组织中的显微成像铺平了道路。然而，在强散射介质后生成sted成像中所需的照明光束还没有被研究。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本公开提出了一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法及系统，基于双波长传输矩阵，使得激发光和损耗光通过强散射介质后同时生成在时间和空间上均重叠的激发光束和损耗光束，实现光束的快速扫描。
7.根据一些实施例，本公开的第一方案提供了一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法，采用如下技术方案：
8.一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法，包括以下步骤：
9.获取激发光束和损耗光束；
10.根据所获取的激发光束和损耗光束以及传输矩阵，得到整形后的激发光束和损耗光束的组合波前；
11.根据整形后的组合波前和强散射介质，生成光束；
12.所述整形后的激发光束和损耗光束的组合波前，使用了传输矩阵和复用计算全息技术，实现激发光束和损耗光束在时间和空间上的重叠。
13.作为进一步的技术限定，在获取激发光束和损耗光束之后，需要进行激发光束传输矩阵和损耗光束传输矩阵的校准。
14.进一步的，所述激发光束传输矩阵和损耗光束传输矩阵之间完全不相关，两个传输矩阵可被单独测量。
15.进一步的，对测量后的激发光束传输矩阵进行光学相位共轭操作，得到共轭波前，根据得到的共轭波前在输出平面上形成所需的激发焦点。
16.进一步的，对测量后的损耗光束进行点扩散函数调制，得到呈点扩散分布的损耗焦点。
17.进一步的，利用空间光调制器加载复用计算全息图，对激发光束和损耗光束同时进行波前整形，将整形后的组合波前入射到强散射介质上，构建出重叠焦点，生成光束。
18.根据一些实施例，本公开的第二方案提供了一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成系统，采用如下技术方案：
19.一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成系统，包括：
20.激光器，用于获取激发光束和损耗光束；
21.光束处理模块，基于传输矩阵和复用计算全息技术，将激发光束的焦点和损耗光束的焦点调整到时间和空间上的重叠，对激光光束和损耗光束进行波前整形，得到整形后的激发光束和损耗光束的组合波前；
22.光束生成模块，将整形后的组合波前透过强散射介质生成光束。
23.作为进一步的技术限定，所述激光器和光束处理模块之间依次设置有分束器和扩束器；所述激发光束和损耗光束均采用连续光源。
24.作为进一步的技术限定，所述光束处理模块采用数字微镜器件，包括光束校准模块、光束空间处理单元和光束时间处理单元。
25.进一步的，所述光束校准模块将所获取的激发光束进行传输矩阵的光学相位共轭操作得到激发聚焦光束，将所获取的损耗光束进行传输矩阵的点扩散函数调制得到损耗聚焦光束。
26.与现有技术相比，本公开的有益效果为：
27.本公开利用复用全息技术，构建了用于2d sted和3d sted显微镜中具有精细结构的重叠焦点。此外，在无机械运动的情况下，基于数字微镜器件的快速切换能力，能快速实现对照明光束的快速扫描，为强散射介质(如厚的生物组织)后的sted成像开辟道路。
附图说明
28.构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
29.图1是本公开实施例一中透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法的流程图；
30.图2(a)是本公开实施例一中强散射介质扰乱激发和sted光束的波前图；
31.图2(b)是本公开实施例一中基于双波长传输矩阵透过强散射介质进行波前调制的过程图；
32.图2(c)是本公开实施例一中复用全息技术透过强散射介质生成重叠的焦点图；
33.图3是本公开实施例一中透过zno散射层生成2d sted成像的照明光束图；
34.图4是本公开实施例一中透过zno散射层生成3d sted成像的照明光束图；
35.图5是本公开实施例二中透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成系统的结构框图；
36.图6是本公开实施例二中透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成系统的实验设计图。
具体实施方式：
37.下面结合附图与实施例对本公开作进一步说明。
38.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
39.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
40.在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
41.实施例一
42.本公开实施例一介绍了一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法。
43.本实施例介绍了一种透过强散射介质构造实现sted显微成像所需的照明光束的技术，利用双波长传输矩阵的方法，使得激发光和损耗光在通过强散射介质后，同时生成激发光束和损耗光束，并使这两光束在时间上和空间上重叠；通过使用数字微镜器件(digital micromirror device，后续简称dmd)生成了重叠的聚焦点。通过强散射介质生成sted的照明光束将有利于sted显微镜在深度组织中的应用。
44.如图1所示的一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法，包括以下步骤：
45.获取激发光束和损耗光束；
46.根据所获取的激发光束和损耗光束以及传输矩阵，得到整形后的激发光束和损耗光束的组合波前；
47.根据整形后的组合波前和强散射介质，生成光束；
48.所述整形后的激发光束和损耗光束的组合波前，使用了传输矩阵和复用计算全息技术，实现激发光束和损耗光束在时间和空间上的重叠。
49.在本实施例中，首先对激发光束和sted光束的双波长传输矩阵进行了校准工作。为了生成激发光束，对激发光束的传输矩阵进行光学相位共轭(optical phase conjugation,后续简称opc)操作，可以在散射介质后面生成一个激发光束聚焦点。对于sted光束，采用基于传输矩阵的点扩散函数(point spread function,后续简称psf)调制方法通过强散射介质生成了二维和三维的sted聚焦光束。在sted显微镜中，激发焦点和sted焦点在时间和空间上需要严格重叠。为了满足这一需求，使用复用计算全息技术同时调制激发光束和sted光束的波前，透过强散射介质同时生成激发焦点和sted焦点，并使其共轴传输，使用dmd实现了快速的波前整形。
50.当激发光束和sted光束入射到强散射介质上时，两束光的波前被打乱，从而在散射介质后产生了强度随机的散斑，如图2(a)所示。在这种情况下，激发光束和sted光束的作用完全被抑制。由于散射的过程是线性和确定的，利用tm的方法通过散射介质来控制输出光场。根据波前整形的数学描述，假设在输入平面和输出平面的光场分别是n
×
1的矢量和m
×
1的矢量，其中n和m分别表示为输入和输出模式数。根据tm理论，尽管多次散射过程中光场是高度混乱的，但是输出场(uo)和输入场(ui)之间的关系遵循线性方程：uo＝t
λ
ui，其中，t
λ
表示波长为λ的光穿过散射介质时的传输矩阵(m
×
n的矩阵)。当激发光和损耗光通过同一个强散射介质时，他们的传输矩阵分别用tg和tr来描述。通常情况下，在sted成像中，激发光和sted光的波长相差约100纳米，两种波长的光束通过强散射介质后的传输矩阵之间完全不相关。因此，两种光束的传输矩阵可以被单独的测量。
51.在本实施例中，传输矩阵的测量采用了文献s.popoff,g.lerosey,r.carminati,m.fink,a.boccara,and s.gigan,"measuring the transmission matrix in optics:an approach to the study and control of light propagation in disordered media,"physical review letters 104,100601(2010).中所介绍的方法。
52.在两个传输矩阵被准确测量之后，可以计算出这两种光束通过强散射介质后在输出平面上得到所需光强分布时对应的波前，详细过程如图2(b)所示。
53.如图2(b)中
①
所示的过程，对测量好的tg进行opc操作(选择在最中间的输出模式上生成聚焦点，得到一个共轭的波前，当这个共轭的波前入射到强散射介质上，就能在输出平面上形成所需的激发焦点。为了生成sted焦点(面包圈或光瓶光束)，采用基于tm的psf调制的方法，来获得所需焦点的psf分布。根据这种方法，用设计好的mask在tm的输出模式对应的虚拟傅里叶平面上进行数值滤波，就可以调制散射介质系统中的psf分布。用作滤波的mask对应psf分布的傅里叶变换。对于2d sted焦点，它的mask分布是一个涡旋相位，而对于3d sted焦点，它的mask是一个π-阶跃相位。
54.如图2(b)中
②
所示的过程，测得的tr被mask数字滤波后得到了滤波后的tr。进而，对滤波后的tr进行opc操作(还是选择在最中间的输出模式上生成聚焦点)后，就可以在焦
平面处得到一个“面包圈”或者“瓶子”的光强分布。图2(b)中的sted焦点显示的是2d sted成像中sted光束的面包圈状强度分布。
55.在sted成像中，使激发焦点和sted焦点共轴是至关重要的。为了让两个焦点在空间上重叠，在对测得的tg和滤波后的tr进行相应的opc操作时，要选择相同的输出模式。为使得两个焦点在时间上重叠，提出可使用复用计算全息技术。最后，利用空间光调制器(spatial light modulator,后续简称slm)加载复用计算全息图，对两束光同时进行波前整形，整形后的组合波前入射到强散射介质上时，就可以在强散射介质后面构建出重叠焦点，如图2(c)所示。
56.在校准了zno散射层的tg和tr后，首先在zno散射层后面构建出2d sted成像中的照明光束。首先，对tg进行opc操作后得到透过zno生成激发聚焦点的共轭波前，然后使用lee方法(在本实施例中采用文献x.hu,q.zhao,p.yu,x.li,z.wang,y.li,and l.gong,"dynamic shaping of orbital-angular-momentum beams for information encoding,"opt express 26,1796-1808(2018).中所介绍的方法)编码这个共轭波前，得到的二值化振幅全息图如图3(a)所示(注：为了清楚起见，这里只展示复用计算全息图的一部分)。在dmd上加载这个全息图后，透过zno在输出平面的中间位置生成了一个紧聚焦的激发焦点，如图3(d)所示。然后，通过对测得的tr进行涡旋相位滤波，得到了滤波后的tr，再对其进行opc操作，其相应的编码的二值化振幅图如图3(b)所示。把这个二值化振幅图加载在dmd上，透过zno散射层在输出平面中间位置生成了面包圈形的sted焦点，其光强分布如图3(e)所示；得到一个面包圈状的强度分布，这个面包圈中心处的强度几乎为零，它的周围都有着更高的强度分布；然后用一个可移动的cmos相机沿z轴方向拍摄了多个二维强度图，对这些图进行处理得到光束传播的x-z强度剖面图，分别如图3(g)和3(h)所示。为了同时生成激发焦点和损耗焦点，把图3(a)和3(b)叠加在一起，得到了一个复用计算全息图，如图3(c)所示。把这个全息图加载在dmd上，透过zno散射层同时生成了激发焦点和sted焦点。输出平面上的光强分布和x-z强度剖面图分别如图3(f)和3(i)所示，可以看到，这两个焦点对准得非常好。沿着图3(i)中白色虚线横截面的光强分布如图3(j)所示，从两曲线中可以看出这两个焦点重合得很好。在图3中，(a-c)用于生成激发光束，面包圈状sted光束，以及由二者构成的叠加光束对应的二进制振幅图；为了清楚起见，这里只展现振幅图的一部分；(d-f)在x-y输出平面上生成激发光束，面包圈状sted光束，以及二者同时构成的叠加光束的光强图；(g-i)对应于(d-f)中光束传播的x-z平面光强剖面图；(j)沿着图(f)中白虚线的光强分布图，圆点和正方形点分别为激发焦点和sted焦点的实验数据的拟合曲线。
57.由于面包圈光束只能耗尽在x-y平面上的荧光，所以为了在z轴方向上限制激发焦点，通常可以使用光瓶光束。因此，在强散射介质后面生成了3d sted显微镜中使用的照明光束。通过π-阶跃相位作为mask对测得的tr进行滤波，在dmd上加载多路复用全息图后，就生成了重叠的照明光束。如图4(a)和图4(b)所示的重叠焦点在x-y平面的光强分布和x-z平面的传播光强分布，生成一个瓶状的3d sted焦点，并且两束光束很好地重叠在一起；在图4(c)和图4(d)中分别显示了沿图4(b)中水平方向虚线和图4(b)中竖直方向虚线的光束强度剖面图。可以看到，对于sted焦点，强度零点周围环绕着高强度区域，激发焦点正如预期的那样位于光瓶光束强度零点的中心。
58.本实施例利用复用全息技术，构建了用于2d sted和3d sted显微镜中具有精细结
构的重叠焦点。此外，在无机械运动的情况下，基于数字微镜器件的快速切换能力，能快速实现对照明光束的快速扫描，为强散射介质(如厚的生物组织)后的sted成像开辟道路。
59.实施例二
60.本公开实施例二介绍了一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成系统，采用了实施例一中所介绍的透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法。
61.如图5所示的一种透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成系统，包括：
62.激光器，用于获取激发光束和损耗光束；
63.光束处理模块，基于传输矩阵和复用计算全息技术，将激发光束的焦点和损耗光束的焦点调整到时间和空间上的重叠，对激光光束和损耗光束进行波前整形，得到整形后的激发光束和损耗光束的组合波前；
64.光束生成模块，将整形后的组合波前透过强散射介质生成光束。
65.如图6所示的实验设计图，其中，图6(a)是实验装置图，图6(b)是两束光的一级光重合装置图，图6(c)是测量传输矩阵时所需的校准模块图，bs表示分束器，be表示扩束器，m表示反射镜，dmd表示数字微镜器件，l表示凸透镜，obj表示物镜，hsm表示强散射介质，ref表示参考光束，cmos表示互补金属氧化物半导体相机。
66.在本实施例中，使用切换速率高达22.727khz的dmd(vialux v7001)实现快速的波前整形，实验装置原理图如图6(a)所示。为了证实实施例一中方法的有效性，使用波长为532nm(coblot series04-01)的激光和波长为633nm(hnl-210l,thorlabs)的激光分别作为激发光和损耗光。两光束首先在bs1处合束，之后经过扩束后充满照亮dmd的表面。在4f系统和空间滤波器的共同作用下，利用lee方法可以调制一级衍射光束的复振幅。为了使一个dmd可以同时调制两束光，在dmd上加载一个复用的计算全息图，这个复用计算全息图由两个单独的全息图叠加产生，每个单独的全息图分别编码产生激发焦点和sted焦点的共轭波前，并且在这两个独立的全息图上分别叠加一个线性光栅相位因子，这个因子可以调节一级光的衍射角度，通过设置这两个线性相位光栅因子的频率，使得两个计算全息图衍射出的一级光相互重叠，如图6(b)所示。这样，一级光便产生了一个叠加的波前。为了清楚起见，在该图中，除了零级和第一级衍射级次，没有展现其他衍射级次。调制好的光束然后通过物镜obj1(10x,na＝0.25)照射到一个沉积的zno散射层上。本实施例中，使用zno散射层作为强散射介质，它的厚度约为280μm。光束通过zno散射层后，被物镜obj2(20x,na＝0.4)收集，然后通过凸透镜l3成像，并用cmos相机(d752,pixelink)记录光强，如图6(c)所示。为了在散射介质后面生成激发焦点和sted焦点，需要首先得到两光束的tm。采用相移法测量tm，引入了两束平面波作为参考光束。本实施例中，在dmd上设置的输入模式是n＝32
×
32，在相机上的输出模式是m＝480
×
480个像素，并利用hadamard基矢编码输入模式获得高信噪比。需要注意的是，图6(c)中的校准模块可以在测得tm后从zno散射介质层后移开，之后就可以进行sted成像。
67.详细步骤与实施例一提供的透过强散射介质受激辐射损耗成像的光束生成方法相同，在此不再赘述。
68.以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。