大肠杆菌O-抗原多糖的生物缀合物、其生产方法及其使用方法与流程

大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物、其生产方法及其使用方法
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背景技术：

3.肠外致病性大肠杆菌(escherichia coli) (expec)菌株与共生大肠杆菌菌株一起通常是人胃肠道的无害居民。expec分离株无法容易地通过血清型与共生分离株区分开，尽管许多克隆谱系以expec为主，如通过o-抗原、荚膜和鞭毛抗原血清型(缩写为o:k:h，例如o25:k1:h4)确定的。与共生大肠杆菌形成对比，expec菌株表达了广泛多样的毒力因子，致使它们能够定殖胃肠道，以及引起广泛范围的肠外感染，所述肠外感染与由于住院和死亡的重大医疗保健成本负担相关。新生儿、老年人和免疫受损的患者特别易受expec感染的影响，所述expec感染包括侵袭性expec疾病(ied)。
4.expec菌株是泌尿道感染(uti)的最常见原因，并且是手术部位感染和新生儿脑膜炎的重要促成因素。这些菌株还与腹部和盆腔感染以及医院内肺炎相关，并且偶尔涉及其它肠外感染，如骨髓炎、蜂窝织炎和伤口感染。所有这些主要感染部位都可以导致expec菌血症。expec是社区发作性菌血症的最常见原因和医院内菌血症的主要病因病原体，并且在约17%至37%的有临床意义的血液分离株中发现。具有expec阳性血培养的患者通常患有脓毒症综合征、严重脓毒症或败血性休克。已观察到expec针对一线抗生素的抗性增加，所述一线抗生素包括头孢菌素、氟喹诺酮和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。expec序列类型131 (st131)的出现和快速全球传播被视为药物抗性包括多药抗性增加的主要驱动因素。这种克隆在所有expec临床分离株的12.5%至30%中发现，主要显示出血清型o25b:h4，并且显示对氟喹诺酮的高水平抗性，其经常伴有甲氧苄啶/磺胺甲噁唑抗性和赋予对头孢菌素的抗性的超广谱β-内酰胺酶。
5.o-抗原包含革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌)中的细胞壁脂多糖(lps)的免疫显性组分。目前存在鉴定的》180种血清学独特的大肠杆菌o-抗原，其中绝大多数expec分离株分类在少于20种o-抗原血清型内。全长大肠杆菌o-抗原通常由约10至25个重复糖单元组成，所述糖单元附着至高度保守的lps核心结构，其中每种组分分别由在rfb和rfa基因簇中占优势地编码的酶合成。在o-抗原聚合之后，o-抗原多糖主链可以为修饰的，通常通过乙酰基或葡萄糖残基的添加。这些修饰通过产生抗原性不同的血清型有效地增加了血清型多样性，所述血清型共享共同多糖主链，但在侧分枝方面不同。编码o-抗原修饰酶的基因通常位于染色体上的rfb簇之外，并且在一些情况下，这些基因在溶原性细菌噬菌体内发现。
6.属于o4血清群的expec分离株已在美国和欧盟血液分离株的当代监视研究中得到普遍鉴定。o4多糖的结构确定为
‑‑
》2) α-l-rha (1-》6) α-d-glc (1-》3) α-l-fucnac (1-》3) β-d-glcnac (1-》，来自大肠杆菌o4:k52菌株(jann等人，carbohydr. res. (1993)第248卷，第241-250页)。对于o4:k3、o4:k6和o4:k12菌株确定了o4多糖结构的不同形式，其中通过添加连接到多糖的鼠李糖残基的α-d-glc (1-》3)修饰上文的结构(jann等人，1993，同上)，这种形式的多糖在本文下文中称为
‘
葡糖基化o4’。负责大肠杆菌o4菌株内的o-抗原修饰的酶尚未得到鉴定。
7.针对开发疫苗以预防expec感染的努力已集中于o-抗原多糖缀合物。通过o-抗原多糖的提取和纯化以及与脱毒的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)外毒素a的化学缀合，合成了12价o-抗原缀合物疫苗，并且在1期临床研究中测试了安全性和免疫原性(cross等人，j. infect. dis. (1994)第170卷，第834-40页)。这种候选疫苗从未获得临床使用许可。最近已开发了在大肠杆菌中的生物缀合系统，其中多糖抗原和载体蛋白质均在体内合成，随后通过在大肠杆菌中表达的寡糖基转移酶pglb (空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)酶)的活性在体内缀合(wacker等人，proc. nat. acad. sci. (2006)第103卷，第7088-93页)。这种n联蛋白质糖基化系统能够将不同的多糖转移到载体蛋白质，允许纯化缀合物的直接方法。
8.生物缀合已成功地用于生产用于大肠杆菌四价o-抗原候选疫苗的缀合物多糖(poolman和wacker，j. infect. dis. (2016)第213(1)卷，第6-13页)。然而，成功的expec疫苗的开发需要占优势血清型的覆盖，并且expec分离株的亚群中存在进一步的o-抗原修饰，在覆盖展示未修饰和修饰lps的分离株方面呈现了进一步的挑战。


技术实现要素：

9.鉴于expec分离株中的抗生素抗性增加以及占优势o-血清型中存在进一步的o-抗原修饰，需要用于这些感染的改善的预防和治疗性治疗。本发明通过限定当代临床分离株的遗传组成来满足这一需要，包括鉴定编码o-抗原修饰酶的基因，因此允许能够合成o-抗原的生物缀合物的重组宿主细胞的改造，所述生物缀合物包括包含所选o-抗原修饰的生物缀合物。
10.在一个方面，本文提供的是与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100的整数，优选1至50，例如3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。
11.在一个特定实施方案中，大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质中的糖基化位点中的asn残基共价连接，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
12.在一些实施方案中，载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌(s. aureus)溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域(passenger domain)、肺炎链球菌
(streptococcus pneumoniae)肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌(neisseria meningitidis)的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)的蛋白d。
13.在一个特定实施方案中，载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)。在此类实施方案中，epa优选包含1至20个，优选1至10个，优选2至4个具有seq id no: 1的糖基化共有序列，所述共有序列优选具有seq id no: 2。
14.在一个特定实施方案中，载体蛋白质包含四个糖基化共有序列(epa-4)。在一个优选实施方案中，载体蛋白质包含seq id no: 3。
15.在另一个方面，本文提供的是组合物或免疫原性组合物，其包含如本文所述的与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物。
16.在一些实施方案中，组合物或免疫原性组合物包含与载体蛋白质共价连接的至少一种另外的抗原多糖。
17.在一些实施方案中，组合物或免疫原性组合物包含与载体蛋白质共价连接的至少一种另外的抗原多糖，其中所述至少一种另外的抗原多糖选自大肠杆菌o1a抗原多糖、大肠杆菌o2抗原多糖、大肠杆菌o6a抗原多糖、大肠杆菌o8抗原多糖、大肠杆菌o15抗原多糖、大肠杆菌o16抗原多糖、大肠杆菌o18a抗原多糖、大肠杆菌o25b抗原多糖和大肠杆菌o75抗原多糖。在具体实施方案中，大肠杆菌o1a抗原多糖包含如表1中所示的式(o1a)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o2抗原多糖包含如表1中所示的式(o2)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o6a抗原多糖包含如表1中所示的式(o6a)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o8抗原多糖包含如表1中所示的式(o8)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o15抗原多糖包含如表1中所示的式(o15)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o16抗原多糖包含如表1中所示的式(o16)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o18a抗原多糖包含如表1中所示的式(o18a)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o25b抗原多糖包含如表1中所示的式(o25b)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。在具体实施方案中，大肠杆菌o75抗原多糖包含如表1中所示的式(o75)的结构，其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。
18.在某些实施方案中，另外的大肠杆菌o1a、o2、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和/或o75抗原多糖各自与载体蛋白质各自中的糖基化位点中的asn残基共价结合，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。在特定实施方案中，载体蛋白质各自是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)。优选地，每种epa包含1-10个，优选2-4个，优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。在特定实施方案中，每种epa包含seq id no: 3。
19.在特定实施方案中，组合物或免疫原性组合物至少包含各自与载体蛋白质共价连
接的大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a和o25b抗原多糖。在特定实施方案中，组合物或免疫原性组合物至少包含各自与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o25b和o75抗原多糖。在特定实施方案中，组合物或免疫原性组合物至少包含各自与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75抗原多糖。
20.在一个特定方面，提供的是组合物或免疫原性组合物，其包含：(i)与包含seq id no: 3的脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa-4)载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含式(o4-glc )的结构；(ii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o1a抗原多糖包含式(o1a)的结构；(iii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o2抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o2抗原多糖包含式(o2)的结构；(iv)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o6a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o6a抗原多糖包含式(o6a)的结构；(v)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o8抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o8抗原多糖包含式(o8)的结构；(vi)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o15抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o15抗原多糖包含式(o15)的结构；(vii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o16抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o16抗原多糖包含式(o16)的结构；(viii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o25b抗原多糖包含式(o25b)的结构；和(ix)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o75抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o75抗原多糖包含式(o75)的结构，其中式(o4-glc )、(o1a)、(o2)、(o6a)、(o8)、(o15)、(o16)、(o18a)、(o25b)和(o75)各自的结构显示于表1中，并且每个n独立地为1至100的整数，优选1至50，例如3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。
21.在某些实施方案中，此类组合物或免疫原性组合物进一步包含：(x)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o18a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o18a抗原多糖包含式(o18a)的结构，其中式(o18a)的结构显示于表1中，并且该结构中的n为1至100的整数，优选1至50，例如3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。
22.在某些实施方案中，大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物存在于本文所述的组合物中的浓度为组合物中的任何其它生物缀合物的浓度的约1.5-6倍，例如约2至4倍。
23.在某些实施方案中，本文所述的组合物包含大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o25b和o75抗原多糖的生物缀合物，其中o1a:o2:葡糖基化o4:o6a:o8:o15:o16:o25b:o75的生物缀合物以按多糖的重量计1:1:1:1:1:1:1:2:1或2:1:1:2:1:1:1:4:1的比率存在。
24.在某些实施方案中，本文所述的组合物包含大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、
o8、o15、o16、o18a、o25b和o75抗原多糖的生物缀合物，其中o1a:o2:葡糖基化o4:o6a:o8:o15:o16:o18a:o25b:o75的生物缀合物以按多糖的重量计1:1:1:1:1:1:1:1:2:1或2:1:1:2:1:1:1:1:4:1的比率存在。
25.在某些实施方案中，本文所述的组合物中的大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物的浓度为2至50 μg/ml，优选8至40 μg/ml，例如16-32 μg/ml。
26.在另一个方面，本文提供的是在受试者中诱导针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原的抗体的方法，其包括向受试者施用如本文所述的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的生物缀合物、或者如本文所述的组合物或免疫原性组合物。
27.在一个特定实施方案中，抗体具有调理吞噬活性。
28.在另一个方面，本文提供的是针对肠外致病性大肠杆菌(expec)给受试者接种疫苗的方法，其包括向受试者施用如本文所述的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、或者如本文所述的组合物或免疫原性组合物。在某些方面，本文提供的是如本文所述的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、或者如本文所述的组合物或免疫原性组合物，其用于诱导针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原的抗体。在某些方面，本文提供的是如本文所述的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、或者如本文所述的组合物或免疫原性组合物，其用于针对肠外致病性大肠杆菌(expec)的疫苗接种。在某些方面，本文提供的是如本文所述的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、或者如本文所述的组合物或免疫原性组合物，用于制造用于在受试者中诱导针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原的抗体的药物的用途。在某些方面，本文提供的是如本文所述的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、或者如本文所述的组合物或免疫原性组合物，用于制造用于针对肠外致病性大肠杆菌(expec)给受试者接种疫苗的药物的用途。
29.在另一个方面，本文提供的是用于产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的重组宿主细胞，其中所述葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100的整数，优选1至50，例如3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20，该宿主细胞包含：(i)关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；(ii)编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述葡糖基转移酶能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；(iii)编码分别与seq id no: 7和8具有至少80%的序列同一性的移位酶和糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化；(iv)编码载体蛋白质的核苷酸序列；和(iv)编码寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述寡糖基转移酶能够将大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质共价连接，以产生生物缀合物。
30.在一个特定实施方案中，重组宿主细胞包含编码葡糖基转移酶的核苷酸序列，所述葡糖基转移酶能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖，并且具有与seq id no: 4具有至少90%，优选至少95%，优选至少98%的序列同一性的氨基酸序
列。在某些实施方案中，葡糖基转移酶包含seq id no: 4。
31.在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码移位酶的核苷酸序列，所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且与seq id no: 7具有至少90%，优选至少95%，优选至少98%的序列同一性。在某些实施方案中，移位酶包含seq id no: 7。
32.在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码糖基转移酶的核苷酸序列，所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化，并且与seq id no: 8具有至少90%，优选至少95%，优选至少98%的序列同一性。在某些实施方案中，糖基转移酶包含seq id no: 8。在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述寡糖基转移酶包含seq id no: 6的氨基酸序列。在优选实施方案中，寡糖基转移酶包含具有突变n311v的seq id no: 6，更优选具有两个突变y77h和n311v的seq id no: 6的氨基酸序列。
33.在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码载体蛋白质的核苷酸序列，所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，其包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
34.在某些实施方案中，关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇包含这样的序列，其编码产生大肠杆菌o4抗原多糖(表1中的式(o4-glc-))的酶，并且与seq id no: 9具有至少80%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少98%同一性。在某些实施方案中，rfb基因簇包含seq id no: 9。
35.在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码载体蛋白质的核苷酸序列，其中所述载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。
36.在一个特定实施方案中，重组宿主细胞编码脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)载体蛋白质，优选地epa包含1-10个，优选2-4个，优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。在一个优选实施方案中，epa包含seq id no: 3的氨基酸序列。
37.优选地，重组宿主细胞是大肠杆菌，例如大肠杆菌k-12菌株，例如菌株w3110。
38.在另一个方面，提供的是产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的方法，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100的整数，优选1至50，例如3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20，该方法包括在用于生物缀合物产生的条件下，培养本发明的重组宿主细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括从重组宿主细胞中分离生物缀合物。
39.在另一个方面，提供的是通过如本文所述的方法产生的生物缀合物。在另一个方面，提供的是包含通过如本文所述的方法产生的生物缀合物的组合物。
40.在另一个方面，提供的是用于制备重组宿主细胞的方法，所述重组宿主细胞用于产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述葡糖
基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100的整数，优选1至50，例如3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20，该方法包括将一种或多种重组核酸分子引入细胞内，以产生重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：(i)关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；(ii)编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述葡糖基转移酶能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；(iii)编码分别与seq id no: 7和8具有至少80%的序列同一性的移位酶和糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化；(iv)编码载体蛋白质的核苷酸序列；和(v)编码寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述寡糖基转移酶能够将大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质共价连接，以产生生物缀合物。
41.在其一个特定实施方案中，能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的葡糖基转移酶具有这样的氨基酸序列，其与seq id no: 4具有至少90%，优选至少95%，优选至少98%的序列同一性。在某些实施方案中，葡糖基转移酶包含seq id no: 4。
42.在某些实施方案中，寡糖基转移酶包含seq id no: 6，优选包含氨基酸突变n311v的seq id no: 6的氨基酸序列。在某些实施方案中，寡糖基转移酶包含具有氨基酸突变y77h和n311v的seq id no: 6。
43.在某些实施方案中，关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇包含这样的序列，其编码产生大肠杆菌o4抗原多糖(表1中的式(o4-glc-))的酶，并且与seq id no: 9具有至少80%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少98%同一性。在某些实施方案中，rfb基因簇包含seq id no: 9。
44.在某些实施方案中，移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且与seq id no: 7具有至少90%，优选至少95%，优选至少98%的序列同一性。在某些实施方案中，移位酶包含seq id no: 7。
45.在某些实施方案中，糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化，并且与seq id no: 8具有至少90%，优选至少95%，优选至少98%的序列同一性。在某些实施方案中，糖基转移酶包含seq id no: 8。
46.在某些实施方案中，载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，其包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。在某些实施方案中，载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。
47.在一个特定实施方案中，载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)，优选地其中所述epa包含1-10个，优选2-4个，优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。在特定实施方案中，载体蛋白质是具有四个糖基化共有序列的epa (epa-4)，优选地其中所述载体蛋白质包含seq id no: 3。
48.在一些实施方案中，重组宿主细胞是例如来自大肠杆菌k12菌株，例如来自w3110菌株的大肠杆菌细胞。
49.在另一个方面，提供的是制备与载体蛋白质共价连接的o
x
抗原多糖的生物缀合物的方法，该方法包括：(i)提供包含以下的重组宿主细胞：a. 关于o
x-抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；b. 编码载体蛋白质的核苷酸序列，所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列；和c. 编码寡糖基转移酶pglby的核苷酸序列；和(ii)在用于生物缀合物产生的条件下培养重组宿主细胞，其中：当o
x-抗原为o1a抗原多糖时，pglby包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为葡糖基化o4抗原多糖时，pglby包含氨基酸突变n311v或氨基酸突变y77h和n311v，并且重组宿主细胞进一步包含编码与seq id no: 4具有至少80%同一性的gtrs的序列、以及编码与seq id no: 7和8分别具有至少80%序列同一性的gtra和gtrb的核苷酸序列；当o
x-抗原为o6a抗原多糖时，pglby包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o8抗原多糖时，pglby不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变；当o
x-抗原为o15抗原多糖时，pglby包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o16抗原多糖时，pglby包含y77h、s80r、q287p、k289r和n311v的氨基酸突变；当o
x-抗原为o18a抗原多糖时，pglby不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变；和当o
x-抗原为o75抗原多糖时，pglby包含n311v的氨基酸突变，其中在每种情况下，氨基酸突变是相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglby。
50.在某些实施方案中，载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)。优选地，epa载体蛋白质包含1-10个，优选2-4个，优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。在一个特定实施方案中，epa载体蛋白质包含seq id no: 3。
51.在另一个方面，提供的是通过制备如本文所述的与载体蛋白质共价连接的o
x
抗原
多糖的生物缀合物的方法产生的生物缀合物。在另一个方面，提供的是包含此类生物缀合物的组合物。在此类实施方案中，组合物包含至少2种，优选至少3种，更优选至少5种，还更优选至少7种此类生物缀合物。
附图说明
52.当与附图结合阅读时，前述概述以及本发明的下述详细描述将得到更好地理解。应当理解，本发明并不限于附图中所示的精确实施方案。
53.在附图中：图1显示了如实施例4中所述的，在来自用glc修饰的o4多糖生物缀合物免疫的两只兔的血清中，针对未修饰的(glc-)或葡萄糖修饰的((glc ) o4 lps的elisa igg滴度；elisa滴度一式四份地进行确定；图2显示了如实施例4中所述的，针对具有特征性gtrs状态的大肠杆菌o4分离株，用来自兔的合并血清的全细胞elisa中的igg滴度，所述兔用glc修饰的o4生物缀合物进行免疫；下述分离株为gtrs阴性的：a2625、stgvxn4988、oc24784、oc24787和oc24788；下述分离株为gtrs阳性的：y1382、e551、oc24334、stgvxn4983、stgvxn4994和oc24794；还包括了阴性对照菌株oc9487 (atcc 35383；血清型o75)；图3显示了用来自由修饰的o4多糖免疫的兔的合并血清探测的，从gtrs阳性和阴性o4分离株中提取的lps的蛋白质印迹；图4a和4b显示了通过葡糖基化o4 (o4-glc )-epa生物缀合物诱导的抗体应答；图4a显示了在免疫后第0、14和42天，通过elisa测量的血清抗体水平；显示了各个滴度(log10 ec50滴度)和gmt
ꢀ±ꢀ
95% ci；灰色虚线指示了高于其时样品的稀释曲线具有4pl拟合的阈值；图4b显示了确定在用葡糖基化o4 (o4-glc )-epa生物缀合物(4.0 μg)免疫后第42天获得的血清样品中抗体的功能性的调理吞噬(opk)测定的结果；威尔科克森秩和检验(wilcoxon rank sum test)和邦弗朗尼校正(bonferroni correction)；*p≤0.05，***p≤0.0001；图5显示了如实施例4中所述的，葡糖基化o4 (o4glc )-epa生物缀合物在以3种不同剂量免疫的sprague dawley大鼠中的加强效应；在免疫后第0、14和42天，通过elisa测量血清抗体水平；显示了关于每只动物的各个滴度(log10 ec50滴度)；数据点之间的线按时间连接了关于每只动物的igg滴度；灰色虚线指示了高于其时样品的稀释曲线具有4pl拟合的阈值；用威尔科克森符号秩检验和用于多重比较的邦弗朗尼校正来执行统计分析(第14天相对于第0天，对于4.0
ꢀµ
g/剂量p = 0.012；第42天相对于第0天，对于所有剂量p = 0.006；第42天相对于第14天，对于所有剂量p = 0.006)；图6显示了通过o4-glc -epa生物缀合物诱导的抗体的功能性；用制剂缓冲液或以4.00
ꢀµ
g/剂量的o4 (glc )-epa生物缀合物，对sprague dawley大鼠进行3次肌内免疫；通过使用o4 (glc )和o4 (glc-)大肠杆菌菌株的调理吞噬性杀死测定(opka)，来确定抗体的功能性；显示了各个调理滴度(oi)和gmt
ꢀ±ꢀ
95% ci；图7显示了使用单克隆抗体来检测周质级分中的o4-glc 生物缀合物，在印迹样图像中显现关于每种测试菌株的o4-glc 生物缀合物产生的pglb筛选的毛细管电泳读出。单糖基化产物大约180 kda，二糖基化产物大约320 kda，而三糖基化产物大约450 kda。a)第
一轮筛选。wt pglb在泳道3中，n311v-pglb在泳道2和4中，空对照菌株在泳道1中，并且其它pglb变体在泳道5和6中。b)第二轮筛选。n311v pglb在泳道3中，n311v y77h pglb在泳道9中，空对照菌株在泳道1和2中，其它pglb变体在剩余泳道中。
54.图8显示了在新西兰白兔中，通过expec10v疫苗诱导的抗体应答。动物接受了用间隔2周施用的expec10v或盐水的3次肌内免疫。expec10v疫苗以3种不同浓度施用(第1组：高剂量，第2组：中剂量和第3组：低剂量，表11)，并且对照组仅接受盐水(第4组，0.9% (w/v)氯化钠溶液)。在第0天(疫苗接种前)以及第14、27和42天(疫苗接种后)，通过elisa测量抗体水平。显示了各个滴度(ec50滴度)和几何平均滴度(gmt)
ꢀ±ꢀ
95% ci。威尔科克森秩和检验伴随用于多重比较的邦弗朗尼校正。expec10v接种疫苗的动物(第1、2和3组)相对于盐水对照(第4组)的比较。**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001；****p ≤ 0.0001。lod：检测极限。
55.图9显示了通过expec10v诱导的抗体应答。新西兰白兔接受了用expec10v (105.6 μg总多糖)或0.9% w/v氯化钠溶液(对照)的3次肌内免疫。在第1天(免疫前，n=20/组)、第31天(免疫后，n=20/组)和第50天(免疫后，n=10/组)，通过elisa确定igg滴度。图显示了关于每组的各个滴度和几何平均值
±ꢀ
95%置信区间。使用具有似然比检验的tobit模型，分析了expec10v和对照组之间的igg滴度差异。p值≤ 0.05被视为显著的。*p ≤ 0.05，****p ≤ 0.0001。
56.图10显示了关于在人中用expec10v疫苗的1/2a期临床试验的总体研究设计。图10a显示了关于队列1的总体研究设计，且图10b显示了关于队列2的总体研究设计。关于细节参见实施例11。
具体实施方式
57.在背景和说明书自始至终引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自通过引用以其整体并入本文。已包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、文章等等的讨论是为了提供本发明的背景的目的。此类讨论并非承认任何或所有这些事项构成关于公开或请求保护的任何发明的现有技术的部分。
58.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在其它方面，本文使用的某些术语具有如说明书中阐述的含义。
59.必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。
60.除非另有说明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每一个要素。
61.本领域技术人员将认识到或能够使用不超过例行实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等价物。此类等价物预期由本发明包含。
62.本说明书和下述权利要求自始至终，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和变化如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”，将理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤组。当在本文中使用时，术语“包含”可以由术语“含有”或“包括”取代，或者有时当在本文中使用时可以由术语“具有”取代。
63.当在本文中使用时，“由
……
组成”排除在权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由
……
组成”并不排除实质上并不影响权利要求的基本和新颖特性的材料或步骤。无论何时在本文在本发明的一个方面或实施方案的上下文中使用时，上述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”中的任一个，都可以替换为术语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”，以改变本公开内容的范围。
64.如本文使用的，多个叙述的要素之间的连接术语“和/或”应理解为包括个别和组合的选项。例如，当两个要素通过“和/或”连接时，第一选项指第一要素的适用性，而没有第二要素。第二选项指第二要素的适用性，而没有第一要素。第三选项指第一要素和第二要素一起的适用性。这些选项中的任何一个应理解为落入该含义内，并且因此满足如本文使用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的同时适用性也应理解为落入该含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
65.在大肠杆菌o4血清型内的o-抗原结构修饰，即葡萄糖分支的鉴定(jann等人，1993)，对发现和开发靶向该血清型内的细菌分离株的糖缀合物疫苗提出了挑战。表达未修饰(没有葡萄糖侧分支)和修饰(具有葡萄糖侧分支)形式的o4 o-抗原的临床当代o4分离株的比例是未知的。获得关于这一特性的信息对于选择有关的抗原结构至关重要。另外，尚未确定疫苗诱导的对一种形式的o4多糖引发的抗体将与另一种形式交叉反应的程度。不含脂质a的o-抗原的纯化以及与载体蛋白质的后续化学缀合是漫长且费力的过程。另外，纯化、脂质a脱毒和化学缀合过程可以导致表位的丧失、抗原异质性和缀合多糖的免疫原性降低。通过生物缀合合成糖缀合物可以克服经典纯化和化学缀合的这些局限性，但葡萄糖分支o4 o-抗原的体内合成需要多糖分支酶的活性，所述多糖分支酶位于rfb基因簇之外。迄今为止，负责o4大肠杆菌菌株中的葡萄糖分支的o-抗原修饰酶尚未得到鉴定。将o4 rfb基因簇克隆到表达pglb的生物缀合大肠杆菌菌株内，将不足以合成葡萄糖分支的o4糖缀合物，而是仅产生非葡萄糖分支的o4生物缀合物(其聚糖的结构显示于表1中的式(o4)中)。如本文使用的，术语“葡糖基化o4”、“葡萄糖分支的o4”、“o4 glc ”和“glc o4
”ꢀ
o-抗原指具有葡萄糖侧分支的o4 o-抗原，并且其结构显示于表1中的式(o4-glc )中。
66.本文公开的是编码o-抗原修饰酶的基因，所述o-抗原修饰酶负责大肠杆菌o4抗原多糖的葡萄糖分支。本文还公开的是宿主细胞，例如重组改造的宿主细胞，其包含编码能够在体内产生生物缀合物的酶的核酸，所述生物缀合物包含与载体蛋白质共价结合的葡糖基化o4抗原多糖。此类宿主细胞可以用于生成包含与载体蛋白质连接的葡糖基化o4抗原的生物缀合物，其可以用于例如治疗和/或预防组合物(例如疫苗)的制剂中。本文进一步提供的是包含单独或与其它大肠杆菌抗原(例如o1、o2、o6、o8、o15、o16、o18、o25和/或o75抗原多糖及其血清亚型)组合的葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的组合物。该组合物可以用于预防和/或治疗方法中，例如针对由大肠杆菌的感染的宿主的疫苗接种，并且可用于抗体的生成，所述抗体可以用于例如治疗方法，例如用于受试者的免疫中。
67.如本文使用的，术语“o-抗原”、“o-抗原多糖”、“o-抗原糖”和“ops”指革兰氏阴性菌的o-抗原。通常，o-抗原是免疫原性重复多糖单元的聚合物。在一个特定实施方案中，术语“o-抗原”、“o-抗原多糖”和“ops”指大肠杆菌的o-抗原。不同血清型的大肠杆菌表达不同的o-抗原。在大肠杆菌中，涉及o-抗原生物发生的基因产物由rfb基因簇编码。
68.如本文使用的，“rfb簇”和“rfb基因簇”指编码能够合成o-抗原主链结构的酶促机
构的基因簇。术语rfb簇可以适用于任何o-抗原生物合成簇，并且优选指来自埃希氏菌属(escherichia)，特别是大肠杆菌的基因簇。
69.如本文使用的，术语“o1a”指大肠杆菌的o1a抗原(大肠杆菌血清型o1的血清亚型)。术语“o2”指大肠杆菌的o2抗原(大肠杆菌血清型o2)。术语“o6a”指大肠杆菌的o6a抗原(大肠杆菌血清型o6的血清亚型)。术语“o8”指大肠杆菌的o8抗原(大肠杆菌血清型o8)。术语“o15”指大肠杆菌的o15抗原(大肠杆菌血清型o15)。术语“o16”指大肠杆菌的o16抗原(大肠杆菌血清型o16)。术语“o18a”指大肠杆菌的o18a抗原(大肠杆菌血清型o18的血清亚型)。术语“o25b”指来自大肠杆菌的o25b抗原(大肠杆菌血清型o25的血清亚型)。术语“o75”指大肠杆菌的o75抗原(大肠杆菌血清型o75)。
70.本技术自始至终提及的大肠杆菌o-抗原多糖的结构显示于下表1中。显示了关于每种大肠杆菌o-抗原多糖的单个重复单元。
71.表1：大肠杆菌o-抗原多糖的结构1每个n独立地为1至100的整数，例如1-50、1-40、1-30、1-20和1-10、3-50、3-40，例如至少5，例如5-40，例如7-30，例如7至25，例如10至20，但在一些情况下，可以为1-2。
72.本文所述的所有单糖具有其在本领域已知的普通含义。单糖可以具有d或l构型。如果未指定d或l，则糖应理解为具有d构型。单糖通常通过本领域通常已知且使用的缩写提及。例如，glc指葡萄糖；d-glc指d-葡萄糖；且l-glc指l-葡萄糖。单糖的其它常见缩写包括：
rha，鼠李糖；glcnac，n-乙酰葡糖胺；galnac，n-乙酰半乳糖胺；fuc，岩藻糖；man，甘露糖；man3me，3-o-甲基-甘露糖；gal，半乳糖；fucnac，n-乙酰岩藻糖胺；和rib，核糖。后缀“f”指呋喃糖，且后缀“p”指吡喃糖。
73.如关于o-抗原使用的术语“ru”、“重复单元(repeat unit)”和“重复单元(repeating unit)”指，当它通过细胞机构(例如，糖基转移酶)在体内合成时，o-抗原的生物重复单元(bru)。o-抗原的ru数目可以根据血清型而变，并且在本发明的实施方案中，通常为约1-100个ru不等，优选约1至50个ru，例如1-50个ru、1-40个ru、1-30个ru、1-20个ru和1-10个ru，且更优选至少3个ru、至少4个ru、至少5个ru，例如3-50个ru，优选5-40个ru，例如7-25个ru，例如10-20个ru。然而，在一些情况下，o-抗原的ru数目可以为1-2。本文具体描述的每种o-抗原的结构显示为含有一个ru，其中变量“n”指定ru的数目。在本发明的生物缀合物中的每种o-抗原多糖中，n独立地为1-100的整数，例如1-50、1-40、1-30、1-20、1-10，优选至少3，更优选至少5，例如3-50，优选5-40 (例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)，但在一些情况下，可以为1-2。在一些实施方案中，n独立地为约7-25的整数，例如约10-20。值在组合物中的各个o-抗原多糖之间可能不同，并且在此处作为平均值提供，即如果生物缀合物在本文中被描述为具有独立地为5-40的整数的n，则组合物含有具有5-40个重复单元的大部分o-抗原多糖，但也可能含有具有少于5个或多于40个重复单元的一些o-抗原多糖。
74.术语“糖缀合物”指与另一个化学种类连接的糖(sugar)或糖(saccharide)抗原(例如，寡糖和多糖)-蛋白质缀合物，所述另一个化学种类包括但不限于蛋白质、肽、脂质等。糖缀合物可以用化学方法制备，例如通过蛋白质和糖(sugar)或糖(saccharide)抗原的化学(合成)键合。术语糖缀合物还包括生物缀合物。
75.术语“生物缀合物”指在宿主细胞背景中制备的，蛋白质(例如载体蛋白质)和糖(sugar)或糖(saccharide)抗原(例如寡糖和多糖)之间的缀合物，所述宿主细胞优选细菌宿主细胞，例如大肠杆菌宿主细胞，其中宿主细胞机构将抗原与蛋白质连接(例如，n联)。优选地，术语“生物缀合物”指在宿主细胞背景中制备的蛋白质(例如载体蛋白质)和o-抗原，优选大肠杆菌o-抗原(例如，o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b、o75等)之间的缀合物，其中宿主细胞机构将抗原与蛋白质连接(例如，n联)。因为生物缀合物通过宿主细胞机构在宿主细胞中制备，所以抗原和蛋白质经由生物缀合物中的糖苷键合或键进行共价连接。生物缀合物可以在重组宿主细胞中进行制备，所述重组宿主细胞被改造为表达合成o-抗原和/或将o-抗原与靶蛋白连接所需的细胞机构。如本文所述的，生物缀合物具有相对于化学制备的糖缀合物(其中聚糖从细菌细胞壁中纯化，并且随后化学偶联至载体蛋白质)的有利性质，例如，生物缀合物在制造中需要更少的化学品，并且在所生成的最终产物方面更一致，并且含有更少的游离(即，未与载体蛋白质结合的)聚糖或不含游离聚糖。因此，在通常的实施方案中，相对于化学产生的糖缀合物优选生物缀合物。
76.当与数目结合使用时，术语“约”指在所提及数目的
±
1、
±
5或
±
10%内的任何数目。
77.术语“百分比(%)序列同一性”或“%同一性”描述了与构成氨基酸序列的总体长度的氨基酸残基数目相比，两个或更多个比对的氨基酸序列的同一氨基酸的匹配(“命中”)数目。换言之，当如使用如本领域已知的序列比较算法测量的，序列就最大对应性进行比较且
比对时，或者当手动比对且目视检查时，使用比对，对于两个或更多个序列，可以确定相同的氨基酸残基的百分比(例如90%、95%、97%或98%同一性)。进行比较以确定序列同一性的序列因此可能因氨基酸的取代、添加或缺失而不同。用于比对蛋白质序列的合适程序是技术人员已知的。蛋白质序列的百分比序列同一性可以例如用程序如clustalw、clustal omega、fasta或blast，例如使用ncbi blast算法(altschul sf等人(1997)，nucleic acids res. 25:3389-3402)进行确定。
78.例如，对于氨基酸序列，序列同一性和/或相似性可以通过使用本领域已知的标准技术或通过检查来确定，所述标准技术包括但不限于smith和waterman，1981，adv. appl. math. 2:482的局部序列同一性算法，needleman和wunsch，1970，j. mol. biol. 48:443的序列同一性比对算法，pearson和lipman，1988，proc. nat. acad. sci. u.s.a. 85:2444的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(wisconsin genetics software package，genetics computer group，575 science drive，madison，wis.中的gap、bestfit、fasta和tfasta)，通过devereux 等人，1984，nucl. acid res. 12:387-395描述的best fit序列程序，优选使用默认设置。在某些实施方案中，基于下述参数通过fastdb计算同一性百分比：错配罚分1；空位罚分1；空位大小罚分0.33；以及连接罚分(joining penalty) 30，"current methods in sequence comparison and analysis," macromolecule sequencing and synthesis，selected methods and applications，第127-149页(1988)，alan r. liss，inc。
79.有用算法的另一个实例是在以下中描述的blast算法：altschul 等人，1990，j. mol. biol. 215:403-410；altschul 等人，1997，nucleic acids res. 25:3389-3402；以及karin 等人，1993，proc. natl. acad. sci. u.s.a. 90:5873-5787。特别有用的blast程序是wu-blast-2程序，其得自altschul 等人，1996，methods in enzymology 266:460-480。wu-blast-2使用几个搜索参数，其中大多数设定为默认值。
80.另一种有用的算法是如通过altschul等人，1993，nucl. acids res. 25:3389-3402报道的gapped blast。
81.术语“侵袭性肠外致病性大肠杆菌(expec)疾病(ied)”在本文中定义为与全身性细菌感染一致的急性病，其通过从患者的血液或其它通常无菌的身体部位中分离和鉴定大肠杆菌、或者通过从患者的尿中分离和鉴定大肠杆菌，在微生物学上得到确认，所述患者具有侵袭性疾病(全身炎症反应综合征(sirs)、脓毒症或败血性休克)的体征和症状的存在，且没有其它可鉴定的感染源。
82.大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物在一个方面，本文提供的是与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物。如本文使用的，术语“o4”指来自大肠杆菌的o4抗原(大肠杆菌血清型o4)。已知o-抗原结构修饰存在于大肠杆菌o4血清型内。特别地，一些o4血清型表达具有分支葡萄糖单元的修饰的o-抗原。如本文使用的，“葡糖基化o4抗原”、“葡糖基化o4抗原多糖”、“o4-glc 抗原多糖”和“o4-glc 抗原”指具有葡萄糖分支的o4抗原(例如，大肠杆菌o4抗原)，其中d-葡萄糖在重复单元l-rha
→
d-glc
→
l-fucnac
→
d-glcnac中与l-鼠李糖连接。在一个特定实施方案中，大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100的整数。在优选实施方案中，n为3至50的整数，例如5至40，例如7至25，例
如10至20。
83.不依赖于葡萄糖分支状态，大肠杆菌o4菌株携带基本上同一的rfb基因簇，其编码负责o4抗原多糖产生的基因。然而，具有葡萄糖分支的修饰的o4抗原的体内合成需要多糖分支酶的活性，所述多糖分支酶位于rfb基因簇之外。就本发明人已知的，负责o4抗原的葡萄糖修饰的多糖分支酶的身份迄今为止仍是未知的。此处，本发明人发现了负责o4抗原的葡萄糖修饰的多糖分支酶的序列。这种酶的鉴定允许产生具有葡萄糖分支的修饰的o4抗原多糖的生物缀合物。o4抗原多糖的葡萄糖修饰形式存在于占优势血清型中，并且因此可以用于提供改善的免疫应答，例如用于预防或治疗用途。
84.特别地，本文提供的是编码对于大肠杆菌血清型o4特异性的葡糖基转移酶的gtrs基因的序列，所述葡糖基转移酶使o4抗原葡糖基化。一般而言，gtra、gtrb和gtrs基因编码负责o-抗原葡糖基化的酶。虽然不同血清型中的gtra和gtrb基因是高度同源且可互换的，但gtrs基因编码血清型特异性o-抗原葡糖基转移酶。大肠杆菌血清型o4的gtrs基因编码gtrs酶，其通过引入葡萄糖分支来修饰o4抗原。o4血清型的当代临床大肠杆菌分离株的表征揭示了，78%的测试分离株中存在gtrs，指示了通过添加葡萄糖残基修饰的大肠杆菌o4抗原多糖在当前感染分离株中是占优势的。
85.在一个实施方案中，本文提供的是来自大肠杆菌血清型o4的gtrs基因的核酸，其编码包含seq id no: 4的氨基酸序列的gtrs葡糖基转移酶。在另一个实施方案中，gtrs核酸编码来自大肠杆菌血清型o4的gtrs蛋白，其与seq id no: 4的氨基酸序列具有约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，优选地，与seq id no: 4的氨基酸序列具有98%、99%或100%的同一性。与seq id no: 4的氨基酸序列具有至少80%同一性的gtrs蛋白能够特异性地使大肠杆菌o4抗原多糖葡糖基化，以获得具有如表1中所示的式(o4-glc )的结构的葡糖基化o4抗原。鉴于本公开内容，本领域普通技术人员将能够制备与seq id no: 4具有至少80%的序列同一性的seq id no: 4的gtrs蛋白的突变形式，并且就大肠杆菌o4抗原的葡糖基化活性测试此类序列。下文更详细地描述了包含编码大肠杆菌血清型o4的葡糖基转移酶gtrs基因的核酸序列的重组宿主细胞，以及重组宿主细胞在生产葡萄糖修饰的o4抗原多糖及其生物缀合物中的用途。
86.关于gtra和gtrb编码的蛋白质的序列可以分别包含与seq id no: 7和8具有至少约80%同一性的氨基酸序列，所述gtra和gtrb编码的蛋白质分别充当细菌萜醇连接的葡萄糖移位酶(gtra，将内膜上的细菌萜醇连接的葡萄糖翻转到周质)、以及细菌萜醇葡糖基转移酶(gtrb，将葡萄糖与细菌萜醇连接)。在某些实施方案中，编码gtra和gtrb蛋白的核酸序列也存在于本发明的宿主细胞中，所述gtra和gtrb蛋白与seq id no: 7和8分别具有至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性，并且分别具有细菌萜醇连接的葡萄糖移位酶和细菌萜醇葡糖基转移酶活性，所述宿主细胞进一步包含o4特异性rfb基因座、上文所述的o4特异性gtrs编码序列、如本文所述的寡糖基转移酶、以及编码如本文所述的具有一个或多个糖基化共有序列的载体蛋白质的序列，以产生大肠杆菌葡糖基化o4血清型(包含表1中的式(o4-glc )的聚糖结构)的生物缀合物。
87.本文提供的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物优选通过糖苷键合与载体蛋白质共价连接。鉴于本公开内容，可以使用本领域技术人员已知的任何载体蛋白质。合适的载体蛋白质包括但不限于脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白
(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。与含有所需共有糖基化序列的各种不同载体蛋白质的生物缀合已得到描述，显示了广泛范围的蛋白质可以使用这种技术进行糖基化(参见例如，wo 06/119987、wo 2015/124769、wo 2015/158403、wo 2015/82571、wo 2017/216286和wo 2017/67964，其共同显示了成功地用于生物缀合中的广泛各种载体蛋白质)。
88.在某些实施方案中，载体蛋白质进行修饰，例如，以使得该蛋白质毒性更小和/或对糖基化更敏感的方式进行修饰。在一个具体实施方案中，本文使用的载体蛋白质进行修饰，使得以以下方式使载体蛋白质中的糖基化位点的数目达到最大，所述方式允许例如在免疫原性组合物中，特别是在其生物缀合物形式中待施用蛋白质的浓度更低。
89.因此，在某些实施方案中，本文所述的载体蛋白质进行修饰，以包括通常与载体蛋白质相关的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个糖基化位点(例如，相对于与以其自然/天然，即“野生型”状态的载体蛋白质相关的糖基化位点的数目)。糖基化位点引入载体蛋白质内可以通过将糖基化共有序列插入蛋白质的一级结构中的任何位置来实现，例如通过向蛋白质的一级结构添加新氨基酸，使得糖基化位点完全或部分地添加，或通过使蛋白质中的现有氨基酸突变以便生成糖基化位点。本领域普通技术人员将认识到，可以使用本领域已知的方法，例如包括编码蛋白质的核酸序列的修饰的重组方法，容易地修饰蛋白质的氨基酸序列。在具体实施方案中，将糖基化共有序列引入载体蛋白质的特异性区域内，例如蛋白质的表面结构，在蛋白质的n或c末端处，和/或在蛋白质的底部通过二硫桥稳定的环中。在一些实施方案中，可以通过添加赖氨酸残基来扩展糖基化共有序列，用于更有效的糖基化。
90.可以插入载体蛋白质内或在载体蛋白质中生成的糖基化共有序列的示例性实例包括asn-x-ser(thr)，其中x可以为除了pro之外的任何氨基酸(seq id no: 1)；和asp(glu)-x-asn-z-ser(thr)，其中x和z独立地选自除了pro之外的任何氨基酸(seq id no: 2)。
91.在一些实施方案中，大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质中的天冬酰胺(asn)残基共价连接(例如，n联)，其中asn残基存在于糖基化位点中，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，更优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。通常，载体蛋白质包含1-10个糖基化位点，优选2至4个糖基化位点，最优选4个糖基化位点，例如1-10个，优选2-4个，且更优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 1的氨基酸序列，且更优选seq id no: 2的氨基酸序列的糖基化共有序列。
92.在特定实施方案中，载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a。对于epa，各种脱毒的蛋白质变体已在文献中进行描述，并且可以用作载体蛋白质。例如，根据lukac等人，1988，infect immun，56: 3095-3098，以及ho等人，2006，hum vaccin，2:89-98，通过使催化必需残基l552v和δe553突变且缺失，可以实现脱毒。如本文使用的，“epa”指脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a。在其中载体蛋白质是epa的那些实施方案中，大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖可以与糖基化位点(其包含具有seq id no: 1的糖基化共有序列)中的asn残基共价连
接，并且优选与糖基化位点(其包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列)中的asn残基共价连接。优选地，epa载体蛋白质包含1-10个糖基化位点，优选2至4个糖基化位点，最优选4个糖基化位点，例如1-10个，优选2-4个，且更优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 1的氨基酸序列，且更优选seq id no: 2的氨基酸序列的糖基化共有序列。
93.在一些实施方案中，epa载体蛋白质包含各自包含糖基化共有序列的四个糖基化位点，例如包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列的糖基化位点。如本文使用的，“epa-4载体蛋白质”和“epa-4”指脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a载体蛋白质，其包含四个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。epa-4载体蛋白质的示例性优选实例是包含seq id no: 3的氨基酸序列的epa载体蛋白质。
94.组合物在另一个方面，本文提供的是包含与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的组合物。本文提供的组合物可以包括本文所述的与载体蛋白质(例如，epa)共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的任何生物缀合物。
95.在一些实施方案中，组合物是免疫原性组合物。如本文使用的，“免疫原性组合物”指可以在组合物施用于其的宿主或受试者中引发免疫应答的组合物。免疫原性组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物是进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物。如本文使用的，“药学上可接受的载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，其与组合物一起施用，并且是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。例如，盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。合适的药学上可接受的载体的其它实例通过e.w. martin在“remington's pharmaceutical sciences”中进行描述。
96.在一个实施方案中，本发明的组合物包含在tris-缓冲盐水(tbs) ph 7.4 (例如含有tris、nacl和kcl，例如分别为25 mm、137 mm和2.7 mm)中的本发明的生物缀合物。在其它实施方案中，本发明的组合物包含在ph约7.0的约10 mm kh2po4/na2hpo4缓冲液中的本发明的生物缀合物，所述缓冲液具有约5% (w/v)山梨糖醇、约10 mm甲硫氨酸和约0.02% (w/v)聚山梨醇酯80。在其它实施方案中，本发明的组合物包含在ph约7.0的约10 mm kh2po4/na2hpo4缓冲液中的本发明的生物缀合物，所述缓冲液具有约8%(w/v)蔗糖、约1 mm edta和约0.02% (w/v)聚山梨醇酯80 (关于与epa载体蛋白质共价结合的大肠杆菌o-抗原的生物缀合物的合适缓冲液，参见例如wo 2018/077853)。
97.在一些实施方案中，本文所述的组合物是单价制剂，并且含有例如以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分的一种大肠杆菌o-抗原多糖，例如大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖。本文还提供的是其为多价组合物，例如二价、三价、四价等组合物的组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)。例如，多价组合物包含多于一种抗原，例如大肠杆菌o-抗原、糖缀合物或其生物缀合物。在特定实施方案中，本文提供的多价组合物包含大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖和至少一种另外抗原的生物缀合物。
98.在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)是单价组合物，其包含如本文所述的与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀
合物。
99.在另一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)是多价组合物，其包含如本文所述的与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖和至少一种另外的抗原。
100.在一些实施方案中，另外的抗原是抗原糖或多糖，更优选大肠杆菌o-抗原多糖，例如o2、o6、o8、o15、o16、o18、o25和o75血清型及其血清亚型中的一种或多种的大肠杆菌o-抗原。在一些实施方案中，另外的大肠杆菌o-抗原多糖各自是糖缀合物，意味着大肠杆菌o-抗原多糖例如通过化学或酶促方法共价连接至另一个化学种类，例如蛋白质、肽、脂质等，最优选载体蛋白质。在优选实施方案中，另外的大肠杆菌o-抗原多糖各自是生物缀合物，其中通过宿主细胞机构酶促地经由糖苷键，将o-抗原多糖共价连接至例如载体蛋白质。在某些实施方案中，本文提供的组合物可以包含1-20种另外的糖缀合物，更优选大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种大肠杆菌o-抗原多糖的另外的糖缀合物或优选地生物缀合物。其它抗原可以包括在本文提供的组合物中，例如肽、蛋白质或脂质抗原等。
101.在一些实施方案中，组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)包含大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖和选自以下的至少一种另外的抗原多糖的生物缀合物：大肠杆菌o1a抗原多糖、大肠杆菌o2抗原多糖、大肠杆菌o6a抗原多糖、大肠杆菌o8抗原多糖、大肠杆菌o15抗原多糖、大肠杆菌o16抗原多糖、大肠杆菌o18a抗原多糖、大肠杆菌o25b抗原多糖和大肠杆菌o75抗原多糖。优选地，每种另外的o-抗原多糖与载体蛋白质共价连接，并且更优选是生物缀合物。
102.在一个实施方案中，o1a抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o1a抗原多糖包含如表1中所示的式(o1a)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o1a抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
103.在一个实施方案中，o2抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o2抗原多糖包含如表1中所示的式(o2)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o2抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
104.在一个实施方案中，o6a抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o6a抗原多糖包含如表1中所示的式(o6a)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o6a抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
105.在一个实施方案中，o8抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o8抗原多糖包含如表1中所示的式(o8)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o8抗原多糖是生物缀合物的
部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
106.在一个实施方案中，o15抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o15抗原多糖包含如表1中所示的式(o15)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o15抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
107.在一个实施方案中，o16抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o16抗原多糖包含如表1中所示的式(o16)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o16抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
108.在一个实施方案中，o18a抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o18a抗原多糖包含如表1中所示的式(o18a)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o18a抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
109.在一个实施方案中，o25b抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o25b抗原多糖包含如表1中所示的式(o25b)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o25b抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
110.在一个实施方案中，o75抗原多糖(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)用于本文提供的组合物中(例如，与葡糖基化o4抗原多糖或其生物缀合物组合)。在一个具体实施方案中，o75抗原多糖包含如表1中所示的式(o75)的结构，其中n为1-100的整数，优选3-50，例如5-40，例如7至25，例如10至20。优选地，o75抗原多糖是生物缀合物的部分，并且与载体蛋白质例如epa共价连接。
111.在另一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)至少包含大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a和o25b抗原多糖，优选与载体蛋白质例如epa共价连接的o1a、o2、葡糖基化o4、o6a和o25b抗原多糖的生物缀合物(即，五价组合物)。
112.在一个优选实施方案中，组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)至少包含大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o25b和o75抗原多糖，优选与载体蛋白质例如epa共价连接的o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o25b和o75抗原多糖的生物缀合物(即，9价组合物)。
113.在另一个优选实施方案中，组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)至少包含大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75抗原多糖，优选与载体蛋白质例如epa共价连接的o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75抗原多糖的生物缀合物(即，10价组合物)。
114.本文还考虑的是组合物，其任选地进一步包含来自其它大肠杆菌血清型的另外o-抗原(例如，以分离的形式或者作为糖缀合物或生物缀合物的部分)。
115.在一些实施方案中，另外的大肠杆菌o1a、o2、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和/或o75抗原多糖各自与载体蛋白质共价连接。o-抗原多糖可以通过化学或其它合成方法与载体蛋白质连接，或者o-抗原多糖可以为生物缀合物的部分，且优选为生物缀合物的部分。鉴于本公开内容，可以使用本领域技术人员已知的任何载体蛋白质。合适的载体蛋白质包括但不限于脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。优选地，载体蛋白质是epa。
116.在一些实施方案中，特别地当是生物缀合物的部分时，另外的大肠杆菌o1a、o2、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和/或o75抗原多糖各自共价连接至载体蛋白质中的天冬酰胺(asn)残基，其中所述asn残基存在于包含糖基化共有序列asn-x-ser(thr)的糖基化位点中，其中x可以为除了pro之外的任何氨基酸(seq id no: 1)，优选地，其中所述asn残基存在于包含糖基化共有序列asp(glu)-x-asn-z-ser(thr)的糖基化位点中，其中x和z独立地选自除了pro之外的任何氨基酸(seq id no: 2)。载体蛋白质可以包含1-10个糖基化位点，优选2至4个糖基化位点，最优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含糖基化共有序列。在一个特定实施方案中，载体蛋白质是epa-4载体蛋白质，例如包含seq id no: 3的氨基酸序列的epa-4载体蛋白质。
117.在一个特定实施方案中，本文提供的是组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)，其包含：(i)与包含seq id no: 3的脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a载体蛋白质(epa-4载体蛋白质)共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含式(o4-glc )的结构；(ii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o1a抗原多糖包含式(o1a)的结构；(iii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o2抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o2抗原多糖包含式(o2)的结构；(iv)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o6a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o6a抗原多糖包含式(o6a)的结构；(v)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o8抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o8抗原多糖包含式(o8)的结构；(vi)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o15抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o15抗原多糖包含式(o15)的结构；(vii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o16抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o16抗原多糖包含式(o16)的结构；(viii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o25b抗原多糖包含式(o25b)的结构；以及(ix)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o75抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o75抗原多糖包含式(o75)的结构，其中所述式各自在表1中提供，并且对于所述式各自独立地，n为1至100的整数，例如1至50，优选3至50，例如5至40。
118.在一个特定实施方案中，所述组合物(例如药物组合物和/或免疫原性组合物)进一步包含：(x)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o18a抗原多糖的生物缀合物，其中
所述大肠杆菌o18a抗原多糖包含如表1中所示的式(o18a)的结构，其中关于该结构的n为1至100的整数，例如1至50，优选3至50，例如5至40。
119.在一些实施方案中，本文提供的组合物包含大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、以及至少大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物存在于组合物中的浓度是组合物中存在的任何其它生物缀合物的浓度的约1.5至6倍，例如约2至4倍，例如1.5、2、3、4、5或6倍。
120.在特定实施方案中，组合物包含大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o25b和o75抗原多糖的生物缀合物，其中所述o1a:o2:葡糖基化o4:o6a:o8:o15:o16:o25b:o75的生物缀合物以1:1:1:1:1:1:1:2:1或2:1:1:2:1:1:1:4:1的比率(按o-抗原多糖的重量计)存在。
121.在特定实施方案中，组合物包含大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75抗原多糖的生物缀合物，其中所述o1a:o2:葡糖基化o4:o6a:o8:o15:o16:o18a:o25b:o75的生物缀合物以1:1:1:1:1:1:1:1:2:1或2:1:1:2:1:1:1:1:4:1的比率(按o-抗原多糖的重量计)存在。
122.在一些实施方案中，本文提供的组合物包含大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、以及至少大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物存在于组合物中的浓度为2至50 μg/ml，优选8至40 μg/ml，更优选16-32 μg/ml，例如16、18、20、22、24、26、28、30或32
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g/ml。在此类实施方案中，大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物的浓度优选为组合物中存在的任何其它生物缀合物的浓度的约1.5至6倍，例如约2至4倍，例如1.5、2、3、4、5或6倍。
123.在某些实施方案中，本文所述的组合物(例如，药物组合物和/或免疫原性组合物)包含佐剂或与佐剂组合施用。用于与本文所述的组合物组合施用的佐剂可以在所述组合物的施用之前(例如在72小时、48小时、24小时、12小时、6小时、2小时、1小时、10分钟内)、同时或之后(例如在72小时、48小时、24小时、12小时、6小时、2小时、1小时、10分钟内)进行施用。如本文使用的，术语“佐剂”指这样的化合物，当与本文所述的组合物结合或作为其部分施用时，所述化合物加大、增强和/或加强对生物缀合物中的大肠杆菌o-抗原多糖的免疫应答，但是当佐剂化合物单独施用时，并不生成对生物缀合物中的大肠杆菌o-抗原多糖的免疫应答。在一些实施方案中，佐剂增强对其生物缀合物中的大肠杆菌o-抗原多糖的免疫应答，并不产生过敏或其它不良反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，所述机制包括例如淋巴细胞募集、b和/或t细胞的刺激和巨噬细胞的刺激。
124.合适佐剂的实例包括但不限于铝盐(铝佐剂(alum)) (例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和氧化铝，包括包含铝佐剂的纳米颗粒或纳米铝佐剂制剂)、磷酸钙、单磷酰脂质a (mpl)或3-脱氧酰化单磷酰脂质a (3d-mpl) (参见例如英国专利gb2220211、ep0971739、ep1194166、us6491919)、as01、as02、as03和as04 (全部为glaxosmithkline；参见例如ep1126876、关于as04的us7357936、ep0671948、ep0761231、关于as02的us5750110)、mf59 (novartis)、咪唑并吡啶化合物(参见wo2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(参见wo2007/109813)、δ-胰岛素、sting活化合成环状二核苷酸(例如us20150056224)、卵磷脂和卡波姆均聚物的组合(例如us6676958)、以及皂苷例如quila和qs21 (参见例如zhu d和w tuo，2016，nat prod chem res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113)、matrix m，
iscoms，iscomatrix等，任选地与qs7组合(参见kensil等人，于vaccine design: the subunit and adjuvant approach (编辑powell & newman，plenum press，ny，1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是水包油乳剂(例如角鲨烯或花生油)，任选地与免疫刺激剂例如单磷酰脂质a组合(参见stoute等人，n. engl. j. med. 336，86-91 (1997))。另一种佐剂是cpg (bioworld today，1998年11月15日)。佐剂的进一步实例是含有免疫刺激剂如mpl和qs21的脂质体，如as01e和as01b中(例如us 2011/0206758)。佐剂的其它实例是cpg (bioworld today，1998年11月15日)和咪唑并喹啉(例如咪喹莫特和r848)。参见例如，reed g等人，2013，nature med，19: 1597-1608。在某些实施方案中，佐剂含有toll样受体4 (tlr4)激动剂。tlr4激动剂是本领域众所周知的，参见例如ireton gc和sg reed，2013，expert rev vaccines 12: 793-807。在某些实施方案中，佐剂包括包含脂质a的tlr4激动剂或者其类似物或衍生物，例如mpl、3d-mpl、rc529 (例如ep1385541)、pet-脂质a、gla (吡喃糖基脂质佐剂，合成二糖糖脂；例如us20100310602、us8722064)、sla (例如carter d 等人，2016，clin transl immunology 5: e108 (doi:10.1038/cti.2016.63)，其描述了优化tlr4配体用于人疫苗的结构-功能方法)、phad (磷酸化六酰基二糖)、3d-phad (其结构与gla相同)、3d-(6-酰基)-phad (3d (6a)-phad) (phad、3d-phad和3d (6a)phad是合成脂质a变体，参见例如avantilipids.com/divisions/adjuvants，其也提供了这些分子的结构)、e6020 (cas编号287180-63-6)、ono4007、om-174等等。
125.在某些实施方案中，本文所述的组合物不包含佐剂并且不与佐剂组合施用。
126.在某些实施方案中，本文所述的组合物被配制为适合于对受试者的预期施用途径。例如，本文所述的组合物(例如，药物和/或免疫原性)可以配制用于皮下、肠胃外、经口、舌下、颊、皮内、经皮、结肠直肠、腹膜内、直肠施用、静脉内、鼻内、气管内、肌内、局部、经皮或皮内施用。在一个具体实施方案中，本文提供的组合物(例如，药物和/或免疫原性)被配制用于肌内注射。
127.使用方法本文提供的生物缀合物和组合物可以用于在受试者中诱导针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原的抗体，并且针对大肠杆菌，特别是肠外致病性大肠杆菌(expec)给受试者接种疫苗。如本文使用的，“受试者”意指将对其或已对其施用本文提供的生物缀合物或组合物的任何动物，优选哺乳动物。如本文使用的，术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、犬、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人灵长类动物(nhp)例如猴或猿、人等。在某些实施方案中，受试者是人。人受试者可以为任何年龄。在某些实施方案中，受试者是约两个月至约18岁的人，例如1岁至18岁。在某些实施方案中，受试者是至少18岁的人。在某些实施方案中，受试者是15至50岁的人，例如18至45岁，例如20至40岁。在某些实施方案中，受试者是男人。在某些实施方案中，受试者是女人。在某些实施方案中，受试者是免疫受损的。在某些实施方案中，受试者是至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁的人。在某些实施方案中，受试者是不超过100岁、不超过95岁、不超过90岁、不超过85岁、不超过80岁或不超过75岁的人。在某些实施方案中，受试者是至少60岁且不超过85岁的人。在某些实施方案中，受试者是健康状况稳定的人。在某些实施方案中，受试者是健康状况稳定的至少60岁且不超过85岁的成年人。在某些实施方案中，受试者是具有泌尿道感染(uti，即尿
道、膀胱、输尿管和/或肾中的细菌感染)史，即在他或她的一生中已具有至少一次uti发作的人。在某些实施方案中，受试者是在过去二十、十五、十二、十、九、八、七、六、五、四、三、二或一年内具有uti史的人。在某些实施方案中，受试者是在过去两年内具有uti史的人。在某些实施方案中，受试者是具有复发性uti史，即在六个月内已具有至少两次uti或在一年内具有至少三次uti的人受试者。在某些实施方案中，受试者是在过去两年内具有复发性uti史的人受试者。在某些实施方案中，受试者是健康状况稳定的60岁或以上的人。在某些实施方案中，受试者是在过去两年内具有uti史的60岁或以上的人。在某些实施方案中，受试者是在过去两年内具有uti史的至少60岁且小于75岁的人。在某些实施方案中，受试者是在过去两年内具有uti史的75岁或以上的人受试者。在某些实施方案中，受试者是预定经历选择性泌尿生殖和/或腹部手术或外科手术，例如经直肠超声引导前列腺穿刺活检术(trus-pnb)的患者。
128.在一个方面，本文提供的是在受试者中诱导针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原的抗体的方法，其包括向受试者施用单独或进一步与其它大肠杆菌o-抗原多糖或者其糖缀合物或生物缀合物组合的，本文所述的与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的任何生物缀合物、或包含与蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的生物缀合物的组合物。
129.在某些实施方案中，针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原诱导、引发或鉴定的抗体具有调理吞噬活性。在特定实施方案中，所诱导、引发或鉴定的抗体是能够介导大肠杆菌葡糖基化和非葡糖基化o4菌株两者的调理吞噬性杀死的交叉反应性抗体。
130.在某些实施方案中，针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原诱导、引发或鉴定的抗体特异性识别未修饰的和葡萄糖修饰的o4抗原多糖。在某些实施方案中，针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原诱导、引发或鉴定的抗体特异性识别o4血清型的大肠杆菌。在某些实施方案中，与非葡糖基化o4抗原相比，由大肠杆菌葡糖基化o4抗原的生物缀合物诱导的抗体优先结合葡糖基化o4抗原。
131.由本文所述的生物缀合物和组合物诱导的抗体可以包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点特异性结合大肠杆菌o-抗原多糖，例如葡糖基化o4抗原多糖。
132.使用本文提供的生物缀合物或组合物诱导、引发或鉴定的抗体可以用于监测疗法的功效和/或疾病进展。本领域已知的任何免疫测定系统可以用于此目的，包括但不限于使用以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：如放射性免疫测定、elisa (酶联免疫吸附测定)、基于电化学发光(ecl)的免疫测定、“夹心”免疫测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白a免疫测定和免疫电泳测定。这些测定中的几种，例如基于ecl的免疫测定可以以多重形式完成，并且通常多重测定形式是优选的。
133.使用大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物诱导、引发或鉴定的抗体，可以用于例如从多种大肠杆菌菌株中检测大肠杆菌o4菌株，特别是葡糖基化o4菌株，和/或诊断通过大肠杆菌o4或葡糖基化o4菌株的感染。
134.在另一个方面，本文提供的是针对大肠杆菌(例如肠外致病性大肠杆菌，expec)给受试者接种疫苗的方法，其包括向受试者施用单独或进一步与其它大肠杆菌o-抗原或者其糖缀合物或生物缀合物组合的，本文所述的与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4
抗原的任何生物缀合物、或包含与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的生物缀合物的组合物。本领域技术人员将理解，受试者将针对大肠杆菌菌株接种疫苗，所述大肠杆菌菌株的o抗原或者其糖缀合物或生物缀合物存在于所施用的组合物中。例如，包含o1a、o2、葡糖基化o4、o6a和o25b抗原多糖的组合物的施用，可以用于针对大肠杆菌血清型o1a、o2、o4、o6a和o25b给受试者接种疫苗。
135.在某些实施方案中，疫苗接种是用于预防侵袭性expec疾病(ied)，例如尿脓毒症、菌血症、脓毒症等。在某些实施方案中，疫苗接种是为了预防或降低泌尿道感染的发生或严重性。在某些实施方案中，ied可以为医院获得性的，例如在经历泌尿生殖和/或腹部手术或外科手术的患者中。在某些实施方案中，ied可以为医疗保健相关的，例如在因另一种状况接受医疗保健的患者中，例如经由中心线、导管等，例如在医院、门诊手术中心、终末期肾病设施、长期护理设施等中。在某些实施方案中，ied可以为社区获得性的，例如在最近没有暴露于医疗保健风险的患者中。
136.在另一个方面，本文提供的是在受试者中诱导针对大肠杆菌(例如，expec)的免疫应答的方法，其包括向受试者施用单独或进一步与其它大肠杆菌o-抗原或者其糖缀合物或生物缀合物组合的，本文所述的与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的任何生物缀合物、或包含与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的生物缀合物的组合物。在一个实施方案中，受试者在施用时患有大肠杆菌(例如，expec)感染。在一个优选实施方案中，受试者在施用时没有大肠杆菌(例如，expec)感染。
137.在某些实施方案中，可以将本文所述的组合物和生物缀合物施用于受试者，以诱导免疫应答，其包括抗体，优选具有调理吞噬活性的抗体的产生。此类抗体可以使用本领域技术人员已知的技术(例如，免疫亲和层析、离心、沉淀等)进行分离。
138.本文描述的生物缀合物和组合物在受试者中生成免疫应答的能力，可以使用本领域技术人员已知或本文描述的任何方法进行评价。在一些实施方案中，生物缀合物在受试者中生成免疫应答的能力可以通过以下进行评价：用本文所述的生物缀合物免疫受试者(例如，小鼠、大鼠、兔或猴)或受试者集合，并且用对照(pbs)免疫另外的受试者(例如，小鼠、大鼠、兔或猴)或受试者集合。随后可以用expec攻击受试者或受试者集合，并且可以确定expec在受试者或受试者集合中引起疾病(例如，uti、菌血症或其它疾病)的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫的受试者或受试者集合在用expec攻击后患有疾病，但用本文所述的生物缀合物或其组合物免疫的受试者或受试者集合较少患有疾病或并未患有疾病，则生物缀合物能够在受试者中生成免疫应答。本文所述的生物缀合物或其组合物诱导与来自expec的o抗原交叉反应的抗血清的能力，可以通过例如免疫测定例如elisa (参见例如，van den dobbelsteen 等人，2016，vaccine 34: 4152-4160)、或基于ecl的免疫测定进行测试。
139.例如，本文所述的生物缀合物在受试者中生成免疫应答的能力，可以使用血清杀菌测定(sba)或调理吞噬性杀死测定(opk测定、或opka)进行评价，所述测定代表了已用于获得基于糖缀合物的疫苗批准的确立和公认的方法。此类测定是本领域众所周知的，并且简言之包括以下步骤：通过向受试者(例如，小鼠、大鼠、兔或猴)施用引发此类抗体的化合物，来生成且分离针对目的靶(例如o抗原多糖，例如大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖)的抗体。随后，抗体的杀菌能力可以通过例如以下进行评价：在抗体和补体以及(取决于测定)嗜
中性粒细胞的存在下，培养所讨论的细菌(例如，有关血清型的大肠杆菌)，并且例如使用标准微生物学方法，测定抗体介导细菌的杀死和/或中和的能力。关于用于大肠杆菌生物缀合物疫苗的opk测定的实例，参见例如abbanat 等人，2017，clin. vaccine immunol. 24: e00123-17。opk测定可以以单重或多重形式执行，其中多重形式(例如，同时检测多种血清型)通常是优选的。多重opk测定在本文中有时称为“mopa”。
140.在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用有效量的单独或进一步与其它大肠杆菌o-抗原或者其糖缀合物或生物缀合物组合的，本文所述的与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的生物缀合物、或包含与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原的生物缀合物的组合物。在一个实施方案中，“有效量”是针对大肠杆菌(例如，expec)给受试者接种疫苗的量。在另一个实施方案中，“有效量”是在受试者中诱导针对大肠杆菌(例如，expec)的免疫应答的量，所述免疫应答例如包括抗体，优选具有调理吞噬活性的抗体产生的免疫应答。
141.在其中本文提供的组合物包含大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物、以及至少大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物的特定实施方案中，大肠杆菌o25b抗原多糖的有效量是组合物中存在的任何其它生物缀合物的浓度的约1.5至6倍，例如约2至4倍，例如1.5、2、3、4、5或6倍。在此类实施方案中，大肠杆菌o25b抗原多糖的有效量为例如约5至18 μg/施用，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18
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g/施用。
142.在某些实施方案中，将根据本发明的生物缀合物或组合物施用于受试者一次。在某些实施方案中，将根据本发明的生物缀合物或组合物施用于受试者多于一次，例如在初免-加强方案中。在某些实施方案中，两次施用之间的时间为至少两周、至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少六个月、至少一年、至少两年、至少五年、至少十年或至少十五年。在人中，通常可以通过根据本发明的生物缀合物或组合物的单次施用，来生成所需的免疫应答。在某些实施方案中，提供了在例如十年后的重复施用。
143.宿主细胞本文提供的是能够产生大肠杆菌o抗原和包含此类大肠杆菌o抗原的生物缀合物的宿主细胞，例如原核宿主细胞。本文提供的宿主细胞优选进行修饰，以包含(例如，通过遗传工程)编码宿主细胞机构(例如糖基转移酶)的一种或多种核酸，所述宿主细胞机构用于产生大肠杆菌o-抗原多糖和/或其生物缀合物。
144.本领域技术人员已知的任何宿主细胞都可以用于产生本文所述的大肠杆菌o抗原多糖(例如，大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖)、以及本文所述的包含大肠杆菌o抗原多糖的生物缀合物 (例如，大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物)，包括古细菌、原核宿主细胞和真核宿主细胞。在一个优选实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。用于产生本文所述的大肠杆菌o抗原多糖、以及本文所述的包含大肠杆菌o抗原多糖的生物缀合物的示例性原核宿主细胞包括但不限于：埃希氏菌属物种、志贺氏菌属(shigella)物种、克雷伯氏菌属(klebsiella)物种、黄单胞菌属(xhantomonas)物种、沙门氏菌属(salmonella)物种、耶尔森氏菌属(yersinia)物种、乳球菌属(lactococcus)物种、乳杆菌属(lactobacillus)物种、假单胞菌属(pseudomonas)物种、棒状杆菌属(corynebacterium)物种、链霉菌属(streptomyces)物种、链球菌属(streptococcus)物种、葡萄球菌属(staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(bacillus)物种和梭菌属(clostridium)物种。
145.在一个具体实施方案中，用于产生本文所述的大肠杆菌o抗原多糖、以及本文所述的包含大肠杆菌o抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞是原核宿主细胞，且优选是大肠杆菌。
146.在某些实施方案中，用于产生本文所述的大肠杆菌o抗原多糖和生物缀合物的宿主细胞进行改造，以包含异源核酸，例如包含所需o抗原血清型的rfb基因簇的异源核酸、编码一种或多种载体蛋白质和/或糖基转移酶的异源核酸。在一个具体实施方案中，可以将异源rfb基因和/或编码涉及糖基化途径(例如，原核和/或真核糖基化途径)的蛋白质的异源核酸引入本文所述的宿主细胞内。此类核酸可以编码蛋白质，包括但不限于寡糖基转移酶和/或糖基转移酶。
147.本文描述了可用于制备重组宿主细胞的编码糖基转移酶的各种基因和基因簇的序列，所述重组宿主细胞可以例如用于制备大肠杆菌o抗原多糖及其生物缀合物。本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，具有特写氨基酸序列的蛋白质可以由多种不同的核酸编码。因此，本领域技术人员将理解，本文提供的核酸可以以以下方式改变，所述方式使得其序列不同于本文提供的序列，而不影响由该核酸编码的蛋白质的氨基酸序列。
148.本文提供的是用于产生以下的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)：大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖、o1a抗原多糖、o2抗原多糖、o6a抗原多糖、o8抗原多糖、o15抗原多糖、o16抗原多糖、o18a抗原多糖、o25b抗原多糖或o75抗原多糖。本文提供的宿主细胞包含编码酶(例如糖基转移酶)的核酸，所述酶能够产生大肠杆菌o抗原多糖。本文提供的宿主细胞可以天然地表达能够产生目的o抗原的核酸，或者宿主细胞可以制备为表达此类核酸。在某些实施方案中，核酸对于宿主细胞是异源的，并且使用本领域已知的遗传方法引入宿主细胞内。例如，可以通过遗传操纵将核酸引入宿主细胞内(例如，基因簇在一种或多种质粒上表达或者整合到宿主细胞基因组内(参见例如，国际专利申请公开wo 2014/037585、wo 2014/057109、wo 2015/052344)。
149.在一个实施方案中，本文提供的是宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，其能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物。优选地通过改造前体细胞，此类宿主细胞包含编码gtrs基因的核酸序列，据本发明人已知的，所述gtrs基因在本文中首次被鉴定为编码多糖分支酶，其能够将葡萄糖转移到大肠杆菌o4抗原(即，对大肠杆菌o4抗原多糖特异性的葡糖基转移酶)，且特别是经由α-1,3-糖苷键合转移到l-rha。seq id no: 4中提供了此类分支酶的氨基酸序列的实例。其它实例包括与其具有至少80%同一性的氨基酸序列。编码对大肠杆菌o4抗原多糖特异性的gtrs基因的核酸序列的示例性实例包括但不限于seq id no: 5，或编码seq id no: 4的关于其的简并核酸序列，或编码与seq id no: 4具有至少80%同一性的功能性o4特异性gtrs酶的核酸序列。
150.在一个具体实施方案中，能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，包含编码葡糖基转移酶的核苷酸序列，所述葡糖基转移酶与seq id no: 4具有至少80%的序列同一性，例如与seq id no: 4具有约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。鉴于遗传密码的冗余，例如，需要时，使用密码子优化的序列，本领域普通技术人员可以制备编码葡糖基转移酶的氨基酸序列的核酸变体。
151.在某些实施方案中，包含编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶(gtrs)的核苷酸序列、能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原
多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，进一步包含编码与seq id no: 7具有至少80%序列同一性的细菌萜醇连接的葡萄糖移位酶(gtra)的核苷酸序列、以及编码与seq id no: 8具有至少80%序列同一性的细菌萜醇葡糖基转移酶(gtrb)的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述核酸序列编码gtra和gtrb蛋白，其分别与seq id no: 7和8具有至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，并且分别具有细菌萜醇连接的葡萄糖移位酶(seq id no: 7)和细菌萜醇葡糖基转移酶(seq id no: 8)活性。鉴于遗传密码的冗余，例如，需要时，使用密码子优化的序列，本领域普通技术人员可以制备编码细菌萜醇连接的葡萄糖移位酶和细菌萜醇葡糖基转移酶的氨基酸序列的核酸变体。
152.本文提供的能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，进一步包含关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列。可用于产生大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的实例在本文中作为seq id no: 9提供。另一个实例可以在genbank，基因座ay568960中找到。还可以使用编码与由该序列编码的相同的酶的简并核酸序列，或编码至少80%同一，优选至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一的酶的序列。
153.在一个具体实施方案中，本文提供的是产生葡糖基化o4抗原多糖的宿主细胞(例如重组宿主细胞，优选重组原核宿主细胞，优选重组大肠杆菌宿主细胞)，其中所述宿主细胞包含gtrs、关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇和编码载体蛋白质的核酸。此类宿主细胞可以使用重组方法进行改造，以包含含有gtrs基因、rfb基因簇和/或编码载体蛋白质的核酸的一种或多种质粒，或者包含整合到宿主细胞基因组内的一些或所有相关基因，例如gtrs、rfb簇和/或编码载体蛋白质的核酸。在某些实施方案中，基因或基因簇已使用同源重组整合到宿主细胞的基因组内。基因整合到宿主细胞的基因组内的优点是在不存在抗生素选择的情况下的稳定性。
154.在另一个具体实施方案中，本文提供的是产生葡糖基化o4抗原多糖的宿主细胞(例如重组宿主细胞，优选重组原核宿主细胞)，其中所述宿主细胞包含gtrs (葡糖基转移酶)、以及由o4 rfb簇编码的酶。在某些实施方案中，上述酶中的一些或全部对于宿主细胞是异源的。
155.在其它具体实施方案中，本文提供的是宿主细胞(例如重组宿主细胞，优选重组原核宿主细胞)，其产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖，优选大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述宿主细胞进一步包含编码寡糖基转移酶的核苷酸序列和/或编码载体蛋白质的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，寡糖基转移酶对于宿主细胞是异源的。在另一个具体实施方案中，载体蛋白质对于宿主细胞是异源的。优选地，宿主细胞包含编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的异源核苷酸序列。在优选实施方案中，o4簇的rfb基因对于宿主细胞是异源的。优选地，编码能够将分支葡萄糖侧链引入o4抗原的酶的序列，即gtrs基因(编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶)对于宿主细胞是异源的。如果相同序列并非天然存在于宿主细胞中，则核酸对于所述宿主细胞是异源的。异源核酸可以例如通过遗传改造，例如通过转化(例如化学转化或电穿孔)和/或重组引入亲本细胞中。在某些实施方案中，将异源核酸例如所需的rfb基因座、gtrs编码序列、载体蛋白质编码序列和/或糖基转移酶编码序列整合到宿主细胞的基因组内，所述宿主细胞优选细菌宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞。在优选实施方案中，与其祖
先相比，内源rfb基因座和(如果适用的话) gtrs编码序列已失活，优选地从重组宿主细胞的基因组中缺失，并且优选地这些分别替换为所需的异源rfb基因座和(如果适用的话)所需的gtrs编码序列。在某些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌的k-12 (作为非限制性实例，大肠杆菌菌株w3110是k-12菌株)，或大肠杆菌的b菌株(作为非限制性实例，大肠杆菌菌株bl21是b菌株)，或任何其它明确定义的大肠杆菌菌株，例如实验室菌株或生产菌株，与原始野生型分离株形成对比。在优选实施方案中，通过将o4 rfb基因座和gtrs基因(其编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶)引入此类大肠杆菌内，宿主细胞衍生自并不表达o4抗原或葡糖基化o4抗原的大肠杆菌。使用充分表征的菌株，如大肠杆菌k-12或大肠杆菌b，作为宿主细胞的前体的优点是对于不同的o-抗原生物缀合物使用类似的生产过程的可能性，因为生产菌株的特性是明确定义的。尽管不同o-抗原的生物缀合物将不同地表现，并且可以根据生产菌株优化表达过程，但至少使用此类明确定义的前体菌株用于生产o-抗原生物缀合物的基本过程，比未知菌株例如野生型分离株用作生产宿主菌株的前体时更可预测。以这种方式，关于较早描述的大肠杆菌o-抗原生物缀合物，如例如wo 2015/124769和wo 2017/035181中描述的o1a、o2、o6a和o25b生物缀合物的生产经验，可以用作设计其它大肠杆菌o-抗原生物缀合物的生产的基础。与gtrs不同，gtra和gtrb基因并非血清型特异性的，并且在某些实施方案中，这些对于宿主细胞是同源的(例如，大肠杆菌k12菌株w3110包括gtra和gtrb基因，其能够连同o4血清型特异性重组引入的gtrs基因(其编码seq id no: 4的葡糖基转移酶或与其具有至少80%同一性的葡糖基转移酶)一起发挥功能，替换内源gtrs基因)。在其它实施方案中，例如在宿主细胞不具有内源gtra和/或gtrb基因的情况下，gtra和gtrb基因(编码分别与seq id no: 7和8具有至少约80%同一性的gtra和gtrb蛋白，并且分别具有细菌萜醇连接的葡萄糖移位酶和细菌萜醇葡糖基转移酶活性)之一或两者也被重组引入宿主细胞内。
156.本文还提供的是宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，其能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a、o2、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b或o75抗原多糖的生物缀合物。此类宿主细胞(例如，重组宿主细胞)包含对o-抗原多糖特异性的rfb基因簇的核苷酸序列。rfb基因簇可以从野生型大肠杆菌菌株中分离，并且在一种宿主细胞内与编码寡糖基转移酶(例如，pglb)和载体蛋白质(例如，epa)的核酸组合，以获得产生目的大肠杆菌o-抗原或其生物缀合物的重组宿主细胞。例如，使用生物缀合技术，例如wo 2014/037585、wo 2009/104074和wo 2009/089396中所述的生物缀合技术，可以使用重组方法改造此类宿主细胞，以包含含有rfb基因簇、寡糖基转移酶(例如，pglb)和载体蛋白质(例如，epa)的一种或多种质粒。优选地，宿主细胞包含整合到其基因组内的rfb基因簇。在某些实施方案中，编码寡糖基转移酶、载体蛋白质和适用时的gtrs基因的核酸也整合到宿主细胞的基因组内。在某些实施方案中，异源或同源的gtra和gtrb基因也整合到宿主细胞的基因组内。
157.关于o1a、o2、o6a和o25b抗原的生物缀合物的制备已在wo 2015/124769和wo 2017/035181中详细描述。关于每种大肠杆菌o抗原的示例性基因簇(rfb基因座)已在以下中进行描述：iguchi a，等人，dna research，2014，1-7 (doi: 10.1093/dnares/dsu043)，以及debroy c，等人，plos one. 2016，11 (1):e0147434 (doi: 10.1371/journal.pone.0147434；更正于：plos one. 2016，11 (4):e0154551，doi: 10.1371/journal.pone.0154551)。关于rfb簇的核酸序列以及关于其中编码的蛋白质的氨基酸序列
也可以在公共数据库例如genbank中找到。可以用于具有本文公开的血清型的多糖抗原的生物缀合物的生产菌株中的rfb簇的示例性序列也在seq id no: 9和11-19中提供。因此，对于上文提到的每种所需生物缀合物，可以将相应的rfb簇引入宿主细胞内，以获得具有关于所需o-抗原的特异性rfb簇、以及含有编码寡糖基转移酶和载体蛋白质的核酸的宿主细胞。出于上文指示的原因，优选地宿主细胞是重组宿主细胞，并且优选地衍生自具有相对众所周知的特性的菌株，例如大肠杆菌实验室或生产菌株，例如大肠杆菌k12或大肠杆菌bl21等。优选地，rfb簇对于宿主细胞是异源的，例如引入宿主细胞的前体细胞内，并且优选整合到其基因组内。优选地，如果原始rfb基因簇存在于前体细胞中，则它在宿主细胞中已替换为关于目的o-抗原的rfb基因簇，以允许产生目的o-抗原的生物缀合物。优选地，寡糖基转移酶对于宿主细胞是异源的，并且在某些实施方案中，编码此类寡糖基转移酶的核酸被整合到宿主细胞的基因组内。
158.本文提供的任何宿主细胞(例如重组宿主细胞，优选重组原核宿主细胞)包含编码在蛋白质的n-糖基化中具有活性的另外酶的核酸，例如，本文提供的宿主细胞可以进一步包含编码寡糖基转移酶的核酸或编码其它糖基转移酶的核酸。
159.本文提供的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸。寡糖基转移酶将脂质连接的寡糖转移到包含n-糖基化共有基序的新生多肽链的天冬酰胺残基。编码寡糖基转移酶的核酸对于宿主细胞可以为天然的，或者可以使用遗传方法引入宿主细胞内。在优选实施方案中，寡糖基转移酶对于宿主细胞是异源的。大肠杆菌并非天然地包含寡糖基转移酶，并且因此如果大肠杆菌用作用于产生生物缀合物的宿主细胞，则异源寡糖基转移酶包含在此类宿主细胞中，例如在通过遗传改造引入后。鉴于本公开内容，寡糖基转移酶可以来自本领域已知的任何来源。
160.在某些实施方案中，具有n-糖基转移酶活性的寡糖基转移酶的替代物，例如o-糖基转移酶，例如作为非限制性实例的pgll，可以与其自身的不同糖基化共有序列联合在载体蛋白质中使用，如例如wo 2016/82597中所述的。其它糖基转移酶，例如o-糖基转移酶，因此也可以用作根据本发明的寡糖基转移酶。
161.在某些优选实施方案中，寡糖基转移酶是来自弯曲杆菌属(campylobacter)的寡糖基转移酶。例如，在一个实施方案中，寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶(即，pglb；参见例如，wacker等人，2002，science 298:1790-1793；还参见例如，ncbi gene id：3231775，uniprot登录号o86154)。在另一个实施方案中，寡糖基转移酶是来自红嘴鸥弯曲杆菌(campylobacter lari)的寡糖基转移酶(参见例如，ncbi gene id：7410986)。
162.在具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌的pglb寡糖基转移酶，包括天然(野生型)蛋白或其任何变体，例如在国际专利申请公开wo 2016/107818和wo 2016/107819中描述的那些。pglb可以将脂质连接的寡糖转移至共有序列seq id no: 1和seq id no: 2中的天冬酰胺残基。在特定实施方案中，pglb寡糖基转移酶包含seq id no: 6或其变体。在某些实施方案中，野生型pglb中的一种或多种内源性糖基化共有序列已进行突变，以避免pglb自糖基化，例如包含突变n534q的seq id no: 6。适用于本文提供的重组宿主细胞中的变体pglb寡糖基转移酶的实例包括seq id no: 6的pglb寡糖基转移酶，其包含选自n311v、k482r、d483h、a669v、y77h、s80r、q287p和k289r的至少一种突变。在一个特定实施方案中，变体pglb寡糖基转移酶具有包含突变n311v的seq id no: 6。在另一个特定实施方案
中，变体pglb寡糖基转移酶具有包含突变y77h和n311v的seq id no: 6。在另一个特定实施方案中，变体pglb寡糖基转移酶具有包含突变n311v、k482r、d483h和a669v的seq id no: 6。在另一个特定实施方案中，变体pglb寡糖基转移酶具有包含突变y77h、s80r、q287p、k289r和n311v的seq id no: 6。在本文中发现并描述了某些pglb寡糖基转移酶变体在特定血清型的大肠杆菌o-抗原生物缀合物的生产中给出令人惊讶地改善的产率。对于给定的大肠杆菌o-抗原，改善的或最佳的pglb变体是不可预测的。因此，在某些方面，本发明还提供了用于使用特异性pglb变体作为寡糖基转移酶，产生特定大肠杆菌o-抗原的生物缀合物的方法。优选在本文组合公开的指示位置上具有一种或多种特定氨基酸(例如77y、80s、287q、289k、311n、482k、483d、669a；或311v；或311v、482r、483h、669v；或77h、80r、287p、289r、311v；或77h、311v；等)的pglb的进一步变体也可以用于生物缀合物的生产，所述变体与seq id no: 6具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性，并且仍具有寡糖基转移酶活性。
163.在一个具体实施方案中，能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，进一步包含编码来自空肠弯曲杆菌的pglb寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述pglb寡糖基转移酶具有seq id no: 6，或优选包含突变n311v的seq id no: 6，或更优选包含突变y77h和n311v的seq id no: 6的氨基酸序列。
164.在其它具体实施方案中，能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a、o6a或o15抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，进一步包含编码来自空肠弯曲杆菌的pglb寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述pglb寡糖基转移酶具有seq id no: 6，或优选包含突变n311v、k482r、d483h和a669v的seq id no: 6的氨基酸序列。
165.在一个具体实施方案中，能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o16抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，进一步包含编码来自空肠弯曲杆菌的pglb寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述pglb寡糖基转移酶具有seq id no: 6，或优选包含突变y77h、s80r、q287p、k289r和n311v的seq id no: 6的氨基酸序列。
166.在一个具体实施方案中，能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o75抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，进一步包含编码来自空肠弯曲杆菌的pglb寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述pglb寡糖基转移酶具有seq id no: 6，或优选包含突变n311v的seq id no: 6的氨基酸序列。
167.在一个具体实施方案中，能够产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o8、o18a、o25b或o2抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)，进一步包含编码来自空肠弯曲杆菌的pglb寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述pglb寡糖基转移酶具有seq id no: 6的氨基酸序列，优选地其中seq id no: 6不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变。
168.在一些实施方案中，本文提供的任何宿主细胞包含编码载体蛋白质的核酸，所述载体蛋白质例如由宿主细胞糖基化机制产生的o-抗原多糖可以附着至其以形成生物缀合物的蛋白质。鉴于本公开内容，宿主细胞可以包含编码本领域技术人员已知的任何载体蛋白质的核酸，所述载体蛋白质包括但不限于脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄
色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。
169.在优选实施方案中，宿主细胞进一步包含编码脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)的核酸。优选地，epa载体蛋白质包含1-10个糖基化位点，优选2至4个糖基化位点，最优选4个糖基化位点，例如1-10个，优选2-4个，且更优选4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 1的氨基酸序列，且更优选具有seq id no: 2的氨基酸序列的糖基化共有序列。在一个具体实施方案中，宿主细胞进一步包含编码epa-4载体蛋白质的核酸，所述epa-4载体蛋白质包含seq id no: 3。
170.在某些实施方案中，用于通过本文所述的宿主细胞生成生物缀合物中的载体蛋白质包含“标签”，即允许分离和/或鉴定载体蛋白质的氨基酸序列。例如，将标签加入载体蛋白质可以用于该蛋白质的纯化，并且因此，用于包含加上标签的载体蛋白质的缀合物疫苗的纯化中。可以在本文中使用的示例性标签包括但不限于组氨酸(his)标签(例如六组氨酸标签或6xhis-tag)、flag-tag和ha标签。在某些实施方案中，一旦本文使用的标签不再需要，例如在蛋白质已纯化后，它们是可去除的，例如通过化学试剂或酶促手段去除。在其它实施方案中，载体蛋白质并不包含标签。
171.在某些实施方案中，本文所述的载体蛋白质包含信号序列，其将载体蛋白质靶向表达载体蛋白质的宿主细胞的周质空间。在一个具体实施方案中，信号序列来自大肠杆菌dsba、大肠杆菌外膜孔蛋白a (ompa)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(male)、软腐欧文氏菌(erwinia carotovorans)果胶裂解酶(pelb)、flgi、nika或芽孢杆菌属(bacillus)物种内切木聚糖酶(xyna)、热不稳定大肠杆菌肠毒素ltiib、芽孢杆菌属内切木聚糖酶xyna或大肠杆菌鞭毛蛋白(flgi)。在一个实施方案中，信号序列包含seq id no: 10。在蛋白质移位至周质后，信号序列可以被切掉，并且因此可能不再存在于生物缀合物的最终载体蛋白质中。
172.在某些实施方案中，可以将另外的修饰引入(例如，使用重组技术)本文所述的宿主细胞内。例如，编码形成可能竞争或干扰糖基化途径(例如，竞争或干扰重组引入宿主细胞内的涉及糖基化的一种或多种异源基因)的的部分蛋白质的宿主细胞核酸(例如基因)，可以在宿主细胞背景(基因组)中被缺失或修饰，其方式使得它们失活/功能失调(即，被缺失/修饰的宿主细胞核酸并不编码功能蛋白质)。在某些实施方案中，当核酸从本文提供的宿主细胞的基因组中缺失时，它们被替换为期望的序列，例如可用于产生o抗原多糖或其生物缀合物的序列。
173.可以在宿主细胞中缺失(并且在一些情况下，由其它所需的核酸序列替换)的示例性基因或基因簇包括涉及糖脂生物合成的宿主细胞的基因或基因簇，例如waal (参见例如，feldman等人，2005，pnas usa 102:3016-3021)、脂质a核心生物合成簇(waa)、半乳糖簇(gal)、阿拉伯糖簇(ara)、结肠酸(colonic acid)簇(wc)、荚膜多糖簇、十一异戊烯醇-p (undecaprenol-p)生物合成基因(例如upps、uppp)、und-p再循环基因、涉及核苷酸活化糖生物合成的代谢酶、肠细菌共同抗原簇(eca)和原噬菌体o抗原修饰簇如gtrabs簇或其区域。在一个具体实施方案中，本文所述的宿主细胞进行修饰，使得它们并不产生除所需o抗
原多糖，例如葡糖基化o4抗原多糖外的任何o抗原多糖。
174.在一个具体实施方案中，waal基因从本文提供的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)的基因组中缺失或功能失活。术语“waal”和“waal基因”指编码膜结合的酶的o-抗原连接酶基因，所述酶的活性位点位于周质中。编码的酶将十一异戊二烯磷酸酯(undecaprenylphosphate) (upp)结合的o抗原转移到脂质a核心，形成脂多糖。内源waal基因的缺失或破坏(例如，δwaal菌株)破坏o-抗原向脂质a的转移，并且相反可以增强o-抗原向另一种生物分子例如载体蛋白质的转移。
175.在另一个具体实施方案中，waal基因、gtra基因、gtrb基因、gtrs基因和rfb基因簇中的一种或多种，从本文提供的原核宿主细胞的原始基因组中缺失或功能失活。
176.在一个实施方案中，本文使用的宿主细胞是大肠杆菌，其产生葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中waal基因从宿主细胞的基因组中缺失或功能性失活，并且插入对大肠杆菌o4抗原多糖特异性的gtrs基因。在关于用于葡糖基化o4 o-抗原的生物缀合物的生产菌株的某些实施方案中，将编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的gtrs基因插入亲本菌株的gtrs基因的位置中，以便由负责o4抗原葡糖基化的gtrs基因替换该亲本菌株中的gtrs基因。此类亲本菌株的实例是大肠杆菌k-12菌株w3110。gtra和gtrb基因对于亲本菌株可以为同源的，或可替代地，这些基因之一或两者对于亲本菌株可以为异源的。通常并且不同于gtrs基因，这些gtra和gtrb基因对o-抗原结构并非特异性的。
177.本文还提供的是制备重组宿主细胞的方法。通过本文所述的方法产生的重组宿主细胞可以用于产生大肠杆菌o抗原的生物缀合物。该方法包括将一种或多种重组核酸分子引入细胞内，以产生重组宿主细胞。通常，重组核酸分子是异源的。鉴于本公开内容，本领域已知的任何方法都可以用于将重组核酸分子引入宿主细胞内。可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法，将重组核酸引入本文所述的宿主细胞内，所述方法例如电穿孔、化学转化、通过热休克、自然转化、噬菌体转导和接合。在具体实施方案中，使用质粒将重组核酸引入本文所述的宿主细胞内。例如，异源核酸可以通过质粒(例如，表达载体)在宿主细胞中表达。在另一个具体实施方案中，使用如例如国际专利申请公开wo 2014/037585、wo 2014/057109或wo 2015/052344中所述的插入基因组内的方法，将异源核酸引入本文所述的宿主细胞内。
178.在一个实施方案中，制备重组宿主细胞用于产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的方法，包括将一种或多种重组核酸分子引入细胞，优选大肠杆菌细胞内，以产生重组宿主细胞。在此类实施方案中，引入细胞内的重组核酸分子包括(i)关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；(ii)编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述葡糖基转移酶能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；(iii)编码载体蛋白质的核苷酸序列；以及(iv)编码寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述寡糖基转移酶能够将大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质共价连接，以产生生物缀合物。在优选实施方案中，编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的核苷酸序列替换内源gtrs基因。缺失内源gtrs具有的优点在于它将不干扰葡糖基化o4抗原多糖结构的生成。在某些实施方案中，关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列替换用于制备重组宿主细胞的亲本菌株的内源rfb基因簇。如果细胞尚未编码gtra和/或gtrb基因，则可以将编码移位酶
(gtra)和糖基转移酶(gtrb) (其分别与seq id no: 7和8具有至少80%同一性)的核苷酸序列引入细胞内。如果细胞已经编码gtra和gtrb基因(例如在大肠杆菌k-12菌株w3110中的情况)，则无需引入或改变这些基因。
179.在一个具体实施方案中，葡糖基转移酶(特异性用于向o4抗原添加葡萄糖分支的gtrs)具有seq id no: 4。
180.在一个具体实施方案中，寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌的pglb。在一个此类实施方案中，寡糖基转移酶包含seq id no: 6的氨基酸序列。在另一个此类实施方案中，寡糖基转移酶包含seq id no: 6的氨基酸序列，所述seq id no: 6包含突变n311v。在另一个此类实施方案中，寡糖基转移酶包含seq id no: 6的氨基酸序列，所述seq id no: 6包含突变y77h和n311v。
181.在另一个具体实施方案中，载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，其包含具有seq id no: 1，优选seq id no: 2的糖基化共有序列。在另一个具体实施方案中，载体蛋白质是epa，优选epa-4，例如包含seq id no: 3的epa-4。
182.在根据本发明的某些实施方案中，在分子生物学中常规用作工具和模式生物的大肠杆菌菌株可以例如用作宿主细胞的亲本。非限制性实例包括大肠杆菌k12菌株(例如，例如w1485、w2637、w3110、mg1655、dh1、dh5α、dh10等)、b菌株(例如bl-21、rel606等)、c菌株或w菌株。在一个特定实施方案中，宿主菌株衍生自亲本菌株w3110。例如，这种菌株可以从yale的大肠杆菌遗传保藏中心(e. coli genetic stock center)获得。关于大肠杆菌的更多信息，参见例如ecoliwiki.net。
183.产生缀合物和生物缀合物的方法还提供的是产生本文所述的大肠杆菌o抗原多糖的糖缀合物的方法。糖缀合物，包括生物缀合物，可以在体外或体内制备，例如使用本文所述的重组宿主细胞用于生产。
184.在一些实施方案中，糖缀合物可以通过化学合成进行制备，即在宿主细胞外(在体外)进行制备。例如，可以使用本领域普通技术人员已知的方法，包括借助于使用多糖/寡糖以及载体蛋白质中的活化反应基团，将大肠杆菌o抗原多糖缀合至载体蛋白质。参见例如，pawlowski等人，2000，vaccine 18:1873-1885；以及robbins等人，2009，proc natl acad sci usa 106:7974-7978)，其公开内容通过引用并入本文。此类方法包括从宿主细胞中提取抗原性多糖/寡糖，纯化多糖/寡糖，化学活化多糖/寡糖，并且将多糖/寡糖缀合至载体蛋白质。
185.在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞可以用于产生包含与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o抗原多糖的生物缀合物。使用宿主细胞产生此类生物缀合物的方法是本领域已知的。参见例如，wo 2003/074687和wo 2006/119987。此类方法包括在生物缀合物产生的条件下，培养本文所述的任何重组宿主细胞。鉴于本公开内容，可以使用本领域已知的任何方法，从重组宿主细胞中分离、分开和/或纯化生物缀合物。例如，可以通过本领域已知的用于纯化蛋白质的任何方法来纯化生物缀合物，所述方法例如层析(例如，离子交换、阴离子交换、亲和以及分级柱层析(sizing column chromatography))、离心、差异溶解度或用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。参见例如wo 2009/104074中描述的方法。进一步地，生物缀合物可以与异源多肽序列融合，以促进纯化。用于纯化特定生物缀合物的实际条件将部分取决于此类因素如生物缀合物的净电荷、疏水性和/或亲水性，并且对于本领域技术人
员将是显而易见的。关于o1a、o2、o6a和o25b的生物缀合物的制备，以及包含这些的疫苗组合物，已例如在wo 2015/124769和wo 2017/035181中进行描述。
186.还提供的是通过本文所述的方法，即使用本文所述的重组宿主细胞产生的生物缀合物。
187.在一些实施方案中，制备与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o-抗原多糖的生物缀合物的方法包括：(i)提供重组宿主细胞，其包含(a)关于o-抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；(b)编码载体蛋白质，优选epa的核苷酸序列，所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点(其包含具有seq id no: 1，优选seq id no: 2的糖基化共有序列)，且更优选包含四个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列；以及(c)编码寡糖基转移酶，例如pglb寡糖基转移酶或其变体的核苷酸序列。
188.在某些实施方案中，使用本文所述的重组宿主细胞产生的大肠杆菌o-抗原多糖，以按重量计的特定多糖/蛋白质比(w/w)与载体蛋白质共价结合。与按重量计的载体蛋白质共价结合的按重量计的o-抗原多糖的量的该比率称为“聚糖/蛋白质比”或“多糖/蛋白质比”或“ps/蛋白质比”。在一些实施方案中，o-抗原多糖以约1:20至20:1，优选1:10至10:1，更优选1:3至3:1的多糖/蛋白质(w/w)比与载体蛋白质共价结合。在关于本文所述的生物缀合物的某些非限制性实施方案中，聚糖/蛋白质比为约0.1至0.5，例如0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5。在此类实施方案中，取决于特定的o-抗原血清型，o-抗原多糖:蛋白质的重量比为约1:10至1:2，例如1:10: 1:9: 1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3或1:2。在某些实施方案中，聚糖/蛋白质比为约0.15至约0.45。一般而言，o-抗原多糖与载体蛋白质的较高聚糖/蛋白质比是优选的，因为在一些情况下，大量的载体蛋白质可以导致免疫干扰。另外，较高的聚糖/蛋白质比将有助于获得足够的以生物缀合物形式给药的o-抗原多糖，同时保持载体蛋白质的量相对较低，这对于其中多种血清型将由组合物覆盖的多价组合物尤为有益，所述组合物例如包含来自至少4种不同o-抗原、至少5种不同o-抗原、至少6种不同o-抗原、至少7种不同o-抗原、至少8种不同o-抗原、至少9种不同o-抗原、至少10种不同o-抗原等的生物缀合物的组合物。
189.根据本发明的缀合物的聚糖/蛋白质比可以通过确定蛋白质量和聚糖量进行确定。蛋白质量可以通过测量在280 nm处的uv吸光度(a280) 进行确定。聚糖量可以基于重复单元中的糖(例如关于表1中的o8的man，以及关于表1中的其它聚糖的glcnac)的离子层析-脉冲安培计检测(ic-pad)进行确定，这之后重复单元的结构信息可以用于计算总聚糖量(例如o1a的重复单元具有845 da的摩尔质量，并且1摩尔此类重复单元含有1摩尔glcnac，当glcnac的量已通过ic-pad进行确定时，允许总聚糖量的计算)。
190.在一些实施方案中，根据本文所述的细胞和方法，使用重组宿主细胞产生的、与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物，具有在l-rh糖的位置2处的一定程度的乙酰化。生物缀合物中的o25b抗原多糖的o-乙酰化程度优选为至少30%，优选至少50%，例如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
191.类似地，生物缀合物中的大肠杆菌o16抗原多糖的o-乙酰化程度优选为至少30%，优选至少50%，例如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
192.在具体实施方案中，制备o-抗原多糖的生物缀合物的方法包括提供包含核酸序列的重组宿主细胞，所述核酸序列编码特定寡糖基转移酶，特别是pglb寡糖基转移酶或其变
体，取决于待生产的o-抗原多糖生物缀合物。特定的寡糖基转移酶变体可能影响通过宿主细胞产生的生物缀合物的产率。通常，较高的产率是优选的，因为产率将影响用于生产特定生物缀合物的成本，其对于包含几种不同的生物缀合物的多价组合物尤为重要。
193.在一个特定实施方案中，当o-抗原为o1a、o6a或o15抗原多糖时，pglb寡糖基转移酶包含n311v、k482r、d483h和a669v的氨基酸突变，其中所述氨基酸突变是相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb。
194.在另一个特定实施方案中，当o-抗原为葡糖基化o4抗原多糖时，pglb寡糖基转移酶包含氨基酸突变n311v、或y77h和n311v的氨基酸突变，其中所述氨基酸突变是相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb。
195.在另一个特定实施方案中，当o-抗原为o16抗原多糖时，pglb寡糖基转移酶包含y77h、s80r、q287p、k289r和n311v的氨基酸突变，其中所述氨基酸突变是相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb。
196.在另一个特定实施方案中，当o-抗原为o75抗原多糖时，pglb寡糖基转移酶包含n311v的氨基酸突变，其中所述氨基酸突变是相对于具有seq id no: 6的氨基酸序列的野生型pglb。
197.在另一个特定实施方案中，当o-抗原为o8、o18a、o25b或o2抗原多糖时，pglb寡糖基转移酶包含seq id no: 6的氨基酸序列，其中seq id no: 6不包含在位置77、80、287、289、311、482、483和669处的氨基酸突变。在其某些实施方案中，pglb寡糖基转移酶包含seq id no: 6的氨基酸序列。
198.在一些实施方案中，根据上文指示的o-抗原/pglb寡糖基转移酶配对，通过编码寡糖基转移酶的重组宿主细胞产生的o-抗原多糖的生物缀合物，优选具有本文所述的一种或多种优选属性，例如聚糖/蛋白质比和/或多糖基化载体蛋白质的百分比。
199.实施方案实施方案1是与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含式(o4-glc )的结构：其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。
200.实施方案2是实施方案1的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质中的糖基化位点中的asn残基共价连接，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
201.实施方案3是实施方案1或实施方案2的生物缀合物，其中所述载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外
膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。
202.实施方案4是实施方案3的生物缀合物，其中所述载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)，优选包含1至20个，优选1至10个，优选2至4个具有seq id no: 1的糖基化共有序列，所述共有序列优选具有seq id no: 2。
203.实施方案5是实施方案4的生物缀合物，其中所述载体蛋白质包含四个糖基化共有序列(epa-4)，优选地其中所述载体蛋白质包含seq id no: 3。
204.实施方案6是包含实施方案1-5中任何一个的生物缀合物的组合物。
205.实施方案7是包含实施方案1-5中任何一个的生物缀合物的免疫原性组合物。
206.实施方案8是实施方案6的组合物或实施方案7的免疫原性组合物，其包含与载体蛋白质共价连接的至少一种另外的抗原多糖。
207.实施方案9是实施方案8的组合物或免疫原性组合物，其中所述至少一种另外的抗原多糖选自大肠杆菌o1a抗原多糖、大肠杆菌o2抗原多糖、大肠杆菌o6a抗原多糖、大肠杆菌o8抗原多糖、大肠杆菌o15抗原多糖、大肠杆菌o16抗原多糖、大肠杆菌o18a抗原多糖、大肠杆菌o25b抗原多糖和大肠杆菌o75抗原多糖。
208.实施方案10是实施方案9的组合物或免疫原性组合物，其中(i)大肠杆菌o1a抗原多糖包含式(o1a)的结构：(ii)大肠杆菌o2抗原多糖包含式(o2)的结构：；(iii)大肠杆菌o6a抗原多糖包含式(o6a)的结构：；(iv)大肠杆菌o8抗原多糖包含式(o8)的结构：；(v)大肠杆菌o15抗原多糖包含式(o15)的结构：；(vi)大肠杆菌o16抗原多糖包含式(o16)的结构：
；(vii)大肠杆菌o18a抗原多糖包含式(o18a)的结构：；(viii)大肠杆菌o25b抗原多糖包含式(o25b)的结构：；和(ix)大肠杆菌o75抗原多糖包含式(o75)的结构：，其中每个n独立地为1至100，优选3至50的整数，例如5至40，例如7至25，例如10至20。
209.实施方案11是实施方案10的组合物或免疫原性组合物，其中所述另外的大肠杆菌o1a、o2、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和/或o75抗原多糖各自与载体蛋白质各自中的糖基化位点中的asn残基共价结合，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
210.实施方案12是实施方案11的组合物或免疫原性组合物，其中所述载体蛋白质各自是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)。
211.实施方案13是实施方案12的组合物或免疫原性组合物，其中每种epa包含1-10个，优选2-4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
212.实施方案14是实施方案12的组合物或免疫原性组合物，其中每种epa包含四个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
213.实施方案15是实施方案12的组合物或免疫原性组合物，其中每种epa包含seq id no: 3。
214.实施方案16是实施方案9-15中任何一个的组合物或免疫原性组合物，其至少包含各自与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a和o25b抗原多糖。
20中任何一个的组合物或免疫原性组合物。
222.实施方案24是实施方案1-5中任何一个的生物缀合物、或者实施方案6-20中任何一个的组合物或免疫原性组合物，其用于诱导针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原的抗体。
223.实施方案25是实施方案1-5中任何一个的生物缀合物、或者实施方案6-20中任何一个的组合物或免疫原性组合物，其用于针对肠外致病性大肠杆菌(expec)的疫苗接种。
224.实施方案26是用于产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的重组宿主细胞，其中所述葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100，优选3至50，例如5至40的整数，所述宿主细胞包含：(i)关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；(ii)编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述葡糖基转移酶能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；(iii)编码分别与seq id no: 7和8具有至少80%的序列同一性的移位酶和糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化；(iv)编码载体蛋白质的核苷酸序列；和(v)编码寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述寡糖基转移酶能够将大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质共价连接，以产生生物缀合物。
225.实施方案27是实施方案26的重组宿主细胞，其中：所述葡糖基转移酶具有seq id no: 4的氨基酸序列；所述寡糖基转移酶包含seq id no: 6，优选包含氨基酸突变n311v的seq id no: 6，更优选包含氨基酸突变y77h和n311v的seq id no: 6的氨基酸序列；和所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，其包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
226.实施方案28是实施方案26或实施方案27的重组宿主细胞，其中所述载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。
227.实施方案29是实施方案26-28中任何一个的重组宿主细胞，其中所述载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)。
228.实施方案30是实施方案29的重组宿主细胞，其中所述epa包含1-10个，优选2-4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
229.实施方案31是实施方案30的重组宿主细胞，其中所述载体蛋白质是具有四个糖基化共有序列的epa (epa-4)，优选地其中所述载体蛋白质包含seq id no: 3。
230.实施方案32是实施方案26-31中任何一个的重组宿主细胞，其为大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌k-12菌株，例如菌株w3110。
231.实施方案33是产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的方法，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100，优选3至50，例如5至40的整数，该方法包括在用于生物缀合物产生的条件下，培养实施方案26-32中任何一个的重组宿主细胞。
232.实施方案34是实施方案33的方法，其进一步包括从重组宿主细胞中分离生物缀合物。
233.实施方案35是通过实施方案33或34的方法产生的生物缀合物。
234.实施方案36是包含实施方案35的生物缀合物的组合物。
235.实施方案37是用于制备重组宿主细胞的方法，所述重组宿主细胞用于产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100，优选3至50，例如5至40的整数，该方法包括将一种或多种重组核酸分子引入细胞内，以产生重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：(i)关于大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；(ii)编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述葡糖基转移酶能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；(iii)编码分别与seq id no: 7和8具有至少80%的序列同一性的移位酶和糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能够使细菌萜醇葡糖基化；(iv)编码载体蛋白质的核苷酸序列；和(v)编码寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述寡糖基转移酶能够将大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质共价连接，以产生生物缀合物。
236.实施方案38是实施方案37的方法，其中：所述葡糖基转移酶具有seq id no: 4；所述寡糖基转移酶包含seq id no: 6，优选包含氨基酸突变n311v的seq id no: 6的氨基酸序列；和所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，其包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
237.实施方案39是实施方案37或实施方案38的方法，其中所述载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
䗩
血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d。
238.实施方案40是实施方案37-39中任何一个的方法，其中所述载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)。
239.实施方案41是实施方案40的方法，其中所述epa包含1-10个，优选2-4个糖基化位
点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列。
240.实施方案42是实施方案41的方法，其中所述载体蛋白质是具有四个糖基化共有序列的epa (epa-4)，优选地其中所述载体蛋白质包含seq id no: 3。
241.实施方案43是实施方案37-42中任何一个的方法，其中所述细胞是例如来自大肠杆菌k12菌株，例如来自w3110菌株的大肠杆菌细胞。
242.实施方案44是根据实施方案19或实施方案20的组合物，其中所述o25b抗原多糖的生物缀合物存在于组合物中的浓度为任何其它生物缀合物的浓度的约1.5-6倍，例如约2至4倍。
243.实施方案45是根据实施方案44的组合物，其中所述o1a:o2:葡糖基化o4:o6a:o8:o15:o16:o25b:o75的生物缀合物以按多糖的重量计1:1:1:1:1:1:1:2:1或2:1:1:2:1:1:1:4:1的比率存在。
244.实施方案46是根据实施方案44的组合物，其中所述o1a:o2:葡糖基化o4:o6a:o8:o15:o16:o18a:o25b:o75的生物缀合物以按多糖的重量计1:1:1:1:1:1:1:1:2:1或2:1:1:2:1:1:1:1:4:1的比率存在。
245.实施方案47是根据实施方案44至46中任何一个的组合物，其中所述o25b抗原多糖的生物缀合物的浓度为2至50 μg/ml，优选8至40 μg/ml，例如16-32 μg/ml。
实施例
246.本发明的下述实施例是为了进一步说明本发明的性质。应当理解，下述实施例并不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求确定。
247.实施例1：大肠杆菌感染的流行病学数据为了确定引起菌血症的大肠杆菌的o-血清型分布，执行了全球监测研究。在2011年至2017年之间，从北美、欧洲、亚太地区和南美各国住院的≥60岁的患者中，收集了多于3200种大肠杆菌血流分离株。使用经典凝集技术和基于序列的o基因分型，分析每种菌株的o抗原血清型。参见表2。
248.分析分离的人血样，以确定其中病原体的身份及其抗生素抗性模式。在分析之后，从样品中获得大肠杆菌分离株。通过maldi-tof ms验证大肠杆菌身份。使用基于抗血清的凝集测定，执行关于大肠杆菌分离株的进一步分析，以确定其o-抗原血清型(debroy等人(2011) animal health research reviews / conference of research workers in animal diseases 12，169-185)。无法通过凝集法分型的分离株通过全基因组测序进一步分析，随后为基于o血清型特异性wzy和wzx基因序列的o基因分型。
249.表2：基于通过凝集的o-血清分型加上无法通过凝集分型的分离株的o-基因分型，在2011年至2017年之间从全球收集的3217种血液分离株的集合中，最常见的菌血症相关的大肠杆菌o-血清型的分布。受试者在下述国家住院：美国、加拿大、阿根廷、巴西、英国、德国、西班牙、意大利、荷兰、法国、日本、泰国、韩国和澳大利亚。o-血清型流行率n(%)o25737(22.9%)o2268(8.3%)o6261(8.1%)
o1255(7.9%)o75145(4.5%)o15110(3.4%)o8104(3.2%)o16103(3.2%)o496(3.0%)o1891(2.8%)
250.关于菌血症相关的大肠杆菌的全球集合中的地理位置的分层显示了前10种o血清型的流行率与位置无关，提示了这些是全球与引起菌血症的大肠杆菌相关的占优势o-血清型。
251.在菌血症相关的多药抗性大肠杆菌分离株(即，对至少三类临床相关抗微生物药物抗性的那些菌株)的全球集合(n=345)中，前10种o-血清型的流行率为75.4%。
252.来自流行病学分析的所有信息综合起来，假设不可分型菌株的亚部分的覆盖，10种占优势o-血清型可以覆盖估计60-80%的大肠杆菌相关的菌血症感染。
253.覆盖显著比例的引起菌血症的大肠杆菌血清型的多价疫苗将是非常有用的。因此，表2的o-血清型将是用于基于o-抗原的多价疫苗的良好候选物。使用生物缀合技术可以有益地制备此类疫苗。
254.前10种(表2)中的一种血清型是o4。因此，制备包括与载体蛋白质偶联的大肠杆菌血清型o4的o-抗原多糖的生物缀合物疫苗将是有益的。
255.实施例2：关于编码o-抗原修饰酶的基因表征当代o4临床分离株大肠杆菌o4抗原多糖的两种变体已得到描述(参见例如，jann b等人，1993，carbohydr. res. 248: 241-250)：具有无分支结构的一种变体(结构显示为表1中的(o4-glc-))、以及由另外的葡萄糖侧分支取代的另一种变体(结构显示为表1中的(o4-glc ))。其中这两种变体在当代临床分离株中发现的比例是未知的。尽管这两种变体均与o4抗血清反应，但是还不知道这些变体之间是否存在免疫学差异。此外，迄今为止尚未鉴定负责附着葡萄糖侧分支以生成(o4-glc )抗原多糖的酶，并且其推定的编码序列很可能位于o4 rfb基因簇之外。
256.最初在2011-2012年期间从美国和欧盟的受试者中分离的32种凝集确认的大肠杆菌o4临床分离株的集合经受全基因组序列分析。从32种测序的o4分离株中提取的rfb基因簇序列与参考菌株的序列进行比对，并且在核苷酸水平下进行比较。除了一些天然存在的单核苷酸多态性之外，表征的分离株全都展示了与o4参考菌株同一的rfb簇，指示了不依赖于其glc分支状态，大肠杆菌o4菌株携带同一的rfb基因簇。因此，为了生成大肠杆菌o4-glc 抗原多糖，很可能需要具有未知序列的基因，其编码大肠杆菌o4特异性分支酶，并且必须位于大肠杆菌o4 rfb基因簇之外的某处。如果希望在菌株中产生具有大肠杆菌o4-glc 抗原多糖的生物缀合物，则需要鉴定且采用这种未知基因的序列，所述菌株否则将仅产生具有大肠杆菌o4-glc-抗原多糖的生物缀合物。
257.然后就可能编码o-抗原修饰酶的rfb基因簇之外的基因的存在，分析全基因组序列数据。首先在大肠杆菌o4中鉴定了福氏志贺氏菌(shigella flexneri)中的gtrab的同源物。大肠杆菌中gtrab下游的开放读码框被推定地鉴定为大肠杆菌o4特异性基因gtrs，其可
以编码推定的大肠杆菌o4特异性分支酶gtrs，其负责向大肠杆菌o4抗原添加葡萄糖分支。
258.大肠杆菌o4特异性gtrs酶的氨基酸序列作为seq id no: 4提供。编码该蛋白质的示例性核酸序列作为seq id no: 5提供。
259.在表征的大肠杆菌o4分离株中，发现大约80%携带此处鉴定的gtrs基因(32种中的26种)。还在2014-2016年期间从美国和欧盟的受试者中分离的20种凝集确认的大肠杆菌o4临床分离株的独立集合中，使用序列特异性引物通过pcr确定了大肠杆菌o4特异性gtrs序列的流行率。该分析证实了20种分离株中的17种携带o4 gtrs序列，其对应于85%的流行率。
260.实施例3：将o4 gtrs克隆到大肠杆菌w3110内，glc修饰的o4生物缀合物的产生和结构确认为了测试是否可以制备包含用分支葡萄糖修饰的o4-抗原多糖的生物缀合物，构建了具有推定分支酶的大肠杆菌o4-抗原epa生物缀合物生产菌株。为此，通过推定的o4-gtrs基因(seq id no: 5，参见实施例2)取代内源o16-gtrs基因，并且通过同源重组，将o16 rfb簇替换为大肠杆菌菌株w3110 δwzze-wecg
ꢀ∆
waal δwbbi-j-k中的o4 rfb簇。可替代地，在一些菌株中，o4 rfb簇是在质粒上编码的。
261.随后，将编码脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)载体蛋白质(具有2或4个共有糖基化位点的变体，分别称为
‘
epa-2’和
‘
epa-4’)和寡糖基转移酶pglb的质粒引入菌株内。通过在生物反应器培养物中生长大肠杆菌生产菌株，并且分别通过iptg和阿拉伯糖诱导pglb和epa表达，来产生用glc修饰的o4-epa生物缀合物。从生物量周质提取物中提取o4-epa生物缀合物。
262.为了确认o4-epa生物缀合物的详细多糖组成和键合，对具有epa-4载体蛋白质的生物缀合物执行多次nmr实验(数据未显示)。获得的分配与发表的文献一致(jansson，p.e.等人，1984，carbohydr. res. 134 (2): 283-291；jann b等人，1993，carbohydr. res. 248: 241-250)。在313k处记录的1d谱显示了来自o4五糖ru的大hod信号和小的尖锐信号，具有五个异头信号、两个nac信号和两个h6信号(rha和fucnac)。
263.通过使用2d质子-质子和质子-碳相关nmr实验确认了1d质子分配。首先，2d tocsy (120 ms)实验证实了关于o4五糖ru来自h1和h6 (对于rha和fucnac)的预计交叉峰，以及来自末端ru和epa的小峰。在甲基区域，tocsy显示了关于o4 ru，对于α-rha从h6到h1、以及对于α-fucnac从h6到h5的交叉峰。观察到的其它峰来自epa氨基酸和末端rha (trha)。其次，碳nmr谱含有关于o4 ru的良好分散和诊断性单峰。通过使用hsqc实验，经由附着的质子间接地对碳进行概况分析。hsqc-dept实验给出了ch2基团的反转峰。hsqc给出了关于o4五糖ru [5个异头、环、两个n-乙酰基和两个甲基(rha和fucnac)]基团以及特征性区域中的epa氨基酸的交叉峰。关于o4的每个质子/碳对都可以基于质子分配和文献进行分配。
[0264]
因此，结构表征实验确认了，使用实施例2中鉴定的推定的大肠杆菌o4-gtrs基因，可以产生glc-分支的o4生物缀合物(包含如通过表1中的式(o4-glc )所示的多糖抗原结构)。
[0265]
实施例4：glc分支的o4生物缀合物在兔中的免疫原性通过应用快速兔方案(eurogentec)，将glc修饰的o4生物缀合物(即，具有含有如表1中所示的式(o4-glc )的结构的聚糖)用于兔免疫。来自免疫兔的血清通过elisa分析针对纯化的o4脂多糖(lps)的抗o4 igg滴度，所述o4脂多糖具有(glc ；即含有葡糖基化o4多
糖)或不具有glc分支(glc-；即含有非葡糖基化o4多糖)。用生物缀合物的免疫在两只兔中均导致高igg滴度(图1)。在这两种情况下，与glc-lps相比，通过o4生物缀合物诱导的抗体滴度针对glc lps更高。
[0266]
还将血清合并，并且使用具有表征的gtrs状态的大肠杆菌o4分离株的测试集，用于全细胞elisa研究中。测试了五种gtrs阴性(无glc分支)和六种gtrs阳性(glc分支)大肠杆菌o4分离株，以及阴性对照菌株。来自用glc修饰的o4生物缀合物免疫的兔的合并血清含有高滴度的igg，其特异性识别测试的o4分离株(图2)。与lps elisa一致，所有测试的o4分离株都被免疫血清识别。gtrs阳性分离株展示了比gtrs阴性分离株总体更高的结合(图2)。特别地，下述分离株为gtrs阳性的：y1382、e551、oc24334、stgvxn4983、stgvxn4994和oc24794，并且下述分离株为gtrs阴性的：a2625、stgvxn4988、oc24784、oc24787和oc24788。免疫血清并不结合无关o血清型大肠杆菌oc9487 (atcc 35383)的阴性对照菌株。
[0267]
从银染色的聚丙烯酰胺凝胶中的gtrs阳性和阴性分离株的测试集中提取的lps概况，并未揭示表达未修饰和修饰形式的o4抗原的分离株之间的显著差异，确认了所观察到的差异没有通过lps表达水平的定量差异得到解释(数据未显示)。
[0268]
执行所提取的lps使用合并的免疫血清的蛋白质印迹，以评价通过igg对o4 o-抗原的识别，所述igg响应用glc修饰的o4生物缀合物的免疫而引发。观察到来自修饰的o4免疫的兔的igg与修饰和未修饰的o4 lps两者的结合，并且包括跨越大范围尺寸的lps条带(包括高分子量lps条带)的特异性识别(图3)。
[0269]
在下文的进一步的实验中，当提及'o4'生物缀合物或生产菌株或'ecoo4'时，意指glc-分支的o4 (具有表1中的聚糖结构(o4-glc ))的生物缀合物或生产菌株，除非另有明确说明(术语
‘
o4’和
‘
o4-glc ’因此可互换地用于这些实验中的生物缀合物或生产菌株)。
[0270]
实施例5：glc分支的o4生物缀合物在大鼠中的免疫原性用制剂缓冲液或(o4-glc )-epa生物缀合物(即与epa载体蛋白质共价偶联的葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物；载体蛋白质是如上文实施例3中所述的epa-2)，以3种不同剂量(0.04
ꢀµ
g、0.40
ꢀµ
g或4.0
ꢀµ
g)，将sprague dawley大鼠肌内免疫3次。在免疫后第0、14和42天，通过elisa测量血清抗体水平。
[0271]
当与制剂缓冲液相比时，在免疫后第42天，用0.04 μg、0.40 μg和4.00 μg (o4-glc )-epa生物缀合物的免疫诱导了igg抗体水平的显著增加(图4a)。通过(o4-glc )-缀合物诱导的抗体是有功能的，即能够介导 (o4-glc )大肠杆菌菌株的杀死(图4b)。
[0272]
与在基线(第42天相对于第0天，对于所有剂量p = 0.006)和免疫后第14天(第42天相对于第14天，对于所有剂量p = 0.006)检测到的相比，通过0.04 μg、0.40 μg和4.0 μg (o4-glc )-epa生物缀合物诱导的抗体水平在第42天显著增加(图5)。在接受4.0
ꢀµ
g生物缀合物的组中，与第0天相比，滴度在第14天也显著增加，指示了单一剂量的4.0
ꢀµ
g (o4-glc )-epa生物缀合物诱导igg滴度的显著增加(第14天相对于第0天，p=0.012)。对于测试的生物缀合物的所有三种浓度，在第14天和第42天之间观察到的igg滴度的显著增加，显示了(o4-glc )-epa生物缀合物的第三个剂量能够加强抗体应答(图5)。
[0273]
通过使用o4 (glu )和o4 (glu-)大肠杆菌菌株的调理吞噬性杀死测定(opka)，确定了用制剂缓冲液或以4.00 μg/剂量的生物缀合物肌内免疫3次的大鼠中，通过o4-glc -epa缀合物诱导的抗体的功能性。通过(o4-glc )-epa生物缀合物诱导的抗体是有功能的，
即，能够介导(o4-glc )大肠杆菌菌株的杀死(图4b，图6)。值得注意的是，通过(o4-glc )-epa生物缀合物诱导的抗体能够介导(o4-glc )和(o4-glc-) (即具有表1中的式(o4-glc-)结构的聚糖，即不含glc分支的o4多糖)大肠杆菌菌株两者的杀死(图6)。
[0274]
总之，通过o4-glc -epa生物缀合物诱导的抗体是交叉反应性的，并且能够介导具有和不具有葡萄糖分支的大肠杆菌o4菌株的杀死。
[0275]
实施例6：用于大肠杆菌o-抗原生物缀合物的生产菌株和所得到的生物缀合物产物除如上文所述制备的(o4-glc )-epa生物缀合物之外，还产生了九(9)种其它的生物缀合物。特别地，另外生产的生物缀合物包括大肠杆菌o1a-epa生物缀合物、o2-epa生物缀合物、o6a-epa生物缀合物、o8-epa生物缀合物、o15-epa生物缀合物、o16-epa生物缀合物、o18a-epa生物缀合物、o25b-epa生物缀合物和o75-epa生物缀合物。这些缀合物的聚糖的化学结构在表1中的各自式中可见。包含10种生物缀合物的组合物在本文中称为
‘
expec10v’。包含o1a-epa、o2-epa、o6a-epa和o25b-epa生物缀合物的组合物称为
‘
expec4v
’ꢀ
(并且先前在例如wo 2015/124769和wo 2017/035181中描述)。
[0276]
大肠杆菌w3110亲本菌株非致病性大肠杆菌k12菌株w3110用作用于构建所有十种生产菌株的亲本菌株。大肠杆菌k12菌株w3110得自大肠杆菌遗传保藏中心(coli genetic stock center) (yale university，new haven (ct)，usa，产品编号cgsc#4474)。它的有关基因型先前得到描述(大肠杆菌w3110，f-，λ-，in(rrnd-rrne)1，rph-1)，并且它的基因组序列先前得到公开(hayashi k等人，2006，mol. syst. biol. 2006.0007 (doi:10.1038/msb4100049)。大肠杆菌w3110菌株进行遗传修饰，以允许生产每种大肠杆菌o-抗原生物缀合物(表3)。
[0277]
生物缀合物生产菌株“expec4v”和“expec10v”组合物均包含来自相同生产菌株的o2-epa和o25b-epa生物缀合物。“expec4v”组合物包含来自stgvxn4411或stlmtb10217生产菌株的o1a-epa生物缀合物，而“expec10v”组合物包含来自stlmtb10217生产菌株的o1a-epa生物缀合物。“expec4v”组合物包含来自stgvxn4112生产菌株的o6a-epa生物缀合物，而“expec10v”组合物包含来自stlmtb10923生产菌株的o6a-epa生物缀合物。此外，“expec10v”组合物包含来自并未用于“expec4v”的生产菌株的o4-epa (即(o4-glc )-epa)、o8-epa、o15-epa、o16-epa、o18a-epa和o75-epa生物缀合物。如下文所示的，不同的生产菌株在用于表达epa载体蛋白质和/或寡糖基转移酶pglb的质粒方面可能不同。几种生产菌株的概述在下表3中给出。
[0278]
表3：用于expec4v和expec10v疫苗组合物的o-抗原生物缀合物的大肠杆菌生产菌株的遗传改造概述
o-抗原生物合成(rfb)基因簇在所有大肠杆菌o-抗原生产菌株中，天然存在的大肠杆菌w3110基因组o16::is5-抗原生物合成(rfb)基因簇，替换为来自所选血清型的大肠杆菌菌株的所选o-抗原特异性生物合成簇，其编码血清型特异性o-抗原结构(关于这些o-抗原结构，参见表1)。在大肠杆菌血液分离株的全基因组分析后，选择或确认了十种供体rfb簇。在o-抗原生物合成上缺陷的w3110 o16::is5 rfb基因簇的替换，已在单个同源重组事件中得到实现。在o16和o18a rfb基因簇的情况下，供体dna经由侧翼gnd和rmlca基因进行重组，而其它菌株的rfb基因簇经由侧翼gnd和galf基因进行重组。生产菌株中的rfb簇的序列在seq id no: 9和11-19中提供。
[0279]
o-抗原连接酶(waal)基因所有大肠杆菌o-抗原生产菌株都携带人工引入的由waal基因编码的大肠杆菌w3110基因组o-抗原连接酶的缺失。在
△
waal菌株中，o-抗原向脂质a的转移被破坏，其相反指导o-抗原向载体蛋白质的转移，以增加产物产率。
[0280]
o-抗原葡糖基化(gtrabs)基因在大肠杆菌o8、o15、o16、o18a、o25b和o75生产菌株中，负责o16 o-抗原葡糖基化的大肠杆菌w3110基因组gtrabs基因已被缺失。虽然不同血清型中的gtra和gtrb基因是高
度同源和可互换的，但gtrs基因编码血清型特异性o-抗原糖基转移酶。在大肠杆菌w3110中，gtrs可以将葡萄糖(glc)残基转移到大肠杆菌o16 o-抗原的α-l-rha-(1
→
3)-d-glcnac基序中的glcnac糖。在大肠杆菌o1a、o2和o6a生产菌株中，没有发生gtrabs基因的缺失或替换。这些o-抗原缺少α-l-rha-(1
→
3)-d-glcnac基序，其是大肠杆菌o16 gtrs的天然底物。在大肠杆菌o4生产菌株中，w3110 gtrs基因已替换为大肠杆菌o4 gtrs基因，以适应大肠杆菌o4 o-抗原的适当葡糖基化。
[0281]
寡糖基转移酶pglb所有大肠杆菌o-抗原生产菌株都表达空肠弯曲杆菌糖基转移酶pglb的变体，其可以通过n-糖基化将o-抗原转移到载体蛋白质上的氨基酸共有序列上。pglb具有广泛的底物识别，但由于产物产率低，制备了表达具有修饰的底物特异性的pglb变体的几种生产菌株，这导致改善的产物产率(参见例如wo 2016/107818、wo 2016/107819)。pglb基因置于质粒上的异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导型启动子之后。下表4列出了由用于生产大肠杆菌o-抗原生产菌株的质粒编码的pglb变体，所述生产菌株用于上述expec4v和expec10v组合物的生物缀合物。在载体主链、抗生素抗性标记物和/或替代pglb变体方面具有变动的进一步质粒也已成功地测试了生物缀合物生产。
[0282]
表4：大肠杆菌o-抗原生产菌株中使用的pglb和epa质粒
质粒名称基因描述1pgvxn114pglb空肠弯曲杆菌密码子使用；sprpgvxn970pglb优化的大肠杆菌密码子使用；sprpgvxn971pglb
n534q
优化的大肠杆菌密码子使用；pglb的天然糖基化位点是失活的；sprpgvxn1217pglb
n311v
优化的大肠杆菌密码子使用；底物优化的pglb；sprpgvxn1221pglb
n311v,k482r,d483h,a669v
优化的大肠杆菌密码子使用；底物优化的pglb；sprpgvxn2381pglb
y77h,s80r,q287p,k289r,n311v
优化的大肠杆菌密码子使用；底物优化的pglb；sprpgvxn659epa-4具有四个生物缀合位点的epa；amprpgvxn1076epa-4具有四个生物缀合位点的epa；kanr
1 spr，壮观霉素抗性；ampr，氨苄青霉素抗性；kanr，卡那霉素抗性载体蛋白质(epa)所有大肠杆菌o-抗原生产菌株都表达遗传脱毒的铜绿假单胞菌adp-核糖基转移酶类毒素(epa)作为用于o-抗原的载体蛋白质。epa类毒素与野生型epa毒素的不同之处在于两个残基：leu552改变为val且glu553 (在催化结构域中)被缺失。glu553缺失据报道显著降低毒性。除脱毒突变之外，还引入了四个(epa-4)共有n-糖基化位点基序。将epa基因置于质粒上的l-阿拉伯糖(ara)诱导型启动子之后(表4)。表4限于用于生物缀合物的生产菌株中使用的质粒，所述生物缀合物用于上述“expec4v”和“expec10v”组合物中。在载体主链、抗生素抗性标记物和/或epa变体方面具有变动，例如在共有n-糖基化位点基序的数目方面不同(例如，具有两个此类基序，epa-2)的质粒，也已成功地测试了生物缀合物生产。
[0283]
实施例7：优化寡糖基转移酶用于生成具有葡糖基化o4 (o4-glc )抗原的生物缀合物关于生物缀合物生产的产率优化可以通过空肠弯曲杆菌寡糖基转移酶pglb的修饰来实现，其可以导致对epa载体蛋白质的目的o-抗原更有效或更高程度的n-糖基化。在用于生产具有葡糖基化o4 (o4-glc ) o-抗原多糖的生物缀合物的大肠杆菌菌株中，应用了此类优化策略并且导致(o4-glc )特异性优化的pglb变体，改善了生物缀合物产物产率。
[0284]
在这种方法中，含有epa表达质粒的o4-glc o-抗原多糖生产菌株用各种不同的pglb表达质粒进行转化，所述质粒各自含有在pglb蛋白中的不同氨基酸取代，改变了底物特异性。在渗透休克实验中在摇瓶水平下评价了每种菌株的生物缀合物生产水平和概况，并且使用o4-glc 特异性单克隆抗体，通过毛细管电泳免疫测定对周质提取物执行读出。
[0285]
发现含有n311v氨基酸取代的测试pglb变体之一显著改善了葡糖基化o4生物缀合物的产物产率(图7a)。
[0286]
在其中进一步修饰n311v pglb-变体的进一步改善中，y77h氨基酸取代进一步增强了o4-glc -特异性产物产率，并且显示了与n311v pglb变体相比增加程度的二糖基化产物和三糖基化产物，其中发现其它修饰是中性的或对产物产率具有负面作用(图7b)。质粒plmtb4008 (spr)编码大肠杆菌密码子使用优化的、(o4-glc )-底物优化的、具有突变y77h和n311v的pglb变体。
[0287]
与第一轮优化的pglb-n311v变体相比，发现对于o4-glc o-抗原多糖具有优化底物特异性的pglb变体使生物缀合物产率倍增，所述pglb变体含有相对于野生型(wt)空肠弯曲杆菌糖基转移酶pglb的n311v和y77h氨基酸取代。
[0288]
类似地，使用筛选，对于expec10v组合物中的其它九种血清型的大肠杆菌o-抗原生物缀合物生产，也确定了最佳产率的pglb变体。
[0289]
对于具有o1a、o6a或o15抗原多糖的生物缀合物，发现具有氨基酸突变n311v、k482r、d483h和a669v的pglb给出最高产率。
[0290]
对于具有o2、o8、o18a或o25b抗原多糖的生物缀合物，发现野生型pglb (即在位置77、80、287、289、311、482、483和669处没有氨基酸突变) 给出最高产率。
[0291]
对于具有o16抗原多糖的生物缀合物，发现具有氨基酸突变y77h、s80r、q287p、k289r和n311v的pglb给出最高产率。
[0292]
对于具有o75抗原多糖的生物缀合物，发现具有氨基酸突变n311v的pglb给出最高产率。
[0293]
从这些结果可以看出，最佳pglb变体对于不同的o-抗原是不同的，并且用于产生具有给定o-抗原多糖的生物缀合物的最佳pglb变体是不可预测的。
[0294]
实施例8：来自10种大肠杆菌血清型的o-抗原的生物缀合物及其质量属性靶o-抗原的o-聚糖残基在结构上是多样的并且具有可变的重复单元。糖基转移酶pglb的特异性和亲和力与聚糖结构相联系。因此，制备具有所需质量属性(例如纯度、聚糖/蛋白质比等)的生物缀合物是具有挑战性的、不简单的任务。pglb和epa载体蛋白质的正确组合决定了产率，并且可能影响糖基化效率。通过优化pglb和载体蛋白质，生产了具有所需质量属性的生物缀合物。维持总载体蛋白质的较低阈值也可能是重要的，特别是当一种或多种o-抗原生物缀合物组合在一起并在单一组合物或疫苗中施用时，因为非常大量的载体蛋白质可能导致免疫干扰。为了避免此类现象，优选具有较高聚糖/蛋白质比的缀合物。因此，对于expec10v疫苗，开发了具有至少(与先前描述的已经受临床试验的expec4v疫苗)可比较的糖基化比率的生物缀合物。
[0295]
通过遵循先前描述的方法在生物反应器(10l和/或200l体积)中培养各自的宿主细胞(实施例6，表3)，并且表达生物缀合物，各自生产了生物缀合物。每种原料药通过细菌补料分批发酵进行分批式制造，以生成含有相应多糖血清型的所表达生物缀合物的生物
量。将细胞培养并且用iptg和阿拉伯糖诱导。通过渗透休克随后为层析纯化，从生物反应器培养物中的细胞周质中分离生物缀合物。对于10种生物缀合物各自执行这一过程。
[0296]
因此制备的其为expec10v和expec4v的原料药(ds)的大肠杆菌o-抗原生物缀合物显示了可比较的关键质量属性：(1)工艺相关纯度(通过rp-hplc测量的)高于95%，(2)多糖/蛋白质比范围为约0.1-0.5，大部分为0.15至0.45，(3)细菌内毒素(欧洲药典(ph. eur.) 2.2.3)小于0.5 eu/μg多糖。各个多糖链的平均长度通常为约10-20个重复单元(使用高分辨率sds-page测量的)。
[0297]
对于其为上述expec10v组合物的ds的所有十种生物缀合物，多糖重复单元的结构确认(通过完整或胰蛋白酶消化的缀合物的nmr和ms/ms)为表1中相应血清型的式中所示的结构。
[0298]
在对其制备生物缀合物用于expec10v组合物的十种血清型中，o18血清型具有最低的生物缀合物生产产率。
[0299]
expec10v药物产品(dp)包含上述十种单价ds的混合物。
[0300]
实施例9：expec10v疫苗的毒理学在雌性nzw兔中进行用expec10v的单一剂量先导毒性和局部耐受性研究(非glp)。一组(n=2)接受对照(盐水)的肌内(im)注射(在第0天时)，而第二组(n=4)接受以105.6
ꢀµ
g总多糖(ps)/剂量(对于分别的o-血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75，9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 9.6: 19.2: 9.6
ꢀµ
g ps/剂量)的expec10v的im注射，使用0.6 ml (176
ꢀµ
g ps/ml)的给药体积。在第2天时执行尸检。
[0301]
没有观察到死亡率。另外，对于临床观察(包括使用draize评分的注射部位效应)、体重、食物消耗和体温，没有注意到疫苗有关效应。在组织病理学上，在施用部位或引流(髂)淋巴结处，并未观察到疫苗有关的变化。在四只治疗的动物之一中观察到脾的生发中心形成中的最低限度增加(第2天)，并且被视为对注射疫苗的正常免疫应答。总体而言，单次im剂量的expec10v对雌性兔的施用是良好耐受的。
[0302]
实施例10：expec10v共混制剂在兔中的免疫原性expec4v疫苗(包含大肠杆菌o1a、o2、o6a和o25b血清型的生物缀合物)先前已显示这四种血清型在大鼠、兔和人中是免疫原性的(参见例如，wo 2015/124769；wo 2017/035181；huttner 等人，2017，lancet infect dis，http://dx.doi.org/10.1016/s1473-3099(17)30108-1；rw frenck jr，等人，abstract 5587，asm microbe 2018)。具有大肠杆菌葡糖基化o4血清型的本发明的新型生物缀合物在上文实施例4和5中显示为免疫原性的。当分开(单价)施用于大鼠时，大肠杆菌血清型o8、o15、o16、o18a和o75 (在本实验中都具有epa-2作为载体蛋白质)的生物缀合物的免疫原性确认了，这些生物缀合物各自也是免疫原性的，因为elisa数据指示了这些生物缀合物各自可以引发高水平的大肠杆菌o-抗原特异性抗体(未显示)。
[0303]
还测试了含有如上文所述的10种生物缀合物的混合物的10价疫苗的免疫原性。新西兰白(nzw)兔(雌性，12-16周龄)接受了用间隔2周施用的expec10v或盐水的3次肌内免疫(表5；在第0、14和27天施用)。其为这些实验中使用的expec10v疫苗的部分的10种多糖与含有4个糖基化位点的载体蛋白质epa (epa-4)缀合。该疫苗按3种不同剂量配制：第1组(
‘
高剂量’)：8 ug/剂量的o1a、o2、o6a、o4、o8、o15、o16、o18和o75，以及16 ug/剂量的o25b；第2
组(
‘
中剂量’)：4 ug/剂量的o2、o4、o8、o15、o16、o18和o75，8 ug/剂量的o1a和o6a，以及16 ug/剂量的o25b；第3组(
‘
低剂量’)：0.4 ug/剂量的o2、o4、o8、o15、o16、o18和o75，0.8 ug/剂量的o1a和o6a，以及1.6 ug/剂量的o25b。来自对照组(第4组)的动物仅接受盐水(0.9% (w/v)氯化钠溶液) (表5)。
[0304]
在第0天(免疫前)以及免疫后第14、27和42天评估抗体应答。使用类型特异性lps作为包被材料，通过elisa (总igg)测量由疫苗中包括的每种生物缀合物和载体蛋白质epa诱导的血清抗体水平。抗体滴度报告为ec50值，其对应于基于4参数逻辑非线性回归模型中绘制的12步滴定曲线的重复的半数最大有效浓度。功能活性通过opk进行确定。
[0305]
表 5. 实验组的描述。
[0306]
结果显示于图8中，并且概括于表6中。
[0307]
表6. 通过expec10v在nzw兔中诱导的大肠杆菌o-抗原特异性抗体应答的概括。
[0308]
深灰色方块显示了其中p值具有统计学显著性的血清型特异性抗体应答。浅灰色方块显示了其中p值没有统计学显著性(ns)的血清型特异性抗体应答。威尔科克森秩和检验伴随用于多重比较的邦弗朗尼校正。expec10v接种疫苗的动物(第1、2和3组)相对于盐水对照(第4组)的比较。*p≤0.05，**p≤0.01。
# p值在从对照组中排除离群动物后具有统计学显著性(敏感性分析)。
[0309]
对于o1a、o2、o4、o6a、o16、o18a和o25b，当与盐水对照相比时，高剂量的expec10v (第1组)在调查的所有时间点(免疫后第14、27和42天)诱导显著更高的igg抗体水平 (图8，表6)。在免疫后第27和42天观察到，当与盐水对照相比时，通过o8和o75缀合物诱导的显著
更高的抗体滴度(图8，表6)。
[0310]
对于o1a、o2、o4、o6a、o16和o25b，当与盐水对照相比时，中剂量(第2组)和低剂量(第3组)的expec10v在调查的所有时间点(免疫后第14、27和42天)诱导显著更高的抗体水平(图8，表6)。在免疫后第27和42天观察到，当与盐水对照相比时，通过o8、o18a和o75缀合物诱导的显著更高的抗体滴度，提示了兔中的加强剂量增加了对这些o血清型的应答(图8，表6)。
[0311]
对于o15缀合物，从对照组中省略离群动物的敏感性分析显示了，在免疫后第14、27和42天，当与盐水对照相比时，所有三种剂量的expec10v疫苗都诱导了抗体应答的显著增加(图8，表6)。
[0312]
在调查的所有时间点(第14、27和42天)，对于测试的expec10v的三种剂量(高、中和低)，通过载体蛋白质epa诱导的抗体显著高于盐水治疗的(对照)组中的epa抗体滴度(图8)。
[0313]
剂量间比较(未显示)显示了在疫苗接种后第14天，对于大多数测试的缀合物(o1a、o2、o4、o6a、o15、o16、o18a和o25b)，当与低剂量相比时，高剂量的expec10v诱导显著更高的抗体应答。对于o1a、o2、o4、o18a、o25b和o75，与低剂量相比，中剂量的expec10v也诱导显著更高的抗体应答。对于o8缀合物，expec10v的所有三种制剂在疫苗接种后第14天诱导相似的抗体水平。
[0314]
对于o1a、o2、o4、o16、o25b和o75缀合物，当与高剂量和中剂量的expec10v相比时，低剂量的expec10v在疫苗接种后第42天(在初免和两次加强剂量后)诱导抗体应答的显著增加。这些发现与用缀合物疫苗的其它经验一致，其中例如，在用肺炎球菌缀合物疫苗接种疫苗的婴儿中，没有观察到剂量以及对初次疫苗接种的抗体应答的量级之间的明确关系(poolman jt等人expert rev vaccines. 2013，12(12):1379-94)。
[0315]
对于o6a、o8和o15缀合物，在疫苗接种后第42天测试的三种剂量的expec10v之间没有显著差异。对于o18a缀合物，当与疫苗接种后第42天的中剂量相比时，高剂量的expec10v诱导显著更高的抗体应答。
[0316]
对于载体蛋白质(epa)，在疫苗接种后第14天，当与低剂量相比时，高剂量和中剂量的expec10v诱导显著更高的抗体应答。在疫苗接种后第42天，当与低剂量相比时，高剂量的疫苗也诱导显著更高的抗体应答。
[0317]
总之，在第0、14、27天时经由肌内注射施用的expec10v的三种制剂(高、中和低)在兔中是免疫原性的。
[0318]
迄今为止，对于血清型o1a、o2、o4、o6a、o15、o16和o25b，显示了在兔中通过这种疫苗诱导的能够杀死大肠杆菌菌株的功能性抗体。
[0319]
在进一步的实验中，作为毒理学研究的部分，制备了expec10v疫苗的gmp分批(关于生产，参见上文实施例8)，并且注射到nzw兔内(表7)。在这项研究中，nzw兔(雄性和雌性)接受了expec10v疫苗的3次肌内注射(0.6 ml) (第1、15和29天)，并且对照组接受了0.9% (w/v)氯化钠溶液(盐水)。疫苗的每种剂量含有血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a和o75的9.6 μg多糖(ps)，以及血清型o25b的19.2 μg ps，对应于105.6 μg总ps (176 μg总ps/ml)和382.8 μg的总epa (638 μg epa/ml)。从在治疗期前(第1天)以及免疫后第31和50天收集的样品中，确定针对o-抗原和载体蛋白质(epa)的igg滴度。
[0320]
当与仅接受盐水的对照组相比时，在接受expec10v的组中，在疫苗接种后第31和50天，观察到针对所有o-抗原和载体蛋白质epa的抗体应答的显著增加(图9，表8)。对于o1a血清型，当接种疫苗的动物与对照组进行比较时，在第1天(基线)也观察到显著更高的抗体应答。这些结果提示了，一些动物预暴露于大肠杆菌或具有与o1a-lps交叉反应的抗体。
[0321]
表7. nzw兔中使用的实验组和expec10v剂量。
[0322]
*对于血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b、o75，每种剂量(0.6 ml给药体积)分别含有9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:9.6:19.2:9.6 μg多糖(ps) (176 μg总ps/ml)。每种剂量含有382.8 μg epa蛋白(638 μg epa/ml)。
[0323]
表8. 作为毒理学研究的部分，expec10v在nzw兔中的免疫原性。
[0324]
通过expec10v诱导的抗体应答。浅灰色方块显示了与对照相比，其中在疫苗组中观察到抗体应答的显著增加的血清型。具有似然比检验的tobit模型。****p ≤ 0.0001。
[0325]
实施例11：在人中用expec10v疫苗的1/2a期试验目前，不存在可用于预防ied的疫苗。选择构成expec10v疫苗的血清型(o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75)，以解决由大多数临床相关expec菌株引起的侵袭性疾病，所述expec菌株也代表了引起抗微生物抗性ied的大多数expec分离株，包括st131。所选血清型代表了引起老年群体中的血流感染的10种流行的expec o-血清型，并且负责由expec引起的血流感染的大约70%。
[0326]
由于缀合物疫苗在侵袭性疾病的预防中的作用机制预计不受抗生素耐药机制的影响，因此认为expec10v疫苗提供了针对由药物抗性和药物敏感性o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75血清型引起的ied的保护。
[0327]
存在关于expec4v (较早的疫苗候选物)的先前临床经验，所述expec4v包含在expec10v中也发现的四种大肠杆菌o-抗原缀合物(o1a、o2、o6a和o25b)的子集。基于来自四项临床研究(两项完成1期的研究、一项完成2期的研究和一项正在进行的2期研究)的结果，expec4v由研究参与者良好耐受，并且在高达16
ꢀµ
g多糖(ps)/血清型(o1a、o2、o6a和o25b)的剂量下，未观察到疫苗相关的安全信号。大多数不良事件(ae)为1级和2级，报告了极少的3级ae。主要对于较高剂量的expec4v，观察到迟发性诉求的(solicited)局部ae (在疫苗接种后第5天后起始的ae)。在每项研究中，expec4v疫苗都显示为免疫原性的，证实了剂量依
赖性疫苗免疫应答、以及o-抗原特异性免疫球蛋白g (igg)滴度增加，如通过酶联免疫吸附测定(elisa)测量的。用expec4v优化的调理吞噬性杀死测定(opka)证实了抗体的功能活性。elisa和opka测试结果的共同分析显示了测定应答之间的关联性(在2期临床试验[研究4v-bac2001]中，对于第30天和第360天，皮尔森相关系数分别为≥0.61和≥0.48)，确证了使用elisa作为expec4v抗体滴度的主要测量并且预测功能性抗体活性。免疫原性数据的分析已证实了，在用expec4v接种疫苗后的三年内，免疫应答的持久性。目前还已观察到，来自用expec4v接种疫苗且具有高滴度的血清型特异性调理吞噬性抗体的人的血清，当被动转移到随后用o25b或o2血清型的大肠杆菌菌株进行腹膜内攻击的小鼠内时，能够介导体内保护(未显示)。因此，expec4v特异性调理吞噬性人抗体在体内介导细菌杀死，这与其它缀合物疫苗一致，其中提出的保护机制是通过诱导介导细菌杀死的调理吞噬性抗体。
[0328]
expec10v包括总共十种血清型，并且将60岁以上的成人中由expec引起的血流感染的覆盖率从约50% (expec4v)增加到大约70%。基于关于expec4v的临床经验，以及如上文实施例中讨论的expec10v的临床前数据，预计expec10v的施用还将在人中诱导针对大肠杆菌血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75的免疫应答。
[0329]
在健康状况稳定的60至85岁的人中进行了随机化、观察者盲法、首次人体1/2a期研究，以评估三种不同剂量的expec10v疫苗的安全性、反应原性和免疫原性(研究10v-bac1001)。研究设计包括2个队列：总共1,004个参与者纳入研究，其中队列1中具有健康状况稳定的年龄≥60至≤85岁的404个参与者(100个参与者/expec10v剂量)，并且队列2中具有在过去5年内具有uti史、健康状况稳定的年龄≥60岁的另外600个参与者。
[0330]
expec10v是开发中的10价疫苗候选物，其用于预防60岁以上的成人中的侵袭性肠外致病性大肠杆菌(expec)疾病(ied)。expec10v由分别与载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75的o-抗原多糖(ps)组成，所述载体蛋白质是遗传脱毒形式的衍生自铜绿假单胞菌的外毒素a (epa)，并且它的产生已在上文进行描述。o4 ps是葡糖基化形式，具有表1中的式(o4-glc )的结构。
[0331]
目标和终点队列1
ꢀ‑ꢀ
1/2a期观察者盲法时期，伴随标签公开的长期随访期(n=404)：
队列2
ꢀ‑ꢀ
双盲期伴随双盲长期随访期(n=600)：
总体设计这是包括两个队列的随机化、多中心、介入性研究。
[0332]
对于队列1，该研究具有观察者盲法、主动对照设计，并且包括年龄≥60至≤85岁、健康状况稳定、具有或没有uti史的总共404个成人参与者。关于队列1的研究设计由三个时期组成：最长28天的筛选期、具有在第1天时的疫苗接种的观察者盲法的181天随访期、以及从疫苗接种后第182天直到3年(第1096天)的标签公开的ltfu期(图10a)。仅来自expec10v所选剂量组的参与者(大约100个参与者)和来自prevnar 13组的参与者进展至ltfu期。队列1的结束是最后一个参与者的第3年就诊(第1096天)。
[0333]
对于队列2，该研究具有双盲、安慰剂对照设计，并且包括年龄≥60岁、健康状况稳定、在过去5年内具有uti史的总共600个成人参与者。在完成1/2a期初步分析和来自队列1的expec10v剂量选择后开始纳入。关于队列2的研究设计由三个时期组成：最长28天的筛选期、具有在第1天时的疫苗接种的双盲181天随访期、以及从疫苗接种后第182天直到3年(第1096天)的双盲ltfu期(图10b)。队列2中的所有参与者都进展至ltfu期。研究的结束是队列2中的最后一个参与者的第3年就诊(第1096天)。
[0334]
队列1：1期在队列1的1期，总共84个参与者遵循逐步剂量递增程序以交错方法纳入，伴随在从一个步骤进展到下一个步骤之前适当的安全性评估。本研究委托内部数据审查委员会(data review committee) (drc)，以审查这84个1期参与者的体格检查数据(基线以及靶向的)、基线人口统计数据、以及疫苗接种后14天的安全性数据(包括诉求的局部和全身ae、非诉求的ae、sae、临床实验室数据和生命体征)。在研究的这个时期，纳入参与者并在六个步骤中随机化：
步骤1：纳入4个哨兵参与者(sentinel participant)并随机化；expec10v低剂量组中的2个参与者(表11)，以及expec4v和prevnar 13组中各1个参与者。
[0335]
步骤2：纳入24个参与者并随机化；expec10v低剂量组中的18个参与者(表11)，以及expec4v和prevnar 13组中各3个参与者。
[0336]
步骤3：纳入4个哨兵参与者并随机化；expec10v中剂量组中的2个参与者(表11)，以及expec4v和prevnar 13组中各1个参与者。
[0337]
步骤4：纳入24个参与者并随机化；expec10v中剂量组中的18个参与者(表11)，以及expec4v和prevnar 13组中各3个参与者。
[0338]
步骤5：纳入4个哨兵参与者并随机化；expec10v高剂量组中的2个参与者(表11)，以及expec4v和prevnar 13组中各1个参与者。
[0339]
步骤6：纳入24个参与者并随机化；expec10v高剂量组中的18个参与者(表11)，以及expec4v和prevnar 13组中各3个参与者。
[0340]
按照分配的研究疫苗接种组，在第1天时，所有参与者接受expec10v (3种剂量中的1种)、expec4v或prevnar 13的单次肌内(im)注射。疫苗接种后24小时通过电话联系了在步骤1、3和5各自的4个哨兵参与者，以收集安全性信息。通过主要研究者(pi)、研究负责医生(srp)和申办者医疗负责人(sml)，审查了每组4个哨兵参与者的盲法疫苗接种后24小时安全性数据。在这种第2天哨兵安全性评估完成之前，停止关于下一步的另外参与者的随机化。
[0341]
在不存在任何临床显著发现的情况下，纳入另外24个参与者(对于步骤2、4和6)，并且随机化到三个研究疫苗接种组之一(表11)，以在第1天时接受expec10v (3种剂量中的1种)、expec4v或prevnar 13的单次im注射。
[0342]
在每个剂量水平(步骤2中的低剂量、步骤4中的中剂量和步骤6中的高剂量)下的另外24个参与者的疫苗接种后，在进展至下一个剂量水平或2a期之前，通过drc审查了在每个剂量水平下的所有28 (4 24)个参与者的疫苗接种后14天的安全性数据。
[0343]
队列1：2a期基于可接受的安全性和反应原性(在不存在任何安全性关注或符合特定研究暂停规则的任何事件的情况下)，如通过drc在审查最初84个参与者的疫苗接种后14天的安全性数据后确定的，来自队列1的剩余320个参与者在研究的2a期随机化并给药。纳入这另外320个参与者，并且以2:2:2:1:1的比率平行随机化到五个研究疫苗接种组之一，以在第1天时接受expec10v (3种剂量中的1种)、expec4v或prevnar 13的单次im注射(表11)。
[0344]
除执行关于最初84个参与者的14天安全性审查之外，drc还评估了在研究过程中队列1的安全性数据，并且审查了满足特定研究疫苗接种暂停规则的任何事件或可能出现的任何其它安全性问题。
[0345]
对于队列1，初步分析在所有参与者已完成第30天就诊(就诊4)或已提前中止时发生。最终分析在所有参与者已完成第181天就诊或已提前中止时发生。对于进展至标签公开的长期随访(ltfu)期(expec10v所选剂量组和prevnar 13组)的参与者，年度随访分析包括直到疫苗接种后第1年(第366天)、第2年(第731天)和第3年(第1096天)的就诊时间，收集的安全性和免疫原性数据(基于多重ecl的免疫测定和mopa)。
[0346]
队列2
在队列2中，在过去5年内具有uti史、健康状况稳定的年龄≥60岁的参与者中，评估所选剂量的expec10v (基于队列1的初步分析结果)的安全性、反应原性和免疫原性。对于队列2，该研究具有双盲、安慰剂对照设计，并且纳入总共600个参与者，且以2:1的比率平行随机化(expec10v组中的400个参与者和安慰剂组中的200个参与者)。
[0347]
按照分配的研究疫苗接种组(表12)，在第1天时，所有参与者接受所选剂量的expec10v或安慰剂的单次im注射。
[0348]
对于队列2，初步分析包括安全性和免疫原性数据，并且在所有参与者已完成第30天就诊(就诊4)或已提前中止时发生。最终分析在所有参与者已完成第181天就诊或已提前中止时发生。对于所有参与者，年度随访分析包括直到疫苗接种后第1年(第366天)、第2年(第731天)和第3年(第1096天)的就诊时间，收集的安全性和免疫原性数据(基于多重ecl的免疫测定和mopa)。
[0349]
使用宏基因组学在所选参与者子集中执行粪便样品分析，以评估expec10v对肠道菌群中病原体(如艰难梭菌)和expec10v血清型的流行率的作用。
[0350]
参与者数目总共1004个参与者纳入该研究中；队列1中的404个参与者和队列2中的600个参与者。
[0351]
干预组干预的描述expec10v：在磷酸盐缓冲溶液中的大肠杆菌生物缀合物疫苗，其含有分别与epa载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75的o-抗原ps。在第1天时，三种剂量的expec10v之一的单次0.5 ml im (三角肌)注射。
[0352]
expec4v：在盐水缓冲溶液中的大肠杆菌生物缀合物疫苗，其含有分别与epa载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o6a、o25b (4:4:4:8
ꢀµ
g ps/expec血清型)的o-抗原ps。在第1天时，expec4v的单次0.5 ml im (三角肌)注射。
[0353]
prevnar 13：个别地与无毒的白喉crm197蛋白连接的肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f和23f的荚膜抗原糖的无菌悬浮液。在单一剂量预充式注射器中供应的，在第1天时的单次0.5 ml im (三角肌)注射。
[0354]
安慰剂：生理盐水。在第1天时，安慰剂的单次0.5 ml im (三角肌)注射。
[0355]
expec研究干预材料在表9中描述。
[0356]
表9. bac1001mv expec 研究疫苗。
[0357]
epa=遗传脱毒形式的衍生自铜绿假单胞菌的外毒素a；ps=多糖expec4v由分别与epa载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o6a和o25b的o-抗原多糖(ps)组成。
[0358]
expec10v由分别与epa载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75的o-抗原多糖(ps)组成。
[0359]
剂量仅基于ps。epa (
µ
g)是测量的值。
[0360]
expec10v由10种单价原料药(ds)组成。对于这种临床研究，生产了2个不同浓度(中和高)的药物产品(dp) (表10)。第三个(低)浓度通过用稀释缓冲液1:1稀释高浓度在临床上获得，所述稀释缓冲液与制剂缓冲液相同。每种dp在以ph 7.0的磷酸钠/钾缓冲液(0.02% [w/w]聚山梨醇酯80、5% [w/w]山梨糖醇、10 mm甲硫氨酸)中配制。
[0361]
表10：用于1/2a期临床研究的expec10v疫苗的组成
epa=用作载体蛋白质的遗传脱毒的铜绿假单胞菌外毒素aa活性成分是由ps抗原和载体蛋白质(epa)组成的生物学合成的缀合物；剂量仅基于ps部分计算。
[0362]bꢀ“
低浓度”通过用稀释缓冲液1:1稀释“高浓度”在临床上获得安全性评估关键安全性评价包括诉求的局部和全身ae、非诉求的ae、sae、体格检查、生命体征测量和临床实验室测试。
[0363]
免疫原性评价所收集血清的关键免疫原性评价包括评价通过疫苗引发的expec10v和expec4v血清型特异性总igg抗体水平，如通过基于多重ecl的免疫测定测量的，以及expec10v和expec4v血清型特异性功能性抗体，如通过多重形式(mopa)的调理吞噬性杀死测定(opka)测量的。不执行通过prevnar 13引发的肺炎球菌抗体滴度的免疫原性评价。
[0364]
通过基于多重电化学发光(ecl)的免疫测定来测量由expec10v诱导的血清抗体的水平。这种测定将高结合碳电极组合在多点96孔形式的微孔板中，所述微孔板涂布有不同的大肠杆菌o-lps抗原或载体蛋白质epa。使用由sulfo-tag标记的二抗(抗人igg)检测血清
样品中存在的抗原特异性抗体的水平。sulfo-tag在电刺激的存在下发光，其强度与结合的igg抗体量成比例增加。该测定根据国际协调会议(international conference on harmonisation) (ich)建议是合格的。
[0365]
通过多重调理吞噬测定(mopa)测量由expec10v诱导的功能性抗体的水平。简言之，将热灭活的血清样品连续稀释，并且与对不同类型的抗生素特异性地抗性的不同大肠杆菌菌株一起温育。这之后，将人补体和吞噬细胞(hl60)加入反应中，并且在第二个温育期后，将反应混合物的等分试样转移到不同的pvdf亲水膜过滤板，所述过滤板含有补充有具体抗生素的培养基，其选择性地允许对该特定抗生素抗性的菌株生长。在过夜生长后，计数菌落形成单位(cfu)，以确定存活细菌的数目。该测定根据ich建议是合格的。
[0366]
对于如通过基于多重ecl的免疫测定和mopa测量的expec10v血清型抗体、以及如仅通过基于多重ecl的免疫测定测量的epa，对于所有免疫原性时间点，免疫原性的下述测量按研究疫苗接种组进行评估且制表：
‑ꢀ
具有血清抗体滴度自第1天(疫苗接种前)的≥2倍和≥4倍增加的参与者比例
‑ꢀ
几何平均滴度(gmt)
‑ꢀ
gmr：根据基线后/基线值计算的距离基线的倍数变化。
[0367]
对于ltfu时期，对于每个血清型提供了免疫原性的描述性概括。
[0368]
关于后期的剂量选择考虑了在队列1的初步分析时(第30天结果)可用的全部证据。
[0369]
表11：队列1：疫苗接种时间* expec10v由分别与载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75的o-抗原多糖(ps)组成，所述载体蛋白质是遗传脱毒形式的衍生自铜绿假单胞菌的外毒素a (epa)。
[0370]
** expec4v由分别与载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o6a和o25b的o-抗原多糖(ps)组成，所述载体蛋白质是遗传脱毒形式的衍生自铜绿假单胞菌的外毒素a (epa)。
[0371]
*** prevnar 13，肺炎球菌13价缀合物疫苗(白喉crm197蛋白)是个别地与无毒的白喉crm197蛋白连接的肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f和23f的
荚膜抗原糖的无菌悬浮液。
[0372]
表12：队列2：疫苗接种时间表
a expec10v由分别与载体蛋白质生物缀合的expec血清型o1a、o2、o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75的o-抗原多糖(ps)组成，所述载体蛋白质是遗传脱毒形式的衍生自铜绿假单胞菌的外毒素a (epa)。
[0373]
关于研究的队列2中纳入的参与者的随机化比率为2:1 (expec10v:安慰剂)。队列2中使用的expec10v剂量基于队列1的初步分析(第30天)结果。
[0374]
状态完成了上述研究的队列1的纳入和疫苗接种。该研究正在以盲法的方式进行。基于安全性数据的持续审查，并未鉴定重大安全性问题，并且expec10v疫苗具有可接受的安全性概况。
[0375]
队列1临床样品的免疫原性分析正在以盲法的形式进行。ecl数据经过100%验收质量限制(acceptance quality limit) (aql)检查且上传用于数据管理。mopa样品的分析正在进行中。数据揭盲和统计分析通过使用临床研究组织(cro)执行。
[0376]
一旦基于来自队列1的第30天结果的完成的初步分析已鉴定了用于队列2的expec10v剂量，就起始该队列的疫苗接种。
[0377]
本领域技术人员将了解，可以对上述实施方案进行改变，而不脱离其广泛的发明构思。因此，应理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案，而是预期覆盖如由本说明书定义的在本发明的精神和范围内的修改。
[0378]
序列seq id no: 1 (糖基化共有序列)asn-x-ser(thr)，其中x可以为除了pro之外的任何氨基酸seq id no: 2 (优化的糖基化共有序列)asp(glu)-x-asn-z-ser(thr)，其中x和z独立地选自除了pro之外的任何氨基酸seq id no: 3 (包含4个糖基化共有序列的epa载体蛋白质(epa-4))
seq id no: 4 (o4 gtrs氨基酸序列)mnnlimnnwcklsifiiafillwlrrpdiltnaqfwaedsvfwykdayengflsslttprngyfqtvstfivgltallnpdyapfvsnffgimirsviiwflfterfnfltlttriflsiyflcmpgldevhanitnahwylslyvsmiliarnpsskswrfhdiffillsglsgpfiifilaascfkfinnckdhisvrsfinfylrqpyalmivcaliqgtsiiltfngtrssaplgfsfdvissiissniflftfvpwdiakagwdnlllsyflsvsilscaafvfvkgtwrmkvfatlplliiifsmakpqltdsapqlptlingqgsryfvnihiaifsllcvyllecvrgkvatlfskiyltillfvmgclnfvitplpnmnwregatlinnaktgdvisiqvlppgltlelrkkseq id no: 5 (示例性o4 gtrs 核酸序列)atgaataatttaattatgaataactggtgtaaattatctatatttattattgcatttattttgctatggcttagaaggccggatatactcacaaacgcacaattttgggcagaagattccgttttctggtataaggacgcctatgagaacggattcttaagttcactaacaacgcctaggaatgggtatttccagactgtttctacatttatagttggtctgactgctttattaaatccagattatgcaccttttgtttctaatttttttggcataatgattcgctcagtaattatatggtttttatttacagaaagattcaacttcctcacattgactactaggattttcttatctatttattttctatgcatgcctggattggatgaagttcatgcaaatataacaaatgcacattggtatttgtcattatatgtatcaatgatcctgatagctcgcaatccaagttcaaaatcatggaggtttcatgatatattctttatcttgctatccgggctcagtggcccatttataattttcattttagcagcttcatgctttaaatttataaataattgtaaagatcatattagtgtaagatctttcataaatttctacttgcgtcagccatacgcattaatgattgtttgcgctttaattcaaggaacttctataattctaactttcaatggcacacgttcctcagcaccgctaggattcagttttgatgtgatttcgtctattatatcatcgaatatttttttatttacatttgtcccatgggatattgcaaaggctgggtgggataatttactgttatcttattttttgtctgtttcgattttgtcgtgtgcggcctttgtttttgttaaaggtacgtggcgaatgaaagtatttgcaactttaccattgctaattataatattttcaatggcaaaaccacaattgacagactcggcacctcaattgccaacacttattaatgggcaaggttcaagatacttcgtaaatatacatattgcgatattctctttgctatgtgtttacttacttgagtgcgtcagggggaaagtggcaactttattttccaaaatatacttaacaattttgctattcgtgatgggatgtttgaattttgttatcaccccactcccaaacatgaactggagggaaggtgctactttgattaataatgcaaaaactggtgatgtcatttcgattcaagtgctaccacctggcctaacacttgaactaaggaaaaaataaseq id no: 6 (示例性pglb序列(
‘
野生型’))mlkkeylknpylvlfamiilayvfsvfcrfywvwwasefneyffnnqlmiisndgyafaegardmiagfhqpndlsyygsslsaltywlykitpfsfesiilymstflsslvviptillaneykrplmgfvaallasiansyynrtmsgyydtdmlvivlpmfilffmvrmilkkdffslialplfigiylwwypssytlnvaliglfliytlifhrkekifyiavilssltlsniawfyqsaiivilfalfaleqkrlnfmiigilgsatliflilsggvdpilyqlkfyifrsdesan
ltqgfmyfnvnqtiqevenvdlsefmrrisgseivflfslfgfvwllrkhksmimalpilvlgflalkgglrftiysvpvmalgfgfllsefkaimvkkysqltsnvcivfatiltlapvfihiynykaptvfsqneasllnqlknianredyvvtwwdygypvryysdvktlvdggkhlgkdnffpsfalskdeqaaanmarlsveyteksfyapqndilktdilqammkdynqsnvdlflaslskpdfkidtpktrdiylymparmslifstvasfsfinldtgvldkpftfstaypldvkngeiylsngvvlsddfrsfkigdnvvsvnsiveinsikqgeykitpiddkaqfyifylkdsaipyaqfilmdktmfnsayvqmfflgnydknlfdlvinsrdakvfklkiseq id no: 7 (示例性gtra氨基酸序列；大肠杆菌w3110 yfdg，genbank: baa16209.1)mlklfakytsigvlntlihwvvfgvciyvahtnqalanfagfvvavsfsffanakftfkastttmrymlyvgfmgtlsatvgwaadrcalppmitlvtfsaislvcgfvyskfivfrdakseq id no: 8 (示例性gtrb氨基酸序列
–
大肠杆菌w3110 yfdh，genbank: baa16210.1)mkislvvpvfneeeaipifyktvrefeelksyeveivfindgskdatesiinalavsdplvvplsftrnfgkepalfagldhatgdaiipidvdlqdpieviphliekwqagadmvlakrsdrstdgrlkrktaewfyklhnkisnpkieenvgdfrlmsrdvveniklmpernlfmkgilswvggktdiveyvraeriagdtkfngwklwnlalegitsfstfplriwtyiglvvasvafiygawmildtiifgnavrgypsllvsilflggiqmigigvlgeyigrtyietkkrpkyiikrvkkseq id no: 9 (示例性o4 rfb基因座核苷酸序列
–ꢀ
o4-epa生产菌株bvec-l-00684f)atgacgaatttaaaagcagttattcctgtagcgggtctcgggatgcatatgttgcctgccactaaggcgatacccaaagagatgctaccaatcgtcgacaagccaatgattcagtacattgttgacgagattgtggctgcagggatcaaagaaatcctcctggtaactcacgcgtccaagaacgcggtcgaaaaccacttcgacacctcttatgagttagaatcactccttgagcagcgcgtgaagcgtcaactgctggcggaagtacagtccatctgtccgccgggcgtgaccattatgaacgtgcgtcagggcgaacctttaggtttaggccactccattttgtgtgcgcgacctgccattggtgacaacccatttgtcgtggtactgccagacgttgtgatcgacgatgccagcgccgacccgctacgttacaaccttgctgccatgattgcacgtttcaacgaaacgggccgcagccaggtgctggcaaaacgtatgccgggtgacctctctgaatactccgtcatccagactaaagagccgctggaccgtgagggtaaagtcagccgcattgttgaatttatcgaaaaaccggatcagccgcagacgctggactcagacatcatggccgtaggtcgctatgtgctttctgccgatatttggccggaactggaacgtactcagcctggtgcatggggacgtattcagctgactgatgctattgccgagctggcgaaaaaacaatccgttgatgcaatgctgatgaccggcgacagttacgactgcggcaaaaaaatgggctatatgcaggcgtttgtgaagtatggcctacgcaacctgaaagaaggggcgaagttccgtaaaggtattgagaagctgttaagcgaataatgaaaatctgaccggatgtaacggttgataagaaaattataacggcagtgaaaattcgcagcaaaagtaatttgttgcgaatcttcctgccgttgttttatataaaccatcagaataacaacgagttagcagtagggttttattcaaagttttccaggattttccttgtttccagagcggattggtaagacaattagcgtttgaatttttcgggtttagcgcgagtgggtaacgctcgtcacatcataggcatgcatgcagtgctctggtagctgtaaagccaggggcggtagcgtgcattaatacctctattaatcaaactgagagccgcttatttcacagcatgctctgaagtaatatggaataaattaagtgaaaatacttgttactggtggcgcaggatttattggttcagctgtagttcgtcacattataaataatacgcaggatagtgttgttaatgtcgataaattaacgtacgccggaaaccgggaatcacttgctgatgtttctgattctgaacgctatgtttttgaacatgcggatatttgcgatgcacctgcaatggcacggatttttgctcagcatcagccggatgcagtgatgcacctggctgctgaaagccatgttgaccgttc
aattacaggccctgcggcatttattgaaaccaatattgttggtacttatgtccttttggaagccgctcgcaattactggtctgctcttgatagcgacaagaaaaatagcttccgttttcatcatatttctactgacgaagtatatggtgatttgcctcatcctgacgaggtaaataatacagaagaattacccttatttactgagacaacagcttacgcgccaagcagcccttattccgcatccaaagcatccagcgatcatttagtccgcgcgtggaaacgtacctatggtttaccgaccattgtgactaattgctctaacaattatggtccttatcatttcccggaaaaattgattccattggttattctcaatgctctggaaggtaaagcattacctatttatggtaaaggggatcaaattcgcgactggctgtatgttgaagatcatgcgcgtgcgttatataccgtcgtaaccgaaggtaaagcgggtgaaacttataacattggtgggcacaacgaaaagaaaaacatagatgtagtgctcactatttgtgatttgctggatgagattgtaccgaaagagaaatcttatcgtgagcaaatcacttatgttgccgatcgtccgggacacgatcgccgttatgcgattgatgctgagaatattggtcgcgaattgggatggaaaccacaggaaacgtttgagagcgggattcggaagacagtggaatggtatctgtccaatacaaaatgggttgataatgtgaaaagtggtgcctatcaatcgtggattgaagagaactatgagggccgccagtaatgaatatcctcctttttggcaaaacagggcaggtaggttgggaactacagcgtgctctggcacctctgggtaacttgattgctcttgatgttcattccactgattattgtggcgatttcagtaaccccgaaggtgtggctgaaaccgtcaaaaaaattcgcccagatgttattgttaatgctgctgctcataccgcggtagataaggctgagtcagaaccagaatttgcacaattactcaatgcgaccagcgttgaagcaattgcaaaagcggctaatgaagttggggcttgggtaattcattactcaactgactacgtcttccctggaaatggcgacatgccatggctcgagactgatgtaaccgctccgctcaatgtttatggcaaaaccaaattggctggagaaagagcattacaagaacattgcgcaaagcatcttattttccgtaccagctgggtatatgcaggtaaaggaaataactttgccaaaacaatgttacgtctggcaaaagagcgcgaagaactggctgtgataaacgatcagtttggcgcaccaacaggtgctgaattgctggctgattgcaccgctcatgccattcgcgtggcattaaaaaaaccagaagttgctggcttgtaccatctggtagcaaatggcacaacaacctggcacgattacgccgcgctagtattcgaagaagcccgtaaagcagggattgaccttgcacttaacaaactcaacgccgtaccaacaacggcttatcctactccagcccgccgtcctcataattctcgcctcaataccgaaaagtttcagcagaactttgcgcttgtcttgcctgactggcaggtgggcgtgaaacgtatgctcaacgaattatttacgactacggcaatttaacaaatttttgcatctcgctcatgatgccagagcgggatgaattaaaaggaatggtgaaatgaaaacgcgtaaaggtattattctggctggtggttccggcactcgtctttatcctgtgacgatggcagtgagtaaacaactgctgccgatttatgataagccgatgatttattatccgctttcaacgcttatgttagcgggtattcgcgatattcttattatcagtacgccacaggatacaccgcgtttccaacaattgttgggggacgggagtcagtgggggcttaatctacagtataaagtacaaccgagtccggatggcctggcgcaagcgtttattattggtgaagactttattggtggtgatgattgtgcactcgtacttggcgataatatcttctatggacacgacttgccgaaattaatggaagctgctgttaacaaagaaatcggtgcaacggtatttgcttatcacgtcaatgatcctgaacgttatggtgtcgtggagtttgataataacggtactgcaattagcctggaagaaaaaccgctggaaccaaaaagtaactatgcggttactgggctttatttctatgacaatgatgttgtagaaatggcgaaaaaccttaagccttctgcccgtggcgaactggaaattaccgatattaaccgtatttatatggagcagggacgtttgtctgtcgctatgatggggcgtggttatgcctggttggatactggtacacatcaaagtcttattgaagcaagtaacttcattgccaccattgaagagcgtcagggattaaaggtatcttgcccggaagagattgcttaccgtaaagggtttattgatgctgagcaggtgaaagtattagccgaaccgctgaagaaaaatgattatggtcagtatctgctaaaaatgattaaaggttattaataaaatgaacgtaattaaaactgaaattcctgatgtgctgatttttgaaccaaaagtttttggtgatgaacgtggcttcttttttgagagttttaaccagaaagtatttgaagaagctgtaggacggaaggttgaatttgttcaggataaccattctaagtctaaaataaatgtattgcgtgggatgcattatcaaacacaaaatactcaaggaaaactggttcgggtaatttctggttcagtatatgatgttgccgtagatttaagagaaaaatcaaagacatttggcaaatgggtgggtgtagaattatctgggaataataaaagacaattgtggatccccgaag
gttttgcccatggtttttatgtgttggaggagaataccgaatttgtttataaatgtaccgatacttataaccctgctcatgaacacacattgctatggaatgatccaactatcaatataagttggccaatcatacaaaactgcaagccaattatttctgaaaaagatgctaatggacatcttttttcacataaaacctatttctgaaatgcaatattatgagtttaattagaaacagtttctataatattgctggttttgctgtgccgacattagttgcagtccctgctttggggattcttgccaggctgcttggaccggagaattttggacttttcacactagcattcgctttgataggatatgcaagtattttcgacgccgggattagtcgagctgtaatcagagaaatcgctctttatcgagaaagtgaaaaagagcaaatacaaattatttcgacagcaagtgtaatcgtactattcttaggggtggttgcagctttgttactttattttagtagtaataaagttgttgagttattgaatgttagttccgtttatattgaaacagcagtgcgtgcattctctgttatttcatttataatacctgtgtatctgattaaccagatttggcttggttatctggaagggctagaaaaatttgcaaatataaatgttcagagaatgatttctagcacaagcttggctatattaccagtgatattttgttattacaatccctcgttgctttatgctatgtatgggttggtggttgggcgtgtgatttcatttttgattagcgcaataatttgtcgagatattattcttaaaagtaaactttactttaatgtggcaacttgcaatcgtcttatctcttttggtggatggataacagttagtaatatcataagcccaatcatggcatatttcgaccgctttatcatctctcatattatgggggcttcgagaattgcattttatacagcgccctcagagggtgtatcaaggttaattaatatcccatatgctttggcaagagctctatttcctaaattggcatatagcaataatgatgatgaacgaaaaaaattacaactacagagctacgcaattataagcattgtatgtctacccatagttgttattggtgtcatttttgcctcattcataatgacaacatggatgggacctgattatgccttagaagcagcaactatcatgaaaatacttcttgctggttttttctttaactctttagcgcaaataccttatgcatacttgcaatctatcggaaagtcaaaaattaccgcatttgtgcatctcatagaacttgcgccatacttattattattgtattacttcacaatgcatttcggcataattggcacggcaatcgcttggtcacttagaacattttgtgattttgttatactactttcgatatcgagaagaaaatgattgcggttgatattgcgcttgcaacctacaatggtgctaattttattcggcaacagattgaatctatccagaaacaaacttatagaaattggcgtcttataataagtgatgataactcgagtgatgatactgttgatattattaaggatatgatgtctaacgacagtcgtatctatttggtaggaaataaaagacaaggaggggttattcagaactttaattatgctctttcacaaactacatctgaaattgtgttactatgtgaccaggatgacatttggccggaggagcgtctggaaattcttatagataaatttaaggccttgcagcgtaatgattttgttccggcaatgatgtttactgatttgaaattagtagacgaaaataattgtttgattgcagaaagtttttatcgaacgaataatattaatccacaagataatctgaaaaataataatcttctctggcgttcaacggtatatggctgtacttgcatcatgaataagaaacttgttgatattgcattgcctatacctacatatgcacatatgcatgatcaatggttggcattattagcgaagcaatatggtaacattttttatttcgactatgcgtctgttcgttataggcaacattctacaaatgttgttggtggtagaaataaaacgccatttcaaaaatttaattccatacaaaaaaacctaaaaaggattaatttgctagtggatagaactgttgctttaattaaatcaaataacgatttctatccagggaataaaatggaaaataaaattgattacttaaaatttggagtgaatgaagtattaccttatctttttaaaggaaacaagaaagttttttcactttgtgtattaattagtttggcattacaaaaatgatatatttattatttttttttgcactgtttatgatctgtacgtttttaacacacaggcgacaggcattatatgttgtatctgcgttagtatttctttttttggctttaacctatccatcaggaggggactggataggttattttctccattatgactgcatggttaatgagcagtgtaataatggttttataatgtttgaacctggatatgaattaattgtttccttatttggatatttgggatttcagacaattattatttttatagccgctgtaaatgtaattctaatattaaattttgcaaagcattttgaaaacggaagttttgttattgttgcgataatgtgcatgttcctttggagtgtttatgttgaggcgattagacaggctctggccttatctatagttatatttgggattcattctctttttttgggtagaaaaaggaaatttataacattagtattatttgcgtcaactttccatataactgctttgatttgttttcttctaatgactcctctattttcaaagaaattaagcaagataataagttatagcctattaattttcagtagcttctttttcgctttttctgaaaccatattaagtgcactccttgcaattttgccagaaggatccattgcca
gtgaaaaattaagtttttacttagcaaccgagcaatacaggccacagttatctattgggagtggcactattcttgacattatacttatttttctgatatgtgtaagttttaaacgaataaagaaatatatgctcgctaattataatgctgcaaatgagatattgcttattggttgctgtctttatatttctttcggtatttttatcgggaaaatgatgccagttatgactcgcattggttggtatggttttccatttgttatagtacttctttatattaacttgggttattcagaatattttaagaggtatataaataaaagagggtgtgggtatagcaaattattaattgctttttattttttgctacaaattttgcgaccattaacatatgattatagctattataatataatgcaccaggatactttgctgaataggtttgatgcattagatgatgcatcattaagacaatcagcgaagagaaaatgtttcgatttgggaaagataggatatggtttcttatgtagtatataatatcctgcattcattcggataatttcctatggaagtgtcctttgctctgtctgtcctcatttgttgaaattttatgttaataagaagctttagataaccacttaggaactgtatgtttgatctgtccaaaaattatattattgtaagtgcgacggcgctggcttccggaggtgcattaactatattaaagcaatttataaaacatgcatcacaaaattcaaatgactatattatgtttgtatctgcgggattggagttgccggtctgtgataacatcatttacatagaaaacacaccaaaaggatggttgaaaagaatatattgggattggttcggttgtcggaagtttatctcggaacataagattaacgttaagaaagtaatttctctacaaaattccagtttgaatgttccttacgaacagattatttacttgcaccagccaattccttttagtaaagttgattcttttttaaaaaatatcacatccgataacgtaaagctttttttatataaaaagttttattcctattttatatttaaatatgtgaatgccaatacaaccatcgtagtgcaaacgaattggatgaaaaaaggagtgctggagcaatgtgataaaattagtaccgaaagggtccttgttataaaacctgatatcaaagcatttaataatactaattttgatgtagatatggatgtatctgcaaaaacactcttatatccagcgacaccacttacctataaaaatcatttggtcattctgaaggcgttggttattttaaagaaaaagtattttatagatgatctgaaattccaagtgacttttgaaaagaataggtacaaaaattttgataagtttgtgcaattaaataacttaagcaaaaacgttgattatctcggcgttctttcatactcgaacttgcaaaaaaaatatatggcggcatctttaatcgtttttcctagctatatcgaatcatatgggttaccactcatcgaagctgctagtttaggaaaaaaaatcattagtagtgatcttccttatgcccgggatgttttaaaggattatagcggcgtagattttgtaatttacaataatgaagatggctgggctaaggcgttgtttaatgttttaaatggcaattcgaagctcaattttaggccttatgaaaaagatagtcgttcatcttggccacagttcttctctattttgaaataaggtgtattatgtttaatggtaaaatattgttaattactggtggtacggggtctttcggtaatgctgttctaagacgttttcttgacactgatatcaaagaaatacgtattttttcccgggatgaaaaaaaacaagatgacatgaggaaaaaatataataatccgaaacttaagttctatataggtgatgttcgcgactattcgagtatcctcaatgcttctcgaggtgttgattttatttatcatgctgcagctctgaagcaagtaccttcctgcgaattccacccaatggaagctgtaaaaacgaatgttttaggtacggaaaacgtactggaagcggcaatagctaatggagttaggcgaattgtatgtttgagtacagataaagctgtatatcctatcaatgcaatgggtatttccaaagcgatgatggaaaaagtaatggtagcaaaatcgcgcaatgttgactgctctaaaacggttatttgcggtacacgttatggcaatgtaatggcatctcgtggttcagttatcccattatttgtcgatctgattaaatcaggtagaccaatgacgataacagaccctaatatgactcgtttcatgatgactctcgaagacgctgttgatttggttctttacgcatttgaacatggcaataatggtgatatttttgtccaaaaggcacctgcggctaccatcgaaacgttggctattgcactcaaagaattacttaatgtaaaccaacaccctgtaaatataatcggcacccgacacggggaaaaactgtacgaagcgttattgagccgagaggaaatgattgcagcggaggatatgggtgattattatcgtgttccaccagatctccgcgatttgaactatggaaaatatgtggaacatggtgaccgtcgtatctcggaagtggaagattataactctcataatactgataggttagatgttgagggaatgaaaaaattactgctaaaacttccttttatccgggcacttcggtctggtgaagattatgagttggattcataatatgaaaattttagttactggcgctgcagggtttatcggtcgaaatttggtattccggcttaaggaagctggatataacgaactcattacgatagatcgtaactcttctttggcggatttagagcagggacttaagcaggcagattttatttttcaccttgctggggtaaatcgtcccgtgaaggagtgtgaatttgaagagggaaat
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–ꢀ
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seq id no: 16 (示例性o16 rfb基因座核苷酸序列
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seq id no: 18 (示例性o25b rfb基因座核苷酸序列
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