大肠杆菌O-抗原多糖的生物缀合物、其生产方法及其使用方法与流程

技术特征：
1.一种与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含式(o4-glc )的结构：其中n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。2.权利要求1的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质中的糖基化位点中的asn残基共价连接，所述糖基化位点包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列。3.权利要求1或权利要求2的生物缀合物，其中所述载体蛋白质选自脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)、大肠杆菌鞭毛蛋白(flic)、crm197、麦芽糖结合蛋白(mbp)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素a、聚集因子a、聚集因子b、大肠杆菌热不稳定肠毒素、大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、匙孔
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血蓝蛋白(klh)、铜绿假单胞菌pcrv、脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白(ompc)、以及来自不可分型的流感嗜血杆菌的蛋白d，优选地其中所述载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)，优选包含1至20个，优选1至10个，优选2至4个具有seq id no: 1的糖基化共有序列，所述共有序列优选具有seq id no: 2，更优选地其中所述载体蛋白质包含四个糖基化共有序列(epa-4)，更优选地其中所述载体蛋白质包含seq id no: 3。4.一种组合物，其包含权利要求1-3中任一项的生物缀合物。5.权利要求4的组合物，其包含与载体蛋白质共价连接的至少一种另外的抗原多糖。6.权利要求5的组合物，其中所述至少一种另外的抗原多糖选自大肠杆菌o1a抗原多糖、大肠杆菌o2抗原多糖、大肠杆菌o6a抗原多糖、大肠杆菌o8抗原多糖、大肠杆菌o15抗原多糖、大肠杆菌o16抗原多糖、大肠杆菌o18a抗原多糖、大肠杆菌o25b抗原多糖和大肠杆菌o75抗原多糖，优选地其中(i)所述大肠杆菌o1a抗原多糖包含式(o1a)的结构：(ii)所述大肠杆菌o2抗原多糖包含式(o2)的结构：；(iii)所述大肠杆菌o6a抗原多糖包含式(o6a)的结构：
；(iv)所述大肠杆菌o8抗原多糖包含式(o8)的结构：；(v)所述大肠杆菌o15抗原多糖包含式(o15)的结构：；(vi)所述大肠杆菌o16抗原多糖包含式(o16)的结构：；(vii)所述大肠杆菌o18a抗原多糖包含式(o18a)的结构：；(viii)所述大肠杆菌o25b抗原多糖包含式(o25b)的结构：；和(ix)所述大肠杆菌o75抗原多糖包含式(o75)的结构：，其中每个n独立地为1至100，优选3至50的整数，例如5至40，例如7至25，例如10至20。7.权利要求6的组合物，其中每种载体蛋白质是包含seq id no: 3的epa。8.权利要求6或7中任一项的组合物，其至少包含各自与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a、o2、葡糖基化o4、o6a、o8、o15、o16、o18a、o25b和o75抗原多糖。9.一种组合物，其包含：(i)与包含seq id no: 3的脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa-4载体蛋白质)共价连
接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含式(o4-glc )的结构；(ii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o1a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o1a抗原多糖包含式(o1a)的结构；(iii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o2抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o2抗原多糖包含式(o2)的结构；(iv)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o6a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o6a抗原多糖包含式(o6a)的结构；(v)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o8抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o8抗原多糖包含式(o8)的结构；(vi)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o15抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o15抗原多糖包含式(o15)的结构；(vii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o16抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o16抗原多糖包含式(o16)的结构；(viii)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o25b抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o25b抗原多糖包含式(o25b)的结构；和(ix)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o75抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o75抗原多糖包含式(o75)的结构，其中所述式(o4-glc )、(o1a)、(o2)、(o6a)、(o8)、(o15)、(o16)、(o25b)和(o75)的结构各自显示于表1中，并且每个n独立地为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20，所述组合物优选进一步包含：(x)与epa-4载体蛋白质共价连接的大肠杆菌o18a抗原多糖的生物缀合物，其中所述大肠杆菌o18a抗原多糖包含表1中所示的式(o18a)的结构，并且n为1至100的整数，优选3至50，例如5至40，例如7至25，例如10至20。10.一种在受试者中诱导针对大肠杆菌葡糖基化o4抗原的抗体的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-3中任一项的生物缀合物、或权利要求4-9中任一项的组合物。11.一种针对大肠杆菌，特别是肠外致病性大肠杆菌(expec)给受试者接种疫苗的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-3中任一项的生物缀合物、或权利要求4-9中任一项的组合物。12.一种用于产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的重组宿主细胞，其中所述葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100，优选3至50，例如5至40的整数，所述宿主细胞包含：(i)大肠杆菌o4抗原多糖的rfb基因簇的核苷酸序列；(ii)编码与seq id no: 4具有至少80%序列同一性的葡糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述葡糖基转移酶能够修饰大肠杆菌o4抗原多糖，以产生大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖；(iii)编码分别与seq id no: 7和8具有至少80%的序列同一性的移位酶和糖基转移酶的核苷酸序列，其中所述移位酶能够移位细菌萜醇连接的葡萄糖，并且所述糖基转移酶能
够使细菌萜醇葡糖基化；(iv)编码载体蛋白质的核苷酸序列；和(v)编码寡糖基转移酶的核苷酸序列，所述寡糖基转移酶能够将大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖与载体蛋白质共价连接，以产生生物缀合物。13.权利要求12的重组宿主细胞，其中：所述葡糖基转移酶具有seq id no: 4；所述寡糖基转移酶包含seq id no: 6，优选包含氨基酸突变n311v的seq id no: 6，更优选包含氨基酸突变y77h和n311v的seq id no: 6的氨基酸序列；和所述载体蛋白质包含至少一个糖基化位点，其包含具有seq id no: 1，优选具有seq id no: 2的糖基化共有序列，优选地其中所述载体蛋白质是脱毒的铜绿假单胞菌外毒素a (epa)，更优选地其中所述epa包含1-10个，优选2-4个糖基化位点，所述糖基化位点各自包含具有seq id no: 2的糖基化共有序列，更优选地其中所述载体蛋白质是具有四个糖基化共有序列的epa (epa-4)，更优选地其中所述载体蛋白质包含seq id no: 3。14.权利要求12或13中任一项的重组宿主细胞，其为大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌k-12菌株，例如菌株w3110。15.一种产生与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖的生物缀合物的方法，其中所述大肠杆菌葡糖基化o4抗原多糖包含如表1中所示的式(o4-glc )的结构，其中n为1至100，优选3至50，例如5至40的整数，所述方法包括在用于生物缀合物产生的条件下，培养权利要求12-14中任一项的重组宿主细胞。16.一种生物缀合物，其通过权利要求15的方法产生。17.一种组合物，其包含权利要求16的生物缀合物。18.根据权利要求9的组合物，其中所述o25b抗原多糖的生物缀合物存在于组合物中的浓度为任何其它生物缀合物的浓度的约1.5-6倍，例如约2至4倍。19.根据权利要求18的组合物，其中所述o1a:o2:葡糖基化o4:o6a:o8:o15:o16:o18a:o25b:o75的生物缀合物以按多糖的重量计1:1:1:1:1:1:1:1:2:1或2:1:1:2:1:1:1:1:4:1的比率存在。20.根据权利要求18或19中任一项的组合物，其中所述o25b抗原多糖的生物缀合物的浓度为2至50 μg/ml，优选8至40 μg/ml，例如16-32 μg/ml。

技术总结
提供了与载体蛋白质共价连接的大肠杆菌葡糖基化O4抗原多糖的生物缀合物及其组合物。还提供的是用于产生生物缀合物的重组宿主细胞，以及使用重组宿主细胞产生生物缀合物的方法。重组宿主细胞含有编码葡糖基转移酶的核酸，所述葡糖基转移酶能够用葡萄糖分支修饰大肠杆菌O4抗原，以产生葡糖基化O4抗原多糖。本文所述的大肠杆菌葡糖基化O4抗原多糖的生物缀合物可以单独使用或者与一种或多种另外的大肠杆菌O-抗原多糖组合使用，以诱导针对大肠杆菌葡糖基化抗原的抗体，并且针对肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)给受试者接种疫苗。大肠杆菌(ExPEC)给受试者接种疫苗。大肠杆菌(ExPEC)给受试者接种疫苗。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
技术研发日：2020.03.18
技术公布日：2022/1/10