miR2911在制备抗EV71的药物中的应用的制作方法

mir2911在制备抗ev71的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物药物领域，涉及mir2911在制备抗ev71的药物中的应用。


背景技术：

2.肠道病毒71型(enterovirus 71，ev71)属于小rna病毒科(picornaviridae)，人类肠道病毒a组。ev71是手足口病(hand,foot,and mouth disease,hfmd)最主要的病原体之一，我国报告的hfmd病例中，40％左右是由于ev71感染引起的，重症和死亡的hfmd病例中，ev71 感染的构成比更达到74％和93％。hfmd一年四季都可发生，春夏多发且主要感染5岁以下儿童，急性起病，潜伏期3-5天，大多数患儿以发热和手、足和口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，该病为自限性疾病，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可能会出现中枢神经系统、呼吸系统损害，引发无菌性脑膜炎、脑炎、急性驰缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，容易发生死亡。ev71感染疾病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。
3.ev71血清型多，抗原易发生变异，对一般抗生素不敏感，因此目前临床上并没有针对ev71 感染的特效药，只能对症治疗。外源性干扰素、il-2等能抑制病毒复制，提高机体细胞免疫功能，但费用昂贵，目前仍在基础研究和临床试验阶段。常用的抗病毒西药主要有病毒唑、利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦等，有一定疗效但不良反应大，长期应用对机体损害大且存在耐药性。我国自主研发的ev71灭活疫苗虽已批准上市，但其为二类疫苗且尚未在全国范围内推广，临床预防效果仍不明确。
4.中药金银花为忍冬科植物忍冬(lonicera japonica thunb)的干燥花蕾，于1963年版中国药典首次收载。金银花性甘、寒，归肺、心、胃经，其药用历史悠久，有“中药中的抗生素”之称，具有清热解毒、疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒和温热发病。根据文献资料，金银花入药最早出现在晋代葛洪的《肘后备急方》中，以“忍冬”为名，其后陶弘景的《名医别录》中也有记载，“忍冬，味甘温，无毒，列为上品，主治寒热身肿”。而“金银花”这一名词则首载于宋代的《苏沈内翰良方》，“其四月开花，极芬，香闻数步，除开白色，数日则变黄，每黄白相间，故名金银花”。在宋代及以前多以忍冬的藤、叶入药，而到了明代，对花的应用越来越多，并逐渐发展至茎、叶和花并用。李时珍的《本草纲目》记载，“忍冬茎叶及花功用皆同。昔人称其治风、除胀、解痢为要药，后世称其消肿，散毒、治为要药”。而明代以后，随着人们对温病学的认知，对金银花功效的掌握更加全面，更强调用花，清朝张璐的《本经逢源》中写道，“金银花主下痢脓血，为内外臃肿之要药。解毒祛脓，泻中有补，痈疽溃后之圣药”。《得配本草》也写道“藤、叶皆可用，花尤佳”。后来，忍冬的茎叶逐渐分化为另一种独立的药材——忍冬藤。
5.近年来，中外学者对金银花化学成分和生物活性物质研究较多，其现代药理学研究表明，金银花具有广谱抗菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝利胆、止血等药理作用。然而，现有研究成果对于金银花抗病毒的有效成分主要集中于其含有的绿原酸、异绿原酸和咖啡酰奎宁酸等化学单体，对于这些化学单体组分以外的抗病毒物质，目前几乎未见报道，对于金银
花抗ev71的详细分子机制也尚未阐明。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供mir2911在制备抗ev71的药物中的应用。
7.本发明的另一目的是提供金银花总rna提取物在制备抗ev71的药物中的应用。
8.本发明的目的可通过如下技术方案实现：
9.mir2911在制备抗ev71的药物中的应用。
10.金银花总rna提取物在制备抗ev71的药物中的应用。
11.一种抗ev71的药物组合物，其特征在于包含mir2911及药用辅料。
12.有益效果：
13.本发明首次发现并提出传统中药金银花抗ev71病毒的主要组分是其中含有的高稳定性高丰度的mir2911，可为中药金银花抗ev71病毒的研究提供基于植物mirna的新思路，还可能为临床治疗ev71重症患者提供基于mirna的新方法。
附图说明
14.图1.金银花水提物和绿原酸抗ev71效果。
15.图2.金银花和金银花汤中小rna高通量测序结果。(a)干金银花中mirna分布；(b)金银花汤中mirna分布。
16.图3.金银花干花和鲜花及相应汤剂中mir2911含量的检测。(a)northern blot检测结果；(b) real-time rt-pcr检测结果。
17.图4.mir2911稳定性研究。(a)mir167(control)和mir2911在热水和血清中稳定性试验；(b) 金银花提取mir2911，合成mir2911及两种突变mir2911在血清中稳定性试验。
18.图5.靶点验证。(a)靶点预测；(b)luciferase assay。
19.图6.靶点验证免疫共沉淀实验。
20.图7.mir2911对ev71抑制作用预实验
具体实施方式
21.实施例1绿原酸和金银花水提物在细胞水平抗ev71预实验
22.在使用终浓度为20ug/ml的绿原酸时，培养物中的病毒滴度与pbs组无显著差异，而加入金银花水提物(细胞培养液含约0.2g干花/ml)具有较强的抑制ev71病毒作用(图1)。以上预实验提示，金银花抗ev71有效物质并非绿原酸，还有其它有效成分。
23.实施例2金银花中小rna高通量测序
24.用solexa深度测序方法检测金银花及金银花汤剂中是否能稳定存在高丰度的mir2911。我们用10克金银花及10克金银花煎制后的总rna用植物总rna提取试剂盒(bioteke,rp3311)进行提取。将这些rna中小于30个碱基的小rna用15％尿素变性聚丙烯酰胺电泳分离并纯化回收。将这些小rna两端加上接头后预扩增，最后用illumina genome analyzer深度测序。结果提示金银花中存在高丰度的多种植物mirna(包括mir2911)，但经过传统方法煎制后，只有mir2911 仍具有较高含量，其余植物mirna都基本降解，提示
mir2911具备高丰度和高稳定性，为其抗ev71病毒提供了基本的可能性(图2)。
25.实施例3mir2911在不同样本中含量检测
26.首先根据mir2911序列，分别合成特异性茎环taqman探针及引物，用real-time rt-pcr 方法检测金银花及金银花汤剂中所提取的总rna中mir2911的绝对浓度，具体方法如下：用植物总rna提取试剂盒(bioteke,rp3311)提取金银花及金银花汤中总rna，用amv及特异性rt引物将2μg rna逆转录成cdna(20μl反应体系)，取2μl cdna按如下条件进行real-timepcr检测：95℃2min；95℃15s，58℃30s，72℃1min，40个循环。根据检测结果，用人工合成mir2911做标准曲线计算样本中mir2911的绝对含量。
27.为进一步确认real-time rt-pcr结果，我们用northern blot方法对样本中mir2911加以检测。我们将从10克金银花及10克金银花煎制后的总rna用尿素变性page胶分离，转膜固定后与地高辛标记的对应探针杂交24小时，洗膜后曝光，显影，根据rna marker判断在20nt 处是否有特异性杂交信号。此外，我们拟用30pmol、7.5pmol、1.5pmpl和0.75pmol rna标准品作为对照，以确定mir2911相对含量。
28.对金银花和金银花汤中mir2911的含量用northern blot和real time rt-pcr检测，发现在金银花干花和鲜花及相应汤剂中，都存在较高浓度的mir2911(图3)。
29.实施例4
30.以mir167作为对照，发现其在热水及血清中都具有很高的稳定性(图4a)。关于其高稳定性的成因，我们推测是由于其本身序列高gc含量所致(ggccgggggacggacuggga)。根据推测，我们合成了两种在不同位置引入突变的mir2911突变rna，发现提取于金银花和人工合成的mir2911在血清中都具有高稳定性，而突变后的rna由于其gc含量降低，很容易降解，提示我们mir2911本身的序列特点是其高稳定性的原因(图4b)。
31.实施例5
32.(1)mir2911在ev71病毒中靶基因生物信息学预测
33.将ncbi数据库中ev71中国流行株(ev71 brcr株)3
’-
utr序列和mir2911序列(5
′ꢀ-
ggccgggggacggacuggga-3
′
)分别导入rnahybrid在线软件，设定窗口大小为100nt，递进单位10nt，设定每个结合靶点最低得分为115，其窗口值最低为-25kcal/mol。根据上述参数，最终预测到mir2911可能结合到vp1基因mrna 3
’-
utr区域的具体序列信息及相关结合自由能，将预测到的可能靶点进行后续研究。预测结果显示mir2911种子序列可以和ev71病毒vp1基因 mrna 3
’-
utr区域特异性结合且结合能量达到-38.9kcal/mol(图5，左)。
34.(2)vp1 mrna 3
′-
utr荧光素酶报告质粒的构建
35.取ev71感染rd细胞48h后总rna 1μg,用oligo d(t)15引物和amv逆转录酶42℃逆转录30分钟，所得cdna用pfu高保真酶pcr扩增，引物为：forward primer: ttgagttgggtagcatatc,reverse primer:ctggaagaggacataagc。pcr反应条件：94℃2min； 94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min。所得pcr产物在1％琼脂糖胶电泳后，切胶回收，与t载体连接，转化感受态细菌，获得vp1 3
′-
utr的t载体克隆，随后将t 载体用spei和hindiii双酶切，回收dna片段，亚克隆到pgl3质粒。测序验证序列的准确性。利用点突变技术，对该载体的mir2911结合位点突变为互补序列，重新构建到pgl3质粒。用无内毒素的质粒提取试剂盒抽提总量200ug的质粒用于后续的细胞转染实验。
36.(3)荧光素酶活性和β-gal酶活性的检测
是其抗ev71病毒的主要成分(图7)。