黑果枸杞花青素提取物及冻干粉的制备方法和在防治糖尿病性白内障产品中的应用与流程

1.本发明涉及黑果枸杞花青素提取物及其产品和应用技术领域，具体涉及黑果枸杞花青素提取物及冻干粉的制备方法和在防治糖尿病性白内障产品中的应用。


背景技术：

2.糖尿病性白内障是糖尿病的主要并发症之一，是首位致盲性眼病，与糖尿病晶状体渗透压改变、糖基化终产物累积和氧化应激等密切相关。据统计，糖尿病患者中发生糖尿病性白内障的概率为63％，病程发展速度较快。与年龄相关性白内障不同的是，青少年糖尿病患者也可发病，且发病率随糖尿病病程延长而显著增加。目前，尚无药物能够治愈白内障，治疗主要以手术方式为主。然而，糖尿病视网膜病变流行病学调查研究中心报告显示，糖尿病患者进行行白内障摘除术危险性较高，手术可能会导致视网膜病变迅速加快，诱发或导致虹膜及黄斑变化，如虹膜黏连或黄斑囊样水肿，且术后10年后复发率超过24.8％。研究表明，糖尿病性白内障在晶状体核浑浊之前，白内障的形成是可逆的。既减轻高糖环境、晶状体的代谢正常，皮质性浑浊可逐渐透明。晶状体核出现浑浊后，成为不可逆的糖尿病性白内障。因此，鉴于手术存在风险及经济压力且术后易复发等问题，未来糖尿病性白内障治疗应将重点放在药物预防与延缓白内障形成、控制血糖等方面，对提高糖尿病患者存活率，改善其生活质量具有重要意义。
3.黑果枸杞(lycium ruthenicum murr.)，藏药中又称为“旁玛”，是茄科枸杞属多年生灌木，其生命力强，能耐盐、耐寒、抗旱，主要分布于我国青海、新疆、宁夏、西藏、陕西北部、甘肃等地。黑果枸杞被收载于《晶珠本草》《四部医典》等藏医药经典著作中，其味甘、性平、清心热，是一种药食两用植物。黑果枸杞中富含花青素和生物碱成分，花青素成分具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、保护视力等多种生理功能，是一种天然的抗氧化剂和自由基清除剂，在医药、食品、保健品、化妆行业中开发应用前景广阔。生物碱成分研究极少，除少数分析测定研究外，其化学成分、生物活性等方面的研究基本属于空白。
4.zl201010542518.x“抗氧化黑果枸杞提取物制备方法”，公开了一种将黑果枸杞鲜果用水浸提、胶体磨研磨、高压均质技术、微滤陶瓷膜除杂、大孔树脂分离及喷雾干燥或冷冻干燥制备黑果枸杞提取物的方法；zl201610548250.8“一种提取黑果枸杞花色苷的方法”，公开了一种将黑果枸杞粉用乙醇溶液混合提取、膜处理、大孔树脂纯化、减压浓缩、干燥得到黑果枸杞花色苷的制备方法；zl201711220791.9“一种具有改善视力功效的组合物”，公开了一种具有改善视力功效的组合物及其制剂，即一种以黑果枸杞、枸杞或其提取物作为有效成分的具有改善视力功效的组合物，所有组合物中还添加有叶黄素。本发明所提供的组合物兼顾缓解视力疲劳，预防和辅助治疗因黄斑病变、视网膜色素变、糖尿病视网膜病变引起的视力衰退、夜盲症、飞蚊症、青光眼、白内障等视力问题的功能，能够最大程度的改善视力。
5.现有方案黑果枸杞花青素的提取分离纯化多采用水或乙醇提取和大孔树脂吸附
纯化，加工处理过程大都采用酸性乙醇溶液提取和洗脱，因此整个提取、分离纯化、浓缩、干燥过程都无法脱除加入的外源酸性物质，所得产品中含有大量的酸，导致花青素的颜色为暗红色(中性状态下花青素为蓝紫色)，花青素活性降低，同时生产过程由于酸性腐蚀，导致产品增加了重金属铬污染的风险。胶体磨研磨、高压均质、超微粉碎、超声波
‑
微波反应提取、仿生提取和超声波辅助提取等前处理、提取设备昂贵，实施产业化较为困难。另外喷雾干燥工艺的高温导致花青素分解或失活，此工艺不适合黑果枸杞花青素的生产。且具有改善视力、缓解眼疲劳、明目功效及防治黄斑病变、白内障、青光眼、老花眼、视疲劳、糖尿病视网膜病变、弱视、夜盲症、视力减退、视力模糊等的药物或保健产品组合物，全部为含黑枸杞提取物的多种提取物的混合物，并添加叶黄素、类胡萝卜素、维生素等，其药用成分不明，作用机制不清。有关明确其中花青素成分的纯黑果枸杞花青素提取物防治糖尿病性白内障的研究未见报道。


技术实现要素：

6.基于上述技术问题，本发明的目的在于提供黑果枸杞花青素提取物及冻干粉的制备方法和在防治糖尿病性白内障产品中的应用。
7.本发明保护黑果枸杞花青素提取物及冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：
8.步骤1，提取过程：将黑果枸杞干果粉碎加5～10倍体积去离子水浸泡、搅拌提取3～5次，得到粗黑果枸杞汁；或者黑果枸杞鲜果破碎、榨汁，残渣再每次加水榨汁提取，反复3次，合并滤液得粗黑果枸杞汁；
9.步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速15000～20000r/min的离心机离心除杂，然后过50～200nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁；
10.步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为50000～100000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为300～5000的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液；
11.步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到黑果枸杞精细花青素分离液；
12.步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在10～50℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液；
13.步骤6，冷冻干燥：将步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，直接冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物；
14.步骤7，冻干粉制备：在步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，添加辅料后搅拌混匀，再冷冻干燥得到黑果枸杞花青素冻干粉。
15.进一步的，所述步骤4中模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：非极性大孔吸附树脂：d101、d101b、da
‑
201、dm
‑
301、dm
‑
11、hpd
‑
100、hpd
‑
450、hpd
‑
750、d1400、d1300、d3520、d4006、d4020、hp
‑
20、h
‑
103、h107、x
‑
5、ads
‑
5、ads
‑
8、bs
‑
55、bs
‑
65、bs
‑
80、nka
‑
2及nka
‑
9；弱极性大孔树脂：ab
‑
8、dm130、d860021、ds
‑
401、bs
‑
30、cad
‑
40及cad
‑
45；极性大孔树脂：ads
‑
f8、ads
‑
21、ads
‑
7、ads
‑
17、bs
‑
75、bs
‑
45、s
‑
8、nka
‑
2及nka
‑
9中的任意一种或者几种，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1～2倍，流速为1～3bv/h；解吸剂为5～90％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的2～4倍，流速1～
3bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h。
16.进一步的，所述步骤6中采用冷冻干燥机在
‑
50～
‑
70℃条件下冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物。
17.进一步的，所述步骤7中所添加辅料为淀粉、麦芽糊精、低聚果糖、低聚半乳糖、乳糖、菊粉、β
‑
环糊精、无水葡萄糖、聚葡萄糖、乳粉、柠檬酸钙、木糖醇、山梨糖醇、d
‑
甘露糖醇中的一种，再采用冷冻干燥机，在
‑
50～
‑
70℃条件下，冷冻干燥得到黑果枸杞花青素冻干粉。
18.本发明还保护上述方法制备的黑果枸杞花青素提取物及冻干粉，其中，所述黑枸杞花青素提取物及冻干粉中的含有以下一种或几种的或全部的化学成分为：n
‑
trans
‑
sinapoyltyramine、(e)
‑
n
‑
(4
‑
acetamidobutyl)
‑2‑
[4,5
‑
dihydroxy
‑2‑
[3
‑
[2
‑
(4
‑
hydroxyphenyl)ethylamino]
‑3‑
oxopropyl]
‑
phenyl]
‑3‑
(4
‑
hydroxy
‑3‑
methoxyphenyl)prop
‑2‑
enamide、(1s,2r)
‑
n3
‑
(4
‑
acetamidobutyl)
‑1‑
(3,4
‑
dihydroxy
‑
phenyl)
‑7‑
hydroxy
‑
n2
‑
(4
‑
hydroxyphenethyl)
‑
6,8
‑
dimethoxy
‑
1,2
‑
dihydro
‑
naphthalene
‑
2,3
‑
dicar boxamide、petunidin 3
‑
o
‑
[6
‑
o
‑
(4
‑
o
‑
(4
‑
o
‑
trans
‑
(β
‑
d
‑
glucopyranoside)
‑
p
‑
coumaroyl)
‑
α
‑
l
‑
rha mnopyranosyl)
‑
β
‑
d
‑
glucopyranoside]
‑5‑
o
‑
[β
‑
d
‑
glucopyranoside]]、n,n
‑
dihydrocaffeoylspermidine、n
‑
caffeoyl
‑
n
‑
hydrocaffeoylspermidine、n
‑
hydrocaffeoyl
‑
n
‑
caffeoylspermidine、petunidin
‑3‑
o
‑
(6
‑
o
‑
p
‑
coumaryl)
‑
rutinoside
‑5‑
o
‑
glucoside、malvidin
‑3‑
o
‑
rutinoside(cis
‑
p
‑
coumaroyl)
‑5‑
o
‑
giucoside、petunidin
‑3‑
o
‑
rutinoside(caffeoyl)
‑5‑
o
‑
glucoside和malvidin
‑3‑
o
‑
rutinoside(cis
‑
p
‑
coumaroyl)
‑5‑
o
‑
giucoside；
[0019]
所述化学成分为的结构式依次为：
[0020]
进一步的，所述黑果枸杞花青素提取物及冻干粉中花青素含量为0.1～90％，总生物碱含量为0.1～90％。
[0021]
本发明还保护上述制备方法制备的黑果枸杞花青素提取物及冻干粉在防治糖尿病性白内障产品中的应用；所述的防治糖尿病性白内障产品为食品、保健食品或药品，具体将黑果枸杞花青素提取物和/或冻干粉作为有效成分，按药学上可接受的任何载体制成各类剂型药品，或按食品科学上可接受的任何载体制成各类食品或保健食品。
[0022]
进一步的，所述食品、保健食品或药品的剂型为粉剂、片剂或者胶囊剂。
[0023]
进一步的，所述食品为黑果枸杞花青素固体饮料、所述保健食品为黑果枸杞花青素压片糖果；所述药品为黑果枸杞花青素胶囊药品。
[0024]
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
[0025]
本发明提供的黑果枸杞花青素提取物及冻干粉制备方法适合工业化生产，且制备过程绿色、无污染，制备得到的提取物和冻干粉中花青素含量高，无需添加外源酸，完全保持了黑果枸杞花青素的天然属性，且脱除了原料中的重金属和农药残留等有害物质。制备的黑果枸杞花青素提取物通过链尿佐菌素(stz)诱导糖尿病大鼠实验模型进行研究，结果表明黑果枸杞花青素能改善stz诱导糖尿病大鼠体重下降、降低血糖浓度、提高视网膜中sod活性，降低mda含量，从而减轻视网膜的氧化损伤，发挥对糖尿病视网膜病变的防治作用；能抑制stz诱导的糖尿病大鼠视网膜细胞调亡，对糖尿病视网膜病变具有一定的保护作用；能够抑制高糖环境下晶状体内ros和ages的生成，抑制氧化应激相关酶活力下降，提高抗氧化防御系统，从而对糖尿病性白内障具有一定的防治作用。可用于防治糖尿病性白内障的功能性食品、保健食品和药品。
附图说明
[0026]
图1为本发明制备的11种黑果枸杞花青素提取物的化学成分结构图；
[0027]
图2为本发明实施例1所得黑果枸杞花青素提取物的hplc图；
[0028]
图3为本发明实施例1所得黑果枸杞花青素提取物的hplc/ms
‑
ms分析离子流图；
[0029]
图4为本发明实施例1所得黑果枸杞花青素提取物模拟移动床分离图；
[0030]
图5为本发明黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠视网膜中bax表达的影响；
[0031]
图6为本发明本发明黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠视网膜中bcl
‑
2表达的影响；
[0032]
图7为本发明黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠晶状体组织ros的影响；
[0033]
图8为本发明黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠晶状体组织ages的影响。
[0034]
图5和6中，normal空白对照组，control半乳糖衰老模型对照组，a黑果枸杞花青素1g生药/kg剂量组，b黑果枸杞花青素2g生药/kg剂量组，c黑果枸杞花青素5g生药/kg剂量组；
δ
p<0.0001，*p<0.05，***p<0.001。
[0035]
图7和8中，normal空白对照组，control半乳糖衰老模型对照组，a黑果枸杞花青素1g生药/kg剂量组，b黑果枸杞花青素2g生药/kg剂量组，c黑果枸杞花青素5g生药/kg剂量组；
δ
p<0.0001，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
[0036]
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]
本发明实施例中所用黑果枸杞原料由青海金麦杞生物科技有限公司提供，采购于青海省格尔木市。
[0038]
试验设备：csj
‑
20粗碎机(江阴方圆机械制造有限公司)，zd
‑
lz
‑
1.5榨汁机(中德食品机械靖江有限公司)，提取设备(浙江温兄机械阀业有限公司)，gq105b管式离心机(上海浦东天本离心机械有限公司)，ptsx40蝶式离心机(宜兴市华鼎机械有限公司)，smb
‑
h
‑
08
‑
a模拟移动床(汉邦科技有限公司)，glz
‑
1b冷冻干燥机(上海浦东冷冻干燥设备有限公司)，scientz
‑
10冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，zpsx压片机(上海祥顺制药机械有限公司)，njp
‑
300全自动胶囊填充机(瑞安市天宏制药机械有限公司)。
[0039]
实验仪器：roche diagnostics gmbh型快速血糖仪及试纸(德国roche公司)，spectra max190酶标仪(美国md公司)，5424r台式高速冷冻离心机(eppendorf)；my
‑
20手持式组织研磨器(上海净信)，9700pcr扩增仪(美国abi公司)，rad
‑
iq5实时荧光定量pcr仪(美国bio
‑
rad公司)，qubittm核酸蛋白测定仪(invitrogen公司)。
[0040]
实验试剂：黑枸杞花青素提取物(青海金麦杞生物科技有限公司提供，批号20201001)；dpph(美国sigma公司)，抗坏血酸素(vc)、吩嗪硫酸甲酯(pms)均购自阿拉丁；还原型辅酶ⅰ(nadh)、硝基四氮唑蓝(nbt)均购自碧云天；30％h2o2、硫酸铁、水杨酸均购自天津大茂试剂公司；生理盐水(批号c17010902，河北天成药业股份有限公司产品)；链尿佐菌素(美国sigma公司)；高糖高脂饲料(ready bite d12492)；戊巴比妥(中国医药集团上海化学试剂公司)；超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)、谷胱甘肽(gsh)、氧化型谷胱甘肽(gssh)、谷胱甘肽还原酶(gr)、过氧化氢酶(cat)、晚期糖基化终末产物(ages)、丙二醛(mda)试剂盒均为南京建成工程研究所产品；细胞内活性氧簇(ros)检测试剂盒(碧云天公司)，rna提取试剂盒(美国promega公司)；逆转录试剂盒、荧光定量pcr试剂盒(takara)。
[0041]
动物：sd大鼠，spf级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：scxk(京)2016
‑
0006。
[0042]
实施例1
[0043]
黑果枸杞花青素提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
[0044]
步骤1，提取过程：将30kg黑果枸杞干果粉碎后，投入200l提取设备中，加5～10倍体积的去离子水浸泡、搅拌提取3～5次，得到粗黑果枸杞汁；
[0045]
步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速20000r/min的高速离心机离心除杂，然后过50nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁约800l；
[0046]
步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为50000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加3～5倍体积的纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为300的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液15l左右；
[0047]
步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到250l黑果枸杞精细花青素分离液；其中，模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：hpd
‑
100：dm130：ads
‑
21＝2:2:1混合树脂，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1.5倍，流速为2bv/h；解吸剂为30～60％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的3倍，流速1～2bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h；
[0048]
步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在10℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液约25kg；
[0049]
步骤6，冷冻干燥：将步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，采用冷冻干燥机在
‑
50～
‑
70℃条件下，直接冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物约1.2kg。
[0050]
ph示差法测定上述黑果枸杞花青素提取物中花青素含量为56.0％，分光光度法测定总生物碱含量为5.5％。
[0051]
黑果枸杞花青素提取物对有机自由基(dpph
·
)的清除能力为92.9％，对超氧阴离子(
·
o2‑
)自由基清除能力为86.6％，对羟自由基(
·
oh)清除能力为96.3％。
[0052]
经hplc
‑
ms/ms分析，黑果枸杞花青素提取物中含化学成分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，结构式详见附图1。
[0053]
实施例2
[0054]
黑果枸杞花青素提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
[0055]
步骤1，提取过程：将32kg黑果枸杞干果粉碎后，投入200l提取设备中，加5～10倍体积的去离子水浸泡、搅拌提取3～5次，得到粗黑果枸杞汁；
[0056]
步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速20000r/min的高速离心机离心除杂，然后过100nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁约800l；
[0057]
步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为100000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加3～5倍体积的纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为5000的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液15l左右；
[0058]
步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到260l黑果枸杞精细花青素分离液；其中，模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：ab
‑
8大孔树脂，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1.5倍，流速为2bv/h；解吸剂为30～60％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的3倍，流速1～2bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h；
[0059]
步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在50℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液约22kg；
[0060]
步骤6，冷冻干燥：将步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，采用冷冻干燥机在
‑
50～
‑
70℃条件下，直接冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物约0.69kg。
[0061]
ph示差法测定上述黑果枸杞花青素提取物中花青素含量为88.6％，分光光度法测定总生物碱含量为0.12％。
[0062]
黑果枸杞花青素提取物对有机自由基(dpph
·
)的清除能力为92.9％，对超氧阴离子(
·
o2‑
)自由基清除能力为86.6％，对羟自由基(
·
oh)清除能力为96.3％。
[0063]
经hplc
‑
ms/ms分析，黑果枸杞花青素提取物中含化学成分4、8、9、10和11，结构式详见附图1。
[0064]
实施例3
[0065]
黑果枸杞花青素提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
[0066]
步骤1，提取过程：将35kg黑果枸杞干果粉碎后，投入200l提取设备中，加5～10倍体积的去离子水浸泡、搅拌提取3～5次，得到粗黑果枸杞汁；
[0067]
步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速20000r/min的高速离心机离心除杂，然后过200nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁约870l；
[0068]
步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为50000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加3～5倍体积的纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为5000的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液17l左右；
[0069]
步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到280l黑果枸杞精细花青素分离液；其中，模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：ab
‑
8：nka
‑
9＝1:1混合树脂，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1.5倍，流速为2bv/h；解吸剂为20～50％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的3倍，流速1～2bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h；
[0070]
步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在20℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液约26kg；
[0071]
步骤6，冷冻干燥：将步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，采用冷冻干燥机在
‑
50～
‑
70℃条件下，直接冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物约1.26kg。
[0072]
ph示差法测定上述黑果枸杞花青素提取物中花青素含量为32.6％，分光光度法测定总生物碱含量为18.2％。
[0073]
黑果枸杞花青素提取物对有机自由基(dpph
·
)的清除能力为82.3％，对超氧阴离子(
·
o2‑
)自由基清除能力为75.6％，对羟自由基(
·
oh)清除能力为82.9％。
[0074]
经hplc
‑
ms/ms分析，黑果枸杞花青素提取物中含化学成分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，结构式详见附图1。
[0075]
实施例4
[0076]
黑果枸杞花青素提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
[0077]
步骤1，提取过程：将150kg黑果枸杞鲜果破碎、榨汁，残渣再每次加200l水榨汁提取，反复3次，合并滤液得粗黑果枸杞汁约750l；
[0078]
步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速15000r/min的蝶式离心机离心除杂，然后过50nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁约850l；
[0079]
步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为50000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加3～5倍体积的纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为5000的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液13l左右；
[0080]
步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到180l黑果枸杞精细花青素分离液；其中，模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：ds
‑
401：bs
‑
75＝1:2混合树脂，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1.5倍，流速为2bv/h；解吸剂为15～45％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的3倍，流速1～2bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h；
[0081]
步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在25℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液约15kg；
[0082]
步骤6，冷冻干燥：将步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，采用冷冻干燥机在
‑
50
～
‑
70℃条件下，直接冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物约0.46kg。
[0083]
ph示差法测定上述黑果枸杞花青素提取物中花青素含量为15.2％，分光光度法测定总生物碱含量为75.6％。
[0084]
黑果枸杞花青素提取物对有机自由基(dpph
·
)的清除能力为77.8％，对超氧阴离子(
·
o2‑
)自由基清除能力为66.5％，对羟自由基(
·
oh)清除能力为82.3％。
[0085]
经hplc
‑
ms/ms分析，黑果枸杞花青素提取物中含化学成分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，结构式详见附图1。
[0086]
实施例5
[0087]
黑果枸杞花青素提取物的制备方法，具体包括如下步骤：
[0088]
步骤1，提取过程：将180kg黑果枸杞鲜果破碎、榨汁，残渣再每次加200l水榨汁提取，反复3次，合并滤液得粗黑果枸杞汁约830l；
[0089]
步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速15000r/min的蝶式离心机离心除杂，然后过50nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁约950l；
[0090]
步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为50000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加3～5倍体积的纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为5000的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液18l左右；
[0091]
步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到80l黑果枸杞精细花青素分离液；其中，模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：nka
‑
2树脂，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1.5倍，流速为2bv/h；解吸剂为5～25％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的3倍，流速1～2bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h；
[0092]
步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在30℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液约8kg；
[0093]
步骤6，冷冻干燥：将步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，采用冷冻干燥机在
‑
50～
‑
70℃条件下，直接冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物约0.22kg。
[0094]
ph示差法测定上述黑果枸杞花青素提取物中花青素含量为3.2％，分光光度法测定总生物碱含量为89.2％。
[0095]
黑果枸杞花青素提取物对有机自由基(dpph
·
)的清除能力为62.8％，对超氧阴离子(
·
o2‑
)自由基清除能力为56.5％，对羟自由基(
·
oh)清除能力为72.6％。
[0096]
经hplc
‑
ms/ms分析，黑果枸杞花青素提取物中含化学成分1、2、3、4、5、6、7、8和10，结构式详见附图1。
[0097]
实施例6
[0098]
黑果枸杞花青素冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：
[0099]
步骤1，提取过程：将40kg黑果枸杞干果粉碎后，投入200l提取设备中，加5～10倍体积的去离子水浸泡、搅拌提取3～5次，得到粗黑果枸杞汁；
[0100]
步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速20000r/min的高速离心机离心除杂，然后过50nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁约960l；
[0101]
步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为
50000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加3～5倍体积的纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为5000的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液20l左右；
[0102]
步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到320l黑果枸杞精细花青素分离液；其中，模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：hp750：d860021：ads
‑
7＝1：1：1混合树脂，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1.5倍，流速为2bv/h；解吸剂为20～50％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的3倍，流速1～2bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h；
[0103]
步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在35℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液约28kg；
[0104]
步骤6，冻干粉制备：在步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，添加10kg乳糖后搅拌混匀，得花青素乳糖混合液约38kg，再采用冷冻干燥机，在
‑
50～
‑
70℃条件下，冷冻干燥得到黑果枸杞花青素冻干粉约12.5kg。
[0105]
ph示差法测定上述黑果枸杞花青素冻干粉中花青素含量为8.6％，分光光度法测定总生物碱含量为1.8％。
[0106]
黑果枸杞花青素冻干粉对有机自由基(dpph
·
)的清除能力为75.4％，对超氧阴离子(
·
o2‑
)自由基清除能力为65.6％，对羟自由基(
·
oh)清除能力为68.5％。
[0107]
经hplc
‑
ms/ms分析，黑果枸杞花青素冻干粉中含化学成分1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，结构式详见附图1。
[0108]
实施例7
[0109]
黑果枸杞花青素冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：
[0110]
步骤1，提取过程：将200kg黑果枸杞鲜果破碎、榨汁，残渣再每次加220l水榨汁提取，反复3次，合并滤液得粗黑果枸杞汁约900l；
[0111]
步骤2，高速离心和陶瓷膜过滤：将步骤1得到粗黑果枸杞汁，先用转速15000r/min的蝶式离心机离心除杂，然后过50nm陶瓷膜澄清，得澄清黑果枸杞汁约950l；
[0112]
步骤3，有机膜脱胶和浓缩：将步骤2得到的澄清黑果枸杞汁，过截留分子量为50000的超滤有机膜脱除果胶、蛋白及多糖大分子物质，加3～5倍体积的纯水清洗，收集流出液，再用截留分子量为5000的超滤有机膜脱水浓缩，得膜浓缩液22l左右；
[0113]
步骤4，模拟移动床色谱分离：将步骤3得到膜浓缩液加入模拟移动床色谱进行分离，得到120l黑果枸杞精细花青素分离液；其中，模拟移动床分离方法为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：模拟移动床色谱填充的吸附剂为：cad
‑
40：bs
‑
45＝1:1混合树脂，吸附区流速1～2bv/h；水洗区为纯化水，其用量为树脂体积的1.5倍，流速为2bv/h；解吸剂为15～40％的乙醇溶液，其用量是树脂体积的3倍，流速1～2bv/h；树脂再生溶剂为95％乙醇溶液，用量是树脂的1倍；流速2～3bv/h；
[0114]
步骤5，低温浓缩：将步骤4所得的黑果枸杞精细花青素分离液，回收乙醇，并在40℃，真空度为
‑
0.06mpa条件下，进行真空低温浓缩，得到黑果枸杞花青素浓缩液约22kg；
[0115]
步骤6，冻干粉制备：在步骤5所得的黑果枸杞花青素浓缩液，添加15kg低聚果糖后搅拌混匀，得花青素低聚果糖混合液约37kg，再采用冷冻干燥机，在
‑
50～
‑
70℃条件下，冷冻干燥得到黑果枸杞花青素冻干粉约16.5kg。
[0116]
ph示差法测定上述黑果枸杞花青素冻干粉中花青素含量为5.5％，分光光度法测定总生物碱含量为3.2％。
[0117]
黑果枸杞花青素冻干粉对有机自由基(dpph
·
)的清除能力为70.6％，对超氧阴离子(
·
o2‑
)自由基清除能力为61.2％，对羟自由基(
·
oh)清除能力为65.8％。
[0118]
经hplc
‑
ms/ms分析，黑果枸杞花青素冻干粉中含化学成分1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，结构式详见附图1。
[0119]
实施例8
[0120]
黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠视网膜氧化应激水平的影响。
[0121]
采用链尿佐菌素(stz)诱导糖尿病大鼠实验模型
[0122]
选用健康雄性sd大鼠50只，体重180
±
10g，按体重随机分组，分别为正常对照组、模型对照组、黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组，共5组，每组10只。正常对照组大鼠喂养普通饲料，其余各组喂养高糖高脂饲料2周后，模型对照组、黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组大鼠禁食24h，期间自由饮水，腹腔一次性注射stz50mg/kg，给予正常饮食，同时正常对照组腹腔一次性注射同等体积的生理盐水。72h后尾静脉取血测大鼠空腹血糖，连测3天，血糖＞16.7mmol/l为糖尿病模型大鼠。造模成功次日即开始灌胃，黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组按照剂量灌胃给药10周，空白对照组、模型对照组生理盐水灌胃10周，自由进食。灌胃结束后各组随机取5只大鼠，腹腔注射2.5％戊巴比妥麻醉，迅速取出其眼球，冰面操作，在解剖显微镜剥取视网膜，手动匀浆，2500r/min离心15min，取上清，试剂盒检测mda含量和sod活性。
[0123]
数据均以表示，以spss16.0软件进行数据统计分析，采用t检验进行组间比较。
[0124]
实验结果
[0125]
表1黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠体重和血糖的影响
[0126][0127]
注：与正常对照组比较：
δ
p<0.001，
δδ
p<0.0001；与模型对照组比较：*p<0.05，**p<0.0005.
[0128]
结果可见，与空白对照组相比，stz诱导糖尿病组大鼠经高糖高脂饲料2周后体重显著增长(p<0.001)，stz诱导后空腹血糖显著升高(p<0.0001)，造模成功。灌胃6周后，与空白对照组相比，stz诱导糖尿病组大鼠体重显著降低(p<0.0001)，空腹血糖升高(p<0.0001)；与stz诱导糖尿病组模型组相比，黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组大鼠体重均有所增长，但仍低于空白对照组，而空腹血糖也有不同程度降低，仍高于空白对照组，黑果枸杞花青素5g生药/kg剂量组效果最为明显(p<0.0005)。
[0129]
表2黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠视网膜中mda含量和sod活性的影响
[0130][0131]
注：与正常对照组比较：
δ
p<0.0001；与模型对照组比较：*p<0.05，
**
p<0.005，
***
p<0.0001.
[0132]
结果可见，与空白对照组相比，stz糖尿病模型组大鼠视网膜中sod活性显著减低(p<0.0001)，mda含量显著升高(p<0.0001)；与stz诱导糖尿病组模型组相比，黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组大鼠sod活性显著上升，mda含量显著下降，在1g生药/kg时既具有显著性(p<0.05)。
[0133]
视网膜是感受和传递视觉信息的起始部位，在体内代谢旺盛。糖代谢紊乱易导致视网膜组织代谢紊乱，脂质过氧化升高，sod活性下降，引起氧化应激损伤。上述结果表明，黑果枸杞花青素能改善stz诱导糖尿病大鼠体重下降、降低血糖浓度、提高视网膜中sod活性，降低mda含量，从而减轻视网膜的氧化损伤，发挥对糖尿病视网膜病变的防治作用。
[0134]
实施例9
[0135]
黑果枸杞花青素提取物对stz诱导糖尿病大鼠视网细胞凋亡情况的影响
[0136]
采用链尿佐菌素(stz)诱导糖尿病大鼠实验模型。灌胃结束后各组随机取5只大鼠，腹腔注射2.5％戊巴比妥麻醉，迅速取出其眼球，冰面操作，在解剖显微镜剥取视网膜，手动匀浆，用rna试剂盒提取视网膜细胞总rna，逆逆转录试剂盒将视网膜细胞总rna逆转录为cdna，测定逆转录产物浓度后4℃保存用于荧光定量pcr试剂盒检测bax、bcl
‑
2表达情况。
[0137]
表3 rt
‑
pcr实验用引物通过pubmed和primer premier v5.0设计，华大基因公司合成
[0138][0139]
数据采用2
‑⊿⊿
ct
法进行数据分析，以spss16.0软件进行数据统计分析，采用t检验进行组间比较。
[0140]
⊿
ct(校准样本)＝对照组的平均ct值
‑
对照组的gapdh平均ct值；
⊿
ct(处理样本)＝处理样本的平均ct值
‑
处理样本的gapdh平均ct值；
⊿⊿
ct＝
⊿
ct(处理样本)
‑⊿
ct(校准样本)。
[0141]
实验结果
[0142]
黑果枸杞花青素对stz诱导糖尿病大鼠视网膜中bax和bcl
‑
2表达的影响(详见附图5和6)。normal空白对照组，control半乳糖衰老模型对照组，a黑果枸杞花青素1g生药/kg剂量组，b黑果枸杞花青素2g生药/kg剂量组，c黑果枸杞花青素5g生药/kg剂量组；
δ
p<0.0001，*p<0.05，***p<0.001。
[0143]
bax和bcl
‑
2为调亡相关基因，bcl
‑
2能够阻止细胞调亡、延长细胞的存活期，bax则可拮抗bcl
‑
2的抑制凋亡作用，并促进细胞凋亡，两者平衡保证了细胞的稳态。bcl
‑
2/bax比值上升能够抑制细胞凋亡，使得细胞受到保护。结果可见，与空白对照组相比，stz糖尿病模
型组大鼠视网膜中bax表达显著升高(p<0.0001)，bcl
‑
2表达显著降低(p<0.0001)；与stz诱导糖尿病组模型组相比，黑果枸杞花青素1g生药/kg剂量组大鼠bax表达无明显变化，bcl
‑
2表达升高(p<0.05)；黑果枸杞花青素2g生药/kg剂量组大鼠bax表达降低(p<0.05)，bcl
‑
2表达升高(p<0.05)；黑果枸杞花青素5g生药/kg剂量组大鼠bax表达显著降低(p<0.0001)，bcl
‑
2表达显著升高(p<0.0001)。表明，黑果枸杞花青素能抑制stz诱导的糖尿病大鼠视网膜细胞调亡，对糖尿病视网膜病变具有一定的保护作用。
[0144]
实施例10
[0145]
黑果枸杞花青素对对糖尿病性白内障的防治作用
[0146]
采用链尿佐菌素(stz)诱导糖尿病大鼠实验模型
[0147]
选用健康雄性sd大鼠30只，体重180
±
10g，按体重随机分组，分别为正常对照组、模型对照组、黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组，共5组，每组6只。正常对照组大鼠喂养普通饲料，其余各组喂养高糖高脂饲料2周后，模型对照组、黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组大鼠禁食24h，期间自由饮水，腹腔一次性注射stz45mg/kg，给予正常饮食，同时正常对照组腹腔一次性注射同等体积的生理盐水。72h后尾静脉取血测大鼠空腹血糖，连测3天血糖＞16.7mmol/l为糖尿病模型大鼠。造模成功次日即开始灌胃，黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组按照剂量灌胃给药6周，空白对照组、模型对照组生理盐水灌胃6周，自由进食。灌胃结束后断头法处死大鼠，摘除眼球，完整分离出晶状体，用生理盐水冰浴研磨，制成质量浓度为10％的冰冷匀浆液，4℃下3000g离心15min取上清，采用试剂盒测定组织器官中cat、sod、mda、gsh
‑
px、gsh、gr及gst值；用生理盐水冰浴研磨，制成质量浓度为10％的冰冷匀浆液，4℃下3000g离心30min取上清采用试剂盒测定组织器官中ages值。
[0148]
数据均以表示，以spss16.0软件进行数据统计分析，采用t检验进行组间比较。
[0149]
实验结果
[0150]
黑果枸杞花青素对stz诱导糖尿病大鼠晶状体组织ros和ages的影响(详见附图7和8)。normal空白对照组，control半乳糖衰老模型对照组，a黑果枸杞花青素1g生药/kg剂量组，b黑果枸杞花青素2g生药/kg剂量组，c黑果枸杞花青素5g生药/kg剂量组；
δ
p<0.0001，**p<0.01，***p<0.001。
[0151]
结果可见，与空白对照组相比，stz糖尿病模型组大鼠晶状体中ros和ages含量显著上升(p<0.0001)。与stz诱导糖尿病组模型组相比，黑果枸杞花青素1g生药/kg剂量组大鼠晶状体中ros和ages含量略有下降，但无统计学意义；黑果枸杞花青素2、5g生药/kg剂量组大鼠晶状体中ros和ages含量显著下降，作用随着剂量增高而增强。
[0152]
表4黑果枸杞花青素对stz诱导糖尿病大鼠晶状体中sod、cat及mda活性的影响
[0153][0154]
注：与正常对照组比较：δp<0.0001；与模型对照组比较：*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005.
[0155]
结果可见，与空白对照组相比，stz糖尿病模型组大鼠晶状体中sod和cat活性显著下降(p<0.0001)，mda含量显著升高(p<0.0001)；与stz诱导糖尿病组模型组相比，黑果枸杞花青素1、2、5g生药/kg剂量组大鼠均能显著提高sod、cat活性，降低mda含量，作用随着剂量增高而增强。
[0156]
表5黑果枸杞花青素对stz诱导糖尿病大鼠晶状体中gsh
‑
px、gr、gssh及gsh的影响
[0157][0158][0159]
注：与正常对照组比较：δp<0.0005，δδp<0.0005；与模型对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0005.
[0160]
晶状体具有gsh合成和再生系统，能够维持高水平的gsh，保护其避免氧化应激损
伤。结果可见，与空白对照组相比，stz糖尿病模型组大鼠晶状体中gsh
‑
px和gr活性显著下降(p<0.0001)，gsh含量限制降低(p<0.0001)，gssh含量显著升高(p<0.0005)；与stz诱导糖尿病组模型组相比，黑果枸杞花青素1g生药/kg剂量组大鼠能显著提高gr活性(p<0.05)和gsh含量(p<0.01)，对gsh
‑
px活性和gssh含量变化无显著性影响。黑果枸杞花青素2、5g生药/kg剂量组大鼠均能显著提高gsh含量及gsh
‑
px、gr活性，降低gssh含量，作用随着剂量增高而增强。
[0161]
氧化损伤和蛋白糖基化均可引发晶状体浑浊，导致糖尿病性白内障的形成。上述结果表明，黑果枸杞花青素能够抑制高糖环境下晶状体内ros和ages的生成，抑制氧化应激相关酶活力下降，提高抗氧化防御系统，从而对糖尿病性白内障具有一定的防治作用。
[0162]
实施例11
[0163]
一种黑果枸杞花青素固体饮料食品
[0164]
实施例6制备得到的黑果枸杞花青素冻干粉中加入18％麦芽糊精、0.25％羧甲基纤维素钠、4％蔗糖或木糖醇，用ch
‑
200槽型混合机混匀，以常规方法制粒，即得黑果枸杞花青素固体饮料。
[0165]
实施例12
[0166]
一种黑果枸杞花青素压片糖果保健食品
[0167]
实施例3制备得到的黑果枸杞花青素提取物中加入18％麦芽糖醇或木糖醇或阿巴斯甜或甜菊糖苷、16％微晶纤维素和6％硬质酸镁，用ch
‑
200槽型混合机混匀，干法制粒，再用十冲头压片机(zpsx)进行压片处理(压力40
‑
60kn)，得到压片糖果。
[0168]
实施例13
[0169]
一种黑果枸杞花青素胶囊药品
[0170]
实施例1得到的黑果枸杞花青素提取物或实施例6制备得到的黑果枸杞花青素冻干粉中加40～50％乳糖或预胶化淀粉、1.8％硬脂酸镁、4.5％滑石粉或微粉硅胶，用ch
‑
200槽型混合机混匀，干法制粒，再用njp
‑
300胶囊填充机灌装，得到胶囊。
[0171]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。