一种UTR拮抗剂GSK1562590的新应用的制作方法

一种utr拮抗剂gsk1562590的新应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种utr拮抗剂gsk1562590的新应用。


背景技术：

2.在皮肤病患者中，瘙痒是导致失眠、焦虑和抑郁发展的最恼人的症状之一。瘙痒包括急性瘙痒和慢性瘙痒，急性瘙痒表现为发生迅速、消退较快，而慢性瘙痒患者表现为皮肤炎症、屏障功能障碍、反复发作、病理周期长(瘙痒持续≥6周)。慢性瘙痒可能由各种病理疾病引起，如湿疹、肾衰竭、肝硬化、神经系统疾病和癌症，也可能是由药物使用后的副作用所致，影响生活质量。慢性瘙痒伴随着一些皮肤疾病的炎症过程，是特应性皮炎(ad)的主要诊断症状之一。
3.据报道，临床常采用药物来缓解瘙痒，如加巴喷丁可缓解糖尿病神经病变患者瘙痒，但其剂量高、治疗周期长达4周，再如拉莫三嗪可以减轻神经性瘙痒，还如普瑞巴林缓解西妥昔单抗诱导的瘙痒，但传统药物治疗过程中易出现耐药性，对于慢性瘙痒治疗明显不佳，还易产生严重副作用，虽然ige抗体或者其他th2细胞因子特异性靶点抗体前期效果较好，但价格非常昂贵，且目前还没有fda批准的治疗慢性瘙痒的特定药物。同时由于复杂的发病机制和慢性瘙痒的成因很多，慢性痒的治疗仍然具有极大挑战性。
4.尿紧张素ii urotensin ii(uii，或uts2)被认为是一种生长抑素样环肽(arman,bozgeyik,dagli,&igci,2017)，是比内皮素1(et
‑
1)更强的内源性血管活性收缩肽(chiu,wang,&shyu,2014；tomiyama,nakamachi,uchiyama,matsuda,&konno,2015)，内皮素
‑
1是人类和动物痛觉和瘙痒的诱导剂。uii的受体gpr14是一种g蛋白偶联受体，称为uii受体(utr)，参与调节各种生理过程，包括血管收缩、心脏肌力效应、免疫功能调节、神经营养作用以及热痛觉过敏和机械性异位痛。但迄今为止，gpr14在感觉神经元系统和皮肤生理学中的分布和功能仍不明确，uii和grp14是否参与瘙痒感觉发生尚不清楚。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种高亲和力和选择性的尿紧张素ii受体utr拮抗剂gsk1562590在制备治疗瘙痒症的药物中的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种utr拮抗剂gsk1562590在制备治疗瘙痒症的药物中的应用。
8.优选地，所述瘙痒症包括慢性瘙痒症。
9.优选地，所述慢性瘙痒症包括慢性皮肤病和/或病理疾病所致的慢性瘙痒；所述慢性皮肤病包括特应性皮炎、牛皮癣和痒疹；所述病理疾病包括肾衰竭、肝硬化、神经系统疾病和癌症。
10.优选地，所述gsk1562590抑制慢性瘙痒症的uii
‑
gpr14信号转导。
11.优选地，所述gsk1562590抑制瘙痒和炎症相关细胞因子的表达。
12.优选地，所述gsk1562590抑制炎症相关肽的表达。
13.优选地，所述瘙痒和炎症相关细胞因子包括nppb、il
‑
24、il
‑
19、cxcl5、cxcl5、fasl、il
‑
1b、il
‑
13、ccl22、ccl17、癌抑素m。
14.优选地，所述瘙痒相关受体包括mrgpra2b、ccr2、ccr6、il
‑
13rα1、il
‑
13rα2、ntrk1、il
‑
31rα、cxcr3、il24rα。
15.本发明还提供了一种治疗瘙痒症的药物，所述药物包括活性成分gsk1562590及药物学上可接受的载体。
16.优选地，所述活性成分在药物中的含量为1％～99％。
17.本发明的有益效果如下：
18.本发明首次公开了一种utr拮抗剂gsk1562590在制备治疗瘙痒症的药物中的应用，本发明通过mc903介导的慢性瘙痒的小鼠模型，验证了gsk1562590对慢性瘙痒的治疗作用，结果表明，utr拮抗剂gsk1562590在治疗第10天显著减弱了mc903诱发的瘙痒样行为，且存在时间依赖性，显著减少了抓挠次数，gsk1562590有效减少了慢性瘙痒样行为，同时gsk156290还显著降低了mrgpra2b、ccr2、ccr6、il
‑
13rα1、il
‑
13rα2、ntrk1、il
‑
31rα、cxcr3、il24rα，炎症细胞因子如nppb、il
‑
24、il
‑
19、cxcl5、cxcl5、fasl、il
‑
1b、il
‑
13、ccl22、ccl17、癌抑素m(osm)的转录水平也显著降低。因此，gsk1562590能够有效治疗瘙痒症。
附图说明
19.图1为实施例1构建的瞬时瘙痒模型中皮内注射不同剂量uii溶液引起的小鼠剂量依赖性瘙痒抓挠结果与诱导的疼痛结果图，a为在60min内不同剂量下抓挠次数的结果，b为在较高剂量和高剂量下，0～10min、10～20min、20～30min、30～40min、40～50min、50～60min时间段内的抓挠次数，c为在60min内不同剂量下擦拭的次数，轻微擦拭表示一种较低程度的疼痛行为；d为对60min内抓挠和擦拭行为的比较结果；
20.图2为免疫组织化学分析uii和gpr14在特应性皮炎小鼠、健康小鼠中的表达以及分布情况图，其中a为uii在特应性皮炎小鼠、健康小鼠中的表达以及分布情况图，b为uii在特应性皮炎小鼠、健康小鼠(control)中的免疫荧光强度统计对比图；c为gpr14在特应性皮炎小鼠、健康小鼠中的表达以及分布情况图，d为gpr14在特应性皮炎小鼠、健康小鼠(control)中的免疫荧光强度统计对比图；
21.图3为免疫组织化学分析uii和gpr14在特应性皮炎小鼠mtgn、健康小鼠mtgn中的表达与分布情况图，其中a为uii在特应性皮炎小鼠、健康小鼠中的表达以及分布情况图，b为uii在特应性皮炎小鼠mtgn、健康小鼠(control)mtgn中的免疫荧光强度统计对比图；c为gpr14在特应性皮炎小鼠mtgn、健康小鼠(control)mtgn中的表达以及分布情况图，d为gpr14在特应性皮炎小鼠mtgn、健康小鼠(control)mtgn中的免疫荧光强度统计对比图；e为uii

神经元亚型在特应性皮炎小鼠小直径(<10μm)、中小直径(10～20μm)、大直径(＞20μm)(pgp9.5

)mtgn中的表达占比图；f为uii

神经元亚型在健康小鼠(control)不同直径(pgp9.5

)mtgn中的表达占比图；g为gpr14

神经元亚型在特应性皮炎小鼠不同直径(pgp9.5

)mtgn中的表达占比图；h为gpr14

神经元亚型在健康小鼠(control)不同直径(pgp9.5

)mtgn中的表达占比图；其中mtgn表示三叉神经节；
22.图4为gsk1562590治疗mc903诱导的小鼠慢性瘙痒行为学测试结果，a为实施处理
的流程图；b为第1天的涂抹mc903和etoh后小鼠抓挠次数统计，第10天施药后，对照组和治疗组的小鼠抓挠次数统计，其中第1天圆形表示对照组(mc903处理小鼠未施加vehicle)的小鼠抓挠次数，方形表示处理组(mc903处理小鼠未施加gsk1562590治疗)的小鼠抓挠次数，第10天圆形表示对照组(mc903处理小鼠施加vehicle)的小鼠抓挠次数，方形表示治疗组(mc903处理小鼠施加gsk1562590治疗)的小鼠抓挠次数；c为治疗期间，每天对对照组和治疗组的小鼠抓挠次数统计图；
23.图5为通过对照组和治疗组治疗后，uii和gpr14在mc903诱导的耳皮同侧(左侧)的慢性痒皮肤表达与分布情况，其中a为通过对照组和治疗组治疗后，uii在mc903诱导的耳皮同侧(左侧)的慢性痒皮肤表达与分布情况；b为通过对照组和治疗组治疗后，gpr14在mc903诱导的耳皮同侧(左侧)的慢性痒皮肤表达与分布情况；c为通过对照组和治疗组治疗后，uii在mc903诱导的耳皮同侧(左侧)的慢性痒皮肤中的免疫荧光强度统计对比图；d为通过对照组和治疗组治疗后，gpr14在mc903诱导的耳皮同侧(左侧)的慢性痒皮肤中的免疫荧光强度统计对比图；
24.图6为通过对照组和治疗组治疗后，uii和gpr14在etoh诱导的耳皮同侧(右侧)的慢性痒皮肤表达与分布情况，其中a为通过对照组和治疗组治疗后，uii在etoh诱导的耳皮对侧(右侧)的慢性痒皮肤表达与分布情况；b为通过对照组和治疗组治疗后，gpr14在etoh诱导的耳皮对侧(右侧)的慢性痒皮肤表达与分布情况；c为通过对照组和治疗组治疗后，uii在etoh诱导的耳皮对侧(右侧)的慢性痒皮肤中的免疫荧光强度统计对比图；d为通过对照组和治疗组治疗后，gpr14在etoh诱导的耳皮对侧(右侧)的慢性痒皮肤中的免疫荧光强度统计对比图；
25.图7为gsk1562590治疗后对耳部皮肤影响结果，其中a为gsk1562590治疗后对耳部皮肤病理变化结果；b为gsk1562590治疗后，耳部皮肤厚度的变化图；c为gsk1562590治疗后，小鼠耳朵真皮中的炎症细胞(主要是嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的富集变化结果；d为gsk1562590治疗后，小鼠耳朵表皮中的炎症细胞的浸润情况图；
26.图8为gsk1562590治疗后，mcpt8特异性标记的嗜碱性粒细胞免疫组化结果图；
27.图9为gsk1562590治疗后，在耳皮进行rna
‑
seq检测的小鼠耳皮肤中瘙痒相关受体和瘙痒相关基因的转录表达情况图，a为gsk1562590治疗后，在耳皮进行rna
‑
seq检测的小鼠耳皮肤中瘙痒相关受体的转录表达情况图；b为gsk1562590治疗后，在耳皮进行rna
‑
seq检测的小鼠耳皮肤中瘙痒相关基因的转录表达情况图；
28.图10为urotensin 2
‑
gpr14信号转导通路图。
具体实施方式
29.本发明提供了一种utr拮抗剂gsk1562590在制备治疗瘙痒症的药物中的应用。
30.在本发明中，通过构建mc903诱导的小鼠慢性瘙痒模型，gsk1562590在治疗第10天显著减弱了mc903诱发的瘙痒样行为，且存在时间依赖性，显著减少了抓挠次数，能够有效治疗慢性瘙痒。在本发明中，瘙痒症优选地包括慢性瘙痒症，所述慢性瘙痒症优选地包括特应性皮炎所致的慢性瘙痒，所述gsk1562590购自(rd，cat.no.5110)，所述gsk1562590的结构式如下:
[0031][0032]
在本发明中，所述gsk1562590区别于以往效力差、选择性和/或内在活性有限的拮抗剂，是一种高亲和力和选择性的utr拮抗剂，且在体内表现出持续的utr停留时间和更好的临床前疗效，通过选择性抑制gpr14，作用于与瘙痒感觉神经元
‑
皮肤表皮免疫相关的uii/gpr14信号转导通路治疗慢性瘙痒。所述gsk1562590优选地抑制炎症相关细胞因子的表达，所述瘙痒和炎症相关细胞因子优选地包括nppb、il
‑
24、il
‑
19、cxcl5、cxcl5、fasl、il
‑
1b、il
‑
13、ccl22、ccl17、癌抑素m。所述gsk1562590优选地抑制瘙痒相关受体的表达，所述瘙痒相关受体优选地包括mrgpra2b、ccr2、ccr6、il
‑
13rα1、il
‑
13rα2、ntrk1、il
‑
31rα、cxcr3、il24rα。
[0033]
在本发明中，所述药物优选地包括活性成分gsk1562590及药物学上可接受的载体，所述活性成分在药物中的含量为1％～99％。本发明中，所述的药物学上可接受的载体包括着色剂、稀释剂、甜味剂、崩解剂、助溶剂、粘合剂、分散剂、湿润剂中的一种或多种，所述采用本领域常规的载体，以不和本发明活性成分发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提。所述药物的剂型可以为常规片剂、胶囊剂、控释制剂、缓释制剂、颗粒剂、溶液剂、注射剂。本发明所述药物可经口服、皮下、肌肉、静脉施用，本发明中的药物给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。本发明药物的制备方法没有特殊限定，采用本领域熟知的方法制备即可，然后按照本领域常规的方式进行包装。
[0034]
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
[0035]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036]
实施例1小鼠脸颊皮内注射uii诱导瞬时瘙痒模型
[0037]
(1)实验动物
[0038]
6～8周健康的c57bl/6j雌鼠，体重16～18g，雌鼠购自北京斯贝福生物科技有限公司，雌鼠按照每笼8只饲养，食水自由。动物房温度恒定为25℃，通风良好，光照与黑暗环境12h周期交替进行。
[0039]
(2)uii溶液配制
[0040]
将uii溶液分别配置为高剂量2.43mg/ml、较高剂量1.215mg/ml、中剂量0.729mg/
ml、低剂量0.405mg/ml的uii溶液。即首先将2.43mg的uii溶于1ml的vehicle(即pbs 7.2～7.4)中，配置成高剂量(2.43mg/ml)uii溶液，然后将2.43mg/ml uii溶液溶于2ml的vehicle中稀释，即得较高剂量(1.215mg/ml)uii溶液，将1.215mg/ml的uii溶液溶于1.7ml的vehicle中，即得中剂量(0.729mg/m1)uii溶液，将0.729mg/ml的uii溶液稀释于1.8ml的vehicle中即得低剂量(0.405mg/ml)uii溶液。浓度配比选择根据小鼠体重计算所得。
[0041]
(3)小鼠脸颊皮内注射uii诱导瞬时瘙痒模型的步骤如下：
[0042]
1)小鼠饲养于小鼠动物房适应3～5天，将小鼠按照体重随机均分为2组：处理组与对照组，处理组即uii溶液组、中剂量uii溶液组、较高剂量uii溶液组和高剂量uii溶液组各8只，对照组即vehicle组8只小鼠；
[0043]
2)处理组小鼠分批次进行右脸颊皮内注射低剂量uii溶液、中剂量uii溶液、较高剂量uii溶液和高剂量uii溶液各10μl，对照组只注射相同剂量的vehicle(即ph为7.2～7.4的pbs溶液)，小鼠脸颊注射完成后，立即录像观察，记录小鼠1个小时的抓挠行为并统计结果(小鼠后爪到右脸颊，指向注射部位的后肢抓挠行为被认为是瘙痒的指示，一次抓挠(scratching bout)被定义为小鼠举起爪子，连续抓挠一段时间，直到爪子还回到地板上。
[0044]
3)小鼠每隔1天进行1次同步骤2)所述的右脸颊皮内注射，观察录像。
[0045]
由附图1可知，行为学测试结果表明小鼠脸颊皮内注射不同剂量的uii溶液，可诱发小鼠产生瘙痒抓挠反应，亦可引起轻微的擦拭，这表示一种较低程度的疼痛行为，通过搔抓平均次数与擦拭平均次数比较，表明uii对瘙痒和疼痛的诱导呈剂量依赖性。
[0046]
实施例2 ad样小鼠模型皮肤、小鼠三叉神经节(tg)切片样本组织病理学检查
[0047]
免疫组化(石蜡切片染色)实验方法步骤如下：
[0048]
(1)脱蜡与抗原修复
[0049]
首先去除切片上的石蜡，在通风橱中，将样品放入装有二甲苯的染缸玻璃容器中，放入2次，每次10min，尽量除去切片上的石蜡，防止石蜡除去不完全导致染色不匀，其中，所述样品取自小鼠颈背部的皮肤；
[0050]
再将切片置于提前准备好的100％、95％、70％、50％的乙醇的染缸容器中各放置10min，将切片取出后放在纯水中洗涤两次，水流不能太急以防样品冲掉，完成洗涤后，将切片放置在纯水中，将准备好的1x抗原修复液(dako)倒入染缸中，并把染缸放入高压锅中加热，抗原修复液沸腾后，其溶液温度超过95℃后，将切片放入抗原修复液中煮沸30min，不能时间过长，否则会把样品煮烂，煮好后，将染缸拿出直接放到4℃冰箱中冷却，直至抗原修复液冷却变澄清；
[0051]
(2)染色
[0052]
将4℃冰箱中的切片放在常温中恢复到室温后，用吸水纸小心擦拭每个组织四周的抗原修复液，并用pap笔(疏水)勾勒出样品边缘，将勾勒好的切片，放入装有pbs的染缸中洗涤3次，每次5min，把洗好的切片放于湿润的皿中(为了防止样品变干)，在每个样品中加入0.2％的triton
‑
pbs通透60～90min，通透后放入pbs的染缸中洗1次，洗5min，洗完后每个样中加入200μl含10％胎牛血清加1％bsa
‑
pbs的封闭液，在室温下封闭1～2h；
[0053]
封闭后加入用封闭液按一定比例稀释的uii(1:100)，gpr14(1:91)，pgp9.5(1:500)一抗，用封口膜封好皿，放置在4℃冰箱中过夜，第二天拿出切片将一抗回收后，将玻片放置在pbs重复上述的洗片过程，洗涤后加入用封闭液按1:500稀释的相应的二抗，室温避
光1～2h，孵育后将切片放入pbs中洗涤3次，每次5min，pbs洗完后再用纯水洗涤1次，洗5min，洗完后，擦干玻片，并用滤纸将pap笔勾勒的地方擦拭干净，擦时防止样品变干，在擦干净的样本中加入一滴含dapi的抗荧光淬灭剂，立即用干净的盖玻片轻轻盖住组织，确保切片中没有气泡，用透明指甲油进行封片，将制好的玻片在室温5min后放在荧光显微镜下进行镜检，拍过图片后将玻片放置在
‑
80℃冰箱保存。
[0054]
由图2和图3免疫组化分析结果可以看出，uii和gpr14在特应性皮肤小鼠中表达显著上调，uii和gpr14的信号增强，且信号多位于微血管壁和角质形成细胞，而且皮炎皮肤有明显增加。此外，小鼠mc903诱导的ad样模型组中，与健康对照组相比，ad
‑
mtgn中uii表达显著上调，而gpr14表达下调，表明uii和gpr14的表达与特应性皮炎皮肤之间的相关性。
[0055]
实施例3 mc903构建的小鼠慢性瘙痒模型
[0056]
(1)实验动物
[0057]
6～8周健康的c57bl/6j雌鼠，体重16～18g，雌鼠购自北京斯贝福生物科技有限公司，雌鼠按照每笼8只饲养，食水自由。动物房温度恒定为25℃，通风良好，光照与黑暗环境12h周期交替进行。
[0058]
(2)mc903构建的小鼠慢性瘙痒模型的步骤如下：
[0059]
1)小鼠饲养于小鼠动物房适应3～5天，将小鼠按照体重随机均分为2组：处理组与对照组，每组8只小鼠；
[0060]
2)小鼠左耳涂抹mc903(4nm，20μl)和右耳涂抹无水乙醇(20μl)，其中mc903购自(sigma，c4369
‑
10mg)，每天给药后立即对所有小鼠进行行为录像，每次录像持续60分钟，记录小鼠1个小时的抓挠行为并统计结果，mc903构建慢性瘙痒模型期间小鼠的抓挠情况见表1。
[0061]
表1 mc903构建慢性瘙痒模型期间小鼠的抓挠情况
[0062][0063]
表1可知，连续7天慢性瘙痒模型建立成功。
[0064]
实施例4 gsk1562590治疗mc903诱导的小鼠慢性痒的试验
[0065]
(1)将实施例3成功建立的慢性瘙痒模型小鼠按照体重、小鼠瘙痒抓挠情况平均分为2组，即治疗组mc903 gsk1562590，对照组mc903 vehicle，每组8只小鼠。
[0066]
(2)每天用mc903(4nm，20μl)和无水乙醇(20μl)分别涂抹小鼠左耳和右耳，然后每天用治疗组、对照组立即进行灌胃治疗1次，施于5mg/kg gsk1562590(1.7％dmso溶液，20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精，剂量100μl)，对照组施加vehicle(1.7％dmso溶液，20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精，剂量100μl)，在每次施药之前先录像观察动物行为学，施药后记录施药时间；
[0067]
5mg/kg gsk1562590(1.7％dmso20％～羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液，剂量100μl)。计算方法为：按照所购买的gsk1562590说明书将其溶解于dmso配置成100mm的母液冻存。由m＝c
×
v
×
m可得到gsk1562590母液浓度约为10mg/166ul＝60.24μg/μl。5mg/kg，以每只小鼠体重18g计算所需剂量。即一只小鼠需要0.09mg的剂量，按10只鼠计算，即一共需要0.9mg母液，按1mg总量计算，则每次需要17μl左右的gsk1562590母液。则治疗组每次需要施加5mg/kg gsk1562590(1.7％dmso20％～羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液)的总剂剂量为1000μl。对照组则需要施加vehicle(1.7％dmso溶液～20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液)的总剂剂量为1000ul。
[0068]
20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液配制：
[0069]
将0.2g羟丙基
‑
β
‑
环糊精粉末溶解于1ml的无菌水或去离子水中即得浓度为20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液。
[0070]
5mg/kg gsk1562590(1.7％dmso～20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液，剂量100μl)配制：向20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液中加入相应体积(17μl)dmso提前配置的gsk1562590母液彻底混匀，静置于室温，即可得到5mg/kg gsk1562590(1.7％dmso20％～20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液)；vehicle(1.7％dmso～20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液，剂量100μl)配制：向20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液中只加入17μl dmso彻底混匀，静置于室温，即可得到含量为(1.7％dmso～20％羟丙基
‑
β
‑
环糊精溶液)。
[0071]
(3)对两组小鼠进行1h平衡处理，待1h平衡结束后对小鼠进行行为录像，每次录像持续60min，施药过程持续进行5天，每天记录小鼠1个小时的抓挠行为并统计结果，在此期间两组小鼠体重均衡，饮食健康；
[0072]
(4)施药过程持续进行5天后不再涂抹mc903和无水乙醇，也不再继续给药治疗，只对两组小鼠进行录像观察；
[0073]
(5)施药后第6天取小鼠耳皮、同侧和对侧三叉神经节(tg)进行rna
‑
seq、h&e染色和免疫组化分析。
[0074]
由图4中b结果显示，第10天(即施药后的第3天)治疗组小鼠抓挠次数明显低于对照组，统计学分析结果表明治疗组小鼠抓挠次数得到显著抑制，施药后第5天发现治疗组与对照组相比小鼠抓挠次数依然存在显著，两组小鼠耳厚存在不同程度的皮炎皮损差异，故gsk1562590抑制剂有效减少了mc903诱导的慢性瘙痒样行为；图4中c结果表明，小鼠第8天开始施药治疗，施药第8天和第9天，治疗组和对照组在瘙痒样行为上没有显著差异，治疗第10天的统计学分析结果显示治疗组与对照组相比小鼠抓挠次数存在显著抑制，表明uii参与了mc903诱导的慢性痒的后期阶段，gsk1562590在第10天显著减弱mc903诱发的瘙痒样行为，且存在时间依赖性。
[0075]
实施例5 h&e染色与免疫组化分析慢性痒皮肤的病理情况以及皮肤表皮免疫细胞的浸润情况。
[0076]
(1)免疫组化(石蜡切片染色)方法同实施例2
[0077]
(2)h&e染色
[0078]
提前准备好mc903慢性瘙痒模型第13天提取的耳皮样品，进行h&e染色，染色步骤如下：
[0079]
1)用蒸馏水将样品洗涤两分钟；
[0080]
2)将上述处理好的样品，用苏木素染色5～10分钟，染色后用纯水洗去残留的染色液；
[0081]
3)用0.5％的盐酸酒精(75％酒精)分化处理30秒，处理完后用纯水洗去盐酸酒精；
[0082]
4)将玻片放在纯水中浸泡5～10分钟，使其返蓝；
[0083]
5)用伊红染色1～5分钟，染色完成后用纯水冲去残留的染色液；
[0084]
6)将玻片浸入无水乙醇中脱水2次，每次脱水2分钟；
[0085]
7)将玻片浸入二甲苯中做透明处理；
[0086]
8)封片并镜检。
[0087]
(3)c
‑
kit试剂盒检测mast cell实验
[0088]
提前制备好mc903慢性瘙痒模型第13天提取的耳皮切片样品，检测步骤如下：
[0089]
1)切片常规脱蜡至水：二甲苯
→
二甲苯
→
100％无水乙醇
→
95％无水乙醇
→
70％无水乙醇
→
50％无水乙醇(每步均为10min)
→
蒸馏水
→
蒸馏水(每步均5min)；
[0090]
2)热修复抗原：抗原修复液(原始的浓度是10x)与纯水按1:9配制在染缸中，将切片漫入染缸电炉加热使抗原修复液煮沸，待温度达到95℃后(染缸内液体完全变为乳白色浑浊)，开始计时，煮沸35～40min，关闭电源，拿出染缸放入4℃冰箱冷却；
[0091]
3)用吸水纸小心擦拭每个组织周围的抗原修复液，并用pap笔(疏水)勾勒出样品边缘，将勾勒好的玻片，pbs洗涤3次，每次5min；
[0092]
4)3％h2o2室温孵育25min以灭活内源性过氧化物酶(锡箔纸包裹避光)，pbs洗3次，每次5min；
[0093]
5)通透：在每个样品中加入0.2％的triton
‑
pbs通透60min，通透后pbs洗1次，5min；
[0094]
6)封闭：滴加5％bsa封闭液，室温孵育20min，擦去多余液体免洗；
[0095]
7)用封闭液将一抗(c
‑
kit)按1:100稀释，滴加稀释的一抗37℃孵育1h左右或20℃孵育2h左右，一般选择4℃过夜，pbs洗3次，每次5min；
[0096]
8)用封闭液将bio
‑
羊抗免igg浓缩液按1:50～100稀释成工作液，滴加bio
‑
羊抗兔igg工作液，20～37℃孵育30min，或选择室温孵育1h，pbs洗4次，每次5min；
[0097]
9)用封闭液将sabc
‑
pod浓缩液按1:100稀释成工作液，滴加sabc
‑
pod工作液，37℃温箱孵育30min，pbs洗4次，每次5min；
[0098]
10)dab显色:配备dab混合液，向5ml蒸馏水中依次加入4滴reagent1，8滴reagent2，4滴reagent 3，4滴reagent 4(蓝色nickel)，确保完全混匀，滴加dab混合液，锡箔纸包裹避光孵育30min(防止背景颜色变深)，镜下观样本染色情况，结束后蒸馏水清洗1次，5min。
[0099]
11)dapi显色标记细胞核：滴加dapi覆盖组织样本即可，孵育5min；
[0100]
12)封片：dapi染色结束后也可进行脱水步骤：50％无水乙醇
→
70％无水乙醇
→
95％无水乙醇
→
100％无水乙醇
→
二甲苯
→
二甲苯，封片保存。
[0101]
13.拍照观察，拍过图片后将玻片放置在
‑
80℃保存。
[0102]
由图5可知，mc903小鼠耳朵皮肤免疫组织化学染色结果表明，uii和gpr14在mc903诱导的耳皮同侧(左侧)的慢性痒皮肤表达显著增强，gsk1562590处理与对照处理相比较uii和gpr14同侧表皮荧光信号显著减弱；然而，由图6可知，uii和gpr14在etoh诱导的小鼠耳皮对侧(右侧)表皮荧光信号强度无明显差异，结果表明uii和gpr14参与了mc903诱导的小鼠慢性痒皮肤的构建。
[0103]
由图7和8结果表明，经gsk1562590治疗后小鼠耳朵表皮厚度显著降低，且小鼠耳朵表皮中嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞浸润显著减少，但在真皮中未减少，以上结果表明gsk1562590影响耳部皮肤的病理变化，且gsk1562590治疗可有效缓解特性应皮炎皮肤炎症。
[0104]
实施例6 mc903诱导的小鼠慢性痒模型耳皮肤样本高通量测序试验
[0105]
1)组织总rna提取
[0106]
提前准备好mc903慢性瘙痒模型第13天提取的耳皮肤样品；
[0107]
使用trizol(invitrogen,usa)按照说明书从组织中提取总rna；取约60mg组织在2ml管中用液氮研磨成粉末，匀浆2分钟，常温放置5分钟；
[0108]
接下来13000g，4℃，离心5分钟，用0.3ml氯仿/异戊醇(24:1)将上清转移到新的ep管中，用力震荡15s(清洗1次，静置3min左右，再次旋涡)，在室温下放置15min，然后在4℃下，13000g离心10min；
[0109]
离心后，将保留rna的上水相转移到新管中，加入等体积的异丙醇上清液，然后在4℃，13000转离心20分钟。
[0110]
移除上层清液,将1ml75％乙醇加入其中重悬溶液,然后在4℃下，13000g离心10min，弃去管中的75％乙醇，并加入无rna酶水25μl
‑
100μl溶解rna，随后，使用纳米液滴和安捷伦2100生物分析仪(thermo fisher scientific,usa)对总rna进行鉴定和定量。
[0111]
2)mrna的建库
[0112]
用oligo(dt)吸附磁珠纯化mrna。将纯化后的mrna在适当温度下用片段缓冲液裂解成小片段。利用随机六聚体引物反转录生成第一链cdna，然后合成第二链cdna。通过加入a
‑
tailing mix与rnaindexadapters进行末端修复。前一步获得的cdna片段经pcr扩增，产物经ampure xp beads纯化后溶解于eb溶液中。对上一步得到的双链pcr产物进行加热变性和夹板寡核苷酸序列环化，得到最终文库。将单链环dna(sscir dna)格式化为最终文库。用phi29扩增最终文库，制成具有一个分子超过300个拷贝的dna纳米球(dnb)，将dnb装载到图案化纳米阵列，在bgiseq500平台(bgi
‑
shenzhen,china)上生成单端50个碱基reads。
[0113]
从图10的rna
‑
seq分析结果可以看出，在mc903诱导的慢性痒耳皮肤中，gsk156290显著降低了mrgpra2b、ccr2、ccr6、il
‑
13rα1、il
‑
13rα2、ntrk1、il
‑
31rα、cxcr3、cxcr6和il27rα，所述显著下调的基因是减少瘙痒样反应的基础。此外，炎症相关细胞因子如nppb、il
‑
24、il
‑
19、cxcl5、cxcl5、fasl、il
‑
1b、il
‑
13、ccl22、ccl17、癌抑素m(osm)的转录水平也显著降低，其转录水平与ad疾病相关，il
‑
13和il
‑
31在ad中起着关键作用。因此，uii在小鼠中代表了一种新的瘙痒原，并可能促进人类皮炎相关的瘙痒，突出了其作为慢性瘙痒的靶点的作用。
[0114]
典型案例：
[0115]
案例1
[0116]
一名特应性皮炎患者(35岁)，每日口服给药gsk1562590(5mg/kg)，治疗三天后，其抓挠反应明显下降，对于患者皮肤的4mm无损伤取样，并经由h&e染色结果和免疫组化分析，可以看出表皮厚度显著降低，皮内嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞浸润显著减少。
[0117]
案例2
[0118]
一名特应性皮炎患者(56岁)，口服给药gsk1562590(5mg/kg)治疗5天后，观察其每日抓挠反应较五日前明显下降，对于患者皮肤的4mm微创取样经由h&e染色结果和免疫组化分析可以看出表皮厚度显著降低，皮内嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞浸润显著减少。
[0119]
本发明通过gsk1562590治疗特应性皮炎可有效降低瘙痒频率，并且缓解特性应皮炎皮肤炎症。
[0120]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。