一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法与流程

1.本发明属于芒萁繁殖技术领域，具体涉及一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，包 括芒萁组织培养和原叶体诱导增殖的方法。


背景技术：

2.芒萁(dicranopteris pedata)，属于里白科、芒萁属，亚热带酸性土指示植物。
3.芒萁常绿，蕨类克隆植物，直立或蔓生；根状茎细长，褐棕色，密被棕色鳞片，在表土层 匍匐生长，不断分枝；叶疏生，纸质，表面黄绿色，背面灰白色，叶柄圆柱形，长短不一， 褐棕色；叶片重复假两歧分叉，在每一交叉处均有羽片着生，在最后一分叉处有羽片两歧着生； 孢子囊群圆形，着生于细脉中段。
4.芒萁的生长特点和生态功能已有研究。芒萁喜阳，耐酸，耐贫瘠，耐旱，适应性强，在 我国南方红壤区的困难立地亦适生，如稀土尾矿、高速公路边坡、红壤崩岗地表，芒萁是先 锋物种；孢子在适宜条件下萌发，缓慢生长成孢子体，成熟孢子体依靠根状茎的克隆生长特 性，逐步形成种群，覆盖裸露地表，有较强的水土保持功能。
5.芒萁的金属富集功能已有研究。芒萁rna测序结果显示，芒萁具有多种重金属结合蛋白 的表达基因。芒萁植株分析能够吸附土壤中的铅pb、锌zn、钨w、锰mn、镉cd等重金属， 镧la、铈ce、镨pr、钕nd等稀土元素，以及镭ra、和钍th等放射性元素，是典型的金属 型植物(metallophytes)，已成为矿区废弃地植被重建的先锋植物。
6.芒萁种群克隆生长的生态过程已有研究，部分结论总结出芒萁根浅根性、芒萁根状茎地 表匍匐生长交织成网状结构等生长特点，可应用于尾矿弃土场、边坡等困难立地覆绿和生态 修复。
7.芒萁孢子自然条件萌发已有观测，孢子萌发成肉眼可见原叶体需58天，发育至直径8mm 左右需9个月。
8.芒萁原叶体是芒萁孢子发育成孢子体的中间产物，可作为一种繁殖材料，应用在芒萁植 株苗生产、野外撒播上。需解决的问题是，需要一种新方法，能够快速、大量的生产原叶体， 并能保持其活性和稳定直至利用。


技术实现要素：

9.针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种芒萁原叶体绿色球状体(greenglobular body，ggb)组培生产方法，该方法打破芒萁孢子休眠，快速萌发生成原叶体，并通过增 殖获得大量原叶体的芒萁繁殖材料，其通过组织培养技术进行原叶体的增殖，解决了通过芒 萁孢子自然条件下萌发成芒萁原叶体的不稳定性、萌发率低等问题；能在较短时间内获得大 量的芒萁原叶体，并能保存至被利用。
10.本发明通过以下技术方案予以实现：
11.一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，该方法包括以下步骤：
12.(1)外植体材料收集和保存：将带有孢子囊群的芒萁叶片剪下，放入洁净的硫酸纸
袋内， 置于通风干燥处一周，待孢子成熟自然散落时收集，立即接种或置于4℃冰柜中保存；
13.(2)外植体材料灭菌处理：取适量芒萁成熟孢子，灭菌处理，无菌水冲洗；
14.(3)孢子的萌发诱导：将经过步骤(2)灭菌处理后的芒萁成熟孢子接种到装有萌发诱 导培养基的培养瓶中进行萌发诱导，并在培养室中培养3～4周，生成片状原叶体；
15.(4)ggb初代培养：将经过步骤(3)培养获得的片状原叶体，转接到初代培养基中进 行初代ggb的培养，在无菌培养室中培养3～4周，生成直径为8mm至12mm的原叶体绿 色球状体，即初代ggb；
16.(5)ggb继代培养：在无菌环境下将经过步骤(4)培养的初代ggb分散成直径0.5mm 至1mm的碎米状原叶体小粒，无菌条件下将碎米状原叶体小粒转接到继代培养基进行继代培 养，无菌培养室中培养3～4周，生成直径为20mm至40mm的原叶体绿色球状体，即继代 ggb；
17.(6)ggb保存：收集继代ggb，洗去附着培养基，移至4℃低温环境中，继代ggb停 止增殖发育，可以保存休眠状态30至60天。
18.进一步地，步骤(1)中，当芒萁叶片背面的孢子囊群由淡黄色转为黄褐色时进行外植体 材料收集；芒萁孢子收集的时间根据纬度不同存在差异，在北纬22
°±
0.5
°
纬度带采集时间2 ～4月份，其中3月最佳，北纬28
±
0.5
°
纬度带采集时间为9～11月份，其中10月最佳。
19.进一步地，步骤(2)中，灭菌处理为将作为外植体材料的芒萁孢子采用5％次氯酸钠溶 液灭菌45s，无菌水冲洗3～4次。
20.进一步地，步骤(3)中萌发诱导培养基为dkw 1mg/l 6
‑
ba 1mg/l naa 蔗糖30g/l 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4；培养条件为：培养光照强度2000～3000lx，光照时间12h/d，温 度23
±
3℃。
21.步骤(3)将孢子萌发诱导生成物片状原叶体，1个孢子诱导生产1个原叶体；原叶体 的形态特征是：绿色，直径1mm～2mm，片状，肉眼可见；原叶体结构特征是：原叶体发育 初级阶段，有大量的初级分生组织细胞。
22.进一步地，步骤(4)中初代培养基为1/8ms 蔗糖15g/l 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4；培 养条件为：培养光照强度2000～3000lx，光照时间12h/d，温度23
±
3℃。
23.片状原叶体中含有叶绿体的初级分生细胞，经步骤(4)培养后大量增殖形成的初级分生 细胞团，得到初代ggb。
24.进一步地，步骤(5)中继代培养基为1/2ms 0.25～1mg/l 6
‑
ba 10～30g/l蔗糖 琼脂5.6g/l， ph4.8～5.4；培养条件为：培养光照强度2000
‑
3000lx，光照时间12h/d，温度23
±
3℃。
25.无菌条件下手捻或者刀切，打散初代ggb成原叶体绿色小粒，原叶体绿色小粒大小为碎 米粒大小或者更小，要求肉眼能见，易收集；其在转接时其粒径过小，不能用镊子夹到培养 基上，可以收集散播在培养基上，也可以收集与无菌水混合均匀后滴在培养基上。
26.继代培养获得的继代ggb，其产出数量大，一个月增殖倍数为2.27～13.58；继代ggb 功能特征是：可以无菌低温保存至继续做继代培养的材料，重复继代培养；亦可以低温保存， 以多种途径进一步培养为成熟原叶体，如应用于芒萁成熟原叶体培育、芒萁孢子体
种苗培育、 芒萁野外种植。
27.与现有技术相比，本发明有益效果包括：
28.(1)本发明的生产物芒萁原叶体的生产物，对比自然培育芒萁原叶体，具有更高效率和 产出，体现在：自然条件下1个孢子发育2个月才能获得1个肉眼可见的片状原叶体，本方 法1个孢子培养21天，获得1个肉眼可见的片状原叶体，培养2个月，可获得1个初代ggb； 1个ggb的分散物，无菌培养和自然条件下，均能直接生成大量芒萁原叶体；
29.(2)本发明的生产物芒萁原叶体绿色球状物(ggb)的生成过程，对比自然条件下孢子 萌发，具有直观性，体现在：对比孢子自然萌动直至片状原叶体出现，自然培育的孢子全过 程肉眼观测困难；本方法组培诱导孢子萌发和初代ggb、继代ggb是否萌动和原叶体的发 育过程可以肉眼观测，培育结果更直观。
30.(3)本发明的生产物芒萁原叶体绿色球状物(ggb)，与成熟原叶体对比，原叶体绿色 球状物具有更多的应用方向：可以继续做继代培养的转接材料，也可以类似种子的功能继续 培育为成熟原叶体，进一步培育成芒萁孢子体；
31.(4)本发明利用组织培养技术，进行原叶体增殖获得大量原叶体，不受季节气候变化、 自然灾害的影响。
32.(5)对比单个孢子直接萌发成单个原叶体，本发明更能有利于芒萁原叶体的后续利用。
附图说明
33.图1为实施例1芒萁孢子开始萌动的组织结构示意图。
34.图2为实施例1中孢子萌发诱导3～4周得到的片状原叶体的细胞组织结构示意图。
35.图3为实施例1中萌发的原叶体经诱导增殖3～4周得到的初代ggb的细胞组织结构示 意图。
具体实施方式
36.下面结合附图，对本发明作进一步地说明。
37.实施例
38.当芒萁叶片背面的孢子囊群由淡黄色转为黄褐色时，将带有孢子囊群的芒萁叶片剪下， 放入洁净的硫酸纸袋内，置于通风干燥处一周，待孢子成熟自然散落时收集，其组织结构如 图1所示，立即接种或置于4℃冰柜中保存；
39.取适量芒萁成熟孢子，置入5％次氯酸钠水溶液灭菌45s，无菌水冲洗34次；
40.将经过灭菌处理后的芒萁成熟孢子接种到装有萌发诱导培养基的培养瓶中进行萌发诱导， 并在培养室中培养3～4周，培养光照强度为2000
‑
3000lx，光照时间为12h/d，温度为23
±
3℃， 萌发诱导培养基为dkw 1mg/l 6
‑
ba 1mg/l naa 蔗糖30g/l 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4，诱 导生成物为芒萁片状原叶体，其结构示意图如图2所示。
41.将片状原叶体转接至ggb初代培养基，培养光照强度为2000～3000lx，光照时间为 12h/d，温度为23
±
3℃，ggb初代培养基为1/8ms 蔗糖15g/l 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4，在 无菌培养室中培养3～4周，生成直径为8mm至12mm的原叶体绿色球状体，即初代ggb， 其结构示意图如图3所示；
42.无菌条件下手捻或者刀切将的初代ggb分散成直径0.5mm至1mm的碎米状原叶体小粒， 无菌条件下将碎米状原叶体小粒转接到继代培养基进行继代培养，培养光照强度为2000～ 3000lx，光照时间为12h/d，温度为23
±
3℃，继代培养基为1/2ms 0.25～1mg/l 6
‑
ba 10～ 30g/l蔗糖 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4，无菌培养室中培养周，生成直径为20mm至40mm 的原叶体绿色球状体，即继代ggb。
43.由图1和图2可知，采用本实施例的培养方法和培养基可以得到由1个孢子，得到1个 片状原叶体。由图3可知，采用本实施例的培养方法和培养基，经原叶体绿色球状体的初代 培养，可将1个原叶体培养成由大量原叶体原始细胞组成的原叶体绿色球状体，由表1可知， 采用本案例的培养方法和培养基，绿色球状体分散后的原叶体绿色小粒，经30d的继代培养 后，可实现增殖，其质量增殖倍数为2.27～13.58，质量增加倍数为1.27～12.58，增殖效果显 著，增殖效率较高。
44.对比例
45.将实施例中继代培养基的配方调整成1/2ms 0～0.25mg/l 6
‑
ba 1mg/l kt 蔗糖30g/l 琼脂5.6g/l，其他操作同实施例1。经步骤1芒萁孢子可萌发成原叶体；经步骤2片状原叶体 可培养成初代原叶体绿色球状体；经步骤3，由表1可知，原叶体绿色小粒继代培养质量增 殖倍数为0.10～1.50，质量增加倍数为
‑
0.9～0.50，增殖培养失败或增殖效果不显著。
46.表1实施例和对比例原叶体绿色球状体继代培养30d后质量增殖倍数对比
[0047][0048]
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理 解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离 本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。 因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。