一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法与流程

技术特征：
1.一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)外植体材料收集和保存：将带有孢子囊群的芒萁叶片剪下，放入洁净的硫酸纸袋内，置于通风干燥处，待孢子成熟自然散落时收集，立即接种或置于4℃冰柜中保存；(2)外植体材料灭菌处理：取适量芒萁成熟孢子，灭菌处理，无菌水冲洗；(3)孢子的萌发诱导：将经过步骤(2)灭菌处理后的芒萁成熟孢子接种到装有萌发诱导培养基的培养瓶中进行萌发诱导，并在培养室中培养3～4周，生成片状原叶体，所述片状原叶体为原叶体发育初级阶段，其含有大量的初级分生组织细胞；(4)ggb初代培养：将经过步骤(3)培养获得的片状原叶体，转接到初代培养基中进行初代ggb的培养，在无菌培养室中培养3～4周，片状原叶体中含有叶绿体的初级分生细胞大量增殖形成的初级分生细胞团，进而生成直径为8mm至12mm的原叶体绿色球状体，即初代ggb；(5)ggb继代培养：在无菌环境下将经过步骤(4)培养的初代ggb分散成直径0.5mm至1mm的碎米状原叶体小粒，无菌条件下将碎米状原叶体小粒转接到继代培养基进行继代培养，无菌培养室中培养周，生成直径为20mm至40mm的原叶体绿色球状体，即继代ggb；(6)ggb保存：收集继代ggb，洗去附着培养基，移至4℃低温环境中，继代ggb停止增殖发育，可以保存休眠状态30至60天。2.根据权利要求1所述的一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，其特征在于：所述步骤(1)中，当芒萁叶片背面的孢子囊群由淡黄色转为黄褐色时进行外植体材料收集；芒萁孢子收集的时间根据纬度不同存在差异，在北纬22
°±
0.5
°
纬度带采集时间2～4月份，北纬28
±
0.5
°
纬度带采集时间为9～11月份。3.根据权利要求1所述的一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，其特征在于：所述步骤(2)中，灭菌处理为将作为外植体材料的芒萁成熟孢子采用5％次氯酸钠溶液灭菌45s，无菌水冲洗3～4次。4.根据权利要求1所述的一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，其特征在于：所述步骤(3)中萌发诱导培养基为dkw 1mg/l 6
‑
ba 1mg/l naa 蔗糖30g/l 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4；培养条件为：培养光照强度2000
‑
3000lx，光照时间12h/d，温度23
±
3℃。5.根据权利要求1所述的一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，其特征在于：所述步骤(4)中初代培养基为1/8ms 蔗糖15g/l 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4；培养条件为：培养光照强度2000～3000lx，光照时间12h/d，温度23
±
3℃。6.根据权利要求1所述的一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，其特征在于：所述步骤(5)中继代培养基为1/2ms 0.25～1mg/l 6
‑
ba 10～30g/l蔗糖 琼脂5.6g/l，ph4.8～5.4；培养条件为：培养光照强度2000～3000lx，光照时间12h/d，温度23
±
3℃。7.根据权利要求1所述的一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，其特征在于，所述继代ggb功能特征是：可无菌低温保存至继续做继代培养的材料，重复继代培养；亦可低温保存，并进一步培养为成熟原叶体，应用于芒萁成熟原叶体培育、芒萁孢子体种苗培育、芒萁野外种植。

技术总结
本发明公开了一种芒萁原叶体绿色球状体组培生产方法，包括以下步骤：外植体材料收集和保存、外植体材料灭菌处理、芒萁孢子诱导萌发、GGB初代培养、GGB继代培养、GGB保存。本发明在芒萁孢子的诱导萌发中，指出有利于提高孢子萌发率的收集时间，通过调整萌发培养基细胞分裂素浓度，诱导孢子快速萌发和生长成片状原叶体；在GGB初代培养中，以片状原叶体为培养材料，调整培养基营养成分、细胞分裂素类型和浓度，抑制片状原叶体向成熟原叶体发育，诱导含有叶绿体的初生分生组织细胞大量增殖，生成原叶体绿色球状体；GGB继代培养中调整培养基细胞分裂素浓度、营养成分，一个月质量增殖倍数为2.27～13.58，大大提高了GGB生产速度。大大提高了GGB生产速度。大大提高了GGB生产速度。


技术研发人员：刘丽婷 龚春 张港隆 熊振宇 高伟 汪雁楠 吴妹杰
受保护的技术使用者：江西省林业科学院
技术研发日：2021.11.08
技术公布日：2022/1/4