用于晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症2型的AAV载体治疗方法与流程

用于晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症2型的aav载体治疗方法
相关申请
1.本专利申请要求于2019年2月1日提交的美国临时专利申请号62/800,131的优先权。前述申请的包括所有正文、表格、附图和序列在内的全部内容通过引用并入本文。


背景技术：

2.晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症2(cln2)，也称为jansky
‑
bielschowsky病和晚期婴儿ncl(lincl)，是一种出现在约2至4岁左右的儿童中的进行性神经变性疾病。症状包括癫痫发作、运动控制和视力丧失、认知和发育障碍，最终在生命的头20年内死亡。潜在的病理机制是由于相应基因的突变导致可溶性溶酶体酶三肽基肽酶
‑
1(tpp1)的缺乏或缺陷。
3.报告表明，内衬于大脑侧脑室的室管膜细胞的腺相关病毒(aav)载体转导可以使得人tpp1连续分泌到脑脊液(csf)中，由此将表达的tpp1蛋白递送到整个中枢神经系统(martz,l.,biocentury innovation,2015年12月10日)。据报道，在cln2的犬模型中经由室管膜转导递送aav2
‑
cag
‑
tpp1可提供疾病改良并延长生命(katz,m.l.,等人(2015).sci transl med,7(313))。


技术实现要素：

4.本文公开了评估aav2
‑
cag
‑
人tpp1载体的安全性和耐受性的非人灵长类动物研究。通过单侧注射到侧脑室中为aav载体递送范围从1e13到2.17e14载体基因组/大脑的3个剂量，然后进行5周和20周的观察。监测每只动物与基线相比tpp1活性和csf中抗原水平的变化。与基线相比，tpp1活性水平显示出了从低剂量队列的～17倍到高剂量队列的～48倍的峰值增加。此外，在整个研究期间，所有测试剂量的平均htpp1转基因表达水平都超过了tpp1的k
uptake
范围。对相关中枢神经系统(cns)组织的初步分析已确定没有与载体传递或tpp1转基因表达相关的病理变化。总之，在非人灵长类动物中利用aav2载体进行室管膜转导后人tpp1的表达具有良好的耐受性，提供维持的csf tpp1蛋白表达，其一直在约60至约120ng/ml的k
uptake
值内或超过该值，足以为具有cln2的动物提供治疗影响。
5.在某些实施方案中，一种治疗需要三肽基肽酶1(tpp1)的灵长类动物的方法，该方法包括(a)提供重组腺相关病毒(aav)载体，该载体包含编码tpp1的核酸；以及(b)向灵长类动物的中枢神经系统(cns)施用一定量的重组aav载体，其中tpp1在灵长类动物中表达。
6.在某些实施方案中，灵长类动物是人类。在某些实施方案中，该人类患有晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症(cln2)。在某些实施方案中，该人类约1
‑
10岁或大于10岁。在某些实施方案中，该人类约2
‑
5岁。
7.在某些实施方案中，在治疗灵长类动物的方法中，将重组aav载体施用于侧脑室或脑池(cisternae magna)。在某些实施方案中，将重组aav载体施用于侧脑室的枕角(occipital horn)。在某些实施方案中，将重组aav载体单侧施用于一个侧脑室。在某些实施方案中，将重组aav载体双侧施用于每个侧脑室。在某些实施方案中，将重组aav载体多次
单侧或双侧施用于侧脑室的一侧或两侧。
8.在某些实施方案中，tpp1在cns中以增加的水平表达。在某些实施方案中，tpp1在整个cns中表达或递送。在某些实施方案中，tpp1在室管膜细胞中表达或递送至室管膜细胞。在某些实施例中，tpp1被递送至实质(parenchyma)。
9.在某些实施方案中，tpp1表达维持在等于或大于tpp1摄取到神经元中的最大量一半所需的水平。在某些实施方案中，tpp1表达维持在等于或大于k
uptake
的水平，其中k
uptake
为至少约60ng/ml。在某些实施方案中，tpp1表达维持在等于或大于k
uptake
的水平，其中kuptake为至少约60ng/ml
‑
120ng/ml。在某些实施方案中，tpp1表达维持在大于约120ng/ml的水平。在某些实施方案中，tpp1表达维持在大于约150ng/ml、大于约200ng/ml、大于约250ng/ml或大于约300ng/ml的水平。在某些实施方案中，tpp1表达在cns中维持至少约5周，或至少约10周，或至少约20周。在某些实施方案中，可检测的tpp1表达或tpp1活性在cns中维持至少5周，或至少10周，或至少20周。
10.在某些实施方案中，在治疗灵长类动物的方法中，将重组aav载体以如下剂量施用于cns：以大于约1.5x10
13
aav载体基因组的剂量；以约5x10
13
aav载体基因组或大于约5x10
13
aav载体基因组的剂量；以约1x10
14
aav载体基因组或大于约1x10
14
aav载体基因组的剂量；以约5x10
14
aav载体基因组或大于约5x10
14
aav载体基因组的剂量；以约1x10
15
aav载体基因组或大于约1x10
15
aav载体基因组的剂量；或以约5x10
15
aav载体基因组或大于约5x10
15
aav载体基因组的剂量。
11.在某些实施方案中，在治疗灵长类动物的方法中，将重组aav载体以如下剂量施用于cns：以范围从约1.5x10
13
到约5x10
15
载体基因组的剂量；以范围从约1x10
14
到约3x10
15
载体基因组的剂量；以范围从约2x10
14
到约2x10
15
载体基因组的剂量；以范围从约2.5x10
14
到约7.5x10
14
载体基因组的剂量；以范围从约5x10
14
到约5x10
15
载体基因组的剂量；或以范围从约1x10
15
到约5x10
15
载体基因组的剂量。
12.在某些实施方案中，在治疗灵长类动物的方法中，将重组aav载体以如下剂量施用于cns：以约1x10
14
载体基因组的剂量，以约2x10
14
载体基因组的剂量，以约3x10
14
载体基因组的剂量，以约4x10
14
载体基因组的剂量，以约5x10
14
载体基因组的剂量，以约6x10
14
载体基因组的剂量，以约7x10
14
载体基因组的剂量，以约8x10
14
载体基因组的剂量，以约9x10
14
载体基因组的剂量，以约1x10
15
载体基因组的剂量，以约2x10
15
载体基因组的剂量，以约3x10
15
载体基因组的剂量，以约4x10
15
载体基因组的剂量，或以约5x10
15
载体基因组的剂量。
13.在某些实施方案中，该方法减少、减轻或抑制cln2的一种或多种症状；或预防或减少cln2的一种或多种症状的进展或恶化；或稳定cln2的一种或多种症状；或改善cln2的一种或多种症状。
14.在某些实施方案中，一种或多种症状选自由视力受损、认知发育受损或迟缓、运动控制丧失和癫痫发作组成的组。
15.在某些实施方案中，编码tpp1的核酸包含与表达控制元件可操作地连接的表达盒。在某些实施方案中，表达控制元件位于核酸的5’。在某些实施方案中，表达控制元件包含cag(seq id no:3)启动子、巨细胞病毒(cmv)即刻早期启动子/增强子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子/增强子、sv40启动子、二氢叶酸还原酶(dhfr)启动子，或鸡β
‑
肌动蛋白(cba)启动子。
16.在某些实施方案中，异源核酸位于一种或多种5’和/或3’aav反向末端重复序列(itr)之间。在某些实施方案中，一种或多种5’和/或3’aav itr包含不被aav rep蛋白加工的突变、修饰或变体的aav itr。在某些实施方案中，一种或多种5’和/或3’aav itr包含突变、修饰或变体的aav itr，其允许或促进在重组aav载体中自互补报告转基因的基因组形成为双链反向重复序列结构。在某些实施方案中，突变、修饰或变体的aav itr具有删除的d序列和/或突变、修饰或变体的末端解析位点(trs)序列。
17.在某些实施方案中，重组aav载体在5
’→3’
取向上包含第一aav itr；在哺乳动物细胞中可操作的启动子；异源核酸；聚腺苷酸化信号；以及任选的第二aav itr。
18.在某些实施方案中，一种或多种itr包括aav血清型aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rh74或rh10 itr。
19.在某些实施方案中，重组aav载体包含vp1、vp2或vp3序列，该vp1、vp2或vp3序列与aav血清型aav1，aav2，aav3，aav3b，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，aav11，aav12，rh74，rh10的vp1、vp2和/或vp3序列，spk1(seq id no:1)或spk2(seq id no:2)vp1、vp2和/或vp3，或任何上述aav血清型的杂交或嵌合体具有60％或更多的同一性。在某些实施方案中，重组aav载体包含vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白，该衣壳蛋白与选自aav1，aav2，aav3，aav3b，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，rh10，rh74的vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白、spk1(seq id no:1)和spk2(seq id no:2)vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白具有100％序列同一性。
20.在某些实施方案中，重组aav载体进一步包含位于核酸3’的聚腺苷酸化序列。在某些实施方案中，与编码tpp1的野生型核酸、表达控制元件或聚腺苷酸化序列相比，编码tpp1的核酸、表达控制元件或聚腺苷酸化序列具有减少的cpg。在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列包含牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化序列。
21.在某些实施方案中，tpp1是人tpp1，包含如seq id no:4所示的序列或由其组成，或者是其功能变体或多态形式。
22.在某些实施方案中，重组aav载体包含(a)一种或多种aav衣壳，以及(b)一种或多种aav反向末端重复序列(itr)，其中一种或多种aav itr位于核酸或表达盒的5’或3’末端的侧翼。
23.在某些实施方案中，重组aav载体进一步包含位于一种或多种itr的5’或3’的内含子。
24.在某些实施方案中，一种或多种itr和/或内含子中的至少一种或多种被修饰以具有减少的cpg。
25.在某些实施方案中，重组aav载体具有衣壳血清型，其包含与aav1，aav2，aav3，aav3b，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，aav11，rh10，rh74，aav
‑
2i8，spk1(seq id no:1)，或spk2(seq id no:2)vp1、vp2和/或vp3序列具有90％或更多序列同一性的aav vp1、vp2和/或vp3衣壳；或与aav1，aav2，aav3，aav3b，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，aav11，aav12，rh10，rh74，aav
‑
2i8，spk1(seq id no:1)，spk2(seq id no:2)vp1、vp2和/或vp3序列具有95％或更多序列同一性的衣壳；或与aav1，aav2，aav3，aav3b，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，aav11，rh10，rh74，aav
‑
2i8，spk1(seq id no:1)，或spk2(seq id no:2)vp1、vp2和/或vp3序列具有100％序列同一性的衣壳。
26.在某些实施方案中，一种或多种itr包括以下任一者的一种或多种itr：aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10或rh74 aav血清型，或其组合。
27.在某些实施方案中，重组aav载体在包含生物相容性载体或赋形剂的药物组合物中。
28.在某些实施方案中，药物组合物进一步包含空aav衣壳。在某些实施方案中，空aav衣壳与重组aav载体的比率在以下范围内或介于其间：约100:1
‑
50:1、约50:1
‑
25:1、约25:1
‑
10:1、约10:1
‑
1:1、约1:1
‑
1:10、约1:10
‑
1:25、约1:25
‑
1:50或约1:50
‑
1:100。在某些实施方案中，空aav衣壳与重组aav载体的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
29.在某些实施方案中，药物组合物进一步包含表面活性剂。
附图说明
30.图1显示了侧脑室的枕角靶标(白色竖直线)的代表性磁共振成像(mri)图像。
31.图2a和2b显示了人tpp1蛋白在csf中的快速表达。(a)在载体施用后30天csf中的人tpp1水平。从转导后2周起，所有剂量(每只动物1.0x10
13
vg、5.0x10
13
vg和2.17x10
14
vg)都提供了可测量的tpp1蛋白水平增加。星号(*)表示溶血的样本，可能会提高结果。(b)csf中人tpp1活性水平的分析表明有功能蛋白表达。
32.图3a和3b显示了20周内csf中维持的人tpp1蛋白表达和活性。(a)aav2
‑
cag
‑
htpp1递送后20周内csf中的人tpp1水平。除一只动物外，其余所有动物中，htpp1的表达水平超过了进入神经元溶酶体的最大摄取量一半所需的水平(k
uptake
约为60
‑
120ng/ml)。在研究结束时，5.0x10
13
vg/动物剂量的表达水平平均高于k
uptake
上限的1.55倍，并且在第10
‑
20周以每只动物为基础显示出相对一致的表达。(b)csf中的人tpp1活性水平。在csf中显示出维持的人tpp1表达的所有动物在整个时间过程中都保持了升高的tpp1活性水平。正如对tpp1蛋白表达所见，发现接受5.0x10
13
vg/动物剂量的动物的平均活性水平最高。
33.图4显示了在整个时间过程中csf中tpp蛋白表达的平均水平。
具体实施方式
34.由“核酸”或“多核苷酸”序列编码的tpp1“多肽”、“蛋白”和“肽”包括全长天然tpp1序列(这与天然存在的野生型tpp1蛋白一样)以及功能性tpp1子序列、修饰形式或序列变体，只要该子序列、修饰形式或变体保留天然全长tpp1蛋白的某种程度的功能即可。在本发明的方法和用途中，由核酸序列编码的这种tpp1多肽、蛋白和肽可以但不要求与有缺陷的或在所处理的哺乳动物中表达不足或缺乏的内源性tpp1蛋白相同。
35.编码ttp1多肽或tpp1的多核苷酸可分别包括一种或多种氨基酸残基或核苷酸修饰，例如但不限于，一种或多种氨基酸残基或核苷酸取代(例如，1
‑
3、3
‑
5、5
‑
10、10
‑
15、15
‑
20、20
‑
25、25
‑
30、30
‑
40、40
‑
50、50
‑
100、100
‑
150、150
‑
200、200
‑
250、250
‑
500、500
‑
750、750
‑
850或更多个氨基酸残基或核苷酸)。
36.氨基酸修饰的一个实例是参考序列(例如tpp1中)的保守氨基酸取代或删除(例如，子序列或片段)。在某些实施方案中，修饰的或变体的tpp1序列保留了未修饰的tpp1序列的功能或活性的至少一部分。
37.明确包括已知的或未知的编码tpp1(包括tpp1的其他哺乳动物形式)的所有哺乳动物和非哺乳动物形式的核酸。
38.如本文所用，术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如，aav载体)或其他可通过插入或掺入核酸进行操作的溶媒(vehicle)。这种载体可用于基因操作(即“克隆载体”)，以将多核苷酸引入/转移到细胞中，以及在细胞中转录或翻译所插入的多核苷酸。“表达载体”是专用载体，其包含具有在宿主细胞中表达所需的必要调控区的基因或核酸序列。
39.载体核酸序列通常包含至少一个用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的附加元件，例如异源核酸(例如，编码tpp1的核酸)、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、反向末端重复序列(itr)、可选择的标志物(例如抗生素抗性)、聚腺苷酸化信号。
40.病毒载体源自或基于一种或多种包含病毒基因组的核酸元件。具体的病毒载体包括腺相关病毒(aav)和慢病毒载体。
41.术语“重组”[作为载体的修饰剂，例如重组aav(raav)载体，以及序列的修饰剂，例如重组核酸和多肽]是指组合物已经以一种自然界中通常不会发生的方式进行了操作(即工程化)。重组aav载体的一个具体实例是将通常不存在于野生型aav基因组中的核酸序列插入aav基因组中。虽然术语“重组”在本文中并不总是用于指代aav载体以及序列，例如核酸，但是包括多核苷酸在内的重组形式被明确地包括在内，尽管有任何这种省略也如此。
[0042]“重组aav载体”或“raav”通过使用分子方法从aav基因组中去除野生型基因组并替换为非天然核酸序列(称为异源核酸)而衍生自aav的野生型基因组。通常，对于aav，aav基因组的一个或两个反向末端重复(itr)序列保留在aav载体中。raav与aav基因组不同，因为aav基因组的全部或部分已被相对于aav基因组核酸的非天然(非aav)序列替换。因此，非天然序列的掺入将aav载体定义为“重组”载体，其可称为“raav载体”。
[0043]
raav序列可以进行包装—在本文中称为“颗粒”—用于随后离体、体外或体内细胞的感染(转导)。当重组aav载体序列被包裹或包装到aav颗粒中时，该颗粒也可称为“raav载体”或“raav颗粒”。这种raav颗粒包括包裹或包装有载体基因组的蛋白，并且在aav的情况下，它们被称为衣壳蛋白。
[0044]“载体基因组”或方便地缩写为“vg”是指重组质粒序列的最终被包装或包裹以形成病毒(例如，raav)颗粒的那部分。在重组质粒用于构建或制造重组载体的情况下，载体基因组不包括不与重组质粒的载体基因组序列对应的“质粒”部分。重组质粒的这个非载体基因组部分可以称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增(这是繁殖和重组病毒生产所需的过程)很重要，但本身没有包装或包裹成病毒(例如，aav)颗粒。因此，“载体基因组”是指被病毒(例如，aav)包装或包裹的核酸。
[0045]
如本文所用，关于aav载体的术语“血清型”是指在血清学上不同于其他aav血清型的衣壳。血清学独特性是根据一种aav与另一种aav的抗体之间缺乏交叉反应性来确定的。交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于aav血清型的vp1、vp2和/或vp3序列差异)。
[0046]
在传统定义下，血清型是指已经针对所有现有和表征的血清型特异性的血清，对目标病毒进行了中和活性测试，并且没有发现可以中和目标病毒的抗体。随着更多天然病毒分离株的发现和/或衣壳突变体的生成，与当前存在的任何血清型可能存在或不存在血清学差异。因此，在新病毒(例如aav)没有血清学差异的情况下，这种新病毒(例如aav)将是
相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试，以确定它们是否属于根据传统血清型定义的另一种血清型。因此，为方便起见并避免重复，术语“血清型”泛指血清学上不同的病毒(例如aav)以及可能属于给定血清型的亚组或变体的血清学上没有不同的病毒(例如aav)。
[0047]
raav载体/颗粒包括任何病毒株或血清型。例如但不限于，raav载体基因组或颗粒(衣壳，例如vp1、vp2和/或vp3)可以基于任何aav血清型，例如aav
‑
1、
‑
2、
‑
3、
‑
4、
‑
5、
‑
6、
‑
7、
‑
8、
‑
9、
‑
10、
‑
11、
‑
12、
‑
rh74、
‑
rh10或aav
‑
2i8。这种raav载体/颗粒可以基于相同的菌株或血清型(或亚组或变体)或彼此不同。例如但不限于，基于一种血清型基因组的raav载体基因组或颗粒(衣壳)可以与包装有载体的一种或多种衣壳蛋白相同。此外，raav载体基因组可以基于与包装有载体基因组的一种或多种衣壳蛋白不同的aav血清型基因组，在这种情况下，三种衣壳蛋白中的至少一种可以是不同的aav血清型，例如，aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、
‑
rh74、
‑
rh10、aav
‑
2i8、spk1(seq id no:1)、spk2(seq id no:2)，或例如其变体。更具体地，raav2载体基因组可包含aav2 itr但来自不同血清型的衣壳，例如aav1、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、
‑
rh74、
‑
rh10、aav
‑
2i8、spk1(seq id no:1)、spk2(seq id no:2)，或例如其变体。因此，raav载体包括与特定血清型特征的基因/蛋白序列相同的基因/蛋白序列，以及“混合”血清型，其也可称为“假型”。
[0048]
在某些实施方案中，raav载体包括衣壳序列或由该衣壳序列组成，该衣壳序列与一种或多种aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、
‑
rh74、
‑
rh10、aav
‑
2i8、spk1(seq id no:1)或spk2(seq id no:2)衣壳蛋白(vp1、vp2和/或vp3序列)具有至少70％或更多(例如，75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％,99.5％等)的同一性。在某些实施方案中，raav载体包括与一种或多种aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、
‑
rh74或
‑
rh10 itr具有至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)的同一性的序列或由该序列组成。
[0049]
在某些实施方案中，raav载体/颗粒包括aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rh10、rh74和aav
‑
2i8及其变体(例如，itr和衣壳变体，例如氨基酸插入、添加、取代和删除)，例如，如wo 2013/158879(国际申请pct/us2013/037170)、wo 2015/013313(国际申请pct/us2014/047670)和us 2013/0059732(美国申请号13/594,773)中所阐述的那样。
[0050]
raav颗粒，例如aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、
‑
rh74、
‑
rh10、aav
‑
2i8、spk1(seq id no:1)、spk2(seq id no:2)和变体、杂交体和嵌合序列，可以使用技术人员已知的重组技术构建，以包括一种或多种异源多核苷酸序列(转基因)，其侧翼有一种或多种功能性5’和/或3’末端的aav itr序列。raav载体通常保留至少一个功能性侧翼itr序列，这是重组载体拯救、复制和包装成raav载体颗粒所必需的。因此，raav载体基因组将包括顺式复制和包装所需的序列(例如，功能性itr序列)。
[0051]
用于产生重组aav颗粒的宿主细胞包括但不限于可以或已经被用作异源raav载体受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可以使用来自稳定人细胞系hek293的
细胞(可通过例如美国典型培养物保藏中心容易地获得，登记号为atcc crl1573)。在某些实施方案中，用腺病毒5型dna片段转化并表达腺病毒e1a和e1b基因的修饰的人胚胎肾细胞系(例如，hek293)用于生成重组aav颗粒。修饰的hek293细胞系易于转染，并提供了在其中产生raav颗粒的特别方便的平台。适用于重组aav生产的其他宿主细胞系在国际申请pct/2017/024951中有所描述。
[0052]
在某些实施方案中，通过在转染aav表达载体之前或同时用aav辅助构建体转染宿主细胞，将aav辅助功能引入宿主细胞。因此，aav辅助构建体有时用于至少提供aav rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充生产性aav转导所需的缺失aav功能。aav辅助构建体通常缺少aav itr，既不能复制也不能自身进行包装。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多aav辅助构建体，例如常用的质粒paav/ad和pim29 45，其编码rep和cap表达产物。许多其他的编码rep和/或cap表达产物的载体是已知的。
[0053]
生成能够转导哺乳动物细胞的重组aav载体/颗粒的方法是本领域已知的。例如，重组aav载体/颗粒可以如美国专利9,408,904；和国际申请pct/us2017/025396和pct/us2016/064414中所描述的那样生产。
[0054]
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。核酸包括基因组dna、cdna和反义dna，以及剪接或未剪接的mrna、rrna trna和抑制性dna或rna(rnai，例如小或短发夹(sh)rna、微小rna(mirna)、小或短干扰(si)rna、反式剪接rna或反义rna)。核酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如变体核酸)。
[0055]
核酸，例如载体基因组、cdna、基因组dna、rna及其片段可以是单链、双链或三链、线性或环状的，并且可以是任何长度。在讨论核酸时，根据在5’至3’方向提供序列的惯例，本文可以描述特定核酸的序列或结构。
[0056]“转基因”在本文中用于方便地指意欲或已经被引入细胞或生物体中的异源核酸。转基因包括任何异源核酸，例如编码tpp1的核酸。
[0057]
术语“转导”及其语法变体是指将分子(例如raav载体)引入细胞或宿主生物体中。异源核酸/转基因可以整合或不整合到受体细胞的基因组核酸中。所引入的异源核酸也可以在染色体外或仅暂时存在于受体细胞或宿主生物体中。
[0058]“转导的细胞”是已经引入有转基因的细胞。因此，“转导的”细胞(例如，在哺乳动物中，例如细胞或组织或器官细胞)是指在将例如核酸(例如转基因)掺入到细胞之后细胞中的遗传变化。因此，“转导的”细胞是其中已引入外源核酸(例如，编码tpp1的核酸)的细胞或其后代。可以增殖细胞并表达所引入的蛋白。对于基因治疗用途和方法，转导的细胞可以在受试者中，例如哺乳动物、灵长类动物或人类。
[0059]“表达控制元件”是指影响可操作连接的核酸表达的核酸序列。本文所述的表达控制元件包括启动子和增强子。包括aav载体的载体序列可以包括一种或多种“表达控制元件”。通常，包含这种元件以促进适当的异源多核苷酸转录和恰当的翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、维持基因的正确阅读框以允许mrna的框内翻译和终止密码子等)。这种元件通常以顺式作用，称为“顺式作用”元件，但也可以反式作用。
[0060]
表达控制可以在转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平上实现。通常，调节转录的表
达控制元件并列在转录的核酸的5’末端(即“上游”)附近。表达控制元件也可以位于转录序列的3’末端(即“下游”)或转录本内(例如内含子中)。表达控制元件可位于与转录序列相邻或相距一定距离处(例如，距多核苷酸1
‑
10、10
‑
25、25
‑
50、50
‑
100、100至500或更多个核苷酸)，甚至在相当的距离处。然而，由于aav载体的长度限制，表达控制元件通常在距异源核酸的转录起始位点1到1000个核苷酸的范围内。
[0061]
在功能上，可操作连接的核酸的表达可至少部分地受元件(例如，启动子)控制，使得元件调节核酸的转录，并在适当时调节转录物的翻译。表达控制元件的一个具体实例是启动子，它通常位于转录的核酸序列的5’处。与不存在启动子时的表达量相比，启动子通常增加从可操作连接的核酸表达的量。
[0062]
如本文所用，“增强子”可以指与异源核酸相邻的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游但也起作用并且可以位于序列的下游或序列的内部。因此，增强子元件可以位于异源核酸序列上游或下游的10
‑
50个碱基对、50
‑
100个碱基对、100
‑
200个碱基对或200
‑
300个碱基对或更多个碱基对处。增强子元件通常将可操作连接的核酸的表达增加到高于启动子元件提供的表达。
[0063]
表达构建体或盒可包含用于驱动特定细胞或组织类型中的表达的调节元件。表达控制元件(例如，启动子)包括在特定组织或细胞类型中具有活性的那些，在本文中称为“组织特异性表达控制元件/启动子”。组织特异性表达控制元件通常在特定细胞或组织(例如肝脏)中具有活性。表达控制元件通常在特定细胞、组织或器官中具有活性，因为它们被转录激活蛋白或对特定细胞、组织或器官类型来说独特的其他转录调节因子识别。这种调节元件是本领域技术人员已知的(参见，例如，sambrook等人(1989)和ausubel等人(1992))。
[0064]
表达控制元件还包括能够驱动多核苷酸在许多不同细胞类型中表达的普遍存在或混杂的启动子/增强子。这种元件包括但不限于巨细胞病毒(cmv)即刻早期启动子/增强子序列、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子/增强子序列和其他在多种哺乳动物细胞类型中具有活性的病毒启动子/增强子，或在自然界中不存在的合成元件(参见，例如boshart等人,cell,41:521
‑
530(1985))、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、细胞质β
‑
肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(pgk)启动子。
[0065]
表达控制元件还能够以可调节的方式赋予表达，即信号或刺激增加或减少可操作连接的异源多核苷酸的表达。响应信号或刺激而增加可操作连接的多核苷酸的表达的可调节元件也称为“诱导型元件”(即，由信号诱导)。具体实例包括但不限于激素(例如类固醇)诱导型启动子。通常，由这些元件赋予的增加或减少量与存在的信号或刺激的量成比例；信号或刺激的量越大，表达的增加或减少就越大。可调节的表达控制元件包括，例如但不限于，锌诱导型绵羊金属硫氨酸(mt)启动子；类固醇激素诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子；t7聚合酶启动系统(wo 98/10088)；四环素抑制系统(gossen,等人,proc.natl.acad.sci.usa,89:5547
‑
5551(1992))；四环素诱导系统(gossen,等人,science.268:1766
‑
1769(1995)；也参见harvey,等人,curr.opin.chem.biol.2:512
‑
518(1998))；ru486诱导系统(wang,等人,nat.biotech.15:239
‑
243(1997)和wang,等人,gene ther.4:432
‑
441(1997)]；以及雷帕霉素诱导系统(magari,等人,j.clin.invest.100:2865
‑
2872(1997)；rivera,等人,nat.medicine.2:1028
‑
1032(1996))。本发明中可以使用的其他可调节控制元件是由特定生理状态(例如温度、急性期、发育)所调节的那些。
[0066]
表达控制元件还包括异源多核苷酸的天然元件。当希望异源多核苷酸的表达应该模拟天然表达时，可以在本发明中使用天然控制元件(例如，启动子)。当异源多核苷酸的表达要在时间上或发育上，或以组织特异性方式，或响应特定转录刺激物时，可以在本发明中使用天然元件。也可以使用其他天然表达控制元件，例如内含子、聚腺苷酸化位点或kozak共有序列。
[0067]
术语“可操作地连接”是指将表达核酸序列所必需的调控序列置于相对于该序列的适当位置，以便实现核酸序列的表达。该相同定义有时适用于表达载体(例如raav载体)中核酸序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。
[0068]
在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中，关系是控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如但不限于，两个dna序列可操作地连接是指这两个dna以这样的关系排列(顺式或反式)，使得dna序列中的至少一个能够对另一个序列施加生理学效应。
[0069]
因此，载体的附加元件包括但不限于表达控制(例如启动子/增强子)元件；转录终止信号或终止密码子；位于序列侧翼的5’或3’非翻译区(例如聚腺苷酸化(polya)序列)，例如aav itr序列的一个或多个拷贝；或内含子。
[0070]
其他元件包括，例如但不限于，填料或填充物多核苷酸序列，例如以改善包装和减少污染性核酸的存在。aav载体通常接受大小范围通常为约4kb至约5.2kb或稍大的dna的插入件。因此，对于较短的序列，包含填充物或填料以将长度调整到接近或等于病毒基因组序列的正常大小，该大小是将aav载体包装到病毒颗粒中可接受的。在某些实施方案中，填料/填充物核酸序列是核酸的未翻译(非蛋白编码)区段。对于小于4.7kb的核酸序列，填料或填充物多核苷酸序列的长度在与序列组合(例如，插入到载体中)时具有在约3.0
‑
5.5kb之间或约4.0
‑
5.0kb之间或约4.3
‑
4.8kb之间的总长度。
[0071]
术语“分离的”，当用作组合物的修饰剂时，是指该组合物由人工制备或完全或至少部分地与其天然存在的体内环境分离。通常，分离的组合物基本上不含它们通常在自然界中与之缔合的一种或多种材料，例如但不限于一种或多种蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。
[0072]
术语“分离的”不排除人工产生的组合，例如但不限于raav序列，或包装或包裹aav载体基因组和药物制剂的raav颗粒。术语“分离的”也不排除组合物的替代物理形式，例如杂交体/嵌合体、多聚体/寡聚体、修饰(例如，磷酸化、糖基化、脂化)或衍生形式，或在宿主细胞中人工产生的表达形式。
[0073]
术语“基本上纯的”是指包含目标化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白等)的至少50
‑
60重量％的制剂。制剂可包含目标化合物的至少75重量％，或至少85重量％，或约90
‑
99重量％。通过适合于目标化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc分析等)测量纯度。
[0074]
当提及特定核苷酸序列或氨基酸序列时，短语“基本上由...组成”是指序列具有给定seq id no.的特性。例如但不限于，当用于氨基酸序列时，该短语包括序列本身和不会影响序列的基本和新颖特征的分子修饰。
[0075]
核酸、表达载体(例如，aav载体基因组)、质粒，包括编码tpp1的核酸，可以通过使用重组dna技术方法来制备。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过多种手段来制备本发明的分离的核酸分子。可以使用各种标准克隆、重组dna技术、经由细胞表达或体外翻译和
化学合成技术来制备编码tpp1的核酸。多核苷酸的纯度可以通过测序、凝胶电泳等确定。例如但不限于，可以使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术来分离核酸。这种技术包括但不限于：(1)基因组dna或cdna文库与探针的杂交以检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛选以检测具有共享结构特征的多肽，例如但不限于使用表达文库；(3)使用能够退火至目标核酸序列的引物，对基因组dna或cdna进行聚合酶链反应(pcr)；(4)对序列数据库进行相关序列的计算机检索；以及(5)消减核酸文库的差异筛选。
[0076]
核酸可以作为dna保持在任何方便的克隆载体中。在某些实施方案中，克隆保持在质粒克隆/表达载体中，例如pbluescript(stratagene,la jolla,ca)，其在合适的大肠杆菌宿主细胞中增殖。替代地，核酸可以保持在适合在哺乳动物细胞中表达的载体(例如但不限于，aav载体)中。在翻译后修饰影响蛋白功能的情况下，核酸分子可以在哺乳动物细胞中表达。
[0077]
在某些实施方案中，raav载体可以任选地包含在细胞中表达异源核酸所必需的调节元件，其定位方式允许编码的蛋白在宿主细胞中表达。表达所需的这种调控元件包括但不限于如本文所述且技术人员已知的启动子序列、增强子序列和转录起始序列。
[0078]
本发明的方法和用途包括将核酸(转基因)递送(转导)到宿主细胞(包括分裂和/或非分裂细胞)中。本发明的核酸、raav载体、方法、用途和药物制剂另外可用于向有需要的受试者递送、施用或提供由异源核酸编码的序列的方法，作为治疗方法。以此方式，在受试者体内转录核酸并产生蛋白。受试者可能受益于或需要该蛋白，因为受试者缺乏该蛋白，或者因为受试者体内该蛋白的产生可以赋予一些治疗效果，作为治疗方法或其他方法。
[0079]
本发明可用于动物，包括人和兽医医学应用。因此，合适的受试者包括哺乳动物，例如人类，以及非人类哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，例如人类、非人类灵长类动物(类人猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、红毛猩猩、猕猴)、家养动物(狗和猫)和实验动物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。人类受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、少年和年轻成人受试者。受试者包括动物疾病模型，例如但不限于，小鼠和其他蛋白/酶缺陷(如cln2)动物模型。
[0080]
适合根据本发明进行治疗的受试者包括患有tpp1缺乏或不足或有这种风险，或产生异常的部分功能性或非功能性的tpp1的那些受试者。可以对受试者进行tpp1表达和/或活性测试以确定这种受试者是否适合根据本发明的方法进行治疗。还可以对受试者进行编码tpp1的内源性核酸的突变测试。已知某些基因突变会降低或破坏tpp1活性。适合根据本发明进行治疗的受试者还包括将从tpp1中受益的那些受试者。治疗后可以定期(例如每1
‑
4周、1
‑
6个月、6
‑
12个月或1、2、3、4、5年或更长时间)监测治疗对象。
[0081]
检测和/或测量tpp1活性的测定是本领域已知的，包括在liu等人,2017,clin.chem.,63:1118
–
1126,doi:10.1373/clinchem.2016.269167和barcenas等人,2014,anal.chem.,87:7962
–
7968中描述的测定。
[0082]
可以对受试者进行免疫反应(例如针对aav的抗体)测试。因此可以在根据本发明的方法治疗之前筛选候选对象。还可以在治疗后对受试者进行针对aav的抗体测试，并任选地在治疗后监测一段时间。可以用免疫抑制剂或如本文所述的其他方案治疗产生aav抗体的受试者。
[0083]
适合根据本发明进行治疗的受试者还包括具有针对aav的抗体(抗aav抗体)或有产生该抗体的风险的受试者。可以使用多种技术将raav载体施用或递送至这种受试者。例
如但不限于，可以递送aav空衣壳(即，缺乏载体基因组的aav)以结合受试者中的抗aav抗体，由此允许包含异源核酸的raav载体转导受试者的细胞。
[0084]
如本文所述，raav可用作基因治疗载体，因为它们可以穿透细胞并将核酸/遗传物质引入细胞。由于aav与人类的致病性疾病无关，raav载体能够将异源多核苷酸序列(例如治疗性蛋白和试剂)传递给人类患者，而不会引起实质性的aav发病机制或疾病。
[0085]
raav载体具有许多用于这种应用的理想特征，包括分裂和非分裂细胞的趋向性。这些载体的早期临床经验也表明没有持续的毒性，并且免疫反应通常很小或无法检测到。已知aav通过受体介导的内吞作用或通过转胞吞作用在体内感染多种细胞类型。这些载体系统已经在人体中靶向许多组织(例如中枢神经系统、大脑、视网膜上皮、肝脏、骨骼肌、气道、关节和造血干细胞)进行了测试。
[0086]
可能需要引入raav载体，该载体可以提供例如但不限于tpp1的多个拷贝并因此提供更大量的tpp1蛋白。在许多参考文献、专利和专利申请[包括：wright j.f.(hum gene ther 20:698
‑
706,2009)]中详细描述了改进的raav载体和用于生产这些载体的方法。
[0087]
raav载体可以经由在生物相容的载体中输注(例如但不限于，经由颅内注射)施用至患者。raav载体可以单独施用或与其他分子组合施用。因此，可以将raav载体和其他组合物、试剂、药物、生物制品(蛋白)掺入药物组合物中。这种药物组合物尤其可用于在体内或离体向受试者施用和递送。
[0088]
在某些实施方案中，药物组合物还包含药学上或生物学上可接受的载体或赋形剂。这种赋形剂包括任何药剂，该药剂本身不诱导对接受该组合物的个体有害的免疫反应，并且其可以在没有过度毒性的情况下施用。
[0089]
如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指适用于一种或多种施用、体内递送或接触途径的生物学上可接受的制剂、气体、液体或固体，或其混合物。“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”组合物是在生物学上或其他方面不是不合需要的材料，例如，可以施用于受试者而不会引起实质性不合需要的生物学效应的材料。因此，这种药物组合物可用于本发明，例如，用于向受试者施用核酸、载体、病毒颗粒或蛋白。
[0090]
药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，例如水、盐水、甘油、糖和乙醇。其中还可以包括药学上可接受的盐，例如但不限于无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等，可存在于这种溶媒中。
[0091]
药物组合物可以作为盐提供并且可以与许多酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐往往更易溶于水性或其他质子溶剂，而不是相应的游离碱形式。在其他情况下，制剂可以是冻干粉，其可包含以下任何或所有项：1
‑
50mm组氨酸、0.1％
‑
2％蔗糖和2
‑
7％甘露醇，ph范围为4.5至5.5，其在使用前与缓冲液组合。
[0092]
药物组合物可以配制成与特定的施用或递送途径相容，如本文所述或本领域技术人员已知的那样。因此，药物组合物包括适合通过各种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。
[0093]
适合肠胃外施用的组合物包括活性化合物的水性和非水性溶液、悬浮液或乳液，这些制剂通常是无菌的并且可以与预期接受者的血液等渗。组合物包括例如但不限于水、缓冲盐水、汉克氏溶液、林格氏溶液、葡萄糖、果糖、乙醇、动物油、植物油或合成油。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。
[0094]
此外，活性化合物的悬浮液可以制备成合适的油注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或试剂，其增加化合物的溶解度以允许制备高浓度溶液。
[0095]
可以将共溶剂和佐剂加入到制剂中。共溶剂可含有羟基基团或其他极性基团，例如但不限于醇类，例如异丙醇；乙二醇，如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。佐剂包括，例如但不限于，表面活性剂，例如大豆卵磷脂和油酸；脱水山梨糖醇酯，例如脱水山梨糖醇三油酸酯；以及聚乙烯吡咯烷酮。
[0096]
在制备药物组合物后，可以将它们放置在合适的容器中并标记用于治疗。这种标记可以包括施用的量、频率和方法。
[0097]
适用于本发明的组合物、方法和用途的药物组合物和递送系统是本领域已知的(参见，例如remington:the science and practice of pharmacy(2003)第20版,mack publishing co.,easton,pa；remington’s pharmaceutical sciences(1990)第18版,mack publishing co.,easton,pa；the merck index(1996)第12版,merck publishing group,whitehouse,nj；pharmaceutical principles of solid dosage forms(1993),technomic publishing co.,inc.,lancaster,pa.；ansel和stoklosa,pharmaceutical calculations(2001)第11版,lippincott williams&wilkins,baltimore,md；以及poznansky等人,drug delivery systems(1980),r.l.juliano,ed.,oxford,n.y.,pp.253
‑
315)。
[0098]“有效量”或“足够量”是指以单剂量或多剂量、单独或与一种或多种其他组合物(治疗剂或免疫抑制剂，例如药物)组合提供治疗、计划或治疗方案试剂、任何持续时间(长期或短期)的可检测反应、任何可测量或可检测程度的或任何持续时间(例如，分钟、小时、天、月、年或治愈)的受试者的预期或期望结果或益处。
[0099]
剂量可以变化并取决于治疗所针对的疾病的类型、发作、进展、严重性、频率、持续时间或概率、期望的临床终点、先前或同时的治疗、受试者的一般健康状况、年龄、性别、种族或免疫能力以及技术人员会理解的其他因素。剂量、数量、频率或持续时间可以按比例增加或减少，如治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其他风险因素以及受试者的状态所指示的。技术人员将理解会影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。
[0100]
达到治疗效果的剂量，例如受试者或患者每公斤体重的载体基因组(vg/kg)的剂量，或受试者或患者每只脑的载体基因组(vg/脑)的剂量，或递送至受试者或患者的cns的载体基因组(vg/cns)的剂量，将根据若干因素而变化，包括但不限于：施用途径、实现治疗效果所需的异源多核苷酸表达水平、治疗的特定疾病、对病毒载体的任何宿主免疫反应、对异源多核苷酸或表达产物(蛋白)的宿主免疫反应以及所表达的蛋白的稳定性。
[0101]
通常，剂量将大于约1.5x10
13
重组aav载体基因组。例如，剂量为约5x10
13
重组aav载体基因组或大于约5x10
13
重组aav载体基因组；剂量为约1x10
14
重组aav载体基因组或大于约1x10
14
重组aav载体基因组；剂量为约5x10
14
重组aav载体基因组或大于约5x10
14
重组aav载体基因组；剂量为约1x10
15重
组aav载体基因组或大于约1x10
15
重组aav载体基因组；以及剂量为约5x10
15
重组aav载体基因组或大于约5x10
15
重组aav载体基因组。
[0102]
在某些实施方案中，重组aav载体基因组以如下剂量范围施用：从约1.5x10
13
到约5x10
15
重组aav载体基因组的剂量范围；从约1x10
14
到约3x10
15
重组aav载体基因组的剂量范
围；从约2x10
14
到约2x10
15
重组aav载体基因组的剂量范围；从约2.5x10
14
到约7.5x10
14
重组aav载体基因组的剂量范围；从约5x10
14
到约5x10
15
重组aav载体基因组；以及从约1x10
15
到约5x10
15
重组aav载体基因组的剂量范围。
[0103]
在某些实施方案中，raav载体基因组以约1x10
14
载体基因组的剂量施用，以约2x10
14
载体基因组的剂量施用，以约3x10
14
载体基因组的剂量施用，以约4x10
14
载体基因组的剂量施用，以约5x10
14
载体基因组的剂量施用，以约6x10
14
载体基因组的剂量施用，以约7x10
14
载体基因组的剂量施用，以约8x10
14
载体基因组的剂量施用，以约9x10
14
载体基因组的剂量施用，以约1x10
15
载体基因组的剂量施用，以约2x10
15
载体基因组的剂量施用，以约3x10
15
载体基因组的剂量施用，以约4x10
15
载体基因组的剂量施用，或以约5x10
15
载体基因组的剂量施用。
[0104]
在某些实施方案中，剂量将大于约1.5x10
13
raav vg/受试者或患者的脑。例如，剂量为约5x10
13
raav vg/脑或大于约5x10
13
raav vg/脑；剂量为约1x10
14
raav vg/脑或大于约1x10
14
raav vg/脑；剂量为约5x10
14
raav vg/脑或大于约5x10
14
raav vg/脑；剂量为约1x10
15
raav vg/脑或大于约1x10
15
raav vg/脑；以及剂量为约5x10
15
raav vg/脑或大于约5x10
15
raav vg/脑。
[0105]
在某些实施方案中，raav vg以如下剂量范围施用：从约1.5x10
13
到约5x10
15
raav vg/脑的剂量范围；从约1x10
14
到约3x10
15
raav vg/脑的剂量范围；从约2x10
14
到约2x10
15
raav vg/脑的剂量范围；从约2.5x10
14
到约7.5x10
14
raav vg/脑的剂量范围；从约5x10
14
到约5x10
15
raav vg/脑；以及从约1x10
15
到约5x10
15
raav vg/脑的剂量范围。
[0106]
在某些实施方案中，raav vg以约1x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约2x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约3x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约4x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约5x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约6x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约7x10
14
raavvg/脑的剂量施用，以约8x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约9x10
14
raav vg/脑的剂量施用，以约1x10
15
raav vg/脑的剂量施用，以约2x10
15
raav vg/脑的剂量施用，以约3x10
15
raav vg/脑的剂量施用，以约4x10
15
raav vg/脑的剂量施用，或以约5x10
15
raav vg/脑的剂量施用。
[0107]
如本文所用，“单位剂型”是指适合作为待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量，任选地与药物载体(赋形剂、稀释剂、溶媒或填充剂)结合，当以一个或多个剂量施用时，计算该药物载体以产生期望的效果(例如，预防或治疗效果)。单位剂型可在例如安瓿和小瓶内，其可包括液体组合物，或冻干或冻干状态的组合物；例如，可以在体内施用或递送之前加入无菌液体载体。单个单位剂型可以包含在多剂量试剂盒或容器中。raav颗粒及其药物组合物可以包装在单个或多个单位剂型中，以便于施用和剂量均匀。
[0108]
用于治疗(例如，改善或提供治疗益处或改善)的“有效量”或“足够量”的剂量通常有效以提供对疾病的一种、多种或所有不良症状、后果或并发症(例如由疾病引起或与疾病相关的一种或多种不良症状、障碍、不适、病症或并发症)的可测量程度上的反应，尽管减少、降低、抑制、阻抑、限制或控制疾病的进展或恶化才是一个令人满意的结果。
[0109]
有效量或足够量可以但不必在单次施用中提供，可能需要多次施用，并且可以但不必单独或与另一种组合物(例如试剂)、治疗、计划或治疗方案组合施用。例如，该量可以根据受试者的需要、所治疗的疾病的类型、状态和严重程度或治疗的副作用(如果有的话)
按比例增加。此外，如果在没有第二组合物(例如，另一种药物或试剂)、治疗、计划或治疗方案的情况下以单剂量或多剂量给予，则有效量或足够量不必是有效或足够的，因为可以包含超过和超出这种剂量的额外的剂量、量或持续时间，或额外的组合物(例如，药物或试剂)、治疗、计划或治疗方案以便被认为对给定受试者是有效或足够的。被认为有效的量还包括导致减少使用另一种治疗、治疗方案或计划的量，例如为了治疗tpp1缺陷(例如，cln2)而施用编码tpp1的核酸。
[0110]
因此，本发明的方法和用途尤其还包括导致对另一种化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗计划、过程或良方的需求或使用减少的方法和用途。因此，根据本发明，提供了减少对另一种治疗或疗法的需求或使用的方法和用途。
[0111]
有效量或足够量不必对所治疗的每一个受试者都有效，也不必对给定群组或群体中的所治疗的大多数受试者有效。有效量或足够量是指在特定受试者而非群组或一般人群中的有效性或充足性。作为这种方法的典型特征，一些受试者将对给定的治疗方法或用途表现出更大的反应，或更少或没有反应。
[0112]
可以在由疾病引起的或与疾病相关的不良症状、病症、并发症等发生之前对受试者进行施用或体内递送。例如，筛选(例如，遗传)可用于将这种受试者鉴定为发明组合物、方法和用途的候选者。因此，这种受试者包括筛选出功能基因产物量不足或缺陷(例如，tpp1缺陷)呈阳性，或产生异常、部分功能或无功能的基因产物(例如，tpp1)的那些受试者。
[0113]
根据本文公开的本发明的方法和用途向受试者施用或体内递送可在受试者已被鉴定为患有靶向治疗的疾病，具有该疾病的一种或多种症状，或者即使该受试者不具有该疾病的一种或多种症状，但是已被筛选并被鉴定为如本文所述的呈阳性之后1
–
2，2
–
4，4
–
12，12
–
24或24
–
72小时内实施。当然，本发明的方法和用途可以在受试者已被鉴定为患有靶向治疗的疾病，具有该疾病的一种或多种症状，或已被筛选并被鉴定为如本文所述的呈阳性之后1
–
7，7
–
14，14
–
24，24
–
48，48
–
64天或更多天、数月或数年内实施。
[0114]
术语“改善”是指受试者的疾病或其症状，或潜在细胞反应的可检测或可测量的改进。可检测或可测量的改进包括疾病或由疾病引起或与疾病相关的并发症的发生、频率、严重性、进展或持续时间的主观或客观减少、降低、抑制、阻抑、限制或控制，或该疾病的症状或潜在原因或后果的改进，或该疾病的逆转。
[0115]
对于cln2，有效量将是抑制、减少或改善视力受损、认知发育受损或迟缓、运动控制丧失或癫痫发作的量。有效量还将是稳定或抑制cln2的不良症状或防止其恶化的量。
[0116]
治疗剂量将取决于受试者的年龄和一般状况、疾病或病症的严重程度等因素。在人类中的治疗有效量将落入可由医师根据个体患者的反应确定的相对较宽的范围内。
[0117]
可将组合物(例如药物组合物)递送给受试者，以允许产生所编码的蛋白。在某些实施方案中，药物组合物包含足够的遗传物质以使受体能够在受试者中产生治疗有效量的蛋白。
[0118]
组合物可以在任何无菌的、生物相容的药物载体中配制和/或施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。组合物可以单独，或与影响止血的其他试剂(例如，辅助因子)组合地配制和/或施用给患者。
[0119]
本发明的治疗方法包括全身性、区域性或局部性、或通过任何途径(例如通过注射或输注)递送和施用。体内药物组合物的递送通常可以经由注射来完成。例如，raav载体/颗
粒可以颅内施用，例如进入cns，特别是，例如进入大脑的一部分，例如侧脑室。
[0120]
根据本发明的治疗方法和raav载体包括联合疗法，其包括额外使用任何化合物、试剂、药物、治疗或其他具有所需治疗、有益、相加、协同或互补活性或影响的治疗方案或计划。示例性组合式组合物和治疗包括第二活性物质，例如生物制品(蛋白)、试剂(例如免疫抑制剂)和药物。这种生物制品(蛋白)、试剂、药物、治疗和疗法可以在根据本发明的任何其他方法或治疗之前、基本上同时或之后施用或进行。
[0121]
化合物、试剂、药物、治疗或其他治疗方案或计划可以作为组合式组合物施用，或单独施用，例如与核酸、载体或raav颗粒的递送或施用同时或依次或按顺序(之前或之后)施用。因此，本发明提供了组合，其中根据本发明的治疗方法与本文所述或本领域技术人员已知的任何化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗计划、过程、良方或组合物进行组合。该化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗计划、过程、良方或组合物可以在根据本发明向患者施用核酸、载体或raav颗粒之前、基本上同时或之后施用或进行。
[0122]
在某些实施方案中，在向受试者施用raav载体之前、基本上同时或之后向受试者施用至少一种免疫抑制剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是类固醇。在某些实施方案中，免疫抑制剂是泼尼松、环孢菌素(例如，环孢菌素a)、霉酚酸酯、利妥昔单抗或其衍生物。
[0123]
在基因转移中减少(克服)或避免对aav的体液免疫的策略包括施用高载体剂量；使用aav空衣壳作为诱饵来吸附抗aav抗体；施用免疫抑制药物以减少、降低、抑制、预防或消除对aav的体液免疫反应；改变aav衣壳血清型或改造aav衣壳，使其不易受到中和抗体的影响；使用血浆置换循环来吸附抗aav免疫球蛋白，由此降低抗aav抗体滴度；以及使用递送技术，例如球囊导管，然后是盐水冲洗。在mingozzi等人,2013,blood,122:23
‑
36中描述了这种策略。
[0124]
aav空衣壳与raav载体的示例性比率可以在以下范围内或介于其间：约100:1
‑
50:1，约50:1
‑
25:1，约25:1
‑
10:1，约10:1
‑
1:1，约1:1
‑
1:10，约1:10
‑
1:25，约1:25
‑
1:50，或约1:50
‑
1:100。比率还可以是约2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，或10:1。
[0125]
可以基于特定受试者中产生的aav抗体的量(滴度)来校准要施用的aav空衣壳的量。
[0126]
aav抗体可能是预先存在的并且可以以降低或阻断靶细胞的tpp1基因转移载体转导的水平存在。替代地，aav抗体可在暴露于aav或施用aav载体后产生。如果在施用aav载体后产生这种抗体，也可以相应地治疗这些受试者。
[0127]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。
[0128]
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其他参考文献、genbank引文和atcc引文均通过引用以其整体并入。若发生冲突，则以说明书(包括定义)为准。
[0129]
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的特征(例如，编码tpp1的核酸、包含编码tpp1的核酸的表达盒和包含编码tpp1的核酸的raav颗粒)是等效或相似特征的一个实例。
[0130]
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一种”、“以及”和“该”包括复数所指对象。因此，例如，提及“一种核酸”则包括多个这种核酸，提及“一种载体”则包括多个这种载体，并且提及“一种病毒”或“颗粒”则包括多个这种病毒/颗粒。
[0131]
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或数值范围包括这种范围内的整数和数值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，提及86％或更多的同一性，则包括86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等，以及86.1％、86.2％、86.3％、86.4％、86.5％等，87.1％、88.2％、88.3％、88.4％、88.5％等，以此类推。
[0132]
用多于(大于)或小于提及整数则分别包括大于或小于所提及数字的任何数字。因此，例如，提及大于1.5x10
13
，则包括1.6x10
13
,1.7x10
13
,1.8x10
13
,1.9x10
13
,2x10
13
,2.1x10
13
,2.2x10
13
,2.3x10
13
,2.4x10
13
,2.5x10
13
,2.6x10
13
,2.7x10
13
,2.8x10
13
,2.9x10
13
,3x10
13
,3.1x10
13
,3.2x10
13
等。
[0133]
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括子范围以及这种范围和子范围内的值和整数的小数，以及这种范围内的整数的小数。因此，为了说明，提及数字范围，例如1
‑
10，则包括1
–
2,1
–
3,1
–
4,1
–
5,1
–
6,1
–
7,1
–
8,1
–
9,2
–
3,2
–
4,2
–
5,2
–
6,2
–
7,2
–
8,2
–
9,2
–
10,3
–
4,3
–
5,3
–
6,3
–
7,3
–
8,3
–
9,3
–
10等；以及1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,以及1.1,1.2,1.3,1.4,1.5等,以此类推。因此，提及范围1
‑
50，则包括1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20等,多达并包含50,以及1.1,1.2,1.3,1.4,1.5等,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5等,以此类推。
[0134]
提及一系列范围则包括组合该系列内不同范围的边界值的范围。因此，为了说明，提及一系列范围例如1
‑
10,10
‑
20,20
‑
30,30
‑
40,40
‑
50,50
‑
60,60
‑
75,75
‑
100,100
‑
150,150
‑
200,200
‑
250,250
‑
300,300
‑
400,400
‑
500,500
‑
750,750
‑
850,则包括以下范围：1
‑
20,1
‑
30,1
‑
40,1
‑
50,1
‑
60,10
‑
30,10
‑
40,10
‑
50,10
‑
60,10
‑
70,10
‑
80,20
‑
40,20
‑
50,20
‑
60,20
‑
70,20
‑
80,20
‑
90,50
‑
75,50
‑
100,50
‑
150,50
‑
200,50
‑
250,100
‑
200,100
‑
250,100
‑
300,100
‑
350,100
‑
400,100
‑
500,150
‑
250,150
‑
300,150
‑
350,150
‑
400,150
‑
450,150
‑
500等。
[0135]
本文使用肯定的语言来描述本发明的众多实施方案，大体上公开了本发明。本发明还具体包括其中全部或部分排除特定主题的实施方案，例如物质或材料、方法步骤和条件、计划或程序。例如，在本发明的某些实施方案中，排除了材料和/或方法步骤。因此，即使本发明在本文中一般不表达本发明不包括的方面，但是本发明中未明确排除的方面仍然在本文中得以公开。
[0136]
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在以任何方式说明但不限制本发明要求保护的范围。实施例实施例1
[0137]
本研究中使用成年猕猴非人灵长类动物(雄性和雌性)。治疗组是：对照(仅溶媒)；低剂量(1.0x10
13 vg/动物)；中剂量(5.0x10
13 vg/动物)；以及高剂量(2.17x10
14 vg/动物)。
[0138]
每个处理组的动物数量：对照(每个时间点n＝3)、低剂量(每个时间点n＝3)、中剂
量(每个时间点n＝3)和高剂量(每个时间点n＝4)。时间点为30天和90天。
[0139]
施用aav2
‑
cag
‑
http1：使用脊髓针(22g,3.5”quinke bd)在mri引导下单侧递送到侧脑室的枕角(图1；竖直线)。以(100μl/min)递送总体积4ml。
[0140]
脑脊液(csf)分析包括tpp1酶活性测定和人tpp1蛋白表达测定(wes western)。实施例2
[0141]
该实施例包括数据的描述，其显示了在脑室内递送aav2
‑
cag
‑
人tpp1之后，人tpp1在cns中的短期和长期表达和活性。
[0142]
在递送靶向cns中侧脑室的室管膜细胞的aav
‑
cag
‑
人tpp1(也称为aav
‑
cag
‑
htpp1)载体后，人tpp被分泌到非人灵长类动物的csf中。在递送aav载体后，在20周的时间过程中存在可测量且维持的人tpp1表达(图2a、3a和4)。此外，所有3个aav载体剂量中的tpp1表达水平都导致水平在tpp1的k
uptake
内或超过该k
uptake
，如先前报道的那样(vuillemenot,b.r.,等人(2014)toxicol appl pharmacol,277(1),49
‑
57)。这表明这些动物的实质可能长时间持续地摄取细胞(katz,ml,等人(2015)sci transl med,7(313)；tecedor,l.(2018)16th international conference on ncl,英国伦敦)。tpp1活性分析证实了表达的tpp1蛋白的功能可行性(图2b和3b)。接受aav2
‑
cag
‑
htpp1的动物的死后组织的初步分析表明，与仅接受稀释剂的对照动物相比，没有显著的病理变化。对动物中表达的htpp1的组织摄取进行分析。
[0143]
这些研究证实了有效的室管膜定向基因治疗方法，其导致来自侧脑室的室管膜细胞的人tpp1表达，以用于治疗晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症。实施例3
[0144]
spk1 vp1衣壳(seq id no:1):spk2 vp1衣壳(seq id no:2):
cag启动子序列(seq id no:3)：tpp1(seq id no:4,人类)：