基于超高效液相色谱荧光检测器检测白酒中尿素的方法与流程

1.本发明属于物理测量测试技术领域，具体涉及一种基于超高效液相色谱荧光检测器检测白酒中尿素的方法。


背景技术：

2.白酒是世界六大蒸馏酒之一，是我国传统的蒸馏酒。其由多种微生物自然接种，经过长时间、开放式的固态发酵等独特工艺，造就了其独特色、香、味。深受广大消费者的喜爱，在世界蒸馏酒中独树一帜。
3.氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，ec，h2ncooc2h5)，又称尿烷，具有基因毒性和致癌性，是一种2a类致癌物，普遍存在于白酒及其他发酵食品中，主要是由相关前体物质在食品发酵及储存过程中形成。研究表明，尿素是形成白酒中ec的重要前体物质。鉴于ec的广泛存在性及基因毒性和致癌性，为了积极应对ec对白酒行业的安全隐患问题，维护广大消费者的合法权益，从源头上做好ec的风险评估和含量控制，从而阻断ec的生成势在必行，这就要求我们做好尿素这一重要前体物质的含量控制研究，故建立一种快速、准确的白酒中尿素的定量方法迫在眉睫。
4.目前，常见的定量白酒中尿素的检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、生物酶法和在线透析
‑
流动注射光度法。上述方法目前的弊端在于：效率偏低、操作复杂、准确性有限、稳定性不佳；尤其衍生剂量和衍生时间直接影响尿素含量检测的准确性。对此，现提出如下改进技术方案。


技术实现要素：

5.本发明解决的技术问题：提供一种基于超高效液相色谱荧光检测器检测白酒中尿素的方法，通过衍生剂量和衍生时间的控制，在最短时间内，实现尿素的准确检测；实现白酒尿素分离度优的快速、准确、高精度检测。
6.本发明采用的技术方案：基于超高效液相色谱荧光检测器检测白酒中尿素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.s001、吸取0.8ml试样，并将试样置于棕色储液瓶；
8.s002、加入0.6ml、0.02mol/l的9
‑
羟基占吨醇溶液、0.2ml、1.5mol/l的盐酸溶液，振荡混匀；
9.s003、室温条件下避光衍生40min；
10.s004、使用0.22μm有机系滤膜过滤；
11.s005、取滤液，并用于超高效液相色谱仪测定。
12.上述技术方案中，进一步地：包括溶液的配制步骤：
13.配制体积分数1.0％的乙酸溶液：吸取1.0ml冰乙酸于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀；
14.配制0.02mol/l的乙酸钠溶液：称取1.64g无水乙酸钠，超纯水溶解并定容至
1000ml，用1.0％乙酸溶液调ph至7.2，过滤后超声脱气15min备用；
15.配制1.5mol/l的盐酸溶液：吸取6.2ml的浓盐酸于50ml容量瓶中，用水定容至50ml刻度，旋涡混合器振荡1min，混匀；
16.配制0.02mol/l的9
‑
羟基占吨醇溶液：称取0.198g 9
‑
羟基占吨，用正丙醇溶液在50ml容量瓶中定容至50ml刻度线，混匀后超声15min备用；
17.配制1.0mg/ml尿素标准储备液：称取0.100g尿素标准品，用无水乙醇溶解并定容至100ml容量瓶刻度线，旋涡混合器振荡1min，混匀后备用；
18.配制100mg/l尿素中间液：吸取1ml尿素标准储备液到10ml容量瓶，用无水乙醇定容至10ml刻度线，旋涡混合器振荡1min，混匀后备用。
19.上述技术方案中，进一步地：所述超高效液相色谱仪的液相色谱条件如下：色谱柱：型号为2.1x100 mm，2μm的c
18
色谱柱；柱温：35℃；检测波长：λex213 nm，λem308 nm；流速：0.2ml/min；进样体积：10μl；流动相a为：ph 7.2、0.02mol/l乙酸钠溶液；流动相b为：乙腈。
20.上述技术方案中，进一步地：所述流动相b的洗脱梯度为0～4.5min，流动相b 80～65％；4.5～12min，流动相b 65～70％；12～18min，流动相b 70～0％；18～21min，流动相b 0
‑
80％；21～25min流动相b，80％。
21.上述技术方案中，进一步地：包括进样量选择实验步骤：将浓度为5.0mg/l的标准工作液衍生后，分别设置2μl、5μl、10μl进样分析，当进样量为10μl时，分离效果最好。
22.上述技术方案中，进一步地：包括尿素的标准曲线绘制步骤：吸取一定体积的100mg/l尿素中间液于10ml容量瓶中，用无水乙醇依次配制成0.05mg/l、0.1mg/l、0.4mg/l、1mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l尿素标准曲线工作液；使用旋涡混合器振荡1min混匀，且现配现用地进行液相分析；以目标色谱峰的面积对标准曲线工作液做图，得到回归方程及相关系数；所述回归方程为y＝1.0
×
107x 3
×
106，r2＝0.9994；加标回收率为102.46％；进样精密度为1.44％、样品的重复性为1.90％。
23.上述技术方案中，进一步地：包括精密度试验步骤：取浓度为6.0mg/l的标准工作液，衍生及过滤后连续进样6次，计算目标峰浓度的rsd；衍生物的平均浓度为6.15mg/l、rsd为1.44％。
24.上述技术方案中，进一步地：包括重复性研究步骤：取多份凤香型白酒样品衍生后，按色谱条件进行进样分析：样品平均浓度为1.50mg/l，相对标准偏差为1.90％。
25.上述技术方案中，进一步地：包括准确度试验步骤：取6份凤香型酒样，分别编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#；在1#、2#中加入4μl浓度为1.0mg/l的标准工作液；在3#、4#中加入5μl浓度为1.0mg/l的标准工作液；在5#、6#中加入6μl浓度为1.0mg/l的标准液标准工作液；衍生及过滤后进行液相分析，得出实际测得的尿素含量，计算各样品的加标回收率：平均加标回收率为102.46％，且各回收率在80～120％之间。
26.上述技术方案中，进一步地：所述方法的检测限lod为0.030mg/l；所述方法的定量限loq为0.093mg/l。
27.本发明与现有技术相比的优点：
28.1、本发明基于超高效液相色谱荧光检测器(uplc
‑
fld)建立了一种快速、准确定量白酒中尿素的方法；该法将白酒样品用9
‑
羟基占吨醇在酸性、避光条件下衍生，采用c
18
反相
色谱柱分离目标物，流动相为乙腈和ph 7.2、0.02mol/l乙酸钠溶液，后经fld检测分析，检测器波长为λex＝213nm，λem＝308nm，25min即可完成白酒中尿素的定量检测；试验表明，尿素的标准曲线方程为y＝1.0
×
107x 3
×
106，r2＝0.9994，线性关系良好；平均加标回收率为102.46％；进样精密度为1.35％、样品的重复性为1.5％；lod与loq分别为0.030mg/l和0.093mg/l；与传统方法相比较，该方法操作简单、快捷、准确度高、稳定性好，为白酒中尿素的定量提供了更好的选择。
29.2、本发明衍生剂量为800μl和衍生时间为40min的优化选择，有效保证了尿素含量的准确，达到了准确定量的目的。
30.3、本发明最佳洗脱梯度的选择，确保尿素目标峰的峰形、分离度更加可靠，能够得到较好的尿素目标物峰谱图。
31.4、由于进样量会影响尿目标峰形和分离度等多方面因素，因此本发明经过试验，确定进样量为10μl时，可以达到较好的分离效果。
32.5、本发明的精密度试验步骤，得到衍生物的平均浓度为6.15mg/l、rsd为1.44％，证实了本发明方法的进样精密度较高；加之样品的平均浓度为1.50mg/l、相对标准偏差为1.90％，小于要求的5％，所以本发明方法的重复性满足要求，效果较好。
33.6、本发明的准确度试验步骤，证实了本发明方法的平均加标回收率为102.46％，且各试验回收率在80～120％之间，符合要求，结果理想。
34.7、本发明提供了一种利用uplc
‑
fld快速、准确定量白酒中尿素的方法；标准曲线方程为y＝1.0
×
107x 3
×
106，r2＝0.9994；加标回收率为102.46％；进样精密度为1.44％、样品的重复性为1.90％。与传统方法相比较，是一种适用于白酒中尿素的快速准确、精度高、分离度好的检测方法；快速定量白酒中尿素方法的建立，将极大推动白酒中氨基甲酸乙酯的形成机理及控制研究。
附图说明
35.图1为同衍生剂量下目标物的峰面积图；
36.图2为同衍生时间下目标物的峰面积图；
37.图3为不同洗脱梯度下尿素的目标物峰谱图；
38.图4为不同进样体积下尿素的色谱图；
39.图5为尿素的标准曲线图。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图1
‑
5，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.所用的材料：凤香型酒样。
42.所用的试剂：无水乙酸钠(ar，科密欧)、无水乙醇(gr，科密欧)、正丙醇(ar，科密欧)；9
‑
羟基占吨醇(不小于98％，sigma)、尿素标准品(纯度不小于99％，sigma)；盐酸(ar，国药集团)、乙腈(gr，mreda)、冰乙酸(ar，上阳宫)。
43.所用的仪器：超高效液相色谱仪(lc
‑
40b，岛津)、旋涡混合器(xw
‑
80a，上海驰唐电子有限公司)、万分之一天平(ae240，梅特勒
‑
托利多)、ph计(fe20，梅特勒
‑
托利多仪器有限公司)、超声波清洗机(sb5200dt，宁波新芝)、荧光分光检测器(rf
‑
20axs，岛津)。
44.基于超高效液相色谱荧光检测器检测白酒中尿素的方法，包括如下步骤：
45.步骤s001、吸取0.8ml试样，并将试样置于棕色储液瓶；
46.步骤s002、加入0.6ml、0.02mol/l的9
‑
羟基占吨醇溶液、0.2ml、1.5mol/l的盐酸溶液，振荡混匀；
47.步骤s003、室温条件下避光衍生40min；
48.步骤s004、使用0.22μm有机系滤膜过滤；
49.步骤s005、取滤液，并用于超高效液相色谱仪测定。
50.上述实施例中，进一步地：包括溶液的配制步骤：
51.配制体积分数1.0％的乙酸溶液：吸取1.0ml冰乙酸于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。
52.配制0.02mol/l的乙酸钠溶液：称取1.64g无水乙酸钠，超纯水溶解并定容至1000ml，用1.0％乙酸溶液调ph至7.2，过滤后超声脱气15min备用。
53.配制1.5mol/l的盐酸溶液：吸取6.2ml的浓盐酸于50ml容量瓶中，用水定容至50ml刻度，旋涡混合器振荡1min，混匀。
54.配制0.02mol/l的9
‑
羟基占吨醇溶液：称取0.198g 9
‑
羟基占吨，用正丙醇溶液在50ml容量瓶中定容至50ml刻度线，混匀后超声15min备用。
55.配制1.0mg/ml尿素标准储备液：称取0.100g尿素标准品，用无水乙醇溶解并定容至100ml容量瓶刻度线，旋涡混合器振荡1min，混匀后备用。
56.配制100mg/l尿素中间液：吸取1ml尿素标准储备液到10ml容量瓶，用无水乙醇定容至10ml刻度线，旋涡混合器振荡1min，混匀后备用。
57.上述实施例中，进一步地：所述超高效液相色谱仪的液相色谱条件如下：色谱柱：型号为2.1x100mm，2μm的c
18
色谱柱；柱温：35℃；检测波长：λex213nm，λem308nm；流速：0.2ml/min；进样体积：10μl；流动相a为：ph 7.2、0.02mol/l乙酸钠溶液；流动相b为：乙腈。
58.流动相a、流动相b洗脱梯度：见表1：
59.表2流动相洗脱梯度
[0060][0061]
关于衍生条件的选择：
[0062]
衍生剂量和衍生时间直接影响尿素含量的准确性，故需要对衍生剂量和衍生时间
进行优化选择，保证在最短时间内样品能够进行充分衍生，进而达到准确定量的目的。
[0063]
由图1、2可以看出，随着衍生剂量的增加，尿素峰面积呈先显著上升后基本稳定趋势，即衍生物随着衍生剂量的增加，进一步反应直至衍生剂量为800μl时反应完全。故最佳衍生剂量为800μl。同时，随着衍生时间的延长，衍生物的峰面积呈持续上升最后持平趋势，考虑到时间成本和衍生过程的充分性，最终选择衍生时间为40min。
[0064]
关于本发明洗脱梯度的优化：
[0065]
洗脱梯度会直接影响到尿素目标峰的峰形、分离度，甚至尿素目标物出峰与否，所以进行洗脱梯度的优化在方法建立中至关重要。为了得到较好的尿素目标物峰谱图，试验中进行了多种洗脱梯度的尝试，最后通过对比，选择了图3中1号峰谱图中的洗脱梯度。
[0066]
即上述实施例中，进一步地：所述流动相b的洗脱梯度为0～4.5min，流动相b 80～65％；4.5～12min，流动相b 65～70％；12～18min，流动相b 70～0％；18～21min，流动相b 0
‑
80％；21～25min流动相b，80％，为最佳的洗脱梯度。
[0067]
关于进样量的选择：
[0068]
进样量会影响到尿素目标峰的峰形、分离度等多方面。为此，将浓度为5.0mg/l的标准工作液按前述优化条件进行衍生后，分别设置2μl、5μl、10μl进样分析，由图4可见，在进样量为10μl时，可以达到较好的分离效果。
[0069]
因此，上述实施例中，进一步地：包括进样量选择实验步骤：将浓度为5.0mg/l的标准工作液衍生后，分别设置2μl、5μl、10μl进样分析，当进样量为10μl时，分离效果最好。
[0070]
关于尿素的标准曲线：
[0071]
上述实施例中，进一步地：包括尿素的标准曲线绘制步骤：吸取一定体积的100mg/l尿素中间液于10ml容量瓶中，用无水乙醇依次配制成0.05mg/l、0.1mg/l、0.4mg/l、1mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l尿素标准曲线工作液；使用旋涡混合器振荡1min混匀，且现配现用地进行液相分析。以目标色谱峰的面积对标准曲线工作液做图，得到回归方程及相关系数；尿素的标准曲线如图4。
[0072]
所述回归方程为y＝1.0
×
107x 3
×
106，r2＝0.9994；加标回收率为102.46％；进样精密度为1.44％、样品的重复性为1.90％。
[0073]
关于精密度试验：
[0074]
本文为了验证精密度，进行了进样精密度试验和重复性试验。为了进行精密度试验以验证其精密性，上述实施例中，进一步地：包括精密度试验步骤：取浓度为6.0mg/l的标准工作液，衍生及过滤后连续进样6次，计算目标峰浓度的rsd；由表2可以看出，该衍生物的平均浓度为6.15mg/l、rsd为1.44％，该方法的进样精密度高。
[0075]
表3进样精密度试验结果
[0076][0077]
为了研究重复性：
[0078]
取6份凤香型酒样衍生后按优化后的色谱条件进行进样分析，由表3可知样品的平均浓度为1.50mg/l、相对标准偏差为1.90％，小于要求的5％，所以该方法的重复性满足要求，效果较好。
[0079]
表4重复性试验结果
[0080][0081][0082]
即上述实施例中，进一步地：包括重复性研究步骤：取多份凤香型白酒样品衍生后，按色谱条件进行进样分析：样品平均浓度为1.50mg/l，相对标准偏差为1.90％。
[0083]
关于准确度试验：
[0084]
为了研究本方法的加标回收率，准确吸取6份凤香型酒样，分别编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#，在1#、2#中加入4μl浓度为1.0mg/l的标准液；在3#、4#中加入5μl浓度为1.0mg/l的标准液；在5#、6#中加入6μl浓度为1.0mg/l的标准液。衍生及过滤后进行液相分析，得出实际测得的尿素的含量，计算各样品的加标回收率，具体见表4。
[0085]
表5加标回收率试验结果
[0086][0087]
由上表可知，该方法的平均加标回收率为102.46％，且各回收率在80～120％之间，符合要求，结果理想。
[0088]
关于方法检测限(lod)和定量限(loq)：
[0089]
检测限(lod)和定量限(loq)的测定方法主要有以下三种：目测法、信噪比法和基于偏差和斜率的方法。本文选取基于偏差和斜率的方法测定检测限和定量限。
[0090]
具体测定方法为选择衍生后的标准液过滤后进行液相分析，观测液相的峰谱图，选择峰面积响应值最少时候的标准液，然后将此标准液连续进样10次，计算峰面积的标准偏差(sd)，记为空白的标准偏差，根据下列公式计算检测限和定量限。
[0091]
检测限(lod)＝3.3σ/s
ꢀꢀꢀ
(1)
[0092]
定量限(loq)＝10σ/s
ꢀꢀꢀ
(2)
[0093]
式中，σ：空白的标准偏差；s：校准曲线的斜率。
[0094]
经试验得出，上述实施例中，进一步地：所述方法的检测限lod为0.030mg/l；所述方法的定量限loq为0.093mg/l。
[0095]
通过以上描述可以发现：本发明基于超高效液相色谱荧光检测器(uplc
‑
fld)建立了一种快速、准确定量白酒中尿素的方法；该法将白酒样品用9
‑
羟基占吨醇在酸性、避光条件下衍生，采用c
18
反相色谱柱分离目标物，流动相为乙腈和ph 7.2、0.02mol/l乙酸钠溶液，后经fld检测分析，检测器波长为λex＝213nm，λem＝308nm，25min即可完成白酒中尿素的定量检测；试验表明，尿素的标准曲线方程为y＝1.0
×
107x 3
×
106，r2＝0.9994，线性关系良好；平均加标回收率为102.46％；进样精密度为1.35％、样品的重复性为1.5％；lod与loq分别为0.030mg/l和0.093mg/l；与传统方法相比较，该方法操作简单、快捷、准确度高、稳定性好，为白酒中尿素的定量提供了更好的选择。
[0096]
本发明衍生剂量为800μl和衍生时间为40min的优化选择，有效保证了尿素含量的准确，达到了准确定量的目的。
[0097]
本发明最佳洗脱梯度的选择，确保尿素目标峰的峰形、分离度更加可靠，能够得到较好的尿素目标物峰谱图。
[0098]
由于进样量会影响尿目标峰形和分离度等多方面因素，因此本发明经过试验，确定进样量为10μl时，可以达到较好的分离效果。
[0099]
本发明的精密度试验步骤，得到衍生物的平均浓度为6.15mg/l、rsd为1.44％，证实了本发明方法的进样精密度较高；加之样品的平均浓度为1.50mg/l、相对标准偏差为1.90％，小于要求的5％，所以本发明方法的重复性满足要求，效果较好。
[0100]
本发明的准确度试验步骤，证实了本发明方法的平均加标回收率为102.46％，且各试验回收率在80～120％之间，符合要求，结果理想。
[0101]
综上所述：本发明提供了一种利用uplc
‑
fld快速、准确定量白酒中尿素的方法；标准曲线方程为y＝1.0
×
107x 3
×
106，r2＝0.9994；加标回收率为102.46％；进样精密度为1.44％、样品的重复性为1.90％。与传统方法相比较，是一种适用于白酒中尿素的快速准确、精度高、分离度好的检测方法；快速定量白酒中尿素方法的建立，将极大推动白酒中氨基甲酸乙酯的形成机理及控制研究。
[0102]
综上所述，本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
[0103]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。