一种肿瘤外泌体检测试剂和检测方法与流程

1.本发明属于医疗临床上肿瘤标志物诊断技术领域，具体涉及一种肿瘤外泌体检测试剂和检测方法。


背景技术：

2.随着现代社会的进步和生活水平的提高，人们对于健康的追求和医学发展之间的矛盾日益突出。在重大疾病中，癌症(恶性肿瘤)已经成为威胁人类生命健康的头号杀手。在临床医学中90％的癌症病例确诊就已经发展到了中晚期，错过了治疗的最佳时机，给后续治疗带来了极大的困难。胰腺癌是一个典型的例子：早期胰腺癌无明显症状，难以诊断。但病情发展十分迅速，等到确诊大多已经发展到了中晚期，错过了治疗的最佳时间。由于胰腺肿瘤所处位置隐蔽，手术难度极大，5年生存率低于1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。若能实现无症状阶段的早期诊断以及无创/微创诊断，癌症的治愈率有望提高80％以上。因此，实现癌症的早期诊断并及时治疗是提高癌症治愈率最有效的策略。
3.肿瘤外泌体是指由肿瘤细胞分泌到体液(血液、尿液、唾液等)中的尺寸大约在50
‑
150nm范围的脂质双层膜囊泡(evs)，包含与肿瘤相关的mrna、mirna和蛋白质等生物活性大分子。相比正常细胞，肿瘤细胞会分泌更多的evs，其包含的核酸和蛋白是肿瘤释放到循环系统中的“信息密码”。因此，肿瘤外泌体检测可作为早期癌症体外筛查的手段之一。相较于循环肿瘤细胞和循环肿瘤dna来说，肿瘤外泌体检测存在诸多优势，例如在血液中的含量丰富，其分析不需要采集大量血液。由于，且由于膜结构的保护，释放到血液中的外泌体内容物不易被血液中的核酸降解酶、蛋白酶等分解。外泌体膜蛋白性质相对稳定，在长期冷存的血液中依然能够被检测出来。研究显示，癌症的发生、发展、转移和耐药性会直接影响循环系统中的肿瘤外泌体水平。例如，胰腺癌与胰腺炎患者血液中肿瘤来源外泌体的数量有显著区别。胰腺癌血液中肿瘤外泌体特异性膜蛋白的表达量因肿瘤的发生发展而升高，因肿瘤得到控制而降低。胰腺癌的分期直接与血液中肿瘤外泌体蛋白浓度相关，中晚期患者肿瘤外泌体蛋白浓度显著高于早期患者。由于胰腺癌化疗过程中产生耐药的几率高，临床上亟需有效的胰腺癌预后监控手段，从而能够及时修正个体化治疗方案、改善疗效。因此，肿瘤外泌体的检测可为癌症的早期诊断、治疗监测及预后评估提供便捷、安全、无创的检测手段，具有重要的临床应用前景。
4.目前针对肿瘤外泌体的检测主要依赖超速离心法或试剂盒提取法，其中超速离心法步骤繁琐且耗时长，制约了外泌体的检测效率提高；试剂盒提取法虽然速度较快，但产率有限，易造成外泌体的损失，影响了检测质量。因此开发出一种肿瘤外泌体检测方法很有必要。


技术实现要素：

5.为了解决以上问题，本发明旨在提供一种肿瘤外泌体检测试剂和检测方法。
6.第一个方面，本发明提供一种肿瘤外泌体检测试剂，所述肿瘤外泌体检测试剂由
表面修饰有磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1抗体的磁性纳米颗粒和表面修饰有a型肝配蛋白受体
‑
2抗体的金纳米颗粒组成。
7.较佳地，所述磁性纳米颗粒和金纳米颗粒的质量比为1：(2～3)。
8.较佳地，所述磁性纳米颗粒为sio2包覆mefe2o4的纳米颗粒，其中me为co、ni和/或mn。
9.较佳地，所述磁性纳米颗粒的粒径为20
‑
50nm，优选为30
‑
40nm。
10.较佳地，所述金纳米颗粒的粒径为5
‑
13nm，所述金纳米颗粒的形状包括棒状、球状、壳状、笼状、多面体或星状，优选为球状。
11.第二个方面，本发明提供了一种肿瘤外泌体检测方法，包括如下步骤：
12.步骤(1)，配置一系列不同浓度的肿瘤外泌体标准溶液；
13.步骤(2)，将如上所述的肿瘤外泌体检测试剂放入所述肿瘤外泌体标准溶液中，通过所述磁性纳米颗粒上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1抗体和所述金纳米颗粒上的a型肝配蛋白受体
‑
2抗体与肿瘤外泌体表面的对应抗原的耦合使所述肿瘤外泌体检测试剂连接至肿瘤外泌体；
14.步骤(3)，采用磁分离，将连接有肿瘤外泌体的肿瘤外泌体检测试剂分离出来，测定其中的金元素信号强度；
15.步骤(4)，确定金元素信号强度和肿瘤外泌体浓度的标准曲线；
16.根据步骤(4)确定的标准曲线计算待测血液中的肿瘤外泌体的浓度。
17.较佳地，所述步骤(3)测定分离产物的金元素信号采用电感耦合等离子体质谱光谱仪进行测定。
18.本发明采用一种基于双纳米颗粒检测试剂作为耦合探针的肿瘤外泌体检测方法，将制备的双纳米颗粒检测试剂作为耦合探针放入肿瘤外泌体溶液中，即将磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1抗体(gpc
‑
1抗体)和a型肝配蛋白受体
‑
2抗体(epha2抗体)特异性抗体分别修饰于金纳米颗粒和磁性纳米颗粒的表面，使得修饰有gpc
‑
1抗体的金纳米颗粒与肿瘤外泌体表面的gpc
‑
1抗原结合，修饰有epha2抗体的磁性纳米颗粒与肿瘤外泌体表面的epha2抗原结合，然后经过多次磁性分离得到分离产物，分离产物通过电感耦合等离子发射光谱质谱仪测定金元素信号浓度，再根据测定的金元素信号浓度和gpc
‑
1特异性蛋白的标准曲线计算待测样品中外泌体gpc
‑
1蛋白浓度来达到检测目的。
19.有益效果：
20.本发明的一种基于双纳米颗粒检测试剂作为耦合探针的肿瘤外泌体检测方法，通过修饰肿瘤外泌体特异性抗体的双纳米颗粒，与肿瘤外泌体表面抗原特异性耦合，经磁性分离将表达两种蛋白的外泌体分离出来，由电感耦合等离子体质谱光谱仪测定分离产物的金元素信号浓度，再根据预先测定的金元素信号浓度与gpc
‑
1蛋白标准曲线计算出肿瘤外泌体gpc
‑
1蛋白浓度，实现通过纳米耦合方法，达到放大信号超灵敏检测胰腺癌外泌体的目的。相比现有的超速离心法和试剂盒检测法，本发明的肿瘤外泌体检测方法在保证检测质量的情况下大大缩短检测时间，且检测限低，灵敏度和特异性高，达到放大信号检测例如胰腺癌肿瘤外泌体的目的，可以更好地辅助目前例如胰腺癌的早期诊断工作。
附图说明
21.图1为本发明实施例中(znmnco)fe2o4@sio2磁性纳米颗粒(简称为zcmfs)的透射电镜tem照片。
22.图2为本发明实施例中zcmfs磁铁吸引前后照片。
23.图3为本发明实施例中金纳米颗粒(简称为aunp)的透射电镜tem照片。
24.图4为本发明实施例中zcmfs、氨基化的zcmfs(zcmfs
‑
nh2)和epha2抗体负载的zcmfs(zcmfs
‑
aepha2)的zeta电位图。
25.图5为本发明实施例中羧基化的aunp(aunp
‑
cooh)和gpc1抗体负载的aunp(aunp
‑
agpc1)的zeta电位图。
26.图6为本发明实施例中金元素浓度与gpc
‑
1蛋白的线性关系标准曲线。
27.图7为本发明实施例的肿瘤外泌体检测方法对比gpc
‑
1elisa法和ca19
‑
9 elisa法对正常人血清样本和胰腺癌血清样本的roc曲线结果对比图。
具体实施方式
28.以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在没有特殊说明的情况下，各百分含量指质量百分含量。
29.本发明提供一种肿瘤(尤其是胰腺癌)外泌体检测试剂，所述肿瘤外泌体检测试剂由表面修饰有磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1抗体的磁性纳米颗粒和表面修饰有a型肝配蛋白受体
‑
2抗体的金纳米颗粒组成。
30.本发明还提供一种肿瘤(尤其是胰腺癌)外泌体检测方法，包括如下步骤：
31.步骤(1)，配置一系列不同浓度的肿瘤外泌体标准溶液；
32.步骤(2)，将如上所述的肿瘤外泌体检测试剂放入所述肿瘤外泌体标准溶液中，通过所述磁性纳米颗粒上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1抗体和所述金纳米颗粒上的a型肝配蛋白受体
‑
2抗体与肿瘤外泌体表面的对应抗原的耦合使所述肿瘤外泌体检测试剂连接至肿瘤外泌体；
33.步骤(3)，采用磁分离，将连接有肿瘤外泌体的肿瘤外泌体检测试剂分离出来，测定其中的金元素信号强度；
34.步骤(4)，确定金元素信号强度和肿瘤外泌体浓度的标准曲线；
35.根据步骤(4)确定的标准曲线计算待测血液中的肿瘤外泌体的浓度。
36.具体地，所述磁性纳米颗粒包括铁氧体颗粒、金属型颗粒和氮化铁颗粒，其中所述铁氧体颗粒包括γ
‑
fe2o3、mefe2o4(me＝co,ni,mn)和fe3o4，所述金属型颗粒包括fe、co、ni及其合金颗粒，所述氮化铁颗粒包括fen、fe2n、ε
‑
fe3n和fe
16
n2。在本实施例中，所述磁性纳米颗粒采用sio2包覆mefe2o4(me＝co,ni,mn)的纳米颗粒，即磁性纳米颗粒(znmnco)fe2o4@sio2(简称为zcmfs)。其中，所述磁性纳米颗粒的粒径优选为20
‑
50nm，更优选为30
‑
40nm。
37.具体地，所述金纳米颗粒简称为aunp，其粒径优选为5
‑
13nm，其形状包括棒状、球状、壳状、笼状、多面体或星状，优选为球状。
38.具体地，所述特异性抗体包括磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1抗体(gpc
‑
1抗体)和a型肝配蛋白受体
‑
2抗体(epha2抗体)，所述gpc
‑
1抗体用于修饰所述金纳米颗粒，所述epha2抗体用于修饰所述磁性纳米颗粒，修饰有epha2抗体的磁性纳米颗粒与肿瘤外泌体表面的epha2抗
原结合，修饰有gpc
‑
1抗体的金纳米颗粒与肿瘤外泌体表面的gpc
‑
1抗原结合。
39.具体地，所述步骤(2)的分离方法可以为本领域常用的分离方法，优选为磁性分离方法。在一个实施例中，所述步骤(3)测定分离产物的金元素信号采用电感耦合等离子体质谱光谱仪进行测定。
40.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
41.实施例：
42.本发明采用一种基于双纳米耦合探针的肿瘤(尤其是胰腺癌)外泌体检测方法，将制备的双纳米耦合探针放入肿瘤外泌体溶液中，即将磷脂酰肌醇蛋白聚糖
‑
1抗体(gpc
‑
1抗体)和a型肝配蛋白受体
‑
2抗体(epha2抗体)特异性抗体分别修饰于金纳米颗粒(简称为aunp)和磁性纳米颗粒(znmnco)fe2o4@sio2(简称为zcmfs)的表面，两种抗体都是通过酰胺反应完成抗体修饰。取质量比为1：2的金纳米颗粒和磁性纳米颗粒，取50ul的2mg/ml的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和1mg/ml的n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)分别活化金纳米颗粒和epha2抗体上的羧基，活化约10分钟，随后加入gpc
‑
1抗体和磁性纳米颗粒zcmfs室温反应2小时，使得修饰有gpc
‑
1抗体的金纳米颗粒与肿瘤外泌体表面的gpc
‑
1抗原结合，修饰有epha2抗体的磁性纳米颗粒与肿瘤外泌体表面的epha2抗原结合，然后经过多次磁性分离得到分离产物，分离产物通过电感耦合等离子发射光谱质谱仪测定金元素信号浓度，再根据测定的金元素信号浓度和gpc
‑
1特异性蛋白的标准曲线计算待测样品中外泌体gpc
‑
1蛋白浓度来达到检测目的。
43.其中，选用粒径大小约30
‑
40nm左右的磁性纳米颗粒zcmfs。图1为本实施例中(znmnco)fe2o4@sio2磁性纳米颗粒(简称为zcmfs)的透射电镜tem照片。由图1可知，选用的zcmfs形貌规整，粒径均一，平均粒径为35nm。图2为本实施例中zcmfs磁铁吸引前后照片。由图2可知，经磁铁吸引后，仅需几分钟，即可将zcmfs全部磁分离。
44.其中，选用粒径大小约5
‑
13nm的金纳米颗粒aunp。图3为本实施例中金纳米颗粒aunp的透射电镜tem照片。由图3可知，选用的aunp形貌均一，粒径大小约为10nm。
45.在本实施例中，选用磷脂酰肌醇蛋白聚糖
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1抗体(gpc
‑
1抗体)和a型肝配蛋白受体
‑
2抗体(epha2抗体)，其中gpc
‑
1抗体用于修饰aunp颗粒，最终尺寸约为5nm，epha2抗体用于修饰所述zcmfs颗粒，最终尺寸约为35nm，修饰有epha2抗体的zcmfs颗粒与肿瘤外泌体表面的epha2抗原结合，修饰有gpc
‑
1抗体的aunp颗粒与肿瘤外泌体表面的gpc
‑
1抗原结合。其中，zcmfs颗粒先经过氨基化成为zcmfs
‑
nh2颗粒，然后epha2抗体通过酰胺反应修饰于氨基化的zcmfs。图4为本实施例中zcmfs、氨基化的zcmfs(zcmfs
‑
nh2)和epha2抗体负载的zcmfs(zcmfs
‑
aepha2)的zeta电位图。由图4可知，修饰epha2抗体的zcmfs的zeta电位相对于氨基化的zcmfs的zeta电位有所降低，说明epha2抗体成功负载zcmfs颗粒表面。类似地，通过酰胺反应将gpc
‑
1抗体负载于aunp表面。图5为本发明实施例中羧基化的aunp(aunp
‑
cooh)和gpc1抗体负载的aunp(aunp
‑
agpc1)的zeta电位图。由图5可知，修饰gpc
‑
1抗体的aunp颗粒的zeta电位由
‑
20mv转变为 18mv，说明gpc
‑
1抗体成功负载于aunp颗粒表面。
46.具体地，通过传统超速离心法提取胰腺癌肿瘤外泌体，用gpc
‑
1elisa试剂盒确定外泌体gpc
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1蛋白浓度并配置成外泌体标准溶液，浓度范围为78
‑
10000pg/ml，将双纳米探针加入各样本溶液中，随后进行磁性分离，例如进行三次磁性分离，每次磁分离后加入pbs溶液重新分散复合物，每次磁性分离时间约为1分钟，将磁性分离复合物用王水充分消化，并由icp
‑
ms测定各样本中的金元素浓度，从而绘制出金元素和gpc
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1蛋白的标准曲线。图6为本实施例中金元素浓度与gpc
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1蛋白的线性关系标准曲线。由图6可知，该标准曲线拟合良好，金元素(y)和log(gpc
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1)(x)之间的关系为y＝940.5x
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1294.2，相关度达0.995，实际检测限可低至78pg/ml，相对于传统elisa法检测gpc
‑
1蛋白，elisa法仅可检测低至约1ng/ml，本发明的肿瘤外泌体的检测方法的检测灵敏度更高。
47.根据测定的标准曲线，对20例胰腺癌病人血清和正常人血清进行检测，对比临床上常用的gpc
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1elisa法和ca19
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9 elisa法。图7为本发明实施例的肿瘤外泌体检测方法对比gpc
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1elisa法和ca19
‑
9 elisa法对正常人血清样本和胰腺癌血清样本的roc曲线结果对比图。由图7可知，本发明实施例的肿瘤外泌体检测方法的roc曲线下的面积为1，大于gpc
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1elisa法和ca19
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9 elisa法，由此说明本发明实施例的肿瘤外泌体检测方法具有更高的检测灵敏度和特异性。
48.在不脱离本发明的基本特征的宗旨下，本发明可体现为多种形式，因此本发明中的实施形态是用于说明而非限制，由于本发明的范围由权利要求限定而非由说明书限定，而且落在权利要求界定的范围，或其界定的范围的等价范围内的所有变化都应理解为包括在权利要求书中。