硼代亮氨酸类化合物的新用途的制作方法

1.本发明涉及氨肽酶n抑制剂技术领域，具体涉及硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯在制备氨肽酶n抑制剂中的应用。


背景技术：

2.氨基肽酶n(aminopeptidase n，apn/cd13，ec 3.4.11.2)是一种锌离子依赖型跨膜金属蛋白酶，通过非共价结合成同源二聚体的形式定位于细胞膜外表面。apn与肿瘤的发生、发展、转移密切相关，抑制apn能抑制肿瘤细胞转移。此外，apn是半静息态肝癌干细胞的生物标志物，增强apn表达能促进肝癌干细胞存活。以上提示靶向抑制apn对于肿瘤治疗可能具有良好的效果。
3.硼代亮氨酸((s)
‑1‑
氨基
‑3‑
甲基丁基硼酸)及硼代亮氨酸迪诺酯((s)
‑1‑
氨基
‑3‑
甲基丁基硼酸蒎烷二醇酯)属于α
‑
氨基硼酸衍生物，是制备蛋白酶体抑制剂硼替佐米的中间体。此外，研究发现此类化合物还能抑制金属蛋白酶脑啡肽酶(enkephalinase，ec 3.4.24.11)的活性。因此，该类化合物在药物设计中越来越受关注。
4.前期在研究小分子apn抑制剂的过程中发现，具有apn和蛋白酶体双靶点抑制活性的ahpa
‑
leu二肽硼酸枸橼酸酯类化合物，具有良好的抗肿瘤活性，但枸橼酸酯不稳定，蛋白酶体抑制活性偏弱，对肿瘤细胞杀伤活性不够强。因此，寻找有效抑制apn活性的小分子化合物并用于抗肿瘤药物研发一直是药物化学领域的研究热点。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供硼代亮氨酸类化合物的新用途。本发明将硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯用于制备apn抑制剂或合成靶向氨肽酶n的荧光探针，硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯可显著抑制apn的活性。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供硼代亮氨酸类化合物在如下1)或2)中的应用：
8.1)制备氨肽酶n抑制剂；
9.2)制备抑制肿瘤生长的药物。
10.优选的，硼代亮氨酸类化合物通过抑制huvec细胞二维管生成来抑制肿瘤生长。
11.优选的，硼代亮氨酸类化合物通过抑制肿瘤细胞迁移来抑制肿瘤生长。
12.优选的，硼代亮氨酸类化合物通过抑制肿瘤细胞侵袭来抑制肿瘤生长。
13.优选的，所述硼代亮氨酸类化合物为具有式1结构的硼代亮氨酸或具有式2结构的硼代亮氨酸迪诺酯；
[0014][0015]
硼代亮氨酸为制备硼替佐米的中间体，其制备方法可参见：asolid
‑
phase approach for the synthesis of a
‑
aminoboronic acid peptides(blake e.daniels and craig e.stivala，rsc adv.,2018,8,3343
–
3347)中第3345页：synthesis of boronic acid 8的制备方法。
[0016]
硼代亮氨酸迪诺酯为制备硼替佐米的中间体，其制备方法可参见：申请号201210156068.x一种制备(1r)
‑
(s)
‑
蒎烷二醇
‑1‑
氨基
‑3‑
甲基丁烷
‑1‑
硼酸酯及其盐的方法公开的(1r)
‑
(s)
‑
蒎烷二醇
‑1‑
氨基
‑3‑
甲基丁烷
‑1‑
硼酸酯的制备方法，该方法制备的式ⅱ化合物与本发明中的硼代亮氨酸迪诺酯结构完全一样。
[0017]
本发明的有益效果：
[0018]
本发明发现了全新的小分子化合物硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯可以抑制apn的酶活性，apn与肿瘤转移密切相关，不管是肿瘤细胞本身表达的apn，还是机体的apn，都能促进肿瘤细胞转移到远端组织形成转移灶。在肿瘤转移过程中，肿瘤组织新生血管生成为肿瘤细胞转移提供了便利，因此抑制肿瘤组织新生血管生成和肿瘤细胞迁移侵袭，都有助于抑制肿瘤转移。试验表明，硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯能抑制脐静脉内皮细胞(huvec)二维管生成和肿瘤细胞迁移、侵袭。因此，该化合物可以作为apn抑制剂类先导物用于新药研发，也可合成靶向apn的荧光探针用于肿瘤早期发现。
附图说明
[0019]
图1：硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯与apn对接示意图；
[0020]
图2：抑制huvec细胞二维管生成试验的照片；
[0021]
图3：抑制乳腺癌细胞迁移试验的照片；
[0022]
图4：抑制乳腺癌细胞迁移试验数值量化；
[0023]
图5：抑制乳腺癌细胞侵袭试验的照片；
[0024]
图6：抑制乳腺癌细胞侵袭试验数值量化；
[0025]
图7：抑制体内肺转移试验的照片；
[0026]
图8：体内肺转移肺结节数量化；
具体实施方式
[0027]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0028]
正如背景技术部分介绍的，具有apn和蛋白酶体双靶点抑制活性的ahpa
‑
leu二肽硼酸枸橼酸酯类化合物，具有良好的抗肿瘤活性，但枸橼酸酯不稳定，蛋白酶体抑制活性偏弱，对肿瘤细胞杀伤活性不够强。
[0029]
基于此，本发明的目的是提供硼代亮氨酸类化合物的新用途。在背景技术的基础上，通过进一步的构效关系研究发现ahpa与leu之间插入一个ileu，n
‑
保护基cbz和硼酸保护基迪诺酯全部保留，形成的新化合物硼代亮氨酸迪诺酯，可以使apn抑制活性和抗肿瘤活性大幅提高。该化合物的抑制apn酶活性水平，明显优于对照药乌苯美司和硼替佐米，抗二维管生成、抗迁移、侵袭方面，也表现出了良好的活性。apn与肿瘤转移密切相关，不管是肿瘤细胞本身表达的apn，还是机体的apn，都能促进肿瘤细胞转移到远端组织形成转移灶。在肿瘤转移过程中，肿瘤组织新生血管生成为肿瘤细胞转移提供了便利，因此抑制肿瘤组织新生血管生成和肿瘤细胞迁移侵袭，都有助于抑制肿瘤转移。试验表明，硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯能抑制脐静脉内皮细胞(huvec)二维管生成和肿瘤细胞迁移、侵袭。因此，该化合物可以作为apn抑制剂类先导物用于新药研发，也可合成靶向apn的荧光探针用于肿瘤早期发现。
[0030]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
[0031]
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
[0032]
说明：实施例中的硼代亮氨酸按照《a solid
‑
phase approach for the synthesis of a
‑
aminoboronic acid peptides》中公开的synthesis of boronic acid 8的制备方法制备得到。
[0033]
硼代亮氨酸迪诺酯按照申请号201210156068.x一种制备(1r)
‑
(s)
‑
蒎烷二醇
‑1‑
氨基
‑3‑
甲基丁烷
‑1‑
硼酸酯及其盐的方法中，公开的(1r)
‑
(s)
‑
蒎烷二醇
‑1‑
氨基
‑3‑
甲基丁烷
‑1‑
硼酸酯的制备方法制备得到式ⅱ化合物即为硼代亮氨酸迪诺酯。
[0034]
实施例1硼代亮氨酸迪诺酯的体外抑酶活性实验：
[0035]
使用制备apn酶源的方法(专利申请号：201810629864.8)用于硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯对氨肽酶n的抑酶活性评价，并以乌苯美司阳性对照1，硼替佐米作为阳性对照2。
[0036]
试验步骤如下：
[0037]
(1)k562
‑
apn细胞超声破碎后制备细胞匀浆，接种于96孔板中；
[0038]
(2)向孔中加入不同浓度梯度的化合物；
[0039]
(3)5min后加入apn底物至1.6mm，孵育1h；
[0040]
(4)测定405nm处的吸光度值，使用origin软件计算ic50。
[0041]
注：试验中使用的化合物为硼代亮氨酸、硼代亮氨酸迪诺酯、乌苯美司或硼替佐米。
[0042]
结果表明，硼代亮氨酸对apn抑酶活性的ic50值为0.15
±
0.003μm，硼代亮氨酸迪诺酯对apn抑酶活性的ic50值为0.007
±
0.001μm，而阳性对照1乌苯美司为20.167
±
1.84μm，阳性对照2硼替佐米为65.69
±
5.94μm，提示硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯对apn的酶活性抑制作用明显优于乌苯美司和硼替佐米。
[0043]
本发明通过分子对接预测硼代亮氨酸迪诺酯和硼代亮氨酸与apn活性位点的结合。如图1所示，氢键和疏水相互作用有助于硼代亮氨酸迪诺酯和硼代亮氨酸结合到apn的活性位点。硼代亮氨酸迪诺酯中的硼酸基团可以与周围的残基如ala262和glu298形成多个氢键相互作用，氨基与glu121、met263和glu264有氢键作用。硼代亮氨酸的硼酸酯中有一个氧原子与ala262的氨基形成氢键作用，硼代亮氨酸的氨基与周围的glu264、glu320之间也存在氢键相互作用。残基met260、ala262、met263、tyr376和tyr381在apn与硼代亮氨酸迪诺酯和硼代亮氨酸的疏水相互作用中起重要作用。在锌结合中，硼代亮氨酸迪诺酯的硼酸基团与锌离子结合，而硼代亮氨酸的氨基也与锌离子结合。因此，锌结合模式的差异可能导致不同的酶抑制活性。
[0044]
实施例2硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯抑制huvec细胞二维管生成实验
[0045]
肿瘤组织新生血管生成能为肿瘤细胞转移提供便利，使用huvec细胞开展二维管生成试验，能反映化合物抑制肿瘤组织新生血管生成的能力，分别考察硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯抑制huvec细胞二维管生成的能力，并以dmso溶剂作为空白对照(记为ctrl)，以硼替佐米作为阳性对照。
[0046]
试验步骤如下：
[0047]
(1)m199培养基1:1稀释的matrigel胶50μl铺于96孔板中，放培养箱中孵育；
[0048]
(2)30min后加入100μl化合物，使孔中补加50μl细胞后，化合物浓度至工作浓度；
[0049]
(3)处理细胞，计数，每孔加入20000cell/50μl/孔；
[0050]
(4)培养6h后，拍照。
[0051]
注：试验中使用的化合物为硼代亮氨酸、硼代亮氨酸迪诺酯、dmso溶剂或硼替佐米作。
[0052]
结果表明，如图2所示，与空白对照和阳性对照相比，硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯能明显抑制huvec细胞二维管生成。
[0053]
实施例3硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯抑制乳腺癌细胞迁移实验
[0054]
划痕试验能反映乳腺癌细胞的迁移能力，考察硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯抑制乳腺癌细胞迁移的能力，并以dmso溶剂作为空白对照(记为ctrl)，以硼替佐米作为阳性对照。
[0055]
试验步骤如下：
[0056]
(1)铺乳腺癌mda
‑
mb
‑
231细胞至6孔板中，加入10μm化合物处理2天；
[0057]
(2)用移液管辅助，白枪头划线，使画线粗细一致；
[0058]
(3)0、36h时拍照，计算机测迁移距离。
[0059]
注：试验中使用的化合物为硼代亮氨酸、硼代亮氨酸迪诺酯、dmso溶剂或硼替佐米。
[0060]
结果表明，如图3～4所示，与空白对照和阳性对照相比，硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯均能明显抑制乳腺癌细胞迁移，且其抑制效果优于阳性对照药硼替佐米。
[0061][0062]
注：d为迁移距离。
[0063]
实施例4硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯抑制乳腺癌细胞侵袭实验
[0064]
侵袭试验能反映乳腺癌细胞的转移能力，考察硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯抑制乳腺癌细胞侵袭的能力，并以dmso溶剂作为空白对照(记为ctrl)，以硼替佐米作为阳性对照。
[0065]
试验步骤如下：
[0066]
(1)metrigel胶按1：19稀释，混匀后取50μl加入小室中；
[0067]
(2)transwell板放入培养箱中，固化1
‑
2h后，加入无血清1640 30μl水化基底膜，30min后加入无血清培养基的乳腺癌细胞1*105个，下室加入10％fbs的培养基；
[0068]
(3)小室中加入10μm化合物培养24h后，小室用pbs洗一遍，甲醇固定10min；
[0069]
(4)吸干液体后，浸入0.1％结晶紫染色2
‑
3min；
[0070]
(5)pbs洗两遍，棉签擦掉上室内的胶及未穿膜的细胞；
[0071]
(6)显微镜下拍照，计数。
[0072]
注：试验中使用的化合物为硼代亮氨酸、硼代亮氨酸迪诺酯、dmso溶剂或硼替佐米。
[0073]
本实施例中穿膜细胞的数量，数量越少说明抑制癌细胞侵袭的效果越好。结果表明，如图5～6所示，与空白对照和阳性对照相比，硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯均能明显抑制乳腺癌细胞侵袭，且其抑制效果优于阳性对照药硼替佐米。
[0074]
实施例5荷瘤鼠评价化合物体内抗转移活性
[0075]
本实验用昆明鼠尾静脉注射小鼠肝癌h22细胞，模拟血道转移，评价硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯的体内抗转移活性，以dmso溶剂作为空白对照(记为ctrl)，以硼替佐米作为阳性对照。
[0076]
试验步骤如下：h22细胞培养扩增，收集细胞，无菌pbs溶液洗涤两次后细胞计数(细胞计数：2.5
×
107个/ml)，小鼠尾静脉注射，每只接种200μl。接种后1天，随机分组并开始腹腔注射给药20mg/kg/d，两周后拉颈处死小鼠，解剖肺组织用苦味酸固定后，观察肺结节数。
[0077]
结果表明，如图7～8所示，与空白对照相比，硼替佐米、硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯均能明显抑制肿瘤细胞转移，硼代亮氨酸和硼代亮氨酸迪诺酯的体内抗肿瘤转移能力优于阳性对照硼替佐米。
[0078]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。